JPH02222675A - 変異枯草菌 - Google Patents
変異枯草菌Info
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- JPH02222675A JPH02222675A JP4331389A JP4331389A JPH02222675A JP H02222675 A JPH02222675 A JP H02222675A JP 4331389 A JP4331389 A JP 4331389A JP 4331389 A JP4331389 A JP 4331389A JP H02222675 A JPH02222675 A JP H02222675A
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- Japan
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- maltotetraose
- dna
- enzyme
- bacillus subtilis
- producing
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、マルトテトラオース生成酵素遺伝子を組み込
んだ新規プラスミドを導入した新規なバチルス・スブチ
リスに関するものである。
んだ新規プラスミドを導入した新規なバチルス・スブチ
リスに関するものである。
マルトテトラオース生成酵素（Ｅｃ３．２．１．６０．
ｅｘ。
ｅｘ。
ｍａｌｔｏｔｅｔｒａｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）は、１９
７１年Ｒｏｂｙ ｔとＡｃｋｅｒｍａｎによってブシュ
−トモナス・ズツッツエリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓ
ｔｕｔｚｅｒｔ）の培養液中に初めて発見された。近年
マルトテトラオース生成酵素は、ブシュ−トモナス・サ
ツ力ロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ蝕匹ｊμ面辻堕
）も産生ずる事が明らかにされた。
７１年Ｒｏｂｙ ｔとＡｃｋｅｒｍａｎによってブシュ
−トモナス・ズツッツエリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓ
ｔｕｔｚｅｒｔ）の培養液中に初めて発見された。近年
マルトテトラオース生成酵素は、ブシュ−トモナス・サ
ツ力ロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ蝕匹ｊμ面辻堕
）も産生ずる事が明らかにされた。
マルトテトラオースは臨床試薬や機能性食品素材として
需要が増大している。しかしながら、従来の微生物によ
るマルトテトラオース生成酵素産生量は低く、かつ不安
定であり、また培地中に含まれる夾雑物が多く、マルト
テトラオース生成酵素の分離精製が困難であった。
需要が増大している。しかしながら、従来の微生物によ
るマルトテトラオース生成酵素産生量は低く、かつ不安
定であり、また培地中に含まれる夾雑物が多く、マルト
テトラオース生成酵素の分離精製が困難であった。
本発明は、マルトテトラオース生成酵素遺伝子を種々の
ベクターに組み込んで宿主微生物に導入した新規組替え
体バチルス・ズブチリスを提供し、マルトテトラオース
生成酵素の分離精製を容易にするものである。
ベクターに組み込んで宿主微生物に導入した新規組替え
体バチルス・ズブチリスを提供し、マルトテトラオース
生成酵素の分離精製を容易にするものである。
本発明者らは、上記の目的を達成するため、マルトテト
ラオース生成酵素産生菌より、マルトテトラオース生成
酵素遺伝子をクローン化した後、該遺伝子を種々のベク
ターに組み込んで宿主微生物に導入し、得られた組替え
体微生物にマルトテトラオース生成酵素産生させること
に成功し、本発明を完成した。
ラオース生成酵素産生菌より、マルトテトラオース生成
酵素遺伝子をクローン化した後、該遺伝子を種々のベク
ターに組み込んで宿主微生物に導入し、得られた組替え
体微生物にマルトテトラオース生成酵素産生させること
に成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明はマルトテトラオース生成酵素を生産
