JPH0227991A - 組織培養法による精油並びにトロポロン類の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、植物の組織を無菌培養し、得られた無定形培
養物、所謂カルスから精油成分並びにトロポロン類を製
造する方法に関わり、更に詳しくはヒノキ科ビヤクシン
属力イヅカイブキ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ　ｃｈｉｎｅｎ
ｓｉｓ　ｃｖ、　’　にａｉｚｕｋａ’　ｌの組織を培
養し、得られるカルスに産生蓄積される精油並びにトロ
ポロン類を抽出法、乃至水蒸気蒸留法等の方法で取得す
る精油並びにトロポロン類の製造方法に関する。

（従来の技術） 精油成分は１通常、土中に播いた種子から栽培するか或
は挿木等植物体の一部の栄養繁殖によって栽培した植物
の全草又は花から溶媒抽出、水蒸気蒸留等の方法により
取得されている。

また、ヒノキ油は従来ヒノキの枝払いした際の葉を主体
とした材料やヒノキ材おが屑から水蒸気蒸留等の方法に
より取得されており、トロポロン類のうちヒノキチオー
ル（β−ツヤプリジン）は台湾ヒノキ油やヒバ油の酸性
区分から分離されていた。

かかる精油は化粧品、香粧品、石鹸用香料、室内芳香剤
として使われており、又ヒノキチオールは歯磨香料、毛
髪剤、防虫剤として広（実用に供されている。

しかし、植物を栽培し、それから精油成分乃至ヒノキ油
を取得する方法は、温度、気候、雨量、土質等による植
生分布の局在化に基づ（制約を受ける他、植物の生育は
年毎の気象条件において大きく左右されるため、特定の
精油乃至ヒノキ油を一定量、計画的に生産することが極
めて困難である等の問題があった。

かかる問題を解決する方法として、植物組織を培養し、
得られたカルスから精油を製造する方法が開示され１例
えばベラルゴニウム属、ゼラニウム属、ルタ属、アネー
ソム属、メンタ属、サルヴイア属、ヴィオラ属、メリッ
サ属については特開昭５９−２１３３９３号、特開昭６
０−２４８１８８号、特開昭６１−７８３９３号公報に
開示されている。

二才イヒバ（クロペ属）　　（Ｔｈｕｊａ　ｏｃｃｉｄ
ｅｎｔａｌｉｓＬ、）については、ウィツトらはムラシ
ゲ・スクーグの培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓ
ｋｏｏｇ　１９８２）で組織培養し、それをＢ５培地（
Ｇａｇｇｂｏｒｇ、　１９６８）に移し、モノテルペン
類やヒノキチオールが産生ずることを認めている［Ｊ、
Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
Ｐｌａｎｔａ　ｍｅｄｉｃａ　４９．２１９ｆ１９８３
）］。

また、本発明者らは同じ二才イヒバの他、ヒノキアスナ
ロ〔アスナロ属）　（Ｔｈｕｊｏｐｓｉｓ　ｄｏｌａｂ
ｒａｔａＳｉｅｂ、ｅｔ　Ｚｕｃｃ、ｖａｒ、ｈｏｎｄ
ａｅ　Ｍａｋｉｎｏ）、コノテガシワ（コノテガシワ属
）　［Ｐｌａｔｙｃｌａｄｕｓ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ
　（Ｌ）　Ｆｒａｎｃｏ］　、　　ヒノキ（ヒノキ属）
　　（Ｃｈａｎａｅｃｙｐａｒｉｓ　ｏｂｔｕｓａ）、
サワラ（ヒノキ属）　（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ　
ｐｉｓｉｆｅｒａｌについて、これらの芽と種子の組織
培養をムラシゲ・スクーグの培地を使用して行ない、得
られたカルスからメタノールで抽出してヒノキオールの
他、６−ゾヒドロフエルジノールやステロイドの産生な
認めている（Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　、　４８　（１０）　、　２５２３〜２５
２７．１９８４１゜（発明が解決しようとする問題点） しかし、これら今迄行なわれてきた植物の組織培養法に
より得られるトロポロン類、特にヒノキチオールの量は
微量であり、到底工業的実用に供されるものではなく、
またヒノキチオールと同様なトロ・ボロン類であるヌー
トカチンについては産生されたという報告例はない。

そこで、本発明者らは植物の組織培養法によるヒノキチ
オール、ヌートカチン等のトロポロン類の工業的製法を
開発することを目的として、二才イヒバ（クロベ属）及
びコツプカシワ属とは異なったビヤクシン属（ネズミサ
シ属）カイヅカイブキ植物の組織培養に関し、種々検討
を重ねた結果１人工的に管理された一定条件下で極めて
短時間にヒノキチオール、ヌートカチンを主成分とする
大量のトロポロン類が産生されることを見出したもので
ある。

