JPS59162882A - プラスミド - Google Patents
プラスミドInfo
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- JPS59162882A JPS59162882A JP58036307A JP3630783A JPS59162882A JP S59162882 A JPS59162882 A JP S59162882A JP 58036307 A JP58036307 A JP 58036307A JP 3630783 A JP3630783 A JP 3630783A JP S59162882 A JPS59162882 A JP S59162882A
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- Japan
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- plasmid
- leucine
- dehydrogenase
- leucine dehydrogenase
- gene
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子を有す
る新規プラスミドに関するものである。
る新規プラスミドに関するものである。
ロイシン脱水素酵素は、臨床検査用酵素として。
非常に重要な酵素である。このロイシン脱水素酵素を生
産できる微生物としては、常温菌であるバチルス・スフ
エリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ
）のようなバチルス菌の細菌が知られている。しかし、
これらの菌より得られるロイシン脱水素酵素は、室温の
水溶液中で１〜３週間のうちに活性をほとんどを失うの
が通例であり、熱安定性及び長期の安定性欠けるもので
あるという大きな欠点を有している。
産できる微生物としては、常温菌であるバチルス・スフ
エリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ
）のようなバチルス菌の細菌が知られている。しかし、
これらの菌より得られるロイシン脱水素酵素は、室温の
水溶液中で１〜３週間のうちに活性をほとんどを失うの
が通例であり、熱安定性及び長期の安定性欠けるもので
あるという大きな欠点を有している。
それゆえ、ロイシン脱水素酵素を用いる臨床検査の分析
法の利点を最大限に発揮するうえで、熱に安定で、室温
で長期間活性を失わないロイシン脱水素酵素の出現が熱
望されていた。
法の利点を最大限に発揮するうえで、熱に安定で、室温
で長期間活性を失わないロイシン脱水素酵素の出現が熱
望されていた。
このこめ、先に本発明者らの一部が、このような観点か
ら、熱に安定で、長期間活性を失わない性質を有するロ
イシン脱水素酵素を求めて鋭意研究した結果、好熱性の
バチルス属に属する細菌に上記の性質を有するロイシン
脱水素酵素が存在することを見い出し、特許出願し、さ
らに生化学。
ら、熱に安定で、長期間活性を失わない性質を有するロ
イシン脱水素酵素を求めて鋭意研究した結果、好熱性の
バチルス属に属する細菌に上記の性質を有するロイシン
脱水素酵素が存在することを見い出し、特許出願し、さ
らに生化学。
Ｖｏｌ、旦ユ第６３４頁、 （１９８２年）に発表し
た。
た。
しかし、この好熱性のバチルス属に属する細菌は、耐熱
性のロイシン脱水素酵素の生産性が低く。
性のロイシン脱水素酵素の生産性が低く。
この酵素を効率良く得るには十分満足しうるものではな
かった。
かった。
一方、ニジエリチア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ）属に
属する細菌は１本来ロイシン脱水素酵素生産能を全く有
していない。
属する細菌は１本来ロイシン脱水素酵素生産能を全く有
していない。
また２組換ＤＮＡ遺伝子工学に有用なプラスミドは良く
知られている。例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
）１９８巻、 １０５６頁（１９７８年）には、プラ
スミドｐＢＲ３２２にラクトースプロモーターをつない
だプラスミドを導入した大腸菌内で動物のタンパク質が
生産されることが記載されている。
知られている。例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
）１９８巻、 １０５６頁（１９７８年）には、プラ
スミドｐＢＲ３２２にラクトースプロモーターをつない
だプラスミドを導入した大腸菌内で動物のタンパク質が
生産されることが記載されている。
また、特開昭５６−５０９３号公報には、サーマス属に
属する細菌の遺伝子を有するプラスミド（ベクターとし
てプラスミドｐＢＲ３２２が用いられている。）を導入
することにより形質転換されたエンシェリチア（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ）属に属する細菌を用いて耐熱性の
