JPS6167486A - 新規クレアチンアミジノハイドロラ−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分計 本発明は微生物の生産する新規酵素クレアチンアミジノ
ハイドロラーゼに関する。特にアシネトバクタ−（Ａｃ
１ｕ＠ｔｏｂａｃｔ＠ｒ　）　Ｊｌ、？イクロコッカス
（Ｍｉａｒｏａｏａａｕｓ　）属、コリネバクテリウム
（０ｏｒｙｎ＠ｂａａｔ＠ｒｉｕｍ　）属、バチルス（
ＢＩＬ（ｌｉｌｌｕｓ　）属、アクチノバチルス（Ａｃ
ｔｉｎｏｂａａｉｌｌｕｇ　）　３％に属する菌株の生
産する新規酵素クレアチンアミジノハイドロラーゼに関
する。

従来技術とその問題点 クレアチン怠よびクレアチニンは人間の血液または尿中
に見出され、その量を迅速かつ正確に検出測定すること
は人間の病蔦、例えば尿毒症、慢性腎炎、急性腎炎、巨
人症、強直性筋異・栄養症等を診断するのに非常に重要
である。

クレアチニン詔よびクレアチンの定量法としては（１）
ピクリン酸を用いるヤッフェ反応に基づく化学的定量法
および（２）クレアチニンディミナーゼを用いる酵素的
定量法が知られている。この中上記（１）の方法は煮沸
操作を必要とすること、およびクレアチンおよびクレア
チニンに対する特異性が低い等の欠点を有している。ま
た上記（２）の方法は内因性アンモニアの作用を受ける
ので正確性に欠ける等の問題点があり、迅速かつ正確な
方法とは言えない。

上記（１〕および（２）に代る方法としてクレアチニン
アミドバイトラーゼおよびクレアチンアミジノハイドロ
ラーゼを用いる酵素的定量方法がある。これらの中クレ
アチンアミジノハイドロラーゼはクレアチンを加水分解
してサルコシンと尿素を生成させ−る酵素である。従っ
て生成するサルコシンをサルコシンデヒドロゲナーゼま
たはサルコシンオキシダーゼを用いる方法により測定す
れば人間の血液中または尿中のクレアチンの量を知るこ
とができ、上述した各種の病気の診断に利用することが
できる。

クレアチンアミジノハイドロラーゼは微生物界に広く見
出されており、既に工業的にも製造クレアチンアミトノ
ハイドロラーゼを生産する菌株としては今までに次の如
き菌株が知られている。

シュードモナス拳アエルギノーサ（Ｐｓｏｕｄｏｍｏｎ
ａｇａｓｒｕｇｉｎｏｓａ　）　（Ｋｏｐｐ句ｒ、Ｐ、
Ｈ，ＨＲｏｂｉｎ、　Ｌ、；Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｏｈｓｍ　、第２６巻、第４５８頁、１９５０年
）。

シュードモナス・オバリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ＆５ｏ
ｖａｌｉｓ）　（Ａｐｐｌｓｙａｒｄ　、　Ｇ、ＨＷｏ
ｏｄ、　Ｄ、Ｄ、；Ｊ、Ｇｅｍ。

ＭｉｃｒｏｂｌｏＩＬ、第１４春、第３５１頁、１９５
６年）。

シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕ４ｏｍｏｎａｓ　ｐ
ｕｔｉｄａ）（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ、Ｔ、；　Ｏｋａ、
ニーＩ　Ｔｓｕｒｕ、　Ｄ、；Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈ＠ｍ、　Ｂｉ、ｏｐｈｙｓ、第１７７巻、第
５０８頁、１９７６年）。

アースロバフタ−・ウレアファシェンス（ＩＣａｐｌａ
ｎｙ　　人、ｉ　　Ｎａｕｇｌｅｒ、Ｄ、Ｉ　　Ｍｏ１
．　０ｅｌｌ　　Ｂｉｏａｈｅｍ。

第３巻、第９頁、１９７４年）。

フラボバクテリウム（ＸＦｌｏｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　）属、マイクロコツカス（Ｍｉａｒｏｏｏａａｕ＋ｓ
　）属（特開昭５．１−１１８８８４号）。

アルカリゲネス（ＡＩＣａｌ１ｇ＠ｎｅｓ　）属、ペニ
シリウム（Ｐｅｎｉａｉｌｌｉｕｍ　）属（特開昭４７
−４３２８１号）。

しかしながら上述した公知の各種菌株から製造された、
クレアチンアミジノハイドロラーゼは至適ｐｇ範囲が７
．５〜８．５と非常に狭く、熱安定性が４０°Ｃ以下で
あって熱に対して不安定であり、にｍ値が例えば２．９
　Ｘ　１０−”　Ｍと大きく、ｐＨ安定性も４．５〜８
．５で狭いという欠点を育していた。このため至・ａｔ
ｐＨ範囲が広く、熱安定性が優れ、しかもＫｍ値の小さ
いクレアチンアミジノハイドロラーゼが述められている
。