（発明が解決しようとする手段） そこで、本発明においては上記知見に基づき、ヒノキ科
ビヤクシン属（ネズミサシ属）カイヅカイブキの切片を
培養してカルスを誘導せしめ、更に得られたカルスを培
養して増殖せしめ、カルス中に産生蓄積された精油成分
並びにトロポロン類を取得する精油並びにトロポロン類
の製造方法を提案するものである。

具体的にはビヤクシン属力イズカイブキの切片を植物ホ
ルモンを含有する培地でカルスを誘導させ、誘導された
カルスを液体または固体培地で継代培養させ、更にこれ
らのカルスから選択された精油含有の高い株を物質生産
用培地で増殖させ、カルス中に目的物質を産生蓄積せし
める。そして、このようにして得られたカルスからは有
機溶媒による抽出法、水蒸気蒸留法など通常使用されて
いる公知の方法により精油成分並びにトロポロン類を取
得するのである。

これを各工程に分けて以下に説明する。

１）カルスの誘導、継代培養、増殖 カルス誘導に供されるヒノキ科のビヤクシン属力イズカ
イブキの植物体は、例えば流水下でよく水洗後、葉、芽
、根部に切り分け、エタノール、塩化ベンザルニウム、
次亜塩素酸ソーダ等を用いて殺菌し、引き続いて滅菌水
で洗浄し、培地を入れた試験管または三角フラスコ中に
投入する。

カルスの誘導、継代培養の培地としては、ムラシゲ・ス
クーグ培地、Ｂ５培地及び改変Ｂ５培地などが挙げられ
るが、これに特に限定されるものでなく、通常植物培養
において使用されている固体培地、液体培地であれば、
カルスの誘導、継代培養の培地として使用可能である。

実際に培養するに際しては基本的培地に糖類、ビタミン
類、必要に応じて生長調節物質を配合したものを用いる
。

生長調節物質としては例えばオーキシンとして２．４−
ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）またはナフタレ
ン酢酸（ＮＡＡＩまたはインドール酢酸（ＩＡＡＩ　を
用い、サイトカイニンとしてベンジルアデニン（ＢＡ）
、カイネチン（Ｋｎ）、　２−イソペンテニルアデニン
（２−ｉｐ）、６−ベンジルアデニン（６−ＢＡ）を単
独又は適宜組み合わせて各々０．１〜３　ｐｐｍ添加し
た寒天培地が用いられる。

なお、カルスの生育促進を目的としてカゼイン加水分解
物、ココナツツミルクなどを用いる場合もある。また、
増殖液体培養では上記の培地から寒天を省いた培地によ
って好気的条件の下で行なわれる。

培養にあたっては培養温度２０〜３０℃、好ましくは２
５℃前後の一定温度に保ち培養を行なう。

カルス誘導に必要な期間は３〜５週間であり、誘導され
るカル又は固定培地上では３〜５週間置きに液体培地中
では２〜４週間置きに新しい培地に継代培養させる。

このようにして得られたカルスは、寒天培地上で小さな
塊ごとに分けて更に培養を続ける（それぞれの培養カル
ス塩を株とする）、或は液体−培養を続ける（液体培養
の場合には、フラスコなどの１つの容器中のカルスを１
つの株とする）。

各株のカルスについて、例えば精油の主成分であるヒノ
キチオールの臭いを指標として官能的に評価し、元の植
物に含まれる主成分の１つまたはそれ以上の成分が感じ
られる株を選び出して、更に株の残りの培養を重ね、選
抜を繰り返し、機器分析等で定量的評価をしてよい株を
選択する。

選ばれた株は更に物質生産用培地上で培養して増殖され
る。

物質生産用培地としては、Ｂ５液体培地等を使用するこ
とができる。また、Ｂ５液体培地を基本として硝酸イオ
ンをアンモニウムイオンに変えたり、マグネシウムの含
有、正リン酸含有、鉄含有を増減させたり、酢酸ソーダ
を加えた培地を使用することができる。

そして、本発明によれば上述のように物質生産用Ｂ５液
体培地の組成を変えることにより、トロポロン類の生産
性を高めることができ、またトロポロン類中のヒノキチ
オールとヌートカチンの生産比率を調整することができ
る。