するバチルス・ズブチリスに関する。
するバチルス・ズブチリスに関する。
以下に、本発明を具体的に説明する。
マルトテトラオース生成酵素産生能を有する供与体微生
物のＤＮＡは、供与体微生物を培養し、得られる培養物
を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させることに
よって調製することができる。
物のＤＮＡは、供与体微生物を培養し、得られる培養物
を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させることに
よって調製することができる。
溶菌方法は、リゾチームなどの細胞壁溶解酵素による処
理や超音波処理などが用いられる。また、必要によりプ
ロテアーゼ、リボヌクレアーゼなどの他の酵素剤やラウ
リル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用される。さ
らに、凍結融解処理を施すこともある。このようにして
得られる溶菌物からＤＮＡを分離、精製するには、常法
にしたがって、フェノール抽出、除蛋白処理、プロテア
ーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱。
理や超音波処理などが用いられる。また、必要によりプ
ロテアーゼ、リボヌクレアーゼなどの他の酵素剤やラウ
リル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用される。さ
らに、凍結融解処理を施すこともある。このようにして
得られる溶菌物からＤＮＡを分離、精製するには、常法
にしたがって、フェノール抽出、除蛋白処理、プロテア
ーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱。
遠心分離などの方法を適宜組み合わせることによって行
うことができる。
うことができる。
ＤＮＡを切断する方法は、超音波処理、制限酵素処理な
どにより行うことができる。切断後、必要に応じてホス
ファターゼやＤＮＡポリメラーゼ等の修飾酵素が用いら
れる。また種々のリンカ−やアダプターを用いることに
よりＤＮＡ断片末端の塩基配列を変えることができる。
どにより行うことができる。切断後、必要に応じてホス
ファターゼやＤＮＡポリメラーゼ等の修飾酵素が用いら
れる。また種々のリンカ−やアダプターを用いることに
よりＤＮＡ断片末端の塩基配列を変えることができる。
切断されたさまざまな長さを持つＤＮＡ断片混合物から
、蔗糖密度勾配遠心法や電気泳動したゲルからの抽出等
によって最適な長さの断片のみを得ることができる。
、蔗糖密度勾配遠心法や電気泳動したゲルからの抽出等
によって最適な長さの断片のみを得ることができる。
ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖し得るフ
ァージまたはプラスミドが適している。
ァージまたはプラスミドが適している。
ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は、ＤＮ
Ａ断片とベクター断片にＤＮＡリガーゼを作用させるこ
とにより組替えＤＮＡを作成する。
Ａ断片とベクター断片にＤＮＡリガーゼを作用させるこ
とにより組替えＤＮＡを作成する。
宿主微生物としては、組替えＤＮＡが安定、かつ自律的
増殖が可能でその形質発現のできるものであればよい。
増殖が可能でその形質発現のできるものであればよい。
宿主微生物に組替えＤＮＡを導入する方法は、公知の方
法、例えば宿主微生物がバチルス・ズブチリスの場合に
は、コンピテントセル法（Ｇｒｙｃｚａｎ、 Ｔ。
法、例えば宿主微生物がバチルス・ズブチリスの場合に
は、コンピテントセル法（Ｇｒｙｃｚａｎ、 Ｔ。
Ｊ、、 Ｃｏｎｔｅｎｔｅ、 Ｓ、 ａｎｄ Ｄｕｂｎ
ａｕ＋ ｏ、ｌ Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。
ａｕ＋ ｏ、ｌ Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。
１３４、３１８．（１９７８））またはプロトプラスト
法（Ｃｈａｎｇ。
法（Ｃｈａｎｇ。
Ｓ、、 Ｃｏｈｅｎ、 Ｓ、 Ｎ、＋ Ｍｏ１． ｇｅ
ｎ、 Ｇｅｎｅｔ、＋ １６８＋ １１１（１９７９）
）などを採用することができる。
