JPH032879B2 - - Google Patents
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Description
請求の範囲
１ 式：
〔式中R1はａアルコキシ中に炭素原子数１〜
４個を有するアルコキシカルボニル基、bp−位
でメチル、メトキシ又は塩素で置換されていてよ
いベンジル基を有するベンジルオキシカルボニル
基又はｃ炭素原子数１〜４個を有するアルカンス
ルホニル基を表わし、R2はａ炭素原子数１〜３
個を有する直鎖又は分枝鎖のアルキル基又はｂシ
クロヘキシル又は４−ヒドロキシシクロヘキシル
基を表わし、R5はｐ−ニトロフエニルアミノ、
β−ナフチルアミノ、４−メトキシ−β−ナフチ
ルアミノ、５−ニトロ−α−ナフチルアミノ、キ
ノン−５−イル−アミノ、８−ニトロ−キノン−
５−イル−アミノ又は４−メチル−クマール−７
−イル−アミノ基を表わす〕のトリペプチド誘導
体又は酸とのその塩。 ２ アルギニンの強塩基性グアニジノ基は無機又
は有機酸でのプロトン化により安定化されてい
る、請求の範囲第１項記載のトリペプチド誘導
体。 ３ アルギニンのグアニジノ基は酢酸でのプロト
ン化により安定化されている、請求の範囲第１項
又は第２項記載のトリペプチド誘導体。 技術分野 本発明は、酵素分類３，４，21、の特定酵素特
に第Xa因子により非常に容易に分解されるトリ
ペプチド誘導体に関する。従つて、この新規トリ
ペプチド誘導体は、前記酵素特に第Xaを定量分
折するための基質として使用される。 背景技術 第Xa因子は、血液凝固カスケード中で酵素前
駆体第Ｘ因子の活性化により形成され、燐脂質及
び（プロトロンビン）をペプチド鎖の２点で蛋白
質分解して、前記因子を、最終的に凝固させる第
ａ因子（トロンビン）に変じる蛋白質分解酵素
である。特定の病気例えば肝臓疾患、ビタミン欠
乏症等の際に、かつジクマロール療法において、
第Ｘ因子の形成は減少されている。この第Ｘ因子
の合成に関する遺伝的障害により、もちろん第
Xa因子の形成は、相応して減少されている。従
つて、簡単かつ正確な方法で、血漿中の第Xa因
子を光学的に分析させる直接酵素分析法を自由に
得ることは、重要である。 第Xa因子を分析する主要な方法は次のとおり
である； ａ 生物学的分析法〔Thrombosis and
Bleeding Disorders，Nils U.Bang、Ceorg
Thieme Verlag196頁（1971年）参照〕：第Ｘ
因子をラツセル（Russel）まむし毒及びカル
シウムイオンを用いて活性化する。１工程操作
で、プロトロンビンを第Ｖ因子及び燐脂質の存
在で第Xa因子を用いて活性化してトロンビン
にし、トロンビンはインジケータフイブリノゲ
ンをフイブリンに変える。凝固時間を測定す
る。所要の第因子及び第Ｖ因子及びフイブリ
ノゲンは、第Ｘ因子不含の基質により供給され
る、凝固時間は、第Ｘ因子の活性化の程度によ
り影響される。他の条件は一定で、この活性化
度は、試料中の第Ｘ因子の濃度の係数である。
凝固時間はこの実験で主観的に読み取られるの
で、この生物学的方法は、粗雑な分析を実施す
ることを可能とするだけである。更に、処理さ
れた血漿が必要であり、その調製の間に誤ちが
起こりうる。更に、インジケータとしての作用