酵素を調整することが記載されているが。
属する細菌の遺伝子を有するプラスミド（ベクターとし
てプラスミドｐＢＲ３２２が用いられている。）を導入
することにより形質転換されたエンシェリチア（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ）属に属する細菌を用いて耐熱性の
酵素を調整することが記載されているが。
耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子を有するプラスミ
ドについては、全く何も記載されていなし。
ドについては、全く何も記載されていなし。
また、その創製に成功したとの報告もなされていない。
そこで２本発明者らは、耐熱性のロイシン脱水素酵素の
生産性を向上させるために常温微生物内で耐熱性のロイ
シン脱水素酵素が発現できるプラスミドを求めて鋭意研
究した結果、好熱性の微生物からロイシン脱水素酵素の
遺伝子を分離し、この遺伝子が公知のプラスミドＤＮＡ
に導入しうろこと及びこのようにして遺伝子を導入して
得たプラスミドが前記の性質を有することを見い出し１
本発明を完成した。
生産性を向上させるために常温微生物内で耐熱性のロイ
シン脱水素酵素が発現できるプラスミドを求めて鋭意研
究した結果、好熱性の微生物からロイシン脱水素酵素の
遺伝子を分離し、この遺伝子が公知のプラスミドＤＮＡ
に導入しうろこと及びこのようにして遺伝子を導入して
得たプラスミドが前記の性質を有することを見い出し１
本発明を完成した。
すなわち１本発明は、耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺
伝子を有するプラスミドである。
伝子を有するプラスミドである。
本発明のプラスミドを得るには１例えば、バイオケミ力
・エト・バイオフイジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｔ＋ａｍ。
・エト・バイオフイジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｔ＋ａｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ ａｃｔａ） ７２． ６１９〜６２９
（１９６３）に記載の方法に従い、耐熱性のロイシ
ン脱水素酵素の遺伝子とベクターとしての役割を有する
ＤＮＡとを制限酵素で消化し５次いでリガーゼを用いて
結合することにより調整することができる。
（１９６３）に記載の方法に従い、耐熱性のロイシ
ン脱水素酵素の遺伝子とベクターとしての役割を有する
ＤＮＡとを制限酵素で消化し５次いでリガーゼを用いて
結合することにより調整することができる。
本発明に好ましく用いられる耐熱性のロイシン脱水素酵
素の遺伝子としては、好熱性の微生物の染色体ＤＮＡ由
来のロイシン脱水素酵素の遺伝子があげられる。この好
熱性の微生物としては、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ）
属に属する細菌や好熱性のバチルス属に属する細菌があ
げられるが、特に好熱性のバチルス属に属する細菌が好
ましい。・その中でもロイシン脱水素酵素の活性が高い
バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ−匹■用）が好ましい。ス
テアロサーモフィルスの具体例としては、 ＴＦＯ１
２２５０，ＡＴＣＣ７９５３，７９５４゜８００５、
１０１９４． １２９８０． ＮＣ八へ５０３などがあ
る。
素の遺伝子としては、好熱性の微生物の染色体ＤＮＡ由
来のロイシン脱水素酵素の遺伝子があげられる。この好
熱性の微生物としては、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ）
属に属する細菌や好熱性のバチルス属に属する細菌があ
げられるが、特に好熱性のバチルス属に属する細菌が好
ましい。・その中でもロイシン脱水素酵素の活性が高い
バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ−匹■用）が好ましい。ス
テアロサーモフィルスの具体例としては、 ＴＦＯ１
２２５０，ＡＴＣＣ７９５３，７９５４゜８００５、
１０１９４． １２９８０． ＮＣ八へ５０３などがあ
る。
また、ベクターとしての役割を有するＤＮＡとしては２
例えば、プラスミドＤＮＡがあげられ、特にプラスミド
ｐＢＲ３２２が好ましい。また、制限酵素としては、た
とえば皿があげられ、リガーゼとしては２例えばＴ４Ｄ
Ｎ＾リガーゼがあげられる。
例えば、プラスミドＤＮＡがあげられ、特にプラスミド
ｐＢＲ３２２が好ましい。また、制限酵素としては、た
とえば皿があげられ、リガーゼとしては２例えばＴ４Ｄ
Ｎ＾リガーゼがあげられる。
本発明のプラスミドとしては１例えば、前記した方法で