ｎ、 Ｇｅｎｅｔ、＋ １６８＋ １１１（１９７９）
）などを採用することができる。
λフアージＤＮＡであれば、イン ビトロ ノでツケイ
ジング法（Ｈｏｒｎ、 Ｂ、、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。
ジング法（Ｈｏｒｎ、 Ｂ、、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。
６８、２９９．（１９７９））によりλフアージ粒子を
形成し、このλフアージ粒子をエシェリヒア・コリの培
養菌懸濁液に添加して、マルトテトラオース生成酵素生
産能を保有する特殊形質導入ファージを得ることができ
る。
形成し、このλフアージ粒子をエシェリヒア・コリの培
養菌懸濁液に添加して、マルトテトラオース生成酵素生
産能を保有する特殊形質導入ファージを得ることができ
る。
組替えＤＮＡが導入された形質転換微生物の選択方法は
、液体選択培地で培養し、培養液中のマルトテトラオー
ス生成酵素活性を測定する。液体選択培地にはベクター
上のマーカーによって、最小培地や抗往物質添加培地が
適宜用いられる。
、液体選択培地で培養し、培養液中のマルトテトラオー
ス生成酵素活性を測定する。液体選択培地にはベクター
上のマーカーによって、最小培地や抗往物質添加培地が
適宜用いられる。
酵素活性の測定は、培養液に澱粉溶液を加え、４０°Ｃ
で保温した後、薄層クロマトグラフィーや高速液体クロ
マトグラフィーを用いて生成されたマルトテトラオース
の同定や定量が行なわれる。
で保温した後、薄層クロマトグラフィーや高速液体クロ
マトグラフィーを用いて生成されたマルトテトラオース
の同定や定量が行なわれる。
得られたマルトテトラオース生成酵素生産菌を液体選択
培地にて３７°Ｃで培養し、公知の方法、例えばアルカ
リ抽出法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、 Ｈ，Ｃ，ａｎｄ Ｄｏ
ｌｙ＋Ｊ、、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｓ１ｄｓ Ｒｅｓ、
、 ？、 １５１３．（１９７９））によってプラスミ
ドを得ることができる。
培地にて３７°Ｃで培養し、公知の方法、例えばアルカ
リ抽出法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、 Ｈ，Ｃ，ａｎｄ Ｄｏ
ｌｙ＋Ｊ、、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｓ１ｄｓ Ｒｅｓ、
、 ？、 １５１３．（１９７９））によってプラスミ
ドを得ることができる。
次に本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例１ マルトテトラオース生成酵素遺伝子のクロー
ン化 ブシュ−トモナス・サッカロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ社胚ｊμ顕辻国”） ＩＡＭ １５０４を可溶性
澱粉を含む液体培地（可溶性澱粉１ｇ、ポリペプトンＩ
ｇ、 リン酸１カリウム０．１ｇ、 リン酸・２カ
リウム０．２８ｇ、水１００ｄ、 ｐＨ７，０）にて３
０°Ｃで４８時間培養し、遠心分離を行って集菌、洗浄
し、得られた菌から５ａｉｔｏ、 Ｍｉｕｒａの方法（
Ｓａｉｔｏ、 Ｈ，ａｎｄＭｉｕｒａ、に、、 Ｂｉｏ
ｃｈｉ＋ｓ、 Ｂｋｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ＋ ７２＋
６１９（１９６４）） によって染色体ＤＮＡを分
離した。得られたＤＮＡをトリス塩酸・ＥＤＴＡ緩衝液
に溶解し、制限酵素Ｓａｕ ３Ａ１ （宝酒造社製）を
添加して、３７°Ｃで部分分解した後、分解物からシｇ
糖密度勾配超遠心法で約２Ｋｂ以上の染色体断片を分離
、取得した。
ン化 ブシュ−トモナス・サッカロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ社胚ｊμ顕辻国”） ＩＡＭ １５０４を可溶性
澱粉を含む液体培地（可溶性澱粉１ｇ、ポリペプトンＩ
ｇ、 リン酸１カリウム０．１ｇ、 リン酸・２カ
リウム０．２８ｇ、水１００ｄ、 ｐＨ７，０）にて３
０°Ｃで４８時間培養し、遠心分離を行って集菌、洗浄
し、得られた菌から５ａｉｔｏ、 Ｍｉｕｒａの方法（