発明の目的 本発明は従って至適ｐＨ範囲が広く、熱安定性に優れ、
ら値の小さいクレアチンアミジノハイドロラーゼを提供
することにある。

発明の構成 本発明は下記の理化学的性質を有する親規クレアチンア
ミジノハイドロラーゼにある。

（ａ）作用：１モルのクレアチンを加水分解して、１モ
ルのサルコシンと１モルの尿素を生成する。゛ （ｂ）基質特異性：クレアチンに特異的に作用する。

（ａ）至適ｐＨ：　７．Ｏ〜９．Ｏ。

（ｄ）至適温度：３５°ｃ〜４５°ｃ０（ｅ）　ｐＨ安
定性：２５”０，１７時間の処理でｐＨ４，５〜８．５
で安定。

（ｒ）　熱安定性：　ｐＨ７，５，３０分間の処理で５
０′ｃまで安定。

（ｇ）　Ｖｍ害剤：　ＡｇＮ０．、Ｈｇ０１．．０ｕ３
０４等。

（ｈＪ　Ｋｍ値：（２，０ｆ−０，５）　Ｘ　１０−”
Ｍ。

（１）分子ｊｌ：　１０００００±５０００　（ケル濾
過法による）。

本発明による上述した理化学的性質を有する新規クレア
チンアミジノハイドロラーゼは、かかる酵素を生産する
能力を有する微生物菌株を栄養培地にて生育させ、培養
物中主として菌体内に上記酵素を生成蓄槽せしめ、これ
を採取することにより得ることができる 本発明で使用しつる微生物としては、アシネトバクタ−
（Ａａｉｎｅｔｏｂａｏｔａｒ　　）、＠ｓアクチノバ
チルス（Ａａｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　）マイクロコ
ツカス（Ｍｉｃｒｏａｏｃｃｕｓ　）属・コリネバクテ
リウム（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）属および
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）　ｊＱに属する微生物
菌株がある。特に本発明者等が福井県敦賀市の土塀より
採取したアシネトバクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｏｔｅ
ｒ）ＯＲＨ−１０４０株、アクチノバチルス（Ａｏｔｉ
ｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　）ＯＲＨ−１２７１株、マイク
ロコツカス（ＩｉＬｉａｒｏｃｏｃｃｕｓ　）ＯＲＨ−
１０９３株、コリネバクテリウム（Ｏｏｒｙｎｅｂａｏ
ｔｅｒｉｕｍ　）ＯＲＨ−１２６８株およびバチルス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＯＲＨ−１２８１株を挙げることが
できる。

上記各菌株の菌学的性質右よび同定の準拠は次のとおり
である。菌学的性質の同定のための実験法は主として長
谷用武治編著「微生物の分類と同定」学会出版センター
（１９７５年）によって行なった。また分類同定の基準
としてバーシーズ・マニュアルＯオプ拳デターミネイテ
ィブ・バクテリオロジー第８版（１９７４年）を参考に
した。

以下に上記各菌株の菌学的性質を示す。

〔アシネトバクタ−（Ａｃ１ｎｅｔｏｂａａｔｅｒ　）
　　ＯＲＨ−（ａ）形態 肉汁寒天培地に３０”Ｏで２０時間培養して大きさく１
．０〜１．５メ）Ｘ（１，５Ｘ２．０））の桿菌であり
、ダラム染色は陰性であり、運動性はない。

（ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 ３０℃、４８時間で直径３〜５ｇＩＩの円形のコロニー
を形成する。表面は平滑で光沢があり、隆起は凸円状、
コロニーは均質不透明で淡いクリーム色で、可溶性色素
は形成しない。

（２）肉汁寒天斜面培養 ３０℃、２０時間で糸状良好な生育を示す。コロニーは
淡いクリーム色である。

（３］肉汁液体培養 ３０℃１１６時間振擾培養にて生育し、濁化する。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養 ３０℃、１６時間培養にて生育し、ゼラチン液化能はな
い。

（５）リ　トマス・ミルク 変化なし。

（ｃ）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元；陰性 （２）脱窒反応；陰性 （３１ＭＲテスト；陰性 （４）　ＶＰテスト；陽性 （５）インドールの生成；陰性 （６）硫化水素の生成；陰性 （７）デンプンの加水分解；陰性 （８〕クエン酸の利用；陰性 （９）無機窒素源の利用；陰性 αＯ）色素の生成；なし く１１）ウレアーゼ；陽性 α２）オキシダーゼ；陰性 α３）カタラーゼ；陽性 （１４）生育の範囲；生育温度１５〜３０℃１至適　゛
温度２０〜２５℃、生育ｐＨ ５、０〜８．Ｏ１至適ｐＭｇ、Ｑ〜７．５α５）酸素に
対する態度；好気性 α６）Ｏ−Ｆテスト；酸化 α７）糖からの酸の生成；Ｄ−フラクトース、ｐ−がラ
クトース、麦芽 糖、乳糖、−１）シンルビット、 Ｄ−マンニット、イノ ジット等から歳を生成 する。