プラスミドｐＢＲ３２２に、バチルス・ステアロサーモ
フィルスの染色体ＤＮＡ由来めロイシン脱水素酵素の遺
伝子を導入したプラスミドｐｌｃＲ１があげられる。こ
のプラスミドｐＩｃＲ１を昭和５８！ｆ−２月２３日に
通産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託の手続を
行ったが、このプラスミドは受託されなかった。
プラスミドｐＢＲ３２２に、バチルス・ステアロサーモ
フィルスの染色体ＤＮＡ由来めロイシン脱水素酵素の遺
伝子を導入したプラスミドｐｌｃＲ１があげられる。こ
のプラスミドｐＩｃＲ１を昭和５８！ｆ−２月２３日に
通産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託の手続を
行ったが、このプラスミドは受託されなかった。
次にこのプラスミドｐｌｃＲ１の理化学的性質を示す。
（１）常温微生物内で耐熱性のロイシン脱水素酵素を発
現させることができる。
現させることができる。
（２）下記制限酵素に対し１次の切断感受性を有する。
制限酵素 切断部位数
１１ｉｃｏＲＩ ２
肛吋１１１［’ １
ハ見■２
Ｓａｔ Ｌ ４
回Ｉ２
制限酵素の名称は次の菌種から得られる制限酵素の略称
である。
である。
ＥｃｏＲＩ ；ニジエリチア・コリ
Ｈ４ｎｄＩＩＩ ；ヘモフィラス・インフルエンザＰｓ
ｔ Ｉ ；プロビデンシア・スチュアーティーＳａｌ
Ｉ ｉストレプトマイセス・アルプスＢａｍＨＩ ；バ
チルス・アミロリクエファシェンス制限酵素による切断
部位数は、過剰の制限酵素存在下でプラスミドｐｌｃｌ
ｌ ｌを消化し、その消化物をアガロースゲル電気泳動
にかけ２分離可能な断片の数から決定される。
ｔ Ｉ ；プロビデンシア・スチュアーティーＳａｌ
Ｉ ｉストレプトマイセス・アルプスＢａｍＨＩ ；バ
チルス・アミロリクエファシェンス制限酵素による切断
部位数は、過剰の制限酵素存在下でプラスミドｐｌｃｌ
ｌ ｌを消化し、その消化物をアガロースゲル電気泳動
にかけ２分離可能な断片の数から決定される。
（３）分子量は約６メガダルトンである。
本発明のプラスミドは１例えば、常温で生育する細菌に
導入することができ、このプラスミドを導入することに
より、形質転換された細菌を得ることができる。この常
温で生育する細菌としては例えば、ニジエリチア（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ）属に属する細菌があげられ、特
にニジエリチアコリ （Ｈｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏ
１１）が好ましい。そのニジエリア コリの具体例とし
て、ニジエリチアコリＣ６００があげられる。
導入することができ、このプラスミドを導入することに
より、形質転換された細菌を得ることができる。この常
温で生育する細菌としては例えば、ニジエリチア（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ）属に属する細菌があげられ、特
にニジエリチアコリ （Ｈｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏ
１１）が好ましい。そのニジエリア コリの具体例とし
て、ニジエリチアコリＣ６００があげられる。
また９本発明のプラスミドを２例えば、上記常温で生育
する細菌に導入するには２例えば。
する細菌に導入するには２例えば。
ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオ゛ロジー（Ｊ、
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 ） ５３，１５９〜１６２ （
１９７０）の方法に従って、０℃付近の温度で塩化カル
シウム処理した上記細菌と本発明のプラスミドとを接触
させることにより行えばよい。
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 ） ５３，１５９〜１６２ （
１９７０）の方法に従って、０℃付近の温度で塩化カル
シウム処理した上記細菌と本発明のプラスミドとを接触
させることにより行えばよい。
以上のようにして形質転換された細菌の例と６’１３７
号）があげられる。この菌株は。
号）があげられる。この菌株は。
（Ｎａｔｕｒｅ ２亘、 １１１０〜１１１４ （１９
６８）を参照。〕と、耐熱性のロイシン脱水素酵素生産
能及びアンピシリン耐性を有する意思外は同じ菌学的性
質を有している。この菌株は、非伝達性を伝達性に変え
ることなく、また非病原性を病原性に変えることなく安
全性が保持されている。
６８）を参照。〕と、耐熱性のロイシン脱水素酵素生産
能及びアンピシリン耐性を有する意思外は同じ菌学的性
質を有している。この菌株は、非伝達性を伝達性に変え
ることなく、また非病原性を病原性に変えることなく安