Ｓａｉｔｏ、 Ｈ，ａｎｄＭｉｕｒａ、に、、 Ｂｉｏ
ｃｈｉ＋ｓ、 Ｂｋｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ＋ ７２＋
６１９（１９６４）） によって染色体ＤＮＡを分
離した。得られたＤＮＡをトリス塩酸・ＥＤＴＡ緩衝液
に溶解し、制限酵素Ｓａｕ ３Ａ１ （宝酒造社製）を
添加して、３７°Ｃで部分分解した後、分解物からシｇ
糖密度勾配超遠心法で約２Ｋｂ以上の染色体断片を分離
、取得した。
ベクターにはファージλＬ４７（アマ−ジャム社製）を
用い、Ｂａａ Ｈｌ （全酒造社製）で切断したλＬ４
７ ＤＮＡと前記のブシュ−トモナス・サン力ロフィラ
ＩＡＭ １５０４株から得られた約２Ｋｂ以上の染色体
断片を混合し、Ｔ４ ＯＮＡリガーゼ（全酒造社製）を
添加して連結処理した（Ｗｅｉｓｓ、 Ｂ、、 ５ａｂ
ｌｏｎ、 Ａ。
用い、Ｂａａ Ｈｌ （全酒造社製）で切断したλＬ４
７ ＤＮＡと前記のブシュ−トモナス・サン力ロフィラ
ＩＡＭ １５０４株から得られた約２Ｋｂ以上の染色体
断片を混合し、Ｔ４ ＯＮＡリガーゼ（全酒造社製）を
添加して連結処理した（Ｗｅｉｓｓ、 Ｂ、、 ５ａｂ
ｌｏｎ、 Ａ。
Ｊ、、 Ｌｉｖｅ、 Ｔ、 Ｒ，、Ｆａｒｅｅｄ、 Ｇ
、 Ｃ，ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ。
、 Ｃ，ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ。
Ｃ，Ｃ，、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、、 ２４３．
４５４３（１９６８）） 、処理液をイン ビトロ バ
ツケイジング キット（全酒造社製）を添加してイン
ビトロ パツケイジフグ法（ｌ（ｏｒｎ、 Ｂ、、 Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。
４５４３（１９６８）） 、処理液をイン ビトロ バ
ツケイジング キット（全酒造社製）を添加してイン
ビトロ パツケイジフグ法（ｌ（ｏｒｎ、 Ｂ、、 Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。
邸、 ２９９．（１９７９））により当該ＤＮＡをファ
ージ粒子に導入した。このファージ粒子をエシェリヒア
・コリーＬ９５の菌体懸濁液に添加し、１％可溶性澱粉
。
ージ粒子に導入した。このファージ粒子をエシェリヒア
・コリーＬ９５の菌体懸濁液に添加し、１％可溶性澱粉
。
１．２％の寒天を含むλ培地（バクトドリブトン１０ｇ
、ＮａＣ１２，５ｇを水１２に溶解）に添加して３７°
Ｃで培養し、出現したプラークにヨウ素液を噴霧してヨ
ウ素反応を起こさなかったファージをマルトテトラオー
ス生成酵素生産ファージとして分離することができた。
、ＮａＣ１２，５ｇを水１２に溶解）に添加して３７°
Ｃで培養し、出現したプラークにヨウ素液を噴霧してヨ
ウ素反応を起こさなかったファージをマルトテトラオー
ス生成酵素生産ファージとして分離することができた。
得られたマルトテトラオース生成酵素生産ファージを単
離し、これをエシェリヒア・コリ札６６とともにλ培地
で３７℃で培養した。培養液を遠心分離して宿主菌体を
除き、ポリエチレングリコールを加えてファージ粒子を
凝集させたのち、遠心分離によってファージ粒子を集め
、新規なファージを得た。このファージをλＧＦ１０２
と名づけた。
離し、これをエシェリヒア・コリ札６６とともにλ培地
で３７℃で培養した。培養液を遠心分離して宿主菌体を
除き、ポリエチレングリコールを加えてファージ粒子を
凝集させたのち、遠心分離によってファージ粒子を集め
、新規なファージを得た。このファージをλＧＦ１０２
と名づけた。
このファージ粒子を５０％ホルムアミドを含むファージ
懸濁用緩衝液に対して透析し、λＧＦ１０２ファージＤ
ＮＡを得た。ファージλ、ＧＦ１０２ ＯＮＡは４６、
４ Ｋｂの大きさで、このフィジカルマツプ（制限酵素
切断地図）を第１図に示す。ここで白ぬきの部分はベク
ターλＬ４７由来で、黒塗りの部分は染色体断片部分で
ある。各略記号はすべて制限酵素切断認識部位である。
懸濁用緩衝液に対して透析し、λＧＦ１０２ファージＤ
ＮＡを得た。ファージλ、ＧＦ１０２ ＯＮＡは４６、
４ Ｋｂの大きさで、このフィジカルマツプ（制限酵素
切断地図）を第１図に示す。ここで白ぬきの部分はベク
