JPH0228599B2

JPH0228599B2 -

Info

Publication number: JPH0228599B2
Application number: JP56000560A
Authority: JP
Inventors: Masahiko Fujino; Tadashi Nishimura
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1981-01-05
Filing date: 1981-01-05
Publication date: 1990-06-25
Also published as: JPS57114565A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、グアニジノ基を保護することによる
ペプチドの製造法に関する。グアニジノ基

【式】を含有する原料化合物（例えばアルギニンなど）を用いてペプチ
ドを製造するためには、グアニジノ基を保護して
おく必要がある。グアニジノ基の保護は、従来、
ニトロ基またはトシル基を導入することにより行
なわれてきた。これらの従来法においては、保護基を脱離する
際の収率が低く、また、トシル基を脱離させるに
は、液体アンモニア―金属ナトリウムあるいは無
水弗化水素などを用い強い条件で行なわなければ
ならないペプチドの他の部分が分解し副生物が生
じ、目的とするペプチドの収率の低下をきたす等
の欠点があつた。本発明者らは、これら欠点を解消する方法とし
て先にグアニジノ基の保護基として、メタンスル
フオン酸で容易に除去できるｐ―メトキシベンゼ
ンスルフオニル，メジチレンスルフオニル基等を
利用する方法（特開昭51―100030）を紹介し、実
用に供した。その後も、本発明者らはグアニジノ
基の保護につてい研究をつづけたところ、グアニ
ジノ基の保護基として、４―メトキシ―２，３，
６―トリメチルベンゼンスルフオニル基が、さら
に緩和な酸処理によつて、該保護基を脱離できる
ことを見い出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、グアニジノ基を有するペプ
チドの製造にあたり、グアニジノ基含有原料化合
物（例：アルギニン）のグアニジノ基を４―メト
キシ―２，３，６―トリメチルベンゼンスルフオ
ニル基で保護して、ペプチド縮合した後保護基を
酸で脱離せしめることを特徴とするペプチドの製
造法である。本発明においては、一般式（）（式中、ＲはＨまたはα―アミノ基の保護基を表
わす）で示されるアルギニン誘導体およびその
塩、ならびに４―メトキシ―２，３，６―トリメ
チルベンゼンスルフオニルハライドが原料化合物
として用いられる。本発明において、グアニジノ基含有化合物のグ
アニジノ基に４―メトキシ―２，３，６―トリメ
チルベンゼンスルフオニル基を導入するに際して
は、グアニジノ基含有化合物のα―アミノ基を保
護して反応に供せられる。このα―アミノ基の保
護は、従来から公知の保護基、例えば一般式
（）におけるＲで示される保護基としてカルボ
ベンゾキシ基、ｐ―ニトロベンジルオキシカルボ
ニル基、ｐ―メトキシベンジルオキシカルボニル
基、ｔ―ブトキシカルボニル基、ｔ―アミロキシ
カルボニル基、９―フルオレニルメトキシカルボ
ニル基、イソニコチニルオキシカルボニル基、Ｏ
―ニトロフエニルスルフエニル基、２―（ｐ―ビ
フエニル）―イソプロピルオキシカルボニル基を
常法により導入したものがあげられ、特にアルギ
ニンをカルボベンゾキシ基、ｔ―ブトキシカルボ
ニル基で保護したものが有利に用いられる。次に、α―アミノ基が保護されたグアニジノ基
含有化合物のグアニジノ基に４―メトキシ―２，
３，６―トリメチルベンゼンスルフオニル基を反
応させる。この反応はグアニジノ基含有化合物に
４―メトキシ―２，３，６―トリメチルベンゼン
スルフオン酸基をグアニジノ基含有化合物１当量
に対し約１〜５当量、さらに好ましくは約１〜２
当量になるように反応させるのがよい。４―メト