また、培養条件は例えば大略２０〜３０℃で１〜５ｒｐ
ｍ　　（往復振どう培養又はジャーファーメンタ−では
３０〜２００ｒｐｍｌの通気下で液体培養を暗黒下で行
なうことができ、この場合適宜酢酸ソーダで中和するこ
とにより、トロポロン類等の酸性物質の産生を増大させ
ることができる。

培養は、カルスが十分赤色を帯びたところで培養を中止
して培養液を濾別する。

（２）精油及びトロポロン類の産生 と取得方法 上述のように濾別して得られたカルスからは石油エーテ
ル、メタノール等の有機溶媒で抽出する方法、水蒸気蒸
留法など公知の方法で精油成分及びトロポロン類を取得
できるが、このうちメタノール等のアルコール類を使う
抽出法が最も好ましい。

また、濾過母液から有機溶媒で抽出する方法、水蒸気蒸
留法など公知の方法で精油成分及びトロポロン類を取得
できる。

抽出法では水と分離するエチルエーテル、石油エーテル
、ｎ−ヘキサン、トルエン、塩化メチレン等の有機溶媒
を使用することができるが、カルス中に産生ずるトロポ
ロイド類を良く抽出するにはクロロホルム、ジクロロメ
タン、ジクロロエタン等のハロゲン化ハイドロカーボン
等の有機溶媒を使用することが好ましい。

抽出液からヒノキチオール等のトロポロン類を分離する
には、抽出液を濃縮して一定量の水と分離する有機溶剤
に溶かし、アルカリ水溶液で振って酸性部を分液して残
部有機溶媒層から有機溶媒を留去し一１中性部の精油を
得る。

上記アルカリ水溶液は酸性に戻して水と分離する有機溶
媒で抽出して抽出液から溶媒を留去して精油の酸性部が
得られる。この酸性部はトロポロン類を主成分とする部
分である。したがって、この部分にヒノキチオールを種
結晶として加えて冷却すると、ヒノキチオールの結晶が
得られる。

なお、水蒸気蒸留にて精油並びにトロポロン類を得るに
は、培養液よりカルスを濾別することなく水蒸気蒸留を
行なうことができる。

（実施例） 以下、本発明の実施例を示す。

なお実施例中、香気の官能評価及び精油成分の分析は次
の方法により行なった６ また、使用した培地組成及びカルス不定芽の増殖度（倍
）は以下に示す。

■）香気の官能評価 カルスを手指で押し潰し、原植物と対照として香気を臭
気により判定した。　１０人の専門員によって行ない、
その平均をもって官能評価とした。評価基準は次の通り
である。

１、原植物特有の精油成分の臭いなし ２、　　　　　　〃　　　　　　　かすかにあり３、　
　　　　　〃　　　　　　　　あり４　、　　　　　　
１１　　　　　　　　強い５、　　　　　　〃　　　　
　　　非常に強い２）精油成分の分析 ガスクロマトグラフィー及び質量分析計を用いて、標準
物質との保持時間及びマススペクトルの一致から成分を
同定し、クロマトグラムのピーク面積から成分量を求め
、精油成分の精油全量に対する百分率で示す、なお、カ
ルスから精油の抽出は、溶媒として塩化メチルを用い、
粉砕、塩析、遠心分離、溶媒層分取、濃縮という常法に
より行なった。

測定条件： ａ）ガスクロマトグラフィー 機種：島津ＧＣ−４ＣＰＴＦガスクロマトグラフカラム
＝５％０Ｖ−１７コーティング（ユニボートＫＳＩ　ガ
ラスカラム インジェクション温度：３３０℃ オーブン温度＝８〜３００℃（昇温５℃／分）ｂ） Ｎ２流量：　６（１＋ｓｌ／分 ガスクロ質量分析 機種二日本電子株式会社製ＪＭＳ−０１００型（質量分
析器） 日本電子株式会社製ＪＧＣ−２０に型（ガスクロマトグ
ラフ） イオン化電圧：　２０ｅＶ ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）と８５培地の組成（ｍｇ／
ｌ） ＭＳ　　　　Ｂ−５ 成分 ＸＮＯ。