をするフイブリノゲンは、直接は形成されない
が、活性化されたトロンビンを経て形成される
（間接的方法）。 ｂ 生化学的方法〔“Thrombosis and Bleeding
Disorders”、N.U.Bang、Georg Thieme
Verlag、196〜７頁（1971年）参照〕；試験さ
れるべき第Ｘ因子調製物が充分に純粋であれ
ば、より正確な分析法が提供されうる。エスナ
フ（Esnouf）及びウイリアムズ（Williams）
（1962年）は、第Xa因子がエステラーゼ活性を
有し、従つて、合成アミノ酸エステルを分解す
ることを示している。しかしながら、この分析
のためには第Ｘ因子50〜100μgが必要である。
他方、カルボベンゾキシ−フエニルアニリン−
ｐ−ニトロフエニルエステルを用い、単位時間
当りの発生ｐ−ニトロフエノールの量を測定す
ることにより、低濃度の第Xa因子を測定する
ことができる。この分析法は次の欠点を有す
る：使用エステルは適用pH値で自己加水分解
し、更に、これは多くの他の酵素にも応答する
ので、第Xa因子に対して特異的ではない。こ
のエステルは水中に不溶であるから、アセトン
が必要である。これらのすべての欠点の結果と
して、この分析法は不正確であり、経費がかか
る。 ｃ 西ドイツ国特許出願公開第2552570号明細書
には、第Xa因子分析用基質として使用される
べきテトラペプチド誘導体が記載されている。 BZ−Ile−Glu−G1y−Arg−pNA−HClが、第
Xa因子により分解されてｐ−ニトロアニリンを
形成するテトラペプチド誘導体の１例として記載
されている。このｐ−ニトロアニリンの形成は、
分光光度法で追跡できる。この第Xa因子分析法
は、前記の生物学的及び生化学的分析法よりはい
くらか正確である。 しかしながら、西ドイツ特許出願公開第
2552570号明細書に記載のテトラペプチド誘導体
は、基質飽和で実施されるべき第Xa因子の分析
を可能とする程度に充分に水性媒体中に可溶では
ない。例えば病的血漿中の測定すべき第Xa因子
の濃度が極めて低い場合には、前記テトラペプチ
ド誘導体は、相応する正確な測定値を得させる程
度に充分に敏感ではない。測定すべき第Xa因子
の量が更に血漿を加えることにより増加したら、
血漿蛋白質の影響下にテトラペプチド基質の沈澱
が生じるはずであり、その結果として、酵素分析
を実施することが不可能となるはずである。 発明の開示 ところで、水性媒体中に非常に溶け易く、第
Xa因子に対して意想外に高い敏感性を有する新
規のトリペプチド誘導体を見つけた。 本発明のこのトリペプチド誘導体は、次の一般
式を有する： 式： 〔式中R1はａアルコキシ中に炭素原子数１〜
４個を有するアルコキシカルボニル基、bp−位
でメチル、メトキシ又は塩素で置換されていてよ
いベンジル基を有するベンジルオキシカルボニル
基又はｃ炭素原子数１〜４個を有するアルカンス
ルホニル基を表わし、R2はａ炭素原子数１〜３
個を有する直鎖又は分枝鎖のアルキル基又はｂシ
クロヘキシル又は４−ヒドロキシシクロヘキシル
基を表わし、R5はｐ−ニトロフエニルアミノ、
β−ナフチルアミノ、４−メトキシ−β−ナフチ
ルアミノ、５−ニトロ−α−ナフチルアミノ、キ
ノン−５−イル−アミノ、８−ニトロ−キノン−
５−イル−アミノ又は４−メチル−クマール−７