キシ―２，３，６―トリメチルベンゼンスルフオ
ン酸基は、通常そのハロゲニド形で反応に供せら
れる。ハロゲニドとしては、クロリド，フルオリ
ド，ブロミド，ヨージドのいずれも使用できる。
４―メトキシ―２，３，６―トリメチルベンンゼ
ンスルフオニルクロリドは、２，３，５―トリメ
チルアニソールに、クロルスルフオン酸を反応さ
せることにより異性体を、生成することなく、結
晶として得ることができる。４―メトキシ―２，
３，６―トリメチルベンゼンスルフオニル基の導
入は、塩基の存在下に行うのが好ましい。塩基としては、たとえば水酸化ナトリウム，水
酸化カリウム，水酸化リチウムなどが挙げられ、
グアニジノ基含有化合物１当量に対し約１〜10当
量、さらに好ましくは約１〜５当量用いられる。
該反応は、通常適当な溶媒たとえば、水，アセト
ン，ジオキサン，ジメチルホルムアミド，テトラ
ヒドロフラン，あるいはそれらの混合溶媒中など
で行うのがよい。該反応は、−10℃乃至25℃、好
ましくは−５℃乃至10℃で行なわれる。このようにして得られる４―メトキシ―２，
３，６―トリメチルベンゼンスルフオニル基で保
護されたグアニジノ基を有する化合物は、遊離の
ままあるいは常法に従つてシクロヘキシルアミ
ン、ジシクロヘキシルアミン、ナトリウムなどの
塩としてペプチド縮合に供せられる。本発明において、グアニジノ基を４―メトキシ
―２，３，６―トリメチルベンゼンスルフオニル
基で保護されたグアニジノ基を有する化合物と
は、前記の一般式（）で示されるアルギニン誘
導体およびその塩である。このようにして得られる４―メトキシ―２，
３，６―トリメチルベンゼンスルフオニル基で保
護されたグアニジノ基を有する化合物は常套手段
によりペプチド縮合反応させる。この常套手段と
しては、例えばM.Bodansky及びM.A.Ondetti
著，ペプチド・シンセシス（Peptide
Synthesis），Inter science，New York，1966
年；F.M.Finn及びK.Hofmann著ザ・プロテイン
ズ（The Proteins），第２巻，H.Nenrath，R.L.
Hill編集，Academic Press Inc.New York，
1976年；泉屋信夫他著“ペプチド合成”丸善
（株）1975年などに記載された方法、たとえばア
ジド法，クロライド法，酸無水物法，混酸無水物
法，DCC法，活性エステル法，ウツドワード試
薬Ｋを用いる方法，カルボジイミダゾール法，酸
化還元法，DCC／HONB法などが挙げられる。次に、ペプチド縮合後、本発明の保護基を酸に
よつて脱離させる。この脱離方法としては、無水
弗化水素法、メタンスルフオン酸法、トリフルオ
ロメタンスルフオン酸法等の公知の酸処理方法が
適用できる。さらに、本発明方法の場合には、新
しい酸処理方法としてトリフルオロ酢酸が有利に
使用でき、特にチオアニソールまたはアニソール
の存在下でトリフルオロ酢酸を用いると脱離反応
が非常に有利に進行する。上記のトリフルオロ酢酸およびチオアニソー
ル，アニソールは溶媒をかね保護基を脱離しうる
に十分な量を用いればよい。たとえば、保護され
たグアニジノ基を有する化合物１当量に対し１〜
10⁵当量、さらに好ましくは１〜10³当量用いら
れ、脱離反応は、酢酸，クロロホルム，メチレン
クリドなどの溶媒中で行つてもよく、また温度は
−10℃乃至300℃程度、さらに好ましくは10゜乃至
100℃程度で行なわれる。本発明方法は、グアニジノ基を有するいかなペ
プチドの製造にも適用できる。具体的な例として
は、Des―Gly¹⁰−〔Ｄ−Leu⁶〕−LH−RH−
ethylamide（特公昭53―14072参照），Des−Gly¹⁰
−LH−RH−ethylamide（特公昭53―24423参
照），Tuftsin〔Nature，228，672（1970）参照〕，
Substance Ｐ，Kyotorphinなどの生理活性ペプ
チドを有利に製造できる。その他のペプチドとし
て、MSH，ACTH，Glucagon−Secretin
