JPH0244508B2 - - Google Patents
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- JPH0244508B2 JPH0244508B2 JP55105645A JP10564580A JPH0244508B2 JP H0244508 B2 JPH0244508 B2 JP H0244508B2 JP 55105645 A JP55105645 A JP 55105645A JP 10564580 A JP10564580 A JP 10564580A JP H0244508 B2 JPH0244508 B2 JP H0244508B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- approximately
- enzyme
- minutes
- superoxide dismutase
- inactivation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/44—Oxidoreductases (1)
- A61K38/446—Superoxide dismutase (1.15)
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
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- General Engineering & Computer Science (AREA)
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- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明は、スーパーオキシドデイスムターゼ
（superoxide dismutase）に関する。 本発明者らは、新規なスーパーオキシドデイス
ムターゼの探索を目的として鋭意研究したとこ
ろ、セラチア属に属する微生物が、上記新規スー
パーオキシドデイスムターゼを生産することを見
い出し、これに基づいてさらに研究した結果本発
明を完成した。 本発明は、特定の性状を有するスーパーオキシ
ドデイスムターゼに関するものである。 本発明の目的物を製造する際に用いられる微生
物は、セラチア属に属しかつスーパーオキシドデ
イスムターゼを生産する能力を有する微生物また
はその変異株であれば何れでもよい。このような
微生物としては、例えば、セラチア・マルセツセ
ンスIFO3736等が挙げられる。上記IFO番号の付
された微生物はいずれも財団法人発酵研究所のリ
スト・オブ・カルチヤーズ1978年第６版
（Institute for Fementation、Osaka、List of
Cultures 1978、sixth edition）に収載されてお
り、該発酵研究所から入手することができる。一
般にセラチア属菌は、その性状が変化しやすく、
たとえばＸ線照射、紫外線照射、放射線照射、人
工変異剤（例、ニトロソグアニジン、エチレンイ
ミンなど）を用いる人工変異手段などで容易に変
異しうる。このようにして得られる変異株であつ
ても、スーパーオキシドデイスムターゼを生産す
る能力を有するものはすべて本発明方法に使用し
得る。 目的とするスーパーオキシドデイスムターゼの
製造は、上記微生物を培地に培養し、培地中に生
産された目的物を採取、精製することによつて行
なわれる。 上記の培養に用いられる培地は、上記微生物が
利用し得る栄養源を含むものであれば、液状でも
固状でもよい。大量に行なう場合には、液状の培
地が好ましい。 培地には、上記微生物が利用し得る栄養源たと
えば炭素源、窒素源、無機物質、微量栄養素等が
適宜配合される。炭素源としては澱粉、デキスト
リン、ブドウ糖、シヨ糖等が、窒素源としては、
コーン、スチープ、リカー、大豆粉、脱脂大豆
粉、酵母エキス、脱核酵母、カゼイン、綿実粉、
塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等の窒素含
有化合物が、無機物質としては、無機塩たとえば
ナトリウム塩（例、塩化ナトリウム）、リン酸塩
（例、リン酸ナトリウム）、カルシウム塩（例、炭
酸カルシウム）、カリウム塩（例、塩化カリウム、
リン酸カリウム）、マグネシウム塩（例、硫酸マ
グネシウム）、マンガン塩（例、塩化マンガン、
炭酸マンガン）、鉄塩（例、塩化鉄）、亜鉛塩
（例、炭酸亜鉛）などがそれぞれ挙げられる。微
量栄養素としては、ビタミン類（例、ビタミン
B1、B2）、脂質〔例、オレイン酸、ラウリン酸、
カプロン酸などのエステル（例、メチルエステ
ル、エチルエステル）〕、核酸（例、リボ核酸、デ
オキシリボ核酸）、核酸の関連化合物（例、イノ
シン酸、グアニル酸、アデニル酸）などが挙げら
れる。さらに油脂類（例、大豆油、コーン油、落
花生油）、合成消泡剤〔例、トウイーン20、60、
800（花王、アトラス社製）、アクトコール（武田
薬品工業株式会社製）〕等を消泡の目的で添加し
てもよい。 培養の手段は、静置培養、振盪培養または通気
撹拌培養等の手段が挙げられる。特に工業的規模
に行なう場合には、深部通気撹拌培養がより有利
である。培養の条件は、培地の状態、組成、菌株
の種類、培養の手段等によつて異なるが、培養温
度は約20〜40℃で、培養時間は約10〜100時間、
さらに好ましくは約20〜72時間で、PHは、約４〜
９、さらに好ましくは約６〜８で行なわれる。 目的の酵素は主として菌体内に蓄積される。該
酵素は、通常用いられる精製手段により分離精製
される。すなわち培養終了後、培養物から遠心分
離法あるいは過法など通常用いられる方法で集
菌し、えられた菌体を例えば超音波処理法、ガラ