ＮＨ，Ｎ０１ ｆＮＨ，）　＊ｓｏ＜ ＫＨ，ＰＯ４ ＮａＨａＰＯ４・Ｈ２Ｏ ＣａＣ１ｇ−２Ｈ，０ Ｍｇ５Ｏｎ・７Ｈ２０ Ｆ７Ｈ２ＯＦｅ５０ ４４ＨｚＯＮａ ２ＥＤＴＡ・４Ｈ２０ ２７，８ ３７，３ ２２，３ ２７，８ ３７，３ ＭｎＳＯ４・ＨＪ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１０ＺｎＳ０４−７Ｈａ０　　　　　　　
　　　　　８．６　　　　　　　２−ＯＨ，ＢＯ３６，
２３，０ ＣｕＳ０４・５Ｈｉ０　　　　　　　　　　　　０．０
２５　　　　　　０．０２５Ｎａ＊Ｍｏ０ｚ　・２Ｈｚ
０　　　　　　　　　　　０．２５　　　　　　０．２
５ＫＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，
８３０，７５ＣａＣ１ｉ・６Ｈｉ０　　　　　　　　　
　　　０．０２５　　　　　０．０２５ミオイノシトー
ル　　　　　１００　　　１００チアミン塩酸塩　　　
　　０．１　　　　１０ピリドキシン塩酸塩　　　０．
５１ ニコチン酸　　　　　　　０．５ グリシン　　　　　　　　　２．０ シエウクロース　　　　３０．０００　　２０．０００
ｐｉｔ　　　　　　　　　　　　　５．７　　　５．７
４、カルスの不定芽の増殖度（倍） ８　　　　　の　　−重 植え継ぎ時の不定芽の新鮮型ｆｇ） 実施例１ ビヤクシン属カイツカブキの新芽を良く水洗し、その後
７０％エタノールに３０秒間漬け、続いて５倍希釈の次
亜塩素酸ナトリウム水溶液に３０分間浸漬して殺菌する
。引き続いて滅菌水で３回洗浄した後、ナフタレン酢酸
（ＮＡＡＩ　２　ｐｐｍを含むムラシゲ・スクーグ培地
（ＭＳ）　（０，９％寒天含有）２０＋ｍｌに置床し、
暗黒下２５℃で３〜４週間培養する。

増殖したカルスｌ〜２ｇを無菌的に砕いて、　３００ｍ
１容三角フラスコ中の下記培地７０ｍ１に移植し、暗黒
下２５℃で振どう培養する。１週間で細胞は赤色を呈し
始めるので、２週間で培養を止める。

培養後、濾別した細胞３〜４ｇ／フラスコをメタノール
１００ｍ１ブレンダー（Ｖｉｒｔｉｓ　Ｍａｃｒｏ−２
３）で粉砕して抽出する。溶媒のメタノールを留去した
。

次に抽出物（４０〜５０＋ｓｇｌ　をジクロロメタンに
溶解する。ジクロロメタン溶液の入ったフラスコを６Ｎ
塩酸と１０％フェロシアン化カリ水溶液３０ｍ１　（ｐ
Ｈ１，０）で処理すれば、一部鉄鎖体となっていたトロ
ポロン類は遊離状態になる。

更に、ジクロロメタン層を５％水酸化ナトリウム水溶液
３０＋ｓｌと振って、常法通り酸性部と中性部に分ける
。

得られた酸性部はエーテルに溶かし、ジアゾメタンのエ
ーテル溶液を加え、室温でメチル化して、ガスクロマト
グラフィーで分析した。

中性部はそのままガスクロマトグラフィーで分析する。

上記酸性部と中性部のガスクロマトグラフィーの分析結
果を第１．２図に示す。

一方、濾過母液もジクロロメタンで抽出し、抽出液を上
記同様酸性部と中性部に分けて酸性部はジアゾメタンで
処理した後、ガスクロマトグラフィー分析した。

以上の分析結果より、培養細胞の主成分はトロポロン類
はヒノキチオール（第１図ガスクロマトグラムのビーク
Ｉｆ及び１３）及びヌートカチン（第１図ガスクロマト
グラムのビーク１７及び１８）であることを確認した。

また、トロポロン類の定量は酸性部をトリメチルシリル
エーテルとし、ガスクロマトグラフィーを用い内部基準
法で行った。内部基準物質にはオクタデカノールを用い
た。

トリメチルシリルエーテル化は次のとおりである。酸性
部２Ｂをピリジン１ｕｉ２に溶かし％Ｎ。

０−ビストリメチルシリルアセトアミド１００μ２を加
えて室温に３０分間放置してシリルエーテルとした。

実施例２ カイヅカイブキの新芽を材料として同様な操作を行ない
細切後、ＮＡＡ　１０−’Ｍを含み、ｐＨ５，７に調節
したムラシゲ・スクーグ液体培地に投入し、２５℃で暗
黒下で培養を行なったところ、１週間後にカルスが増殖
し始めた。

このカルスを実施例１と同様、主成分の１つであるヒノ
キチオールをマーカーとして高含有株を８週間毎に選択
し、増殖することを繰り返した２００世代目カルスを分
析すると、第１表のような結果が得られ、比較例として
カルス株第１世枚目、選抜４日を経た５世代目の細胞及
び栽培中の原植物体の葉について併記する。