Bradykinin，Dynorphin，α―Neoendorphinお
よびそれらの活性断片なども有利に製造できる。本発明方法において用いる４―メトキシシ―
２，３，６―トリメチルベンゼンスルフオニル基
は、従来行なわれていた酸処理によるグアニジノ
保護基の脱離方法はもちろんのこと、さらに緩和
な条件下でも容易に脱離される。例えば、トリフ
ルオロ酢酸のような緩和な酸処理は、従来知られ
たグアニジノ保護基の脱離には適用することがで
きないが、４―メトキシ―２，３，６―トリメチ
ルベンゼンスルフオニル基で保護した場合はよく
脱離が進行し充分に適用できる。ところで、従来
の方法により、ｐ―メトキシベンゼンスルフオニ
ル基、メジチレンスルフオニル基でグアニジノ基
を保護しペプチド縮合後、メタンスルフオン酸を
用いて保護基を脱離する場合、そのペプチド中
に、アスパラギンやアスパラギン酸残基を含有す
る場合には、サクシンイミド型の副反応が生ずる
ことがあり、またセリンやスレオニン残基が存在
するとＮ→Ｏアシル転位が起る。本発明方法の場
合、これらのアミノ酸残基を含むペプチドであつ
てもトリフルオロ酢酸のような緩和な酸を用いる
ことにより上記のような副反応が起こることなく
脱離することができる。次に、本発明を参考例、実施例および試験例を
挙げてさらに詳しく説明する。なお、本明細書に
おいては４―メトキシ―２，３，６―トリメチル
ベンゼンスルフオニル基をMtrと略記することが
あり、またアミノ酸、ペプチド、保護基、活性基
等に関し、IUPAC―IUB commission on
Biological Nomenclatureに基づく略号あるいは
当該分野における慣用略号で表示する場合があ
る。それらを例示する。 pGlu：ピログルタミン酸；His：ヒスチジン；
Trp：トリプトフアン；Ser：セリン；Tyr：チ
ロシン；Leu：ロイシン；Gly：グリシン；
Arg：アルギニン；Pro：プロリン；Lys：リジ
ン；Gl_N：グルタミン；Phe：フエニルアラニ
ン；Met：メチオニン；Thr：スレオニン（以上
特に表示のない場合はアミノ酸はＬ体をさすもの
とし、Ｄ体はその旨明記する。但しGlyを除
く）；Ｚ：カルボベンゾキシ；Boc：ｔ―ブトキ
シカルボニル；Et：エチル；HoNBおよび
ONB：Ｎ―ハイドロキシ―５―ノルボルネン―
２，３―ジカルボキシイミドおよびそのエステ
ル；HOBt：Ｎ―ハイドロキシベンツトリアゾー
ル；DCC；Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジ
イミド；H₂／pd：接触還元；TFA：トリフルオ
酢酸；CHA：シクロヘキシルアミン；OTCP：
２，４，５―トリクロロフエニルエステル；
OSu：Ｎ―ハイドロキシスクシンイミドエステル参考例１ (1) ２，３，５―トリメチルアニソールの合成２，３，５―トリメチルフエノール10ｇ，沃
化メチル10.4mlをジメチルスルフオキシド100
mlにとかし、氷冷し、これに、60％油性水素化
ナトリウム5.6ｇを加え、10時間かきまぜる。
これに水を加えたのち、エーテルで抽出し、エ
ーテル層は水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥
する。溶媒を留去すると、油状物を得る。収量
12.9ｇ（定量的）。 (2) ４―メトキシ―２，３，６―トリメチルベン
ゼンスルフオニルクロリドの合成２，３，５―トリメチルアニソール4.5ｇを、
塩化メチレン500mlにとかし、−5゜〜−10℃に冷
却したのち、クロルスルフオン酸6.0mlを含む
塩化メチレン溶液400mlを滴下する。その後、
室温にまでもどし、５％炭酸水素ナトリウム水
を含む氷上にあける。塩化メチレン層は水洗し
たのち、無水硫酸マグネシウムで乾燥する。溶
媒を留去したのち、ｎ―ヘキサンより結晶とし
て、ろ取する。収量5.0ｇ（67.0％）融点 56−58℃ 元素分析 C₁₀H₁₃O₃SC1として計算値：Ｃ，48.29；Ｈ，5.27；