ス・ビーズによるグラインデイング破砕法、ある
いは種々の界面活性剤や溶媒など通常用いられる
方法で破砕し、その破砕物から酵素を抽出するの
が有利である。酵素の採取に当つては、いずれの
場合も当分野における公知の分離精製手段を適宜
利用し、任意純度の標品に導きうる。即ち、この
酵素含有破砕物を遠心分離法あるいは過法で破
砕菌体残査物を除去した後、上清あるいは液を
える。これを酵素抽出液とする。この酵素抽出液
に硫酸アンモニウムあるいはアセトンなどを加
え、生じた沈澱物を遠心分離法で集めた後、これ
を少量の水に溶解し、透析などで脱塩し凍結乾燥
することにより粗酵素粉末をえることができる。
精製はこの粗酵素粉末を通常の酵素の精製に用い
られる手段を利用することにより達成できる。例
えば、セフアデツクス（フアルマシア社（スエー
デン）製）によるゲル過、更にジエチルアミノ
エチルセルロース（セルバ社（西ドイツ）製）に
よるカラム・クロマトグラフイー等の手段を適宜
実施することによりスーパー・オキシドデイスム
ターゼが単離される。このようにして任意純度の
スーパー・オキシドデイスムターゼが分離精製さ
れる。 後述の実施例２によつてえられたスーパーオキ
シドデイスムターゼの酵素化学的特性は下記の通
りである。 (a) 作用：スーパーオキシドイオンを過酸化水素
水分子と酸素分子とに不均化する。 (b) 基質特異性：スーパーオキシドイオンに作用
する。 (c) 作用至適PH： 本酵素の活性は第１図に示したように、その
作用至適PHは約７〜８にある。 (d) PH安定性： 本酵素のPH安定曲線は第２図に示した通り、
PH約６〜11の範囲で安定である。 (e) 作用適温の範囲：約20〜45℃ (f) 熱安定性（失活の条件）： 本酵素はPH7.8で一定時間、各温度で処理し、
その残存活性をしらべたところ、第３図に示す
ように37℃、60分間処理は安定であり、50〜60
℃、60分間処理では約50％が失活し、80℃、５
分間処理ではほぼ100％が失活する。 (g) 分子量： 本酵素の分子量はセフアデツクスＧ−100（フ
アルマシア社製）のカラムによるゲル過法
〔ザ・バイオケミカル・ジヤーナル（The
Biochemical Journal）91巻、222〜233頁、
1964年参照。〕で約4.8×104をえた。また１％
ラウリル硫酸ナトリウム（以下SDSと略称す
る。）で処理した後、そのSDS存在下のポリア
クリルアミドゲル電気泳動法〔ザ・ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（The Journal of Biological Chemistry）244
巻、5074〜5080頁、1969年参照〕では分子量約
2.4×104をえる。この結果、本酵素は分子量約
2.4×104のサブユニツトの２重体から成り立つ
ていることがわかる。 (h) 元素分析： Ｃ＝48.90±2.0％、Ｈ＝7.05±2.0％、Ｎ＝
14.80±2.0％。 (i) 紫外部および可視部領域の吸収スペクトル： 第４図および第５図に示すように、本酵素の
紫外部領域では280nｍ付近に極大吸収を、
253nｍ付近に極小吸収があり、290nｍ付近に
肩をもつている。280nｍの吸光度に対する
260nｍの吸光度比は1.8である。また可視部領
域では470〜475nｍ付近に極大吸収を、375〜
380nｍに極小吸収が、また610nｍ付近に肩を
もつている。 (j) 赤外線吸収スペクトル： KBr法によるスペクトルを第６図に示す。
特徴的ピークは3.02（強）、3.38（中）、6.00（強）、
6.60（強）、6.95（中）、7.25（中）、8.10（中）、8.
50
（弱）、9.0（弱）である。 (k) 分子吸光係数： 本酵素の280nｍにおける分子吸収係数は約
1.08×105M-1・cm-.1である。 (l) アミノ酸組成： 本酵素を6N−HCl、110℃で一定時間（24〜
72時間）加水分解した後、アミノ酸分析機によ
り構成アミノ酸を定量する。表の値は酵素１モ
ル（分子量＝4.8×104当りの残基数で示す。
（superoxide dismutase）に関する。 本発明者らは、新規なスーパーオキシドデイス
ムターゼの探索を目的として鋭意研究したとこ
ろ、セラチア属に属する微生物が、上記新規スー
パーオキシドデイスムターゼを生産することを見
い出し、これに基づいてさらに研究した結果本発
明を完成した。 本発明は、特定の性状を有するスーパーオキシ
ドデイスムターゼに関するものである。 本発明の目的物を製造する際に用いられる微生
物は、セラチア属に属しかつスーパーオキシドデ
イスムターゼを生産する能力を有する微生物また
はその変異株であれば何れでもよい。このような
微生物としては、例えば、セラチア・マルセツセ
ンスIFO3736等が挙げられる。上記IFO番号の付
された微生物はいずれも財団法人発酵研究所のリ
スト・オブ・カルチヤーズ1978年第６版
（Institute for Fementation、Osaka、List of
Cultures 1978、sixth edition）に収載されてお
り、該発酵研究所から入手することができる。一
般にセラチア属菌は、その性状が変化しやすく、
たとえばＸ線照射、紫外線照射、放射線照射、人
工変異剤（例、ニトロソグアニジン、エチレンイ
ミンなど）を用いる人工変異手段などで容易に変
異しうる。このようにして得られる変異株であつ
ても、スーパーオキシドデイスムターゼを生産す
る能力を有するものはすべて本発明方法に使用し
得る。 目的とするスーパーオキシドデイスムターゼの
製造は、上記微生物を培地に培養し、培地中に生
産された目的物を採取、精製することによつて行
なわれる。 上記の培養に用いられる培地は、上記微生物が
利用し得る栄養源を含むものであれば、液状でも