α９その他 アルギニンの分解；陰性 リジンの脱炭酸反応；陽性 オルニチンの脱炭酸側１陰性 前記文献および上記菌学的性質からＯＲＨ−１０４０株
はアシネトバクタ−属に属するとみなされる。しかしな
がら前記文献には上記菌種の蘭学的性質は多くは記載さ
れていない。アシネトバクタ−・カルコアセチカス（Ａ
Ｃｉｎ■ｏｂａｃｔｅｒλ１ａｏａａｅｔｉｃｕｓ　）
とよく一致するが、リジン脱炭酸反応の点に詔いて相異
が認められる。従って本菌株はアシネトバクタ−（Ａａ
ｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　）ＯＲ１（−１０４０株と命
名した。ホロは工業技術院微生物工業研究所に微生物受
託番号機工研究コ菌寄第７７１８号として寄託されてい
る。

〔アクチノバチルス（Ａａｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　
）　０ＲＨ−１２７１’ｌ：１ （ａ）形態 肉汁寒天培地に３０°Ｃで２０時間培養して大きさく０
，３〜ｏ、　ｓ　、１１＞　ｘ　（ｏ、　ｓ〜１．０ｆ
ｉ）の桿菌であり、ダラム染色は陰性であり、運動性は
ない。

（ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 ３０’０１４８時間で直径３〜５ｉｍの円形のコロニー
を形成する。表面は平滑で光沢があり、隆起は凸円状、
コロニーは均質不透明でクリーム色で可溶性色素は形成
しない。

（２１肉汁寒天斜面培養 ３０℃、２０時間で糸状良好な生育を承す。コロニーは
クリーム色でバター質である。

（３）肉汁液体培養 ３０°Ｃ％１６時間振ｌ培養にて生育し、濁化する。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養 ３０’（！、１６時間培養で生育し、ゼラチン液化能は
ない。

（５）リ　トマス拳ミルり 酸性となり、凝固反応する。

（（＋）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元；陽性 （２Ｊ脱窒反応；陰性 （３）　ＭＲテスト；陰性 （４）ｖｐテスト；陰性 （５）インドールの生成；陰性 （６）　ｖｔ化水素の生成寥陰性 （７）デンプンの加水分解；陰性 （８）クエン酸の利用；陰性 （９）無機窒素源の利用；陽性 α０）色素の生成；なし α１）ウレアーゼ；陽性 ０２）オキシダーゼ；陽性 （１３）カタラーゼ；陽性 α４）生育の範囲；生育温度１５〜４５℃、至適温度２
５〜３５℃、生育ｐＨ ５，０〜８．０、至ｉｉ！ｉ　ｐＨ６，０〜７．５ α５）！！素に対する態度；好気性 α６）ｏ−ｙテスト↓発酵 α７）糖からの酸の生成；Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラ
クトース、麦芽 糖、ショ糖、乳糖、ト レハロース、Ｄ−ソル ビット、Ｄ−マンニラ ト、イノジッド等から 酸を生成する。

α８）その他 アルギニンの分解；陽性、 リジンの脱炭酸反応；陽性 オルニチンの脱炭酸反応；陰性 前記文献セよび上記菌学的性質から（！ＲＨ−１２７１
株はアクチノバチルス（Ａａｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ
）属に属するものとみなされる。しかしながら前記文献
には上記菌種の菌学的性質は多くは記載されていない。

アクチノバチルス・エクリー（Ａｃｔｉｎｏｂａａｉｌ
ｌｕｓ　ａｑｕｕｌｉ　）とよく一致するがゼラチンの
液化能の点において相異が認められる。

従って本菌株はアクチノバチルス（Ａａｔｉｎｏｂａａ
ｉｌｌｕｓ）ＯＲＨ−１２７１株と命名した。ホロは工
業技術院微生物工業研、でに微生物受託番号微工研菌寄
第７７２１号として寄託されている。

〔マイクロコツカス（’ｕｉａｒｏａｏｏｏｕｓ　）　
Ｃ！Ｆ、Ｈ−１０９３〕 （ａ）形態 肉汁寒天培地に３０′Ｃで２０時間培養し′Ｃ１大きさ
０．３・〜１゜Ｏｆｉの球菌であり、ダラム染色は陽性
であり、運動性はない。

（ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 ３０″０１４８時間で直径３〜５Ｗｌ１１１の円形のコ
ロニーを形成する。表面は平滑で光沢があり、隆起は凸
円状、コロニーは均質不透明であり、淡いクリーム色で
可溶性色素は形成しない。

（２）肉汁寒天斜面培養 ３０°Ｃｌ２Ｏ時間で糸状良好な生育を示す。コロニー
は淡いクリーム色である。

（３）肉汁液体培養 ３０’Ｃ，１６時間で振−培養にて生育し、濁化する。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養 ３０℃、１６時間培養にて生育し、ゼラチン液化能はな
い。

（５）リドマス・ミルク 変化なし くｃ）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元；陰性 （２）脱窒反応；陰性 （３）　ＭＲテスト；陰性 （４１ＶＰテスト；陰性 （５）インドールの生成；陰性 （６）硫化水素の生成；陰性 （７）デンプンの加水分解；陰性 （８）クエン酸の利用；陰性 （９）無機窒素源の利用；陰性 αＯ）色素の生成；なし αυウレアーゼ；陽性 αのオキシダーゼ；陰性 αΦカタラーゼ；陽性 （１ル生育の範囲一生育温度１５〜３０”Ｃ，至適温度
２５〜３０℃、生育ｐ）１５ 、０〜８，０１至適ｐＨ６，ＯＡ−７，５α９酸素に対
する態度；好気性 （１６）Ｏ−ＩＦテスト；酸化、発酵ともにしないαつ
糖からの醸の生成層Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンチット、
イノジッ ト等から酸を生成する。