ターλＬ４７由来で、黒塗りの部分は染色体断片部分で
ある。各略記号はすべて制限酵素切断認識部位である。
ここに得られたλＧＦ１０２ファージＤＮＡをトリス塩
酸・ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、制限酵素Ｓａｕ ３ＡＩ
を添加し、３７°Ｃで部分分解した。分解物からシラ糖
密度勾配超遠心法で約２Ｋｂ以上の染色体断片を分離、
取得し、プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫを用いて再クロ
ーン化を図った。プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ （ヤ
クルト社製）は４．９Ｋｂでアンピシリン耐性（Ａｐ’
）およびテトラサイクリン耐性（Ｔｃ’）を有し、制限
酵素Ｂａ１ｌＨ１によって１箇所切断されるものである
。
酸・ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、制限酵素Ｓａｕ ３ＡＩ
を添加し、３７°Ｃで部分分解した。分解物からシラ糖
密度勾配超遠心法で約２Ｋｂ以上の染色体断片を分離、
取得し、プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫを用いて再クロ
ーン化を図った。プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ （ヤ
クルト社製）は４．９Ｋｂでアンピシリン耐性（Ａｐ’
）およびテトラサイクリン耐性（Ｔｃ’）を有し、制限
酵素Ｂａ１ｌＨ１によって１箇所切断されるものである
。
Ｒａｍ Ｈｌで１箇所切断したｐＨＹ３００ＰＩＪをア
ルカリフォスファターゼ（全酒造社製）処理した後、前
記のλＧＦ１０２ファージから得られた約２Ｋｂ以上の
染色体断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡ リガーゼを添加して
連結理した。この処理液を用い、バチルス・ズブチリス
ｌ５Ｗ１２１４株を宿主として、コンペテントセル法（
Ｉｓｈｉｗａ、 Ｈ，、ａｎｄ ５ｈｉｂａｈａｒａ
Ｈ，、Ｊｐｎ、 Ｊ。
ルカリフォスファターゼ（全酒造社製）処理した後、前
記のλＧＦ１０２ファージから得られた約２Ｋｂ以上の
染色体断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡ リガーゼを添加して
連結理した。この処理液を用い、バチルス・ズブチリス
ｌ５Ｗ１２１４株を宿主として、コンペテントセル法（
Ｉｓｈｉｗａ、 Ｈ，、ａｎｄ ５ｈｉｂａｈａｒａ
Ｈ，、Ｊｐｎ、 Ｊ。
Ｇｅｎｅｔ、、 ６０．２３５．（１９８５））により
当言亥プラスミドを導入した。
当言亥プラスミドを導入した。
得られた形質転換処理菌体を選択培地である可溶性澱粉
１％、テトラサイクリン２０μｇ／ｄ。
１％、テトラサイクリン２０μｇ／ｄ。
寒天１．６％を含むし培地（バクトドリブトン１０ｇ、
酵母エキス５ｇ、ＮａＣｉｔ５ｇ＠ｌｌの水に”溶解）
にて３７°Ｃで培養し、テトラサイクリン耐性株を得た
。このテトラサイクリン耐性株をテトラサイクリン２０
μｇ／ＩＲ１，１％可溶性澱粉を含むし培地にて３７°
Ｃで２４時間培養し、培養液中のマルトテトラオース生
成酵素活性の有無を薄層クロマトグラフィーによって調
べた。
酵母エキス５ｇ、ＮａＣｉｔ５ｇ＠ｌｌの水に”溶解）
にて３７°Ｃで培養し、テトラサイクリン耐性株を得た
。このテトラサイクリン耐性株をテトラサイクリン２０
μｇ／ＩＲ１，１％可溶性澱粉を含むし培地にて３７°
Ｃで２４時間培養し、培養液中のマルトテトラオース生
成酵素活性の有無を薄層クロマトグラフィーによって調
べた。
薄層クロマトグラフィーは培養液をｎ−ブタノール／ｎ
−プロパツール／水（３１５／４）の溶媒系で６０″Ｃ
１２回上昇展開を行ったのち、硫酸を噴霧してマルトテ
トラオースの有無を検索し、マルトテトラオース生成酵
素生産株を分離することができた。
−プロパツール／水（３１５／４）の溶媒系で６０″Ｃ
１２回上昇展開を行ったのち、硫酸を噴霧してマルトテ
トラオースの有無を検索し、マルトテトラオース生成酵
素生産株を分離することができた。
得られたマルトテトラオース生成酵素生産菌株を単離し
、これをテトラサイクリン２０μｇ／ｄを含むし培地に