全性が保持されている。
本発明のプラスミドは、上記したように有用な微生物５
例えば、常温で生育する細菌を形質転換して耐熱性のロ
イシン脱水酵素生産能を賦与することができ、形質転換
された細菌がら耐熱性のロイシン脱水素酵素を大量に、
しかも容易に得ることができるので、非常に有用である
。
例えば、常温で生育する細菌を形質転換して耐熱性のロ
イシン脱水酵素生産能を賦与することができ、形質転換
された細菌がら耐熱性のロイシン脱水素酵素を大量に、
しかも容易に得ることができるので、非常に有用である
。
本発明によって得られる耐熱性のロイシン脱水素酵素は
、生化学、 Ｖｏｌ、５４．第６３４頁。
、生化学、 Ｖｏｌ、５４．第６３４頁。
（１９８２年）に記載の耐熱性のロイシン脱水素酵素と
同じ理化学的性質を有する。
同じ理化学的性質を有する。
次に本発明を実施例により具体的に説明する。
なお、耐熱性のロイシン脱水素酵素の活性はアミノ酸、
核酸〔へｍ１ｎｏ八ｃｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄ訂、８４〜８Ｂ （１９７３） ）に記載され
ているロイシン脱水素酵素活性の測定法、すなわち、
ｐＨ１１，３の１００．１７ ｍｏｌｅのグリシン−Ｋ
ＣＩ−ＫＯＨ緩衝液中で、 １：２５．ｃｚ ｍｏｌ
ｅの ＮＡＤと、 １０．ｃｒ ｍｏｌｅのＬ−ロイ
シンを含む混合液を調製し、その混合液に適当量の粗酵
素抽出液をかえて最終容量を０．８＋ｎｌとし、２５℃
あるいは５５℃における還元型ＮＡＩ）の単位時間あた
りの増加を３４０ｎｍの吸光度の増加として測定する方
法で行っだ゛。
核酸〔へｍ１ｎｏ八ｃｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄ訂、８４〜８Ｂ （１９７３） ）に記載され
ているロイシン脱水素酵素活性の測定法、すなわち、
ｐＨ１１，３の１００．１７ ｍｏｌｅのグリシン−Ｋ
ＣＩ−ＫＯＨ緩衝液中で、 １：２５．ｃｚ ｍｏｌ
ｅの ＮＡＤと、 １０．ｃｒ ｍｏｌｅのＬ−ロイ
シンを含む混合液を調製し、その混合液に適当量の粗酵
素抽出液をかえて最終容量を０．８＋ｎｌとし、２５℃
あるいは５５℃における還元型ＮＡＩ）の単位時間あた
りの増加を３４０ｎｍの吸光度の増加として測定する方
法で行っだ゛。
また、実施例及び参考側中の％は、容量％を示す。
実施例１
（ｉ）バチルス・ステアロサーモフィルスの染色体ＤＮ
Ａの分離。
Ａの分離。
バチルス・ステアロサーモフィルス ＩＰ０１２２５０
株から、バイオケミ力・エト・バイオフィジカ・アクタ
（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ａｃｔａ）互、
６１９−６２９ （１（１６３）に記載の方法に準じ
染色体ＤＮＡを分離した。
株から、バイオケミ力・エト・バイオフィジカ・アクタ
（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ａｃｔａ）互、
６１９−６２９ （１（１６３）に記載の方法に準じ
染色体ＤＮＡを分離した。
まず、バチルス・ステアロサーモフィルスＩＰ０１２２
５０株をグリセロール培地（ポリペプトン１０ｇ／ｆｆ
、酵母エキス２．５ｇ ／ ｌ 、肉エキス２ ｇ／Ｉ
！、、グリセロール２ｇ／β、塩化ナトリウム５ｇ／β
１．リン酸１カリウム２ｇ／ｊ！、 リン酸２カリウ
ム２ｇ／ｊ２．硫酸マグネシウム０．１ｇ／β、ビオチ
ン４μｇ／β。
５０株をグリセロール培地（ポリペプトン１０ｇ／ｆｆ
、酵母エキス２．５ｇ ／ ｌ 、肉エキス２ ｇ／Ｉ
！、、グリセロール２ｇ／β、塩化ナトリウム５ｇ／β
１．リン酸１カリウム２ｇ／ｊ！、 リン酸２カリウ
ム２ｇ／ｊ２．硫酸マグネシウム０．１ｇ／β、ビオチ
ン４μｇ／β。
そしてｐｉｆ ７．２に調り２４’で、５５℃で１２時
間振とう培養した後、遠心分離にて集菌した。
間振とう培養した後、遠心分離にて集菌した。
次に、 １２ｍｇのりゾチームを６ｍｌｍササ（ｓａ
ｌｉｎｅ） −ＥＤＴＡ熔液（０，１５Ｍ ＮａＣ］
と ０．ＩＭＥＤＴＡ’ｌｒ 含ミ、ｐＨａ、ｏニｉＪ
！ｉｔ！、 ） ニｆ６カシ、 コの溶液に集菌した菌
体を加え、よく攪拌した。
ｌｉｎｅ） −ＥＤＴＡ熔液（０，１５Ｍ ＮａＣ］
と ０．ＩＭＥＤＴＡ’ｌｒ 含ミ、ｐＨａ、ｏニｉＪ
！ｉｔ！、 ） ニｆ６カシ、 コの溶液に集菌した菌
体を加え、よく攪拌した。
これを３７℃で約１０分間加温し、菌体が溶菌し始めた
ら、直ちに凍結した。
ら、直ちに凍結した。
この凍結した菌体に５’Ｏｍｌのトリス−ＳＯ５緩衝液
（１％ＳＤＳと ０．ＩＭ ＮａＣ１を含むｐＨ９，０
に調製された０、１Ｍ ）リス緩衝液。）を加えて攪拌
し、さらに６０℃に加温し、完全に溶菌させた。
（１％ＳＤＳと ０．ＩＭ ＮａＣ１を含むｐＨ９，０
に調製された０、１Ｍ ）リス緩衝液。）を加えて攪拌
し、さらに６０℃に加温し、完全に溶菌させた。
この溶菌液に５６ｍ１の８０％フェノールを加えて、約