−イル−アミノ基を表わす〕。 アルギニンの強塩基性グアニジノ基は、例えば
鉱酸例えばHCl、HBr、H2SO4又はH3PO4又は
有機酸例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、
クエン酸、蓚酸、酒石酸、安息香酸、フタル酸、
トリクロル酢酸又はトリフルオル酢酸でプロトン
化することにより安定化されるのが有利である。
プロトン化の特性は、酵素に対するトリペプチド
基質の敏感度（感受性）に対して影響を有しな
い。 式のトリペプチド誘導体は、次に記載の自体
公知の方法で製造できる。 １ 色原性基R5をＣ−末端アルギニンのカルボ
キシ基に付着させ、他方、そのα−アミノ基を
保護基例えばカルボベンゾキシ又はｔ−ブトキ
シカルボニル基で保護し、アルギニンのδ−グ
アニジンを例えばHClを用いるプロトン化、窒
化又はトジル化により保護する。Ｃ−末端基は
ペプチド鎖の段階的形成の間に保護基としての
役目もする。残りの保護基は、必要に応じて所
望ペプチド鎖が完全に組立てられるまでに、次
のアミノ酸誘導体に付着するために、選択的に
除去することができる。最後に、影響されてい
る基R5以外の残りの保護基をまつたく除去す
ることができる〔例えばMiklos Bodansky等
による“Peptide Synthesis”、Interscience
Publishers、163〜165頁、（1966年）参照〕。 ２ まず、ペプチド鎖を形成し、他方、アルギニ
ンのＣ−末端カルボキシル基を有用なエステル
基例えばメトキシ、エトキシ又はベンジルオキ
シ基で保護する（前記のBodanskyの文献参
照）。選択的にトリフルオル酢酸を用いて除去
すべきｔ−ブトキシ基以外のエステル基はアル
カリ性加水分解により除去することができる。
アルギニンのδ−グアニジル基をプロトン化す
ると、このエステル基はトリプシンにより除去
され、この場合にラセミ化は起こらない。その
後、色原性基R5を導入する。アルギニンのδ
−グアニジノ基をニトロ又はトシル基で保護
し、トリペプチド誘導体のＮ−末端α−アミノ
基をカルボベンゾキシ基又はｐ−メチル、ｐ−
メトキシ又はｐ−クロル−ベンジルオキシカル
ボニル基又はｔ−ブトキシ基で保護する場合
は、これらすべての保護基を同時に除去する。
この除去は、保護されたトリペプチド誘導体を
室温で無水HFで処理することにより達成で
き、結果として、前記のアミノ基及びδ−グア
ニジノ保護基のすべてが除去される。この除去
は、保護されたトリペプチド誘導体が保護基と
してニトロ又はトシル基を含有しない場合は、
室温で氷酢酸中の2N HBrでの処理によつて実
施することもできる。 式のトリペプチド誘導体は、西ドイツ特許出
願公開第2552570号明細書に記載のテトラペプチ
ド誘導体よりも著しく容易に水中に溶け、従つ
て、信頼しうる測定結果を得るために要求される
基質飽和で実施されるべき酵素分析を可能とす
る。更に、式のトリペプチド基質は、西ドイツ
特許出願公開第2552570号明細書記載のテトラペ
プチド誘導体よりも著しく敏感であり、従つて、
極めて低い濃度の第Xa因子を分析するために使
用することもできる。 西ドイツ特許出願公開第7607433号明細書には、
一般式：Ｈ−Ｄ−A1−A2−A3−NH−Ｒ（A1，
A2，A3＝アミノ酸残基）を有し、酵素分類E.