固状でもよい。大量に行なう場合には、液状の培
地が好ましい。 培地には、上記微生物が利用し得る栄養源たと
えば炭素源、窒素源、無機物質、微量栄養素等が
適宜配合される。炭素源としては澱粉、デキスト
リン、ブドウ糖、シヨ糖等が、窒素源としては、
コーン、スチープ、リカー、大豆粉、脱脂大豆
粉、酵母エキス、脱核酵母、カゼイン、綿実粉、
塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等の窒素含
有化合物が、無機物質としては、無機塩たとえば
ナトリウム塩（例、塩化ナトリウム）、リン酸塩
（例、リン酸ナトリウム）、カルシウム塩（例、炭
酸カルシウム）、カリウム塩（例、塩化カリウム、
リン酸カリウム）、マグネシウム塩（例、硫酸マ
グネシウム）、マンガン塩（例、塩化マンガン、
炭酸マンガン）、鉄塩（例、塩化鉄）、亜鉛塩
（例、炭酸亜鉛）などがそれぞれ挙げられる。微
量栄養素としては、ビタミン類（例、ビタミン
B1、B2）、脂質〔例、オレイン酸、ラウリン酸、
カプロン酸などのエステル（例、メチルエステ
ル、エチルエステル）〕、核酸（例、リボ核酸、デ
オキシリボ核酸）、核酸の関連化合物（例、イノ
シン酸、グアニル酸、アデニル酸）などが挙げら
れる。さらに油脂類（例、大豆油、コーン油、落
花生油）、合成消泡剤〔例、トウイーン20、60、
800（花王、アトラス社製）、アクトコール（武田
薬品工業株式会社製）〕等を消泡の目的で添加し
てもよい。 培養の手段は、静置培養、振盪培養または通気
撹拌培養等の手段が挙げられる。特に工業的規模
に行なう場合には、深部通気撹拌培養がより有利
である。培養の条件は、培地の状態、組成、菌株
の種類、培養の手段等によつて異なるが、培養温
度は約20〜40℃で、培養時間は約10〜100時間、
さらに好ましくは約20〜72時間で、PHは、約４〜
９、さらに好ましくは約６〜８で行なわれる。 目的の酵素は主として菌体内に蓄積される。該
酵素は、通常用いられる精製手段により分離精製
される。すなわち培養終了後、培養物から遠心分
離法あるいは過法など通常用いられる方法で集
菌し、えられた菌体を例えば超音波処理法、ガラ
ス・ビーズによるグラインデイング破砕法、ある
いは種々の界面活性剤や溶媒など通常用いられる
方法で破砕し、その破砕物から酵素を抽出するの
が有利である。酵素の採取に当つては、いずれの
場合も当分野における公知の分離精製手段を適宜
利用し、任意純度の標品に導きうる。即ち、この
酵素含有破砕物を遠心分離法あるいは過法で破
砕菌体残査物を除去した後、上清あるいは液を
える。これを酵素抽出液とする。この酵素抽出液
に硫酸アンモニウムあるいはアセトンなどを加
え、生じた沈澱物を遠心分離法で集めた後、これ
を少量の水に溶解し、透析などで脱塩し凍結乾燥
することにより粗酵素粉末をえることができる。
精製はこの粗酵素粉末を通常の酵素の精製に用い
られる手段を利用することにより達成できる。例
えば、セフアデツクス（フアルマシア社（スエー
デン）製）によるゲル過、更にジエチルアミノ
エチルセルロース（セルバ社（西ドイツ）製）に
よるカラム・クロマトグラフイー等の手段を適宜
実施することによりスーパー・オキシドデイスム
ターゼが単離される。このようにして任意純度の
スーパー・オキシドデイスムターゼが分離精製さ
れる。 後述の実施例２によつてえられたスーパーオキ
シドデイスムターゼの酵素化学的特性は下記の通
りである。 (a) 作用：スーパーオキシドイオンを過酸化水素
水分子と酸素分子とに不均化する。 (b) 基質特異性：スーパーオキシドイオンに作用
する。 (c) 作用至適PH： 本酵素の活性は第１図に示したように、その
作用至適PHは約７〜８にある。 (d) PH安定性： 本酵素のPH安定曲線は第２図に示した通り、
PH約６〜11の範囲で安定である。 (e) 作用適温の範囲：約20〜45℃ (f) 熱安定性（失活の条件）： 本酵素はPH7.8で一定時間、各温度で処理し、
その残存活性をしらべたところ、第３図に示す
ように37℃、60分間処理は安定であり、50〜60
℃、60分間処理では約50％が失活し、80℃、５
分間処理ではほぼ100％が失活する。 (g) 分子量： 本酵素の分子量はセフアデツクスＧ−100（フ
アルマシア社製）のカラムによるゲル過法
〔ザ・バイオケミカル・ジヤーナル（The
Biochemical Journal）91巻、222〜233頁、
1964年参照。〕で約4.8×104をえた。また１％
ラウリル硫酸ナトリウム（以下SDSと略称す
る。）で処理した後、そのSDS存在下のポリア
クリルアミドゲル電気泳動法〔ザ・ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（The Journal of Biological Chemistry）244
巻、5074〜5080頁、1969年参照〕では分子量約
2.4×104をえる。この結果、本酵素は分子量約
2.4×104のサブユニツトの２重体から成り立つ
ていることがわかる。 (h) 元素分析： Ｃ＝48.90±2.0％、Ｈ＝7.05±2.0％、Ｎ＝
14.80±2.0％。 (i) 紫外部および可視部領域の吸収スペクトル： 第４図および第５図に示すように、本酵素の
紫外部領域では280nｍ付近に極大吸収を、
253nｍ付近に極小吸収があり、290nｍ付近に
肩をもつている。280nｍの吸光度に対する
260nｍの吸光度比は1.8である。また可視部領
域では470〜475nｍ付近に極大吸収を、375〜
380nｍに極小吸収が、また610nｍ付近に肩を
もつている。 (j) 赤外線吸収スペクトル： KBr法によるスペクトルを第６図に示す。
特徴的ピークは3.02（強）、3.38（中）、6.00（強）、
6.60（強）、6.95（中）、7.25（中）、8.10（中）、8.