２０分間振とうさせ、フェノール抽出を行い、夾雑蛋白
質を除去した。この抽出された粗ＤＮＡ溶液に２倍容量
の冷エタノールを加えてガラス棒で繊維状の沈殿を巻き
取り、７ｏ。
２０分間振とうさせ、フェノール抽出を行い、夾雑蛋白
質を除去した。この抽出された粗ＤＮＡ溶液に２倍容量
の冷エタノールを加えてガラス棒で繊維状の沈殿を巻き
取り、７ｏ。
８０、９０％のエタノール各１０ｍ１’中に準じ、数分
ずつ浸漬した後、 ２０ｍ１の希すリンーサイトティレ
ート（５ａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（０，０１
５ＭＮａＣｌ、 ０．００１５Ｍ’Ｎａａ−クエン酸に
調製。）に熔かし、さらに１ｓａｌｔｎｅ−ｃｉｔｒａ
ｔｅ熔液（１，５ＭＮａＣ１，Ｏ，１５Ｍ Ｎａ５−ク
エン酸に調製。）を２ｍｌ加えて、粗ＤＮＡ液をｍＭし
た。
ずつ浸漬した後、 ２０ｍ１の希すリンーサイトティレ
ート（５ａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（０，０１
５ＭＮａＣｌ、 ０．００１５Ｍ’Ｎａａ−クエン酸に
調製。）に熔かし、さらに１ｓａｌｔｎｅ−ｃｉｔｒａ
ｔｅ熔液（１，５ＭＮａＣ１，Ｏ，１５Ｍ Ｎａ５−ク
エン酸に調製。）を２ｍｌ加えて、粗ＤＮＡ液をｍＭし
た。
この粗ＤＮＡ液を５００μｇ／ｍ１位にうすめてリボヌ
クレアーゼ（ＲＮａ５ｅ （シグマ社鮭）〕を５０μｇ
／ｍｌ、 ＲＮａ５ｅ Ｔ＋ （シグマ社製）を３０
Ｈｇ／ｍ＋になるように加え、３７℃で３０分間加温し
た。冷却後１等量の８０％フェノールを加え、フェノー
ル抽出を行い、抽出ＤＮＡをエタノール沈殿にて回収し
、さらに上記の希５ａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒａｔｅ熔液２
０ｍ ｌに溶解させ、さらに上記の濃５ａｌｉｎｅ−ｃ
ｉｔｒａｔｅ熔液を２ｍｌ加えることにより、染色体Ｄ
ＮＡの抽出液を調製した。
クレアーゼ（ＲＮａ５ｅ （シグマ社鮭）〕を５０μｇ
／ｍｌ、 ＲＮａ５ｅ Ｔ＋ （シグマ社製）を３０
Ｈｇ／ｍ＋になるように加え、３７℃で３０分間加温し
た。冷却後１等量の８０％フェノールを加え、フェノー
ル抽出を行い、抽出ＤＮＡをエタノール沈殿にて回収し
、さらに上記の希５ａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒａｔｅ熔液２
０ｍ ｌに溶解させ、さらに上記の濃５ａｌｉｎｅ−ｃ
ｉｔｒａｔｅ熔液を２ｍｌ加えることにより、染色体Ｄ
ＮＡの抽出液を調製した。
（ｉｉ ）ベクタープラスミドｐＢＲ３２２の調製。
プラスミドｐＢＲ３２２（Ｂｅｔｈｅａｄａ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を導入したニ
ジエリチア・コリＣ６００株を、２ｚのし一培地（ポリ
ペプトンｌＯｇ／／！、酵母エキス５ ｇ ／ ｊ！
、グルコースＩｇ／Ｃ塩化ナトリウム５ｇ／ｎでｐＨ７
，２に調製。）で対数増殖前期になるまで３７℃で通気
培養した後、 １０ｍ１のクロラムフェニコール溶液（
３，６ｍｇ／ｍｌとなるようにエタノールで調製。）を
添加し、さらに３７℃で１５時間通気培養してプラスミ
ドｐＢＲ３２２を増殖させた。
ａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を導入したニ
ジエリチア・コリＣ６００株を、２ｚのし一培地（ポリ
ペプトンｌＯｇ／／！、酵母エキス５ ｇ ／ ｊ！
、グルコースＩｇ／Ｃ塩化ナトリウム５ｇ／ｎでｐＨ７
，２に調製。）で対数増殖前期になるまで３７℃で通気
培養した後、 １０ｍ１のクロラムフェニコール溶液（
３，６ｍｇ／ｍｌとなるようにエタノールで調製。）を
添加し、さらに３７℃で１５時間通気培養してプラスミ
ドｐＢＲ３２２を増殖させた。
次に遠心分離にて集菌した菌を８０ｍ１のＴＥ−シュク
ロース緩衝液（２０％シュクロース、 ２０ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含み、 ｐｕ ｓ、ｏに調製された０、０５Ｍト
リス緩衝液。）に懸濁し、さらに８ｍｌのりゾチーム溶
液（５ｍｇ／ｍｌとなるように上記ＴＥ−シュクロース
緩衝液にて調製。）を添加し。
ロース緩衝液（２０％シュクロース、 ２０ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含み、 ｐｕ ｓ、ｏに調製された０、０５Ｍト
リス緩衝液。）に懸濁し、さらに８ｍｌのりゾチーム溶
液（５ｍｇ／ｍｌとなるように上記ＴＥ−シュクロース
緩衝液にて調製。）を添加し。
さらに２８ｍ１の５ Ｍ ＮａＣ１溶液と４ｍｌの４％
ＳＯ５溶液を加えた。
ＳＯ５溶液を加えた。
この混合液を３７℃で２時間反応させた後。
遠心分離にて粗プラスミドＤＮＡを分離した。
次に、２容量の８０％フェノールを加えてフェノール処
理を行い、夾雑蛋白質を除去した。