て３７°Ｃで培養した。培養液を遠心分離して集菌し、
洗浄後、分離菌体からアルカリ抽出法（Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ、 Ｈ，Ｃ，ａｎｄ Ｄｏｌｙ、 Ｊｅｔ Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ＾５ｉｄｓ Ｒｅｓ、、 ７．１５１３．（１９
７９））によってプラスミドを分離し、新規なプラスミ
ドを得た。このプラスミドをプラスミドｐＧＦ１１と名
づけた。
、これをテトラサイクリン２０μｇ／ｄを含むし培地に
て３７°Ｃで培養した。培養液を遠心分離して集菌し、
洗浄後、分離菌体からアルカリ抽出法（Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ、 Ｈ，Ｃ，ａｎｄ Ｄｏｌｙ、 Ｊｅｔ Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ＾５ｉｄｓ Ｒｅｓ、、 ７．１５１３．（１９
７９））によってプラスミドを分離し、新規なプラスミ
ドを得た。このプラスミドをプラスミドｐＧＦ１１と名
づけた。
プラスミドｐＧＦ１１は８．ＯＫｂの大きさで、そのフ
ィジカルマツプを第２図に示す。ここで白ぬきの部分は
ベクターｐＨＹ３００ＰＬに由来で、黒塗りの部分は染
色体断片部分である Ａ１１ｌ ｒはアンピシリン耐性
Ｔｃ ｒはテトラサイクリン耐性を示し、他の各略記
号はすべて制限酵素の切断認識部位である。
ィジカルマツプを第２図に示す。ここで白ぬきの部分は
ベクターｐＨＹ３００ＰＬに由来で、黒塗りの部分は染
色体断片部分である Ａ１１ｌ ｒはアンピシリン耐性
Ｔｃ ｒはテトラサイクリン耐性を示し、他の各略記
号はすべて制限酵素の切断認識部位である。
プラスミドｐＧＦ１１で形質転換されたバチルス・ズブ
チリス（Ｂａｔｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉ１ｉｓ）ＩＳＷ
１２１４−１）ＧＰＩＩは工業技術院微生物工業技術研
究所にＦＥＲＭ Ｐ−１０４１２として寄託されている
。
チリス（Ｂａｔｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉ１ｉｓ）ＩＳＷ
１２１４−１）ＧＰＩＩは工業技術院微生物工業技術研
究所にＦＥＲＭ Ｐ−１０４１２として寄託されている
。
、：：（７） ｐＧＦｌｌ ＤＮＡをＸｈｏｌ （宝酒
造社製）で切断し、２．３Ｋｂの断片を得る。この断片
を３２ｐでラベルし、ブシュ−トモナス・サツ力ロフイ
ラＩＡＭ１５０４株染色体ＤＮＡ、バチルス・ズブチリ
スｌ５Ｗ１２１４株染色体ＤＮＡおよびλＧＦ１０２
ＯＮへのそれぞれのＸｈｏ１分解物とサザンハイブリダ
イゼーション（Ｓａｕｔｈｅｒｎ、 Ｅ、 Ｍ、。
造社製）で切断し、２．３Ｋｂの断片を得る。この断片
を３２ｐでラベルし、ブシュ−トモナス・サツ力ロフイ
ラＩＡＭ１５０４株染色体ＤＮＡ、バチルス・ズブチリ
スｌ５Ｗ１２１４株染色体ＤＮＡおよびλＧＦ１０２
ＯＮへのそれぞれのＸｈｏ１分解物とサザンハイブリダ
イゼーション（Ｓａｕｔｈｅｒｎ、 Ｅ、 Ｍ、。
Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ！、＋匣、 ５０３．（１９７
５））を行った。バチルス・ズブチリス株染色体ＤＮＡ
とは全くノ＼イブリダイズしなかったが、ブシュ−トモ
ナス・サツ力ロフィラ■へＭ１５０４株染色体ＤＮＡお
よびλＧＦ１０２ＯＮ＾には特異的にハイブリダイズす
る２、 ３ Ｋｂのバンドが見いだされた。このことか
らクローン化したＤＮＡはブシュ−トモナス・サツカロ
フイラＩＡＭ１５０４株由来であることが確かめられた
。
５））を行った。バチルス・ズブチリス株染色体ＤＮＡ
とは全くノ＼イブリダイズしなかったが、ブシュ−トモ
ナス・サツ力ロフィラ■へＭ１５０４株染色体ＤＮＡお
よびλＧＦ１０２ＯＮ＾には特異的にハイブリダイズす
る２、 ３ Ｋｂのバンドが見いだされた。このことか
らクローン化したＤＮＡはブシュ−トモナス・サツカロ
フイラＩＡＭ１５０４株由来であることが確かめられた
。
実施例２ プラスミドｐＵＢ１１０ＥＸを用いたバチル
ス・ズブチリスＮＡ６４株へのマルトテトラオース生成
酵素遺伝子の再クロー ン化 実施例１で得られたｐＧＦｌｌに制限酵素Ｘｈｏｌを作