50
（弱）、9.0（弱）である。 (k) 分子吸光係数： 本酵素の280nｍにおける分子吸収係数は約
1.08×105M-1・cm-.1である。 (l) アミノ酸組成： 本酵素を6N−HCl、110℃で一定時間（24〜
72時間）加水分解した後、アミノ酸分析機によ
り構成アミノ酸を定量する。表の値は酵素１モ
ル（分子量＝4.8×104当りの残基数で示す。
【表】
(m) 金属分析：
本酵素は原子吸光分析法により、酵素１モル
当り約1.5ｇ原子のマンガンを含んでいる。従
つて本酵素はMn型スーパーオキシドデイスム
ターゼであることが伴る。 なお酵素力価の測定は次のようにして行われ
る。 (イ) ザ・ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（The Journal of Biological
Chemistry）244巻、6049〜6055頁、1969年に
記載の方法に従う。即ち、光路１cmセルに100
ｍＭリン酸緩衝液（PH7.8）1.5ml、60μMチト
クロームC0.5ml、0.6ｍＭエチレンジアミン四
酢酸ナトリウム0.5ml、0.66ｍＭキサンチン0.25
ml、測定可能な濃度にPH7.8のリン酸緩衝液で
希釈した酵素液0.21mlを入れ、これにキサンチ
ンオキシダーゼ溶液0.04mlを添加し全量を3.0
mlとし、分光光度計にセツトして、25℃で反応
を開始し、550nｍにおけるチトクロームＣ還
元の初速度（ｖ）を測定する。また酵素液の代
りに蒸留水を加えた時のチトクロームＣの還元
初速度（Ｖ）をも測定する。酵素力価は上記反
応条件下、チトクロームＣの還元初速度を50％
阻害する酵素量を１単位とし、次式より算出す
る。 Ｕ／mg＝（Ｖ）−（ｖ）／（ｖ）×酵素量（mg）／反応
液1.0ml (ロ) アナリテイカル・バイオケミストリー
（Analytical Biochemistry）44巻、276〜287
頁、1971年に記載の活性染色法をも適宜利用さ
れる。即ちポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行つた後、ゲルを2.45ｍＭニトロブルーテトラ
ゾリウム溶液に20分間浸す。次いで28ｍＭテト
ラエチルエチレンジアミン、0.028ｍＭリボフ
ラビン、36ｍＭリン酸カリウム（PH7.8）の混
合液に15分間浸した後、ゲルを試験管に入れ、
15W螢光灯下で30分間照射すると、リボフラビ
ンの光還元により発生したスーパーオキシドイ
オン、O2 -、がニトロブルーテトラゾリウムを
還元して、スーパーオキシドデイスムターゼ活
性のある部位以外はブルー・フオルマザンを形
成し青紫色に染色される。 蛋白質はローリー法〔ザ・ジヤーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（The
Journal of Biological Chemistry）193巻、
265〜275頁、1951年〕により定量される。 本発明のスーパーオキシドデイスムターゼは、
公知のスーパーオキシドデイスムターゼとは物性
が異なる。すなわち、公知のものとしてはエシエ
リヒア・コリＢ（Escherichia coli Ｂ）から得ら
れるもの〔ザ・ジヤーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（The Journal of Biological
Chemistry）vol.245、No.22、pp、6176−6181、
1970参照〕、バチルス・ステアロサーモフイルス
（Bacillus stearothermophilus）から得られるも
の〔ジヤーナル・オブ・モレキユラー・バイオロ
ジー（Journal of Molecular Biology）
vol.105、pp.333−335、1976参照〕が挙げられる
が、エシエリヒア・コリから得られるものの分子
量は39500であり、バチルス・ステアロサーモフ
イルスから得られるものの分子量は40000である。
ところが本発明の酵素の分子量は約4.8×104であ
り、したがつて分子量が大きく異なる。それ由、
本発明のスーパーオキシドデイスムターゼは新規
酵素と考えられる。 本発明の酵素スーパーオキシドデイスムターゼ
は、抗炎症作用を有するので、抗炎症剤として用
いることができる。たとえば、本発明の酵素
（3000u／mgの標品）を通常行われるラツト後肢
のカラゲニン浮腫法（van Arman，C.G.，
etal：J.Pharmac.exp.Ther.，150，328（1965））
で、1.0mg／Kg以上を静脈内に投与することによ
り明らかに浮腫抑制効果を示す。 本発明の酵素は、通常の方法に従つて錠剤、注
射剤、軟膏剤などの製剤とし、１日投与量１〜５
mg／Kgを哺乳動物（例、マウス、ラツト、ウサ
ギ、ネコ、犬、サル、人）に、該動物の各種急性
もしくは亜急性の炎症〔例、浮腫（例、関節炎、
気管支炎、打撲による浮腫、火傷）〕の治療を目
的として、経口または非経口的に投与し得る。 本発明の酵素の毒性は低く、たとえば、ラツト
腹腔内に60mg／Kgとなる量を注射で投与しても死
亡例を認めない。 以下、実施例に示すが、本発明は以下の実施例
の範囲に限定されるものではない。パーセント
（％）は特にことわりのなかぎり、重量／容量パ
ーセント（Ｗ／Ｖ％）を表わす。 実施例 １ 脱脂大豆粉1.0％、カゼイン1.5％、リン酸二ア
ンモニウム0.6％、塩化ナトリウム0.1％、塩化カ
リウム0.05％、塩化カルシウム0.02％、硫酸マグ
ネシウム0.02％、炭酸カルシウム1.0％、炭酸亜
鉛0.0021％、大豆油0.6％、アクトコール0.1％か
ら成る液体培地（PH7.0に調節）40mlを200ml容三
角フラスコに分注し、120℃で20分間蒸気滅菌し
た。これに下記の各種セラチア属菌株の一白金耳
量を接種し、28℃で毎分230回転のロータリー式
振盪培養機で48時間培養した。培養終了後、培養
物から遠心分離法により集菌し、−20℃で凍結保
存した。凍結菌体10ｇをとり、30℃で融解後、こ
れに20ｍＭリン酸緩衝液（PH7.8）を40ml加え、
超音波処理（2A、５分間）で菌体を破砕した。
この破砕菌体から遠心分離法により上清をえた。
この上清液についてスーパーオキシドデイスムタ