理を行い、夾雑蛋白質を除去した。
この抽出した粗プラスミドを冷イソプロパツールにて沈
殿回収し、さらにＴＥ緩衝液（０，１４ＭＮａＣ＋、
１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む、 ｐＨ７，５に調製され
た２０ｍＭ ）リス緩衝液。）に溶解した。この混合液
に２ ｍ”ｉのＲＮａ５ｅを添加し、３７℃で２時間反
応させ、上記と同様の方法でフェノール処理にて夾雑Ｒ
Ｎ＾を除去した。
殿回収し、さらにＴＥ緩衝液（０，１４ＭＮａＣ＋、
１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む、 ｐＨ７，５に調製され
た２０ｍＭ ）リス緩衝液。）に溶解した。この混合液
に２ ｍ”ｉのＲＮａ５ｅを添加し、３７℃で２時間反
応させ、上記と同様の方法でフェノール処理にて夾雑Ｒ
Ｎ＾を除去した。
この抽出した粗プラスミドを２倍容量のエタノールを加
え、エタノール沈殿にて回収した。これを、さらに、
１０ｍ１の上記のＴＥ緩衝液に熔解させ、アガロース
ゲルロ過にて夾雑ＲＮＡをさらに除去し、得られた粗Ｄ
ＮＡをエタノールにて再び回収した。
え、エタノール沈殿にて回収した。これを、さらに、
１０ｍ１の上記のＴＥ緩衝液に熔解させ、アガロース
ゲルロ過にて夾雑ＲＮＡをさらに除去し、得られた粗Ｄ
ＮＡをエタノールにて再び回収した。
この沈殿を２３．１ｍｌの０．０２Ｍ ）リス緩衝液（
ｐ１４８．０に８周製。）に溶解し、さらに２３．７ｇ
の塩化セシウムと０．６ｍｌのエチジウムブロマイド溶
液（１０’ｍｇ／ ｍｌに調製。）を加え、約４０時間
超遠心することにより、プラスミド ＤＮＡを分離し２
次にノルマルブクノールにより、エチジウムブロマイド
を除去した。この分離したプラスミドを０．０１ＨのＴ
Ｅ緩衝液（０，１ｍＭ ＥＤＴＡを含む。ｐｕ ７．５
に調製ささた０、ＯＩＭ トリス緩衝液で透析すること
により、精製プラスミドｐＢＲ３２２を得た。
ｐ１４８．０に８周製。）に溶解し、さらに２３．７ｇ
の塩化セシウムと０．６ｍｌのエチジウムブロマイド溶
液（１０’ｍｇ／ ｍｌに調製。）を加え、約４０時間
超遠心することにより、プラスミド ＤＮＡを分離し２
次にノルマルブクノールにより、エチジウムブロマイド
を除去した。この分離したプラスミドを０．０１ＨのＴ
Ｅ緩衝液（０，１ｍＭ ＥＤＴＡを含む。ｐｕ ７．５
に調製ささた０、ＯＩＭ トリス緩衝液で透析すること
により、精製プラスミドｐＢＲ３２２を得た。
（ｉｉｉ ）プラスミドｐｌｃＲ１の創製。
（ｉ）の方法で得られたバチルス・ステアロサ−モフィ
ルスの染色体ＤＮＡ ５μｇと制限酵素Ｓａｌ■（宝酒
造社’ＪｊＪ＞ ２０：ｌ−ニラトラ、 ７ ｍＭ
Ｍｇ Ｃ１２。
ルスの染色体ＤＮＡ ５μｇと制限酵素Ｓａｌ■（宝酒
造社’ＪｊＪ＞ ２０：ｌ−ニラトラ、 ７ ｍＭ
Ｍｇ Ｃ１２。
１５０ｍＭ ＮａＣ］、 ０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、
７ ｍＭ２−メルヵプトエタ／ −ル、 ０．０１％Ｂ
ＳＡを含むｐＨ１，５ニ調製した１０ｍＭトリス緩衝液
１００μｌに入れ、３７℃で２．５時間反応させて、
ＤＮＡを消化させた後、６５℃で５分間加熱し、 Ｓ
ａｌ Ｉを不活性化し、冷エタノールにて消化ＤＮＡ断
片を沈殿回収した。
７ ｍＭ２−メルヵプトエタ／ −ル、 ０．０１％Ｂ
ＳＡを含むｐＨ１，５ニ調製した１０ｍＭトリス緩衝液
１００μｌに入れ、３７℃で２．５時間反応させて、
ＤＮＡを消化させた後、６５℃で５分間加熱し、 Ｓ
ａｌ Ｉを不活性化し、冷エタノールにて消化ＤＮＡ断
片を沈殿回収した。
次に、（ｉｉ）の方法で得られたプラスミドｐＢＲ３２
２Ｉμｇに制限酵素Ｓａｌ １３ユニツトを加え。
２Ｉμｇに制限酵素Ｓａｌ １３ユニツトを加え。
上記と同様の緩ｉｈ液中で３７℃で１０時間反応させ。
上記と同様の方法で消化プラスミドＤＮＡを回収した。
こうして得られた消化染色体及びプラスミドのＤＮＡを
混合し、 Ｔ４’ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用
イ、 ６．６ｍＭ ＭｇＣＩａ 、 １０ｍＭ’ ＤＴ
Ｔ、 ６６ｇＭ ＡＴＰ ｊｉ−含むｐＨ７，６に調製
した６６ｍＭ’）リス緩衝液中で、１３℃で１９＃１間
反応させ、消化１）ＮＡを再結合することにより、プラ
スミドｐｌｃＲ１を得た。
混合し、 Ｔ４’ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用
イ、 ６．６ｍＭ ＭｇＣＩａ 、 １０ｍＭ’ ＤＴ
Ｔ、 ６６ｇＭ ＡＴＰ ｊｉ−含むｐＨ７，６に調製
した６６ｍＭ’）リス緩衝液中で、１３℃で１９＃１間
反応させ、消化１）ＮＡを再結合することにより、プラ
スミドｐｌｃＲ１を得た。
参考例１
実施例１で得たプラスミドｐｌｃＲ１の発現性を調べる
ため２次のトランスフォーメーション処理を行った。