第１表 実施例３ 実施例２で得られたカルス１５ｇを無菌的に砕き、１２
容のフラスコ中にＢ５液体培地７００ｍ１に移植し、暗
黒下２５℃で振どう培養する。３週間培養して、濾別し
て細胞７４ｇを得た。さらに、これをメタノール２ａで
抽出してメタノールを留去し、抽出物２２６ｍｇを得た
。これをジクロロメタン１００ｍ１に溶解させ、　６Ｎ
塩酸と１０％フェロシアン化カリ水溶液５抛ｌで振って
実施例１と同様に処理して褐色油−状物の酸性部ａＯｍ
ｇと中性部１２［ＩＢを得た。

一方、培地（濾過母液）から実施例１と同様に抽出して
抽出物９８＋ｎｇを得、これより褐色油状物の酸性部３
０ｍｇ、中性部５０＋ｗｇを得た。

得られた酸性部５０Ｂを冷却してヒノキチオールの種結
晶を入れて２週間冷蔵庫に保存する。得られた結晶を濾
過して８ｍｇの結晶を得た。この結晶の融点はｍｐ　５
１　℃であった。

実施例４ 実施例２で得られたカルスを実施例３と同様に下記第２
表に示す培地を使用して培養し、２週間後にカルスを収
穫した。収穫したカルスの生育量並びに培地からの抽出
物量、抽出物中の酸性部、中性部及び培地（濾過母液）
中の酸性部、中性部の収量を第３表に示す。

これによれば、培地Ｎｏ、　１　（前記組成の８５培地
）に比べ８５培地を改変した培地Ｎｏ、２〜Ｎｏゴにお
いては代謝産物量の増加が認められた。

また、第４表は培地Ｎｏ、１＝Ｎｏ、７についてトロポ
ロン類（ヒノキチオールとヌートカチン）の収量を示す
ものであるが、これによれば培地ＮＯ１２〜Ｎｏ、５で
は培地Ｎｏ、　ｌにくらべてトロポロン類の産生量が増
加し、また培地Ｎｏ、　ｌではヌートカチンが主に産生
ずるのに対して培地Ｎｏ、３ではヌートカチンと等モル
のヒノキチオールが産生じている。

第２表　使用培地 実施例５ 実施例４の培地Ｎ００２で培養したカイヅカイブキの抽
出物酸性部をガスクロマトグラフィーにかけ、これより
トロポロン類を分析したところカイ１ゾカイブキからは
ヒノキチオールとヌート力チンの含量の窩いトロポロン
類が得られることが明らかになった。

これと比較のために、二才イヒバ、コノテガシワの組織
培養法によって得られたトロポロン類の収量を併記して
下記第５表に示す。

これによればカイ・ゾカイブキからはヒノキチオールと
ヌートカチンからなるトロポロン類が産生し、ヒノキチ
オールの産生量は二才イヒバの約１０倍、コノテガシワ
の約１００倍近く、またヌートカチンについてはカイヅ
カイブキのみが著量のヌートカチンを産生することが認
められた。

第５表　トロポロン類の収量 （発明の効果） 以上要するに、本発明によればヒノキ科ビヤクシン属（
ネズミサシ属）カイヅカイブキの植物体を原料として組
織培養を行なうことにより、カルス誘導を比較的容易に
行なうことができ、またヒノキチオール、ヌートカチン
を主成分とするトロポロン類を収率良く製造することが
でき、更に液体培地の条件を選ぶことによりトロポロン
類の生産性を高めることができるなどの効果を挙げるこ
とができる。

したがって、本発明によれば、自然環境の影響を受ける
ことなく完全に制御された環境下で容易且つ収率良く精
油並びにヒノキチオール、ヌートカチンなどのトロポロ
ン類を工業的に製造できる方法が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１において力イヅカイプキより誘導さ
れたカルスより抽出された酸性部のメチル化されたもの
のガスクロマトグラム、第２図は、実施例１において力
イヅカイブキより誘導されたカルスより抽出された中性
部のガスクロマトダラムである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒノキ科ビャクシン属（ネズミサシ属）カイヅカ
   イブキの切片を培養してカルスを誘導せしめ、更に得ら
   れたカルスを培養して増殖せしめ、カルス中に産生蓄積
   された精油成分並びにトロポロン類を取得することを特
   徴とする精油並びにトロポロン類の製造方法。
2. （２）トロポロン類がヒノキチオール及びヌートカチン
   である特許請求の範囲第１項記載の製造方法。