ーゼの力価を先にのべたキサンチン・キサンチン
オキシダーゼ・チトクロームＣ法およびポリアク
リルアミドゲル電気泳動法で測定した。結果は次
表に示す通りで、セラチア属に属するいずれの菌
株とも、その菌体内には強力なスーパーオキシド
デイスムターゼを蓄積していることを認めた。
当り約1.5ｇ原子のマンガンを含んでいる。従
つて本酵素はMn型スーパーオキシドデイスム
ターゼであることが伴る。 なお酵素力価の測定は次のようにして行われ
る。 (イ) ザ・ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（The Journal of Biological
Chemistry）244巻、6049〜6055頁、1969年に
記載の方法に従う。即ち、光路１cmセルに100
ｍＭリン酸緩衝液（PH7.8）1.5ml、60μMチト
クロームC0.5ml、0.6ｍＭエチレンジアミン四
酢酸ナトリウム0.5ml、0.66ｍＭキサンチン0.25
ml、測定可能な濃度にPH7.8のリン酸緩衝液で
希釈した酵素液0.21mlを入れ、これにキサンチ
ンオキシダーゼ溶液0.04mlを添加し全量を3.0
mlとし、分光光度計にセツトして、25℃で反応
を開始し、550nｍにおけるチトクロームＣ還
元の初速度（ｖ）を測定する。また酵素液の代
りに蒸留水を加えた時のチトクロームＣの還元
初速度（Ｖ）をも測定する。酵素力価は上記反
応条件下、チトクロームＣの還元初速度を50％
阻害する酵素量を１単位とし、次式より算出す
る。 Ｕ／mg＝（Ｖ）−（ｖ）／（ｖ）×酵素量（mg）／反応
液1.0ml (ロ) アナリテイカル・バイオケミストリー
（Analytical Biochemistry）44巻、276〜287
頁、1971年に記載の活性染色法をも適宜利用さ
れる。即ちポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行つた後、ゲルを2.45ｍＭニトロブルーテトラ
ゾリウム溶液に20分間浸す。次いで28ｍＭテト
ラエチルエチレンジアミン、0.028ｍＭリボフ
ラビン、36ｍＭリン酸カリウム（PH7.8）の混
合液に15分間浸した後、ゲルを試験管に入れ、
15W螢光灯下で30分間照射すると、リボフラビ
ンの光還元により発生したスーパーオキシドイ
オン、O2 -、がニトロブルーテトラゾリウムを
還元して、スーパーオキシドデイスムターゼ活
性のある部位以外はブルー・フオルマザンを形
成し青紫色に染色される。 蛋白質はローリー法〔ザ・ジヤーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（The
Journal of Biological Chemistry）193巻、
265〜275頁、1951年〕により定量される。 本発明のスーパーオキシドデイスムターゼは、
公知のスーパーオキシドデイスムターゼとは物性
が異なる。すなわち、公知のものとしてはエシエ
リヒア・コリＢ（Escherichia coli Ｂ）から得ら
れるもの〔ザ・ジヤーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（The Journal of Biological
Chemistry）vol.245、No.22、pp、6176−6181、
1970参照〕、バチルス・ステアロサーモフイルス
（Bacillus stearothermophilus）から得られるも
の〔ジヤーナル・オブ・モレキユラー・バイオロ
ジー（Journal of Molecular Biology）
vol.105、pp.333−335、1976参照〕が挙げられる
が、エシエリヒア・コリから得られるものの分子
量は39500であり、バチルス・ステアロサーモフ
イルスから得られるものの分子量は40000である。
ところが本発明の酵素の分子量は約4.8×104であ
り、したがつて分子量が大きく異なる。それ由、
本発明のスーパーオキシドデイスムターゼは新規
酵素と考えられる。 本発明の酵素スーパーオキシドデイスムターゼ
は、抗炎症作用を有するので、抗炎症剤として用
いることができる。たとえば、本発明の酵素
（3000u／mgの標品）を通常行われるラツト後肢
のカラゲニン浮腫法（van Arman，C.G.，
etal：J.Pharmac.exp.Ther.，150，328（1965））
で、1.0mg／Kg以上を静脈内に投与することによ
り明らかに浮腫抑制効果を示す。 本発明の酵素は、通常の方法に従つて錠剤、注
射剤、軟膏剤などの製剤とし、１日投与量１〜５
mg／Kgを哺乳動物（例、マウス、ラツト、ウサ
ギ、ネコ、犬、サル、人）に、該動物の各種急性
もしくは亜急性の炎症〔例、浮腫（例、関節炎、
気管支炎、打撲による浮腫、火傷）〕の治療を目
的として、経口または非経口的に投与し得る。 本発明の酵素の毒性は低く、たとえば、ラツト
腹腔内に60mg／Kgとなる量を注射で投与しても死
亡例を認めない。 以下、実施例に示すが、本発明は以下の実施例
の範囲に限定されるものではない。パーセント
（％）は特にことわりのなかぎり、重量／容量パ
ーセント（Ｗ／Ｖ％）を表わす。 実施例 １ 脱脂大豆粉1.0％、カゼイン1.5％、リン酸二ア
ンモニウム0.6％、塩化ナトリウム0.1％、塩化カ
リウム0.05％、塩化カルシウム0.02％、硫酸マグ
ネシウム0.02％、炭酸カルシウム1.0％、炭酸亜
鉛0.0021％、大豆油0.6％、アクトコール0.1％か
ら成る液体培地（PH7.0に調節）40mlを200ml容三
角フラスコに分注し、120℃で20分間蒸気滅菌し
た。これに下記の各種セラチア属菌株の一白金耳
量を接種し、28℃で毎分230回転のロータリー式
振盪培養機で48時間培養した。培養終了後、培養
物から遠心分離法により集菌し、−20℃で凍結保
存した。凍結菌体10ｇをとり、30℃で融解後、こ
れに20ｍＭリン酸緩衝液（PH7.8）を40ml加え、
超音波処理（2A、５分間）で菌体を破砕した。
この破砕菌体から遠心分離法により上清をえた。
この上清液についてスーパーオキシドデイスムタ
ーゼの力価を先にのべたキサンチン・キサンチン
オキシダーゼ・チトクロームＣ法およびポリアク
リルアミドゲル電気泳動法で測定した。結果は次
表に示す通りで、セラチア属に属するいずれの菌