用させた。この反応液を０．７％アガロース電気泳動に
供し、そこに観察される５、 ５ Ｘｂ ＤＮＡとマル
トテトラオース生成酵素遺伝子を含む２．３ ＫｂＤＮ
Ａのうち、２，３にｂ ＤＮＡのみを市販のＤＮＡ精製
キットＧＥＮＥＣＬＥＡＮ” （フナコシ社製）により
回収精製した。遺伝子の導入はバチルス・ズブチリスＮ
＾６４を宿主、プラスミドｐＵＢ１１０ＥＸ（４，５に
ｂ）をベクターニ用いた。ｐＵＢｌｌｏＥＸはプラスミ
ドｐＵＢ１１０のＥｃｏＲ１部位にＸｈｏｌリンカ−（
宝酒造社製）を挿入したプラスミド誘導体である。この
ｐＵＢｌｌｏＥＸにＸｈｏｌを作用させた後、アルカリ
フォスファターゼで処理し、さきに回収精製したマルト
テトラオース精製酵素遺伝子を含む２． ：ｌｂ ＤＮ
Ａ断片を混合し、Ｔ４０Ｎ＾リガーゼを添加して連結処
理した。
ス・ズブチリスＮＡ６４株へのマルトテトラオース生成
酵素遺伝子の再クロー ン化 実施例１で得られたｐＧＦｌｌに制限酵素Ｘｈｏｌを作
用させた。この反応液を０．７％アガロース電気泳動に
供し、そこに観察される５、 ５ Ｘｂ ＤＮＡとマル
トテトラオース生成酵素遺伝子を含む２．３ ＫｂＤＮ
Ａのうち、２，３にｂ ＤＮＡのみを市販のＤＮＡ精製
キットＧＥＮＥＣＬＥＡＮ” （フナコシ社製）により
回収精製した。遺伝子の導入はバチルス・ズブチリスＮ
＾６４を宿主、プラスミドｐＵＢ１１０ＥＸ（４，５に
ｂ）をベクターニ用いた。ｐＵＢｌｌｏＥＸはプラスミ
ドｐＵＢ１１０のＥｃｏＲ１部位にＸｈｏｌリンカ−（
宝酒造社製）を挿入したプラスミド誘導体である。この
ｐＵＢｌｌｏＥＸにＸｈｏｌを作用させた後、アルカリ
フォスファターゼで処理し、さきに回収精製したマルト
テトラオース精製酵素遺伝子を含む２． ：ｌｂ ＤＮ
Ａ断片を混合し、Ｔ４０Ｎ＾リガーゼを添加して連結処
理した。
この処理液を用いてバチルス・ズブチリスＮＡ６４株へ
コンピテントセル法（Ｇｒｙｃｚａｎ＋ Ｔ、 Ｊ、、
Ｃｏｎｔｅｎｔｅ。
コンピテントセル法（Ｇｒｙｃｚａｎ＋ Ｔ、 Ｊ、、
Ｃｏｎｔｅｎｔｅ。
Ｓ、 ａｎｄ Ｄｕｂｎａｕ、 Ｄ、、 Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、、 １３４＋ ３１８゜（１９７ｇ））に
より導入した。
ｅｒｉｏｌ、、 １３４＋ ３１８゜（１９７ｇ））に
より導入した。
得られた形質転換処理菌体を選択培地である１％可溶性
澱粉およびカナマイシンｌＯａｇ／ｍｌを含むＬＧ培地
（バタトトリブトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｊ
２５ｇ、グルコース２ｇを１１の水に溶解）にて３７°
Ｃで２４時間培養し、培養液中のマルトテトラオース生
成酵素活性の有無を、実施例１と同様薄層クロマトグラ
フィーによって調べた。その結果、マルトテトラオース
生成酵素分泌株を分７離することができた。
澱粉およびカナマイシンｌＯａｇ／ｍｌを含むＬＧ培地
（バタトトリブトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｊ
２５ｇ、グルコース２ｇを１１の水に溶解）にて３７°
Ｃで２４時間培養し、培養液中のマルトテトラオース生
成酵素活性の有無を、実施例１と同様薄層クロマトグラ
フィーによって調べた。その結果、マルトテトラオース
生成酵素分泌株を分７離することができた。
得られたマルトテトラオース生成酵素生産株を、カナマ
イシン１０ ｔｔ ｇ／ｄを含むＬＧ培地にて３７°Ｃ
で培養し、培養液を遠心分離して集菌し、洗浄後、分離
菌体からアルカリ抽出法によってプラスミドを分離した
。このプラスミドをプラスミドｐＨ３ＤＯ１と名づけた
。
イシン１０ ｔｔ ｇ／ｄを含むＬＧ培地にて３７°Ｃ
で培養し、培養液を遠心分離して集菌し、洗浄後、分離
菌体からアルカリ抽出法によってプラスミドを分離した
。このプラスミドをプラスミドｐＨ３ＤＯ１と名づけた
。
プラスミドｐＨ５ＤＱＩは６．９ Ｋｂの大きさで、そ
のフィジカルマツプを第３図に示す。ここで白ぬきの部
分はベクターｐＵＢ１１０ＥＸ由来で、黒塗りの部分は
染色体断片部分であり、Ｋｍ’ （ｎｅｏ’）はカナマ
イシン耐性およびネオマイシン耐性を示す。その他の各
略記号はすべて制限酵素である。
のフィジカルマツプを第３図に示す。ここで白ぬきの部
分はベクターｐＵＢ１１０ＥＸ由来で、黒塗りの部分は