α０その他 アルギニンの分解；陰性 リジンの脱炭酸反応；陽性 オルニチンの脱炭酸反応；陰性 前記文献およ・び上記菌学的性質からＯＲＨ−１０９３
株はマイクロコツカス属に属するとみなされる。しかし
ながら前記文献には上記菌種の菌学的性質は多くは記載
されていない。マイクロコツカスｌｌルナウス（Ｍｉｃ
ｒｏｃｏｃｏｕ８１ｕｔｅｕｓ）とよく一致する。従っ
て本菌株はマイク゛ロコツカス書ルテウス（Ｍｉａｒｏ
ｏｏｃｃｕｓ　１ｕｔｅｕｓ　）の変種と考えられる。

従って本菌株はマイクロコツカス属トＭｉｃｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ　）　ＯＲＢ　−１０９３株と命名した。ホロは
工業技術院微生物工業研究所；こ微生物受託番号微工研
菌寄第７７１９号として寄託されている。

〔コリネバクテリウム（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）ＯＲＨ−ｘｚ６８） （ａ）形態 肉汁寒天培地に３０°Ｃで２０時間培養して、大きさく
０．３〜０．５声）×（１，０〜２．０声）へ憔胡予七
ｈ　グうム泌色は陽性であり、運動性はない。

（ｂ）各培地に詔ける生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 ３０’Ｃ，４８時間で直径３〜５ｗｓの円形のコロニー
を形成する。表面は平滑で光沢があり、隆起は凸円状、
コロニーは均質不透明で淡いクリーム色で可溶性色素は
形成しない。

（２）肉汁寒天斜面培養 ３０°０，２０時間で糸状良好な生育を示す。コロニー
は淡いクリーム色である。

（３）肉汁液体培養 ３０℃、１６時間振婦培養にて生育し、濁化する。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養 ３０℃、１６時間培養に生育し、ゼラチ液化能はない。

（５）リドマスｅミルク 変化しない （ｃ）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元；陰性 （２）脱窒反応；陰性 （３）　ＭＲテスト：陰性 （４）ＶＰ　　テス　ト　；　陰性 （５）インドールの生成；陰性 （６）硫化水素の生成；陰性 （７）デンプンの加水分解；陽性 （８）クエン酸の利用；陰性 （９）無機窒素源の利用；陰性 （１０１色素の生成；なし αυウレアーゼ；険性 αのオキシダーゼ；陰性 α３）カタラーゼ；陽性 αつ生育の範囲；生育温度１５〜４５℃、至適温度２５
〜３５℃、生育ｐＨ ５、０〜１０．０．至適ｐＨ６，８〜 ８．５ α５）酸素に対する態度；好気性 α６）Ｏ−ＩＦテスト；発酵 αＤ糖からの酸の生成；Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラク
トース、Ｄ− キシロース、麦芽糖、 ショ糖、乳糖、マンノ ース、フラクトース、 トレハロース、ローン ルビット、Ｄ−ソルビ ビット、Ｄ−マンニラ ト、イノンット等から 酸を生成する。

αｅその他 アルギニンの分解；陽性 リジンの脱炭酸反応：陰性 オルニチンの脱炭酸反応；陰性 前記文献および上記菌学的性質からＯＲＨ−１２６８株
はコリネバクテリウム（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）属に属するとみなされる。従って本菌株はコリ子ネ
バクテリウム（０ａｒｙｎ＠ｂ＆ａｔｅｒｉｕｍ　）　
ＯＲＨ−１２６８株と命名した。重囲は工業技術院微生
物工業研究所に微生物寄託番号微工研菌寄第７７２０号
として寄託されている。

〔バチ／Ｌ／　ｘ　（Ｂａａｉｌｌｕｓ　）　（ＪＲＨ
−１２８１）（ＩＬ）形態 肉汁寒天培地に３０’Ｃで２０時間培養して、大きさく
　０．３　Ｘ　Ｏ，５ｆｉ　）　Ｘ　（０，５〜１．０
７１）の桿菌であり、ダラム染色は陽性であり、運動性
はない。

（ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 ３０℃、４８時間で直径３〜５態の円形のコロニーを形
成する。表面は平滑で光沢があり、隆起は凸円状、コロ
ニーは均質不透明で淡いクリーム色で可溶性色素は形成
しない。

（２）肉汁寒天斜面培養 ３０’Ｃ，２０時間で糸状良好な生育を示す。コロニー
は淡いクリーム色でバター質である。

（３）肉汁液体培養 ３０℃、１６時間振掃培養にて生育し、濁化する。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養 ３０℃、１６時間培養で生育し、ゼラチン液化能はない
。