株とも、その菌体内には強力なスーパーオキシド
デイスムターゼを蓄積していることを認めた。
【表】
実施例 ２
(イ) 集菌
実施例１で使用した液体培地と同一組成の培
地500mlを２の坂口フラスコに分注、減菌し、
これにセラチア・マルセツセンスIFO3736を接
種して、28℃で毎分230回転のロータリー式振
盪培養機で24時間培養し種培養を調製した。同
じ組成の培地100を200のタンクに注入し、
これに前記の種培養物を接種し、培養温度28℃
毎分100の空気を送りながら、通気撹拌培養
を20時間行つた。この培養物から遠心分離法に
より菌体を採取し、−20℃で凍結保存した。 (ロ) 粗酵素標品の調製 凍結保存菌体1.5Kgを30℃で融解し、これに
３の20ｍＭリン酸緩衝液（PH7.8）を加え、
ダイノミル（ウイリー・エ・バツコーフエン社
製、スイス）装置で菌体を破砕し、シヤープレ
ス遠心分離機にかけて澄明な上清液をえた。こ
の上清液から硫酸アンモニウム30〜70％（Ｗ／
Ｖ）で生じてくる沈澱物を遠心分離法で集め
た。この沈澱物を少量の0.1MKClを含んだ20
ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解し、セロフ
アン・チユーブに入れ、同一緩衝液に対して３
日間透析した。透析内液150mlをダイアフロー
UM−５（アミコン社製（アメリカ）、限外過
膜）の膜で限外過法により30mlにまで濃縮し
た。この濃縮液を予め同一緩衝液で平衡化した
セフアデツクスＧ−150（フアルマシア社製）の
カラム（4.0×66.0cm）に負荷し、同一緩衝液
で溶出し、酵素活性を有する画分210mlを集め
た。この画分に硫酸アンモニウムを70％（Ｗ／
Ｖ）まで加え、生じた沈澱物を遠心分離法で集
め、これを少量の水に溶解し、セロフアンチユ
ーブに入れ、水に対して３日間透析後、透析内
液を凍結乾燥に付し、粗酵素標品620mgをえた。
この標品の比活性は、3600U／mg・proteinで
あつた。 (ハ) 精製標品の調整 (i) ジエチルアミノエチセルロースのカラムク
ロマトグラフイー (ロ)で得た粗酵素標品620mgを少量の20ｍＭ
トリス−塩基緩衝液（PH9.0）で溶解し、セ
ロフアンチユーブに入れ、同一の緩衝液に対
して３日間透析した。この透析内液80mlを予
め同一緩衝液で平衡化したジエチルアミノエ
チルセルロースのカラム（2.5×45.0cm）に
負荷させた後、同一緩衝液中で塩化ナトリウ
ム濃度を直線的に０〜250ｍＭに上げること
により酵素を溶出し、酵素活性を有する画分
45mlを集めた。 (ii) セフアデツクスＧ−100によるゲル過(i)
でえた酵素液45mlをセロフアンチユーブに入
れ、0.1M KClを含んだ20ｍＭリン酸緩衝液
に対して透析した。透析内液60mlをダイアフ
ローUM−５の膜で限外過法により6.0ml
まで濃縮した。この濃縮を予め同一緩衝液で
平衡化したセフアデツクスＧ−100（フアルマ
シア社製）のカラム（2.6×74.0cm）に負荷
し、同一緩衝液で溶出し、酵素活性を有した
赤紫色の溶出画分を集めた。このようにして
えられたいずれの画分もその比活性に変動が
なく、またポリアクリルアミドゲル電気泳動
法でも単一であるMn型スーパーオキシドデ
イスムターゼ標品24mgをえた。この精製標品
の比活性は12000U／mg・proteinであつた。 参考例 １ セラチア・マルセツセンスIFO3759を実施例２
と同様の方法で処理し、凍結菌体1.5Kgから、粗
酵素標品410mgをえた。この標品の比活性は
3630U／mg・proteinであつた。またこの粗酵素
より実施例２と同じ方法で、精製したMnスーパ
ーオキシドデイスムターゼ標品をえた。この精製
標品の比活性は12000U／mg・proteinであつた。 参考例 ２ セラチア・マリノルブラIFO12973を実施例２
と同様の方法で処理し、凍結菌体1.5Kgから、粗
酵素標品830mgをえた。この標品の比活性は
3800U／mg・proteinであつた。
地500mlを２の坂口フラスコに分注、減菌し、
これにセラチア・マルセツセンスIFO3736を接
種して、28℃で毎分230回転のロータリー式振
盪培養機で24時間培養し種培養を調製した。同
じ組成の培地100を200のタンクに注入し、
これに前記の種培養物を接種し、培養温度28℃
毎分100の空気を送りながら、通気撹拌培養
を20時間行つた。この培養物から遠心分離法に
より菌体を採取し、−20℃で凍結保存した。 (ロ) 粗酵素標品の調製 凍結保存菌体1.5Kgを30℃で融解し、これに
３の20ｍＭリン酸緩衝液（PH7.8）を加え、
ダイノミル（ウイリー・エ・バツコーフエン社
製、スイス）装置で菌体を破砕し、シヤープレ
ス遠心分離機にかけて澄明な上清液をえた。こ
の上清液から硫酸アンモニウム30〜70％（Ｗ／
Ｖ）で生じてくる沈澱物を遠心分離法で集め
た。この沈澱物を少量の0.1MKClを含んだ20
ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解し、セロフ
アン・チユーブに入れ、同一緩衝液に対して３
日間透析した。透析内液150mlをダイアフロー
UM−５（アミコン社製（アメリカ）、限外過
膜）の膜で限外過法により30mlにまで濃縮し
た。この濃縮液を予め同一緩衝液で平衡化した
セフアデツクスＧ−150（フアルマシア社製）の
カラム（4.0×66.0cm）に負荷し、同一緩衝液
で溶出し、酵素活性を有する画分210mlを集め
た。この画分に硫酸アンモニウムを70％（Ｗ／
Ｖ）まで加え、生じた沈澱物を遠心分離法で集
め、これを少量の水に溶解し、セロフアンチユ
ーブに入れ、水に対して３日間透析後、透析内
液を凍結乾燥に付し、粗酵素標品620mgをえた。
この標品の比活性は、3600U／mg・proteinで
あつた。 (ハ) 精製標品の調整 (i) ジエチルアミノエチセルロースのカラムク
ロマトグラフイー (ロ)で得た粗酵素標品620mgを少量の20ｍＭ
トリス−塩基緩衝液（PH9.0）で溶解し、セ
ロフアンチユーブに入れ、同一の緩衝液に対
して３日間透析した。この透析内液80mlを予
め同一緩衝液で平衡化したジエチルアミノエ
チルセルロースのカラム（2.5×45.0cm）に