C.3，４，21の酵素例えばトロンビン及びプラス
ミンに対して高い敏感度を有するトリペプチド誘
導体が記載されている。この高い敏感度は、Ｎ−
末端Ｄ−アミノ酸が非置換α−アミノ基を有する
事実に起因する。実際に、この末端Ｄ−アミノ酸
のα−アミノ基が置換されている場合、即ち、式
中の水素が保護基又は遮断基例えばベンゾイル又
はカルボベンゾキシ基で換えられると、酵素分類
３，４，21の酵素に対するトリペプチド誘導体の
敏感度は著しく低下される。 これらの発見に基づき、式中のＮ−末端Ｄ−ア
ミノ酸のα−アミノ基が保護基又は遮断基を有す
る式の新規トリペプチド誘導体は酵素分類３，
４，21の酵素により分解されないか又は僅かに分
解されることは予測できた。しかしながら、すべ
ての予想に反して、新規トリペプチド基質は意想
外に第Xa因子に対する非常に高い敏感度を有す
る。 西ドイツ特許出願公開第255257号明細書に記載
のテトラペプチド誘導体に比べた本発明のトリペ
プチド基質のもう１つの利点は、実際に、その合
成が簡単かつ経費が安い事実に帰する。 本発明のトリペプチド基質は、酵素分類E.C.3，
４，21の特定酵素（“Enzyme Nomenc1−ature”
Elsevier Scientific Publishing Com−pany，
Amsterdam1973年238頁以降参照）例えば血漿中
の第Xa因子の定量分析に使用することができ、
第Xa因子を経て、他の生物学的に重要な因子例
えば第Ｘ因子（第Xa因子のプロ酵素）、第Xa抗
因子（＝抗トロンビン又はヘパリン補因子）又
は血漿中のヘパリンの定量分析にも使用できる。 これらの種々の分析は次に記載の方法で実施で
きる： １ 第Xa因子及び第Ｘ因子の分析： クエン酸処理したヒト血漿を用い、まず、血漿
中に存在する第Ｘ因子を第Xa因子に変えるため
に、ラツセルまむし毒（RVV＝Russel viper
venom）又はトロンボプラスチン試薬で活性化
する。次の試薬を使用する： 緩衝液 トリス−イミダゾール緩衝液、
pH8.4、イオン濃度0.3； RVV 凍結乾燥したラツセルまむし毒調製物
（Laboratoire Stago，92600Asnieres
Ｓ／Seine，Franceより提供）を CaCl2 0.015Mを含有する緩衝液中に溶解したも
の； 基 質 蒸留水中に溶かしたMeSO2−Ｄ−
CHA−Gly−Arg−pNA・AcOH（濃度：
２×１ 0-3M）。 試験キユベツトに、37℃で加熱したRVV0.2ml
を装入し、次いで、クエン酸処理したヒト血漿
0.02mlを装入する。この２種成分を直ちに混合
し、次いで、37℃で60秒間インキユベートする。
生じる活性混合物を37℃に加熱された緩衝液1.6
mlで希釈し、２×１ 0-3M基質溶液0.2mlと混合
する。次いで、発生ｐ−ニトロアニリンにより惹
起される混合物の光学密度の変化を405nmの波長
で分光度法で測定する。測定された１分当りの光
学密度の増加は、活性化された血漿中に存在する
第Xa因子の量に正比例する。測定された１分当
りの光学密度の増加は、活性化の結果として、第
Ｘ因子の所定量が化学量論的に相当量の第Xa因
子に変じるので、出発血漿中に存在する第Ｘ因子
の量に関する尺度でもある。 ２ 第Xa抗因子の分析： クエン酸塩処理したヒト血漿をTRIS−緩衝液
で１：10の割合で希釈することにより試料を調製
する。TRIS−イミダゾール緩衝液中のヘパリン
溶液（緩衝液１ml当りヘバリン3USP単位を含
有）100μlを前記希釈血漿100μlに加え、混合物を
37℃で２分間インキユベートし、このインキユベ
ートしたものに、１ml当り第Xa因子8.5単位を含
有する牛の第Xa因子調製物ダイアゲン
（Diagen；提供者Diagnostic Reagents、
Thame、英国）を加える。この混合物を37℃で
３分間インキユベートする。このインキユベート
したものを37℃に加熱したTRIS−イミダゾール