ため２次のトランスフォーメーション処理を行った。
（ｉｖ）ｈランスフォーメーション
まず、宿主菌のニジエリチア・３９０６００１ｍ株を５
０ｍ１の上記のし一培地にて培養し、遠心分離にて集菌
後、 ５０ｍ１の０．１Ｍ ＭｇＣｌ２熔液ニ１．濁し
、さらに遠心分離を行って最終的には２．５ｍｌの０．
１ＭＭｇＣＩ２１ｇ液に懸濁させた。
０ｍ１の上記のし一培地にて培養し、遠心分離にて集菌
後、 ５０ｍ１の０．１Ｍ ＭｇＣｌ２熔液ニ１．濁し
、さらに遠心分離を行って最終的には２．５ｍｌの０．
１ＭＭｇＣＩ２１ｇ液に懸濁させた。
このようにして得られたニジエリチア・コリＣＣ６０ｏ
ｒ株の懸濁液０．２ｍｌに（ｉｉｉ ）の方法で得たプ
ラスミドｐｌｃＲ１を含む混合物を０．１ｍｌ加え、０
℃で３０分間処理したのち、４２℃で２分間処理した。
ｒ株の懸濁液０．２ｍｌに（ｉｉｉ ）の方法で得たプ
ラスミドｐｌｃＲ１を含む混合物を０．１ｍｌ加え、０
℃で３０分間処理したのち、４２℃で２分間処理した。
次にこれに３ｍｌ前記したＬ−培地を加え５３７℃で
１時間培養し、さらにアンピシリン（１５ｇｇ／ｍｌに
調製。）の入ったＬ〜寒天培地（Ｌ−培地１１当り、１
５ｇの寒天を加えたもの。）で３７℃で培＃後、生じた
コロニーを、さらにテトラサイクリン（２５，ｃｒ ｇ
／ ｍｌに１ＩｉＩｉ！！。）の入ったＬ−寒天培地
で培養後、生えてこないコロニーを見出すコトにより、
プラスミドｐｌｃｌ’ｌ Ｉの導入されたニジエリチア
・コリＣ６００−ｐｌｃＲ１が得られた。
１時間培養し、さらにアンピシリン（１５ｇｇ／ｍｌに
調製。）の入ったＬ〜寒天培地（Ｌ−培地１１当り、１
５ｇの寒天を加えたもの。）で３７℃で培＃後、生じた
コロニーを、さらにテトラサイクリン（２５，ｃｒ ｇ
／ ｍｌに１ＩｉＩｉ！！。）の入ったＬ−寒天培地
で培養後、生えてこないコロニーを見出すコトにより、
プラスミドｐｌｃｌ’ｌ Ｉの導入されたニジエリチア
・コリＣ６００−ｐｌｃＲ１が得られた。
次にこうして得られたニジエリチア・コリＣ６００−ｐ
ｌｃＲ’ｌのコロニーより、アンピシリン（１５ｇｇ／
ｍｌに調製。）の入った上記のグリセロール培地１００
ｍ１で３７℃で１６時間、振とう培養を行った。これを
遠心分離にて集菌、洗浄後、５ｍｌの０．０１％２−メ
ルカプトエタノールを含み、 ｐｌ（７，４に調製した
０、ＯＩＭのリン酸緩衝液に懸濁し、０℃で５分間の超
音波処理にて菌体を破砕し、遠心分離にて粗酵素抽出液
を得た。
ｌｃＲ’ｌのコロニーより、アンピシリン（１５ｇｇ／
ｍｌに調製。）の入った上記のグリセロール培地１００
ｍ１で３７℃で１６時間、振とう培養を行った。これを
遠心分離にて集菌、洗浄後、５ｍｌの０．０１％２−メ
ルカプトエタノールを含み、 ｐｌ（７，４に調製した
０、ＯＩＭのリン酸緩衝液に懸濁し、０℃で５分間の超
音波処理にて菌体を破砕し、遠心分離にて粗酵素抽出液
を得た。
このようにして得た粗酵素抽出液の耐熱性のロイシン脱
水素酵素の活性を測定したところ、 ０．２０１ユニッ
ト／ｍｇ・プロティンであった。これはＤＩＩＩＡ供与
菌であるバチルス・ステアロサーモフィルスＩＰ０１２
２５０株のロイシン脱水素酵素の活性（０，０１０ユニ
ット／ｍｇ・プロティン）よりも１０倍以上の活性があ
った。
水素酵素の活性を測定したところ、 ０．２０１ユニッ
ト／ｍｇ・プロティンであった。これはＤＩＩＩＡ供与
菌であるバチルス・ステアロサーモフィルスＩＰ０１２
２５０株のロイシン脱水素酵素の活性（０，０１０ユニ
ット／ｍｇ・プロティン）よりも１０倍以上の活性があ
った。
また、このロイシン脱水素酵素を含む粗酵素抽出液は、
２−メルカプトエタノールを０．０１％含むｐｏ ７．
２の１０ｍＭリン酸緩衝液中、７０℃で２０分間加熱処
理したところ、８０％以上の残存活性を有していた。
２−メルカプトエタノールを０．０１％含むｐｏ ７．
２の１０ｍＭリン酸緩衝液中、７０℃で２０分間加熱処
理したところ、８０％以上の残存活性を有していた。
次にこの菌株から前記（ｉｉｉ ）と同様の方法でプラ
スミドｐＩＣＲ１を分離して、水平型アガロースゲル電
気泳動でプラスミ）’ ｐｌｃ＋２１の性質を調べた。
スミドｐＩＣＲ１を分離して、水平型アガロースゲル電
気泳動でプラスミ）’ ｐｌｃ＋２１の性質を調べた。
電気泳動に用いた緩衝液として、 ２．５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ−Ｎａ、 ８９ｍＭのほう酸を含みｐＨ８，３に調
製した８９ｍＭのトリス緩衝液を用い、ゲルとしてこの
緩衝液に０．７％の７ガロースと０．５ｍｇ／ ｊｉに
調製したエチジウムブロマイドを加えたものを用い、こ
れに、プラスミドｐＩＣＲ１とプラスミドｐＢＲ３２２
，さらに分子量マーカーとしてのラムダファージＤＮＡ
の１ｌｉｎｄｌｌ’１（宝酒造社性）消化断片を各約１
μｇ ＤＮＡを同一アガロースゲル上で同時に中１ｃ
ｍ当り、 ７Ｖの足付加電圧で３〜４時間、泳動させた