負荷させた後、同一緩衝液中で塩化ナトリウ
ム濃度を直線的に０〜250ｍＭに上げること
により酵素を溶出し、酵素活性を有する画分
45mlを集めた。 (ii) セフアデツクスＧ−100によるゲル過(i)
でえた酵素液45mlをセロフアンチユーブに入
れ、0.1M KClを含んだ20ｍＭリン酸緩衝液
に対して透析した。透析内液60mlをダイアフ
ローUM−５の膜で限外過法により6.0ml
まで濃縮した。この濃縮を予め同一緩衝液で
平衡化したセフアデツクスＧ−100（フアルマ
シア社製）のカラム（2.6×74.0cm）に負荷
し、同一緩衝液で溶出し、酵素活性を有した
赤紫色の溶出画分を集めた。このようにして
えられたいずれの画分もその比活性に変動が
なく、またポリアクリルアミドゲル電気泳動
法でも単一であるMn型スーパーオキシドデ
イスムターゼ標品24mgをえた。この精製標品
の比活性は12000U／mg・proteinであつた。 参考例 １ セラチア・マルセツセンスIFO3759を実施例２
と同様の方法で処理し、凍結菌体1.5Kgから、粗
酵素標品410mgをえた。この標品の比活性は
3630U／mg・proteinであつた。またこの粗酵素
より実施例２と同じ方法で、精製したMnスーパ
ーオキシドデイスムターゼ標品をえた。この精製
標品の比活性は12000U／mg・proteinであつた。 参考例 ２ セラチア・マリノルブラIFO12973を実施例２
と同様の方法で処理し、凍結菌体1.5Kgから、粗
酵素標品830mgをえた。この標品の比活性は
3800U／mg・proteinであつた。
第１図は実施例２で得られたスーパーオキシド
デイスムターゼのPH作用曲線を、第２図はそのPH
安定曲線を、第３図はその熱安定性を、第４図は
その紫外部領域における吸収スペクトルを、第５
図はその可視部領域における吸収スペクトルを、
第６図はその赤外線吸収スペクトルをそれぞれ表
わす。
デイスムターゼのPH作用曲線を、第２図はそのPH
安定曲線を、第３図はその熱安定性を、第４図は
その紫外部領域における吸収スペクトルを、第５
図はその可視部領域における吸収スペクトルを、
第６図はその赤外線吸収スペクトルをそれぞれ表
わす。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の性状を有する比活性3000以上のMn型ス
ーパーオキシドデイスムターゼ： (a) 作用：スーパーオキシドイオンを過酸化水素
分子と酸素分子とに不均化する。 (b) 基質特異性：スーパーオキシドイオンに作用
する。 (c) 至適PH範囲：約７〜８ (d) 安定PH範囲：約６〜11 (e) 作用適温の範囲：約20〜45℃ (f) 失活の条件：30℃60分間処理で安定。 50〜60℃60分間処理で約50％失活。 80℃５分間でほぼ100％失活。 (g) 分子量：約4.8×104（ゲル過法による）。 (h) 元素分析： C48.90±2.0％、 Ｈ 7.05±2.0％、 N14.80±2.0％。 (i) 可視部吸収スペクトル：470〜475nｍ（極大
吸収）、375〜380nｍ（極小吸収）、610nｍ付近
（肩）。 (j) 分子吸光係数：280nｍにおいて約 1.08×105M-1・cm-1 (k) 加水分解により、アミノ酸としてリジン、ヒ
スチジン、アルギニン、グリシン、アラニン、
トリプトフアン、アスパラギン酸、スレオニ
ン、バリン、メチオニン、イソロイシン、セリ
ン、グリタミン酸、プロリン、ロイシン、チロ
シン及びフエニルアラニンが検出される。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10564580A JPS5729285A (en) | 1980-07-30 | 1980-07-30 | Superoxide dismutase and its preparation |
| CA000382808A CA1182061A (en) | 1980-07-30 | 1981-07-29 | Superoxide dismutase, its production and use |
| AT81303498T ATE23188T1 (de) | 1980-07-30 | 1981-07-30 | Mn-superoxyddismutase, ihre herstellung und ihre verwendung. |
| DE8181303498T DE3175526D1 (en) | 1980-07-30 | 1981-07-30 | Mn-superoxide dismutase, its production and use |
| EP81303498A EP0045222B1 (en) | 1980-07-30 | 1981-07-30 | Mn-superoxide dismutase, its production and use |
| US06/656,418 US4563349A (en) | 1980-07-30 | 1984-10-01 | Superoxide dismutase, its immobilized form, and their production and use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10564580A JPS5729285A (en) | 1980-07-30 | 1980-07-30 | Superoxide dismutase and its preparation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5729285A JPS5729285A (en) | 1982-02-17 |
| JPH0244508B2 true JPH0244508B2 (ja) | 1990-10-04 |
Family
ID=14413184
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10564580A Granted JPS5729285A (en) | 1980-07-30 | 1980-07-30 | Superoxide dismutase and its preparation |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0045222B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5729285A (ja) |