Ｓ，12.89；C1，14.26 実験値：Ｃ，48.42；Ｈ，5.21；
Ｓ，12.61；C1，14.25 (3) Ｚ−Arg（Mtr）OH・CHAの合成Ｚ−Arg OH2.83ｇを4N―水酸化ナトリウ
ム水10ml，アセトン40の混合液にとかし、氷冷
する。これに４―メトキシ―２，３，６―トリ
メチルベンゼンスルフオニルクロリド4.0ｇを
含むアセトン溶液10mlを加え、33時間かきまぜ
る。クエン酸々性として、アセトンを留去し、
酢酸エチルで抽出する。溶媒を留去すると、油
状物4.8ｇを得るので、これを少量の酢酸エチ
ルにとかしシクロヘキシルアミン1.04mlを加え
て結晶としてろ取し、MeOH−酢酸エチルよ
り再結晶する。収量4.10ｇ（72.1％）。融点195
−197℃〔α〕²³ _D＋6.5゜（Ｃ＝1.18，MeOH）元素分析 C₃₀H₄₅O₇N₅Sとして計算値：Ｃ，58.14；Ｈ，7.32；
Ｎ，11.30；Ｓ，5.17 実験値：Ｃ，58.08；Ｈ，7.34；
Ｎ，11.58；Ｓ，5.32 (4) Ｈ―Arg（Mtr）−OHの合成Ｚ−Arg（Mtr）−OH・CHA1.5ｇを酢酸エチ
ル30mlにケンダクし、これに0.2N―H₂SO₄15
mlを加えてよく振りまぜ水洗する。溶媒を留去
したのち、残留物をメメタノールにとかしPd
黒を触媒として接触還元を行なう。触媒をろ去
し、溶媒を留去し、残留物に水を加えると、結
晶化するので、これをろ取する。収量0.77ｇ
（81％）。融点 100−103℃ 〔α〕²³ _D−4.8゜（Ｃ＝1.30，MeOH）元素分析 C₁₆H₂₆O₅N₄S・1/2H₂Oとして計算値：Ｃ，48.59；Ｈ，6.88；
Ｎ，14.18；Ｓ，8.11 実験値：Ｃ，48.78；Ｈ，7.16；
Ｎ，13.88；Ｓ，8.29 試験例Ｈ−Arg（Mtr）−OH約20mgをトリフルオロ酢
酸−チオアニソール（９：１）２mlにとかし、表
１に示すような各条件で放置したのち、その
100μをとり、全体を10mlに秤量し、アミノ酸
分析を行ない、生成したアルギニンの量を測定し
た。結果を表１に示した。

【表】この結果、Mtr基は、TFA―チオアニソール
系では23℃で約１時間でも充分切断可能である。実施例１ (1) Boc―Tyr−Arg（Mtr）−OH Ｈ−Arg（Mtr）−OH0.80ｇをテトラヒドロ
フラン20mlにとかし、冷時、トリエチルアミン
0.34ml，Boc−Tyr−ONB（Boc−Tyr−
OH0.57ｇ，HONB0.40ｇ，DCC0.50ｇより調
製）を加えて室温で15時間かきまぜる。溶媒を
留去したのち、クエン酸で酸性として、酢酸エ
チルで抽出する。酢酸エチル層を水洗したのち
溶媒を留去し、クロロホルムにとかしてシリカ
ゲルカラム（４×６cm）に付す。５％
MeOH／CHCl₃で溶出し、目的物の画分を集
め、濃縮しエーテルより粉末としてろ取する。
収量0.67ｇ（51.5％）融点 114−121℃ 〔α〕²³ _D＋1.2゜（Ｃ＝0.4，ジメチルホルムアミド）元素分析 C₃₀H₄₃O₉N₅Sとして計算値：Ｃ，55.45；Ｈ，6.67；
Ｎ，10.78；Ｓ，4.94 実験値：Ｃ，55.12；Ｈ，6.83；
Ｎ，10.53；Ｓ，4.54 (2) Ｈ―Tyr−Arg−OH（Kyotorphin）の合成 Boc−Tyr−Arg（Mtr）OH400mgをトリフル
オロ酢酸−チオアニソール（９：１）５mlにと
かし、室温で２時間放置する。トリフルオロ酢
酸を減圧で留去したのち、残留物にエーテルを
加えて、生ずる沈澱をろ取する。これを少量の
水にとかし、アンバーライトIRA−410（酢酸
型）のカラム（１×10cm）を通したのち凍結乾
燥する。これを少量の水にとかし、カルボキシ
メチルセルロースのカラム（2.2×８cm）に付
したのち、水（300ml）と0.1M酢酸アンモニウ
ム（300ml）の間で直線勾配をかけて溶出を行
なう。100〜150mlの画分を集めて、凍結乾燥を
行なう。収量175mg，〔α〕²¹ _D−17.4゜（Ｃ＝0.5，