。次に紫外線ランプでバンドを判定し、プラスミドｐｌ
ｃＲ１の大きさを調べた結果１分子量が約６メガダルト
ンであった。また、プラスミドｐＢＲ３２２の分子量は
、２．８メガダルトンであった。
ＴＡ−Ｎａ、 ８９ｍＭのほう酸を含みｐＨ８，３に調
製した８９ｍＭのトリス緩衝液を用い、ゲルとしてこの
緩衝液に０．７％の７ガロースと０．５ｍｇ／ ｊｉに
調製したエチジウムブロマイドを加えたものを用い、こ
れに、プラスミドｐＩＣＲ１とプラスミドｐＢＲ３２２
，さらに分子量マーカーとしてのラムダファージＤＮＡ
の１ｌｉｎｄｌｌ’１（宝酒造社性）消化断片を各約１
μｇ ＤＮＡを同一アガロースゲル上で同時に中１ｃ
ｍ当り、 ７Ｖの足付加電圧で３〜４時間、泳動させた
。次に紫外線ランプでバンドを判定し、プラスミドｐｌ
ｃＲ１の大きさを調べた結果１分子量が約６メガダルト
ンであった。また、プラスミドｐＢＲ３２２の分子量は
、２．８メガダルトンであった。
また、このプラスミドｐｒｃｌｊｌを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ。
Ｉ。
財皿■、ハ祁１．Ｐ部Ｉ、Ｓ旦■で各々の制限酵素の適
正条件で反応させ、プラスミドｐＩＣＲ１を消化させた
。
正条件で反応させ、プラスミドｐＩＣＲ１を消化させた
。
各制限酵素にて得られた消化試料は、上記と同様の方法
でアガロースゲル電気泳動を行い、各制限酵素による切
断部位数による切断部位数を調べた結果、プラスミドｐ
ｌｃＲ１は以下の切断感受性部位を有することが判明し
た。
でアガロースゲル電気泳動を行い、各制限酵素による切
断部位数による切断部位数を調べた結果、プラスミドｐ
ｌｃＲ１は以下の切断感受性部位を有することが判明し
た。
制限酵素 切断部位数
に牝■２
Ｈｉｎｄｌｌｌ １
ハｔｌ ２
Ｓａｌ Ｉ ４
堕畦Ｉ２
さらに、プラスミドｐｌｃＲ１は、 Ｓａｌ ｒ切断
部位にて、バチルス、ステアロサーモフィルス ＩＰ０
１２２５０株のロイシン脱水素酵素の遺伝子を含む染色
体ＤＮＡ断片とプラスミドｐＢＲ３２２ＯＮＡとが結合
していることが明らかである。
部位にて、バチルス、ステアロサーモフィルス ＩＰ０
１２２５０株のロイシン脱水素酵素の遺伝子を含む染色
体ＤＮＡ断片とプラスミドｐＢＲ３２２ＯＮＡとが結合
していることが明らかである。
特許出願人 ユニチカ株式会社
Claims (4)
- （１）耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子を有するプ
ラスミド。 - （２）耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子が、好熱性
の微生物の染色体ＤＮＡ白米のロイシン脱水素酵素の遺
伝子である特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。 - （３）好熱性の微生物が、好熱性のバチルス属に属する
細菌である特許請求の範囲承２項記載のプラスミド。 - （４） 好ｉ性のバチルス属に属する細菌が、バチルス
・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である特許請求の範囲
第３項記載のプラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58036307A JPS59162882A (ja) | 1983-03-04 | 1983-03-04 | プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58036307A JPS59162882A (ja) | 1983-03-04 | 1983-03-04 | プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59162882A true JPS59162882A (ja) | 1984-09-13 |
| JPH0249713B2 JPH0249713B2 (ja) | 1990-10-31 |
Family
ID=12466180
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58036307A Granted JPS59162882A (ja) | 1983-03-04 | 1983-03-04 | プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59162882A (ja) |
-
1983
- 1983-03-04 JP JP58036307A patent/JPS59162882A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0249713B2 (ja) | 1990-10-31 |
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