緩衝液0.6mlで希釈し、直ちに、37℃に加熱した
蒸留水中の２×10-3MのCH3SO2−Ｄ−CHA−
Gly−Arg−pNA・AcOH（基質）の溶液100μlと
混合する。 並行実験で、同じ方法によるが、希釈された血
漿の代わりに同量の緩衝液を用いて盲検試料を調
製した。 双方の試料（被検試料及び盲検試料）に関し
て、405nmでの光学密度の増加をを分光光度法で
測定する。盲検試料の１分当りの光学密度の増加
（ΔOD盲検／min）と被検試料の１分当りの光学
密度の増加（ΔOD被検／min）との間の差は、
第Xa抗因子−ヘパリン錯体により抑制された第
Xa因子の量に関する尺度であり、従つて血漿中
に存在する第Xa抗因子（＝抗トロンビン）の
量の尺度である。 ３ 血漿中のヘパリンの分析： ヘパリン処理した患者の血漿をTRIS−イミダ
ゾール緩衝液で１：10の割合で希釈することによ
り被検試料を調整する。この希釈した血漿を37℃
で１〜２分間インキユベートし、このインキユベ
ートしたものにウシの第Xa因子調製物ダイアゲ
ン（提供者：Diagnostic Rra gents、 Thame、
英国）の溶液（１ml当り第Xa因子8.5単位含有）
100μlを添加し、混合物を37℃で３分間インキユ
ベートする。このインキユベート物を37℃に加熱
したTRIS−イミダゾール緩衝液0.6mlで希釈し、
直ちに、蒸留水中のCH3SO2−Ｄ−CHA−Gly−
Arg−pNA・AcOH（基質）の２×10-3M溶液
100μlと混合する。 並行実験で、同じ方法であるが、希釈されたヘ
パリン処理血漿の代わりに相応して希釈された正
常血漿（ヘパリン不含）同量を用いて、盲検試料
を調製する。 双方の試料に関して405nmにおける１分当りの
光学密度の増加を測定する。盲検試料の１分当り
の光学密度の増加（ΔOD盲検／min）と被検試
料の１分当りの光学密度の増加（ΔOD被検／
min）との間の差は、ヘパリン−補因子（抗トロ
ンビン）に結合したヘパリンの抑制活性の尺度で
ある。 第Xa抗因子（＝ヘパリン−補因子又は抗トロ
ンビン）は単独で第Xa因子を抑制するが、短
いインキユベーシヨン時間（例えば３分）内に少
量の第Xa因子だけが抑制される程度に遅い。し
かしながら、第Xa抗因子がヘパリンと接触する
なら、２成分は、第Xa因子の迅速抑制成分であ
り、短いインキユベーシヨン時間（例えば３分）
内に第Xa因子と完全に結合する錯体を形成する。 第Xa因子の抑制は、存在するヘパリンの量に
比例するので、充分な第Xa抗因子が存在するか
ぎり、患者の血漿中に存在するヘパリンの量は、
正常血漿で得られる並行曲線を用いて、かつ添加
したヘパリンの強化作用の理由で、添加へパリン
の量を増加することにより測定できる。 第Xa因子と本発明のトリペプチド誘導体との
間の反応で生じた着色された分解生成物Ｈ−R5
（ｐ−ニトロアニリン）の量の測定において、利
点は、分解生成物が基質のそれとは異なるUVス
ペクトルを有し、長波長の方向にシフトしている
事実に基づく。本発明の基質は約310nmで最大吸
収を示し、約13000のモル吸光係数を示す。
405nmでの基質の吸収は実質的に０である。基質
の酵素的加水分解により形成される分解生成物即
ちｐ−ニトロアニリンは、380nmで最大吸収及び
約13200のモル吸光係数を示す。405nmでの吸光
係数は、徐々に、即ち約10400まで減少する。 色原性基としてβ−ナフチルアミノ、４−メト
キシ−β−ナフチルアミノ又はクマル−７−イル
−アミノ基を有する基質の場合に、第Xa因子に
より形成された分解生成物Ｈ−R5の量を蛍光分
光光度法により測定する。第Xa因子、緩衝液及
び基質よりなる試験系において、蛍光分解生成物
を300〜400nmのエネルギーの多い光で連続的に
励起した後に、400〜470nmでエネルギーの少な
い光を連続的に測定する。単位時間当りに形成さ
れる分解生成物の量は、存在する第Xa因子活性
の尺度である。定義によれば、１分当りに形成さ
れる分解