H₂O）アミノ酸分解（酸分解）：Arg1.00(1)；
Tyr0.94(1)平均回収率86.5％。実施例２ (1) Ｚ−Arg（Mtr）−Pro−Lys（Boc）−Pro−
OHの合成Ｈ−Pro−OMeにＺ−Lys（Boc）−ONBとＺ
−Pro−ONBを順次縮合することにより合成
した油状のＺ−Pro−Lys（Boc）−Pro−
OMe0.59ｇをメタノール30にとかし、パラジ
ウム黒を触媒として、接触還元を行なう。触媒
をろ別し、ろ液を濃縮したのち、残留物をジメ
チルホルムアミド10mlにとかし、これにＺ−
Arg（Mtr）OH・〔Ｚ−Arg（Mtr）・OH・
CHA0.56ｇより調製〕，HOBt0.15ｇ，
DCC0.23ｇを加え室温で15時間かきまぜる。生
じたDCUをろ去し、溶媒を留去したのち、残
留物を酢酸エチルにとかし、重曹水，0.2N塩
酸で洗浄する。乾燥後、溶媒を留去し、残留す
る油状物〔Ｚ−Arg（Mtr）−Pro−Lys（Boc）−
Pro OMe〕を10mlのメタノールに溶解する。
冷時２mlの1N−水酸化ナトリウム水を加え、
室温で２時間ケン化を行なう。1N−塩酸２ml
を冷時加えて中和し、メタノールを留去したの
ち、析出した油状物を酢酸エチルで抽出する。
溶媒を留去したのち、石油ベンジンを加えて粉
末としてろ取し、酢酸エチル−エーテルより再
沈でんする。収量610mg（66.1％）融点90−95℃ 〔α〕²³ _D−32.7゜（Ｃ＝0.6，ジ
メチルホルムアミド）元素分析 C₄₃H₇₀O₁₂N₈Sとして計算値：Ｃ，55.94；Ｈ，7.64；
Ｎ，12.14；Ｓ，3.47 実験値：Ｃ，55.62；Ｈ，7.56；
Ｎ，11.98；Ｓ，3.19 (2) Ｈ―Arg―Pro―Lys―Pro―Gl_N―Gl_N―Phe
―Phe―Gly―Leu―Met―NH₂（Substance
Ｐ）の合成 Boc―Gl_N―Gl_N―Phe―Phe―Gly―Leu―
Met―NH₂0.49ｇをトリフルオロ酢酸（4.5ml）
―水（0.5ml）の混液にとかし、10℃で20分間
ふりまぜる。0.5mlの1N―塩酸を加えて留去
し、残留物にエーテルを加えて粉末としてろ取
し乾燥する。これをジメチルホルムアミド15ml
にとかし、冷時トリエチルアミン0.1mlを加え、
さらにＺ―Arg（Mtr）―Pro―Lys（Boc）―
Pro―OH0.45ｇ、HONB0.18ｇ、DCC0.20ｇを
加えそのまゝ24時間かきまぜる。生成した
DCUをろ去し、ろ液を濃縮する。残留物は水
を加え、生じた沈でんをろ取する。この100mg
をとり、トリフルオロ酢酸―チオアニソール
（９：１）１mlにとかし、50℃で１時間振りま
ぜたのちトリフルオロ酢酸を減圧で留去し、残
留物にエーテルに加えて、生ずる沈でんをろ取
し、乾燥する。これを少量の水にとかし、アン
バーライト―IRA―410（酢酸型）のカラム（１
×10cm）を通したのち凍結乾燥する。これをセ
フアデツクスＧ−25のカラム（2.5×120cm）に
付し、30％酢酸水で溶出する。主要溶出画分
（230〜260ml）を集めて、凍結乾燥する。収量
58mg、〔α〕²³ _D−78.8゜（Ｃ＝0.5，５％酢酸）アミノ酸分析（酸分解）：Lys1.00(1)；
Arg1.04(1)；Glu2.05(2)；Pro2.20(2)；Gly0.91
(1)；Met0.89(1)；Leu1.05(1)；Phe1.89(2)，平均
回収率82.3％。

Claims

【特許請求の範囲】１グアニジノ基を有するペプチドの製造にあた
り、グアニジノ基含有原料化合物のグアニジノ基
を４―メトキシ―２，３，６―トリメチルベンゼ
ンスルフオニル基で保護して、ペプチド縮合した
後保護基を酸で脱離せしめることを特徴とするペ
プチドの製造法。２酸としてトリフルオロ酢酸を用いる特許請求
の範囲第１項記載の製造法。３チオアニソールまたはアニソールの存在下で
保護基を脱離せしめることを特徴とする特許請求
の範囲第１項または第２項記載の製造法。