| AT (1) | ATE23188T1 (ja) |
| CA (1) | CA1182061A (ja) |
| DE (1) | DE3175526D1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5816685A (ja) * | 1981-07-22 | 1983-01-31 | Takeda Chem Ind Ltd | 固定化酵素，その製造法および製剤 |
| EP0070656B1 (en) * | 1981-07-22 | 1986-09-24 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Immobilized superoxide dismutase, its production and pharmaceutical composition |
| CA1272943A (en) * | 1985-03-01 | 1990-08-21 | Toshiro Hanada | Process for determining superoxide dismutase activity |
| ES8800982A1 (es) * | 1985-07-05 | 1987-12-01 | Takeda Chemical Industries Ltd | Un metodo para producir la enzima superoxido-dismutasa modificada con derivados de polietilenglicol y triazina. |
| JPS6219284A (ja) * | 1985-07-16 | 1987-01-28 | Osaka Gas Co Ltd | 塗装方法 |
| US5248603A (en) * | 1985-09-03 | 1993-09-28 | Symbicom Aktiebolag | Superoxide dismutase |
| DK402785D0 (da) * | 1985-09-03 | 1985-09-03 | Syn Tek Ab | Fremgangsmaade til fremstilling af et enzym |
| JPS6279778A (ja) * | 1985-10-04 | 1987-04-13 | Suntory Ltd | 新規ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼ及びその製造方法 |
| JPS63132820A (ja) * | 1986-11-22 | 1988-06-04 | Minoru Nakano | 口腔用組成物 |
| JPS63176703A (ja) * | 1987-01-14 | 1988-07-21 | Toyo Tire & Rubber Co Ltd | 小型バイアスタイヤ |
| KR910004362B1 (ko) * | 1989-04-29 | 1991-06-26 | 영진약품공업 주식회사 | 세라티아 sp.Y-4가 생산하는 신규의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 그의 생산방법 |
| DK455789D0 (da) * | 1989-09-15 | 1989-09-15 | Symbicom Ab | Polypeptid |
| US5416071A (en) * | 1991-03-12 | 1995-05-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Water-soluble composition for sustained-release containing epo and hyaluronic acid |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0070656B1 (en) * | 1981-07-22 | 1986-09-24 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Immobilized superoxide dismutase, its production and pharmaceutical composition |
-
1980
- 1980-07-30 JP JP10564580A patent/JPS5729285A/ja active Granted
-
1981
- 1981-07-29 CA CA000382808A patent/CA1182061A/en not_active Expired
- 1981-07-30 DE DE8181303498T patent/DE3175526D1/de not_active Expired
- 1981-07-30 AT AT81303498T patent/ATE23188T1/de active
- 1981-07-30 EP EP81303498A patent/EP0045222B1/en not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.GEN.APPL.MICROBIOL=1976 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE23188T1 (de) | 1986-11-15 |
| EP0045222A3 (en) | 1982-08-04 |
| EP0045222B1 (en) | 1986-10-29 |
| JPS5729285A (en) | 1982-02-17 |
| CA1182061A (en) | 1985-02-05 |
| DE3175526D1 (en) | 1986-12-04 |
| EP0045222A2 (en) | 1982-02-03 |
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