（５）リドマス・ミルク 変化なし く０）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元；陰性 （２Ｊ脱窒反応；陰性 （３）　ＭＲテスト；陰性 （４）　ＶＰテスト；陰性 Ｇ）インドールの生成；陰性 （６）硫化水素の生成；陰性 （７）デンプンの加水分解り陰性 （８）クエン酸の利用；陽性 （９）無機窒素源の利用；陽性 α０）色素の生成；なし αυウレアーゼ；陰性 α２）オキシダーゼ；陰性 α■カタラーゼ；陽性 αく生育の範ＦＭｉ；生育温度１５〜３５℃、至適温度
２０〜３０’Ｃ，生育ｐＨ ５，０〜１０．０、至適ｐｉ（６，Ｏ〜７．５ （１５）酸素に対する態度；好気性 （１ｆ５）Ｏ−Ｆテスト：酸化 （１７１％からの酸の生成；Ｌ−アラビノース、Ｄ−キ
シロース、Ｄ−マ ンノース、Ｄ−フラグ トース、Ｄ−ソルビン ト、Ｄ−マンニラ　ト、 イノジット等から酸を 生成する。

（１ａ）その他 アルギニンの分解；陽性 リジン脱炭酸反応；陽性 オルニチンの脱炭酸反応；陰性 前記文献および上記菌学的性質からＯＲＨ−１２８１株
はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）属に属するものとみ
なされる。従って本菌株はノイチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　）　ＯＲＨ−１２８１と命名した。ホロは工業技術
院微生物工業研究所に微生物受託番号微工研菌寄第７７
２２号として寄託されている。

本発明の新規クレアチンアミジノハイドロラーゼを得る
に当っては、上述した各菌株を通常の栄養培地で培養し
、培養物特に菌体中に生産蓄積させ、これから採取する
ことができる。使用しうる栄養培地としては好ましくは
クレアチニン、クレアチンまたはそれらの誘導体を用い
た培地で生育させるとよい。栄養培地の炭素源としては
クレアチニン、クレアチン、グリコース、シュクロース
、フラクトース、澱粉、廃糖蜜、アルコール類、有機酸
類が利用でき、天然栄養源としてはペプトン、肉エキス
、酵母エキス、コーンステイープリカー等が利用でき、
窒素源としてはクレアチニン、クレアチン、アンモ：７
．硫酸、硝安、塩安、尿素等が利用でき、無機塩類とし
てはリン酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、
硫酸マグネシウム等が利用できる。これらの栄養源はそ
れぞれ単独で用いることもできまた組合せて用いること
もてきる。

菌株を培養す６に当っては、通常振い培養または通気攪
拌培養で行なうことができる。一般に培養温度は２５〜
３５“Ｃ１培地ｐＨは６．５・〜７．５であるのが好ま
しく、通常１〜２日間培養を行なうと菌体中にクレアチ
ンアミジノハイドロラーゼが生成蓄積する。培養条件は
使用する菌株、培地組成等に応じてクレアチンアミジノ
ハイドロラーゼの生産量が最大になるように設定するこ
とは当然である。

上記方法（ζよって生成蓄積されたクレアチンアミジノ
ハイドロラーゼを採取するに当っては、培養液から遠心
分離、濾過等の操作により菌体を集め、集めた菌体をビ
ーズ破砕もしくは超音波破砕等の操作をして菌体中から
クレアチンアミジノハイドロラーゼを取り出す。かくし
て得られた粗酵Ｘ　’Ｗからクレアチンアミジノハイド
ロラーゼを単離するに当っては、通常の酵素精製に用い
られる方法を使用できる。例えば塩析、有償溶媒沈殿、
透析、等電点沈澱、イオン交換法、ゲル濾過等の方法を
組合せて使用できる。例えば粗酵素液を遠心分離し、上
清を得る。さらにその上清の硫安塩析画分（０，３５〜
０．５５飽和）を得る。−夜透析後、ＤＩＡＩ−セファ
ロースＯＩ。

４Ｂイオン交換体に吸着、溶出させる。活性画分を濃縮
後、セファアクリル８２００のゲル濾過を行なうことに
より高度に精製されたクレアチンアミジノハイドロラー
ゼを単離することができる。

本発明番とよる新規クレアチンアミジノハイドロラーゼ
は下記の酵素化学的および理化学的性質を有する。

（ａ）作用： １モルのクレアチンを加水分解し、１モルのサルコシン
と１モルの尿素を生成する。

（ｂ）基質特異性； クレアチンに特異的に作用する。

（Ｃ）至適ｐＨ： 本発明の酵素の至適ｐＨは第１図の実線で表わされる如
く、７．０〜９．０に高い活性を有している。

（ｄｌ至適温度： 本発明の酵素の至適温度は第２図の実線で表わされる如
く３５℃〜４５゛Ｃにある。

（ｅ）　ｐＨ安定性： 本発明の酵素を２５°ＣでそれぞれのｐＨで１７時間処
理したときのｐＨ安定性を第３図に実線で示す。第３図
より明らかな如く本発明の酵素はｐＨ４，５〜８．５の
間で安定である。

（ｆ）熱安定性： 本発明の酵素をｐＨ７，５でそれぞれの温度で３０分間
処理したときの熱安定性を第４図に示す。第４図から明
らかな如く、本発明の酵素は５０’ＣまＣ安定である。

なお第１図〜第４図において破線で示したものは公知の
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐ
ｕｔｉｄａ　）から得られたクレアチンアミジノハイド
ロラーゼの至適ｐＨ１至適温度、ｐＨ安定性および熱安
定性を示す曲線である。