染色体断片部分であり、Ｋｍ’ （ｎｅｏ’）はカナマ
イシン耐性およびネオマイシン耐性を示す。その他の各
略記号はすべて制限酵素である。
プラスミドｐＨ５ＤＯ１で形質転換されたバチルス・ズ
ブチリス（Ｂａｃｈ ｉ ｌ Ｉｕｓ 剋■ｕｎ） Ｎ
Ａ６４− ｐＨ５ＤＯ１は工業技術院微生物工業技術研
究所にＦＥＲＭ Ｐ−１０４１３として寄託されている
。
ブチリス（Ｂａｃｈ ｉ ｌ Ｉｕｓ 剋■ｕｎ） Ｎ
Ａ６４− ｐＨ５ＤＯ１は工業技術院微生物工業技術研
究所にＦＥＲＭ Ｐ−１０４１３として寄託されている
。
（発明の効果）
本発明によりマルトテトラオース生成酵素遺伝子を種々
のベクターに組み込んで宿主微生物に導入した新規組替
え体微生物を得、この組替え体微生物が安定的にマルト
テトラオース生成酵素活性を有するポリペプチドを生産
することを見いだした。本発明によればマルトテトラオ
ース生成酵素活性を有するポリペプチドの供給量の増大
を図り得ることとなり、その果たす意義は大きい。
のベクターに組み込んで宿主微生物に導入した新規組替
え体微生物を得、この組替え体微生物が安定的にマルト
テトラオース生成酵素活性を有するポリペプチドを生産
することを見いだした。本発明によればマルトテトラオ
ース生成酵素活性を有するポリペプチドの供給量の増大
を図り得ることとなり、その果たす意義は大きい。
第１図はファージλＧＦ１０２のフィジカルマツプ、第
２図はプラスミドｐＧＦ１１のフィジカルマツプ、第３
図はプラスミドｐ）１５００１のフィジカルマツプをそ
れぞれ示している。 第 Ｘｈｏ Ｉ 手続主甫正書（自発） 平成１年６月１ 日
２図はプラスミドｐＧＦ１１のフィジカルマツプ、第３
図はプラスミドｐ）１５００１のフィジカルマツプをそ
れぞれ示している。 第 Ｘｈｏ Ｉ 手続主甫正書（自発） 平成１年６月１ 日
Claims (1)
- マルトテトラオース生成酵素を生産するバチルス・スブ
チリス。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4331389A JPH02222675A (ja) | 1989-02-27 | 1989-02-27 | 変異枯草菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4331389A JPH02222675A (ja) | 1989-02-27 | 1989-02-27 | 変異枯草菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02222675A true JPH02222675A (ja) | 1990-09-05 |
| JPH0533028B2 JPH0533028B2 (ja) | 1993-05-18 |
Family
ID=12660314
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4331389A Granted JPH02222675A (ja) | 1989-02-27 | 1989-02-27 | 変異枯草菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02222675A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2026045942A1 (zh) * | 2024-08-29 | 2026-03-05 | 江南大学 | 一种枯草芽孢杆菌发酵生产直链麦芽四糖生成酶的方法 |
-
1989
- 1989-02-27 JP JP4331389A patent/JPH02222675A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2026045942A1 (zh) * | 2024-08-29 | 2026-03-05 | 江南大学 | 一种枯草芽孢杆菌发酵生产直链麦芽四糖生成酶的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0533028B2 (ja) | 1993-05-18 |
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Legal Events
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