（ｇｌ阻害剤： 本発明の酵素は下表１に示す如く硝酸銀、塩化水銀＠情
調で阻害された。

（ｈ）ら値： 本発明の酵素のｈ値は（２，０±Ｏ，Ｓ　）　Ｘ１０Ｍ
である。

（１）分子量： 本発明の酵素はセファアクリルＳ−２００を用いたゲル
濾過法で約１０００００±５０００である。

（ｊ）酵素活性測定法： 本発明の酵素活性の測定は下記条件下で１分間に１マイ
クロモルの黄色色素を生成する酵素活性を１単位とする
。

試薬： （Ａ）　０．１　Ｍクレアチン溶液（１，４９Ｆのクレ
アチンを５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，５に溶解し、１
００−とする）。

（Ｂ）　ＤＡＢ　溶液（２，Ｏｒのｐ−ジメチルアミノ
ベンズアルデニドを１００ｄのジメチルスルホキシドに
溶解させた後、濃塩酸１５ｍ１を加える）。

（０）酵素溶液（酵素標品を予め氷冷した５　０　ｍＭ
ｌす、・ン酸１ａ衝液ｐＨ７，５で１．０〜４．　ＯＵ
　／　ｍｌに稀釈する）。

手順： １、試験管に上記基質溶液（Ａ）　０．９　ｗＬｌを入
れ、３７”Ｃで約５分間予備加熱する。

２、上記酵素溶液（０）　０．１　ｍＪを加え反応を開
始する。

３．３７°Ｃで正確に１０分間反応させた後、上記ＤＡ
Ｂ溶液（Ｂ）　２．０−を加えて反応を停止させる。

４．２５℃で２０分間放置後４３５ｎｍにおける吸光度
を測定する（ＯＤｔｅｇｔ）。

５、盲検は上記基質溶液（Ａ）　０．９−を３７°Ｃで
１０分間放置後、上記ＤＡＢ溶液（Ｂ）　２．　Ｏａ（
を加えて混和し、次いで上記酵素溶液（０）　０．１　
ｍを加えて調製する。以下同様に２５°Ｃで２０分間放
置後吸光度を測定する（ｏＤ’ｂｌａｎｋ　）。

計算式： ％式％ ０．３２１＝黄色色素のミリモル分子吸光係数（ａｌ／
μＭ）１．０＝光路長一 実施例の説明 以下に本発明によるクレアチンアミ、ジノハイロラーゼ
の製造法を実施例を挙げて説明する。％は他に特記せぬ
限りＣｖ／′ｖ）％である。

実施例　１ 培地組成　０．２％クレアチン、０．５％ポリペプトン
、０．５％酵母エキス、１．４ ％　Ｋ、１（ＰＯ，，０，３％Ｋｌｌ　茸ＰＯａ、０．
０１％ＭｇＥＪＯ＊　　＠　　７　　ＨｓＯ，ｐＨ７，
０上記の培地５０１Ｌｌを５００１１１７の坂ロフラス
コに入れ、１２１℃で１０分間オートクレーブ殺菌する
。アシネトバクタ−（Ａａｌｎｅｔｏｂａａｔｅｒ　）
ＯＲＨ−１０４０（微工研菌寄第７７１８号）の１白金
耳上記培地に接種し３０″（：！、２０時間振掃培養し
、種培養液とする。別に同条件にて殺菌した培地６Ｌを
含む１０Ｌ容ジヤーフアメンターへ上記種培養液５Ｑｄ
を接種する。　　３００ｒｐｍ。

通気量３４／ｍｉｎ、　３０℃で１６時間培養する。

得られた培養液のクレアチンアミジノハイドロラーゼ活
性は０．５Ｕ／ｄであった。培養液６ｔを遠心分離し、
菌体を集め５０　ｍＭ’Ｊン酸緩衝波緩衝液し、ＩＬと
してビーズ破砕機（ダイノミルＫＤＬ　）により破砕す
る。菌体破砕液を遠心分離し、上清を得る。上清液に０
．３５飽和になるよう硫安を加え遠心分離し、上清を得
るもその上清液にさらに０．５５飽和になるよう硫安を
加え、遠心分離し、沈澱物を得る。５ＱｍＭリン酸緩衝
液ｐＨ７，５，２５０ｒｎｌに再溶解する。再溶解液を
５０ｍＭＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，５で平衡化したセファ
デックスＧ−２５カラム（２Ｌ）で脱塩する。脱塩液を
ＤＫＡＫ−セファロース０Ｌ−４Ｂカラム５０ｄに吸着
させ、０．４　Ｍ　　Ｍａｉｌにて溶出する。溶出液を
限外ｐ過にて濃縮し、セファアクリリルＳ−２００カラ
ムにて分子篩を行なう。活性画分の比活性は１５．３Ｕ
／Ｔｎ９蛋白であった。

実施例　２ 培地組成　０．２％クレアチン、０．５％ポリペプトン
、０．５％酵母エキス、１．４％ＫｊｌｉＰＯ＊、　０
．３　％　ＫＨｚｌ’Ｏｓ、０．１　％ＭｇＳＯ４・７
　Ｈ８０、ｐＨ７，９ 上記の培地５０ｒｎｌを５００１１Ｌｌの坂ロフラスコ
に入れ、１２１°Ｃで１０分間オートクレーブ殺３０℃
、２０″時間振儲培養し、種＃！養液とする。

別に同条件にて殺菌した培地６ｔを含む１０Ｊａ容ジヤ
ーフアメンターへ種培養液５０ａＪを種菌する。３００
ｒｐｍ、通気１３　Ｌ／　ｍｉｎ、　　３０℃で１６時
間培養する。得られた培養液のクレアチンアミジノハイ
ドロラーゼ活性は０．８ｔＴ／−であった。培養液６Ｌ
を遠心分離し、菌体を集め５０！ＩＩＭＩＪン酸緩衝液
に懸濁し１ｔとしてビーズ破砕機（ダイノミルＫＤＬ　
）により破砕する。

菌体破砕液を遠心分離し、上清を得る。上清液に０，３
５飽和になるよう硫安を加え遠心分離し、上清を得る。

その上清液にさらに０．５５飽和になるよう硫安を加え
遠心分離し、沈澱物を得る。

５ＱｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，５，２５０ｍｌに再溶解
する。再溶解液を５０ｍＭ’）ン酸緩衝液ｐｉ−１７，
５で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２ｔ）
で脱塩する。脱塩液を］）ＫＡＫ−セファロース０Ｌ−
４Ｂ力ラム５０ｍ１に吸着させ、Ｑ、４Ｍ　　Ｍａｉｌ
にて溶出する。溶出液を限外濾過にて濃縮し、セファア
クリルＳ−２００カラムにて分子篩を行なう。活性画分
の比活性は１８．ＩＵ／η蛋白であった。

実施例　３ 培地組成　０．２％り１／アチン、０．５％ポリペプト
ン、０．５％酵母エキス、１．４％ＫＩＨＰ０４．０．
３　％ＫＨ糞Ｐ０４．０．０１％Ｍｇ５Ｏ４ｅ　７　Ｈ
ｌ　Ｏ，ｐ）１７．０上記の培地５Ｑｍｌを５００１１
１１の坂ロフラスコに入れ、１２１°Ｃで１０分間オー
トクレーブ殺菌する。マイクロコツカス（Ｍｉｃ５ｏｃ
ｏａｃｕｓ　）　０ＲＨ−１０９３（微工研菌寄第７７
１９号）の１白金耳を上記培地に接種し３０°０，２０
時間振盪培養し、種培養液とす、る。別に同条件にて殺
菌した培地６ｔを含む１０を容ジャーファメンターへ上
記種培養液５０ｍノを接種する。３００．　ｒｐｍ、通
気１３　Ｌ／　ｍｉｎ、　３０°Ｃで１６時間培養する
。

得られた接養液のクレアチンアミジノハイドロラーゼ活
１性：は：、Ｉ　Ｏ，６５ｔｒ／ｍｊ！であった。培養
液６ｔを遠心分離し、菌体を集め５０ｍＭ！Ｊン酸緩衝
液に懸濁し、ＩＬとしてビーズ破砕機（グイレ ノミルＫＤＬ　）により破砕する。菌体破砕液を遠心分
離し、上清を得る。上清液に０．３５飽和になるよう硫
安を加え遠心分離し、上清を得る。

その上清液に更に０，５５飽和になるよう硫安を加え遠
心分離し、沈澱を得る。５０１！ＬＭ！Ｊン醗緩衝液ｐ
Ｈ７，５，２５０ｍ１に再溶解する。再溶解液を５０ｍ
ＭＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，５で平衡化したセファデック
スＧ−２５カラム（２Ｌ）で脱塩する。

脱塩液をＤＥＡＥｔ−セファロース０Ｌ−４Ｂカラム、
５０ｒＩＬｌに吸着させ、０．４　Ｍ　　Ｎａ０１にて
溶出する。

溶出液を限外濾過にて濃縮し、セファアクリルＳ　−２
００カラムにて分子篩を行なう。活性画分の比活性は１
７．８Ｕ／１１９蛋白であった。

実施例　４ 培地組成　０．２％クレアチン、０．５％ポリペプトン
、０．５％酵母エキス、１．４ ％に２１（ＰＯ，，０，３％ＫＨ嘗ＰＯ４，０，０１％
Ｍｇ５Ｏ４・７Ｈ２０、ｐＨ７，９ 上記の培地５Ｑｒｎｌを５０ＩＯｍ７！を坂ロフラスコ
に入れ、１２１’Ｃを１０分間オートクレーブ殺菌する
。コリネバクテリウム（Ｏｏｒｙｎｅｂａａｔｅｒｌｕ
ｍ　）ＯＲＨ−１２６８（微工研菌寄第７７２０号）の
１白金耳を上記培地に接種し３０″０，２０時間振い培
養し、種培養液とする。別に同条件にて殺菌した培地６
ｔを含む１０４容ジヤーフアメンターへ上記種培養液５
０ｒｕｌを接種する。３００ｒｐｍ　％通気Ｊｉｌ　３
　ｔ　／　ｍｉｎ、　　３０℃で１６時間培養する。得
られた培養液のタレアチンアミジノハイドロラーゼ活性
はＱ、　ｇ　５　Ｕ　／１ｎｔであった。

￥養液６ｔを遠心分離し、菌体を集め５０ｍＭ！Ｊン酸
緩衝液に懸濁し１ｔとしてビーズ破砕機（硫安を加え遠
心分離し、上清を得る。その上清液にさらに０，５５飽
和になるよう硫安を加え遠心分離し、沈澱を得る。５０
ｍＭＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，５２５０１Ｌｌに再溶解す
る。再溶解液を５０ｍＭＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，５で平
衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２ｔ）で脱塩
する。脱塩液をＤＫＡ］１Ｔｈ−セファロース０Ｌ−４
Ｂ力ラム５０ｍ１に吸着させ、Ｑ、４ＭＮａ０Ｌにて溶
出する。溶出液を限外濾過にて濃縮し、セファアクリル
Ｓ−２００カラムにて分子篩を行なう。活性画分の比活
性は１７．６υ／岬蛋白であった。

実施例　５ 培地組成　０．２％クレアチン、０．５％ポリペプトン
、０．５％酵母エキス、１．４ ％に麿ＨＰＯａ、０．３％ＫＪＩ！Ｐ　Ｏζ　０．０１
％ＭｇＳＯ４・７　ＨｓＯ１ｐＨ７，０上記の培地５０
ｍ１を５００４の坂ロフラスコに入れ、１２１°Ｃを１
０分間オートクレーブ殺菌する。バチルス（Ｂａａｉｌ
ｌｕａ　）ＯＲＨ−１２８１（微工研菌寄第７７２２号
）の１白金耳を上記培地に接種し３０’０，２０時間振
？。

に同条件にて殺菌した培地６ｔを含む１０を容ジャーフ
ァメンターへ上記種培養液５０ｍｊを接種する。３００
ｒｐｍ、通気量３１／ｍｉｎ、３０°Ｃで１６時間培養
する。得られた培養液のクレアチンアミジノハイドロラ
ーゼ活性は０．７８ＴＪ／ｍｌであった。培養液６Ｌを
遠心分離し、菌体を集め５０ｍＭＩＪン醸緩衝液に懸濁
し、１ｔとしてビーズ破砕機（ダイノミルＫＤＬ　）に
より破砕する。

菌体破砕液を遠心分離し、上清を得る。上清液に０．３
５飽和になるよう硫安を加え遠心分離し、上清を得る。

その上清液にさらに０．５５飽和になるよう硫安を加え
、遠心分離し、沈澱物を得る。５ＱｍＭリン酸緩衝液、
ｐＨ７，５，２５０ＷＬｔに再溶解する。再溶消液を５
０　ｍＭ　ＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，５で平衡比したセフ
ァデックスＧ−２５カラム（２ｔ）で脱塩する。脱塩液
をＤＫＡＫ−セファロース０Ｌ−４Ｂカラム、５０ｒｒ
Ｌｌに吸着させ、０．４ＭＮａ０にて溶出する。溶出液
を限外濾過にて！ＩｗＪシ、セファアクリルＳ−２００
カラムにて分子篩を行なう。活性画分の比活性は１７．
２Ｕ／η蛋白であった。

発明の効果 本発明による新規り１ノアチンアミジノハロラーゼは熱
安定性が５０°Ｃまで安定であり、至適ｐＨ７，０〜９
．０と広く、にｍ値も（２，Ｏｆｏ、５）Ｘ１０−１Ｍ
と小さくすぐれており、ｐＨ安定性も４．５〜８．５で
従来のものより広い。

【図面の簡単な説明】

第１図の実線は本発明の新規クレアチンアミジノハイド
ロラーゼのｐＨと活性の関係を表わし、第２図の実線は
温度と活性の関係を表わし、第３図は２５°Ｃでそれぞ
れのｐＨで′−１７時間処理したときのｐＨと活性の関
係を表わし、＄４ｍはｐ！（７，５でそれぞれの温度で
３０分処理したときの濃度と活性の関係を表わす。なお
第１図〜第４図中破線は公知のシュードモナス・プチダ
により得られたクレアチンアミジノハイドロラーゼの活
性との関係を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記理化学的性質を有する新規クレアチンアミジノ
   ハイドロラーゼ。 （ａ）作用：１モルのクレアチンを加水分解し、１モル
   のサルコシンと１モルの尿素を生成する。 （ｂ）基質特異性：クレアチンに特異的に作用する。 （ｃ）至適ｐＨ：７．０〜９．０。 （ｄ）至適温度：３５℃〜４５℃。 （ｅ）ｐＨ安定性：２５℃、１７時間処理でｐＨ４．５
   〜８．５で安定。 （ｆ）熱安定性：ｐＨ７．５、３０分間の処理で５０℃
   まで安定。 （ｇ）阻害剤：ＡｇＮＯ＿３、ＨｇＣｌ＿２、ＣｕＳＯ
   ＿４等。 （ｈ）Ｋｍ値：（２．０±０．５）×１０＾−＾２Ｍ。 （ｉ）分子量：１０００００±５０００（ゲル濾過法に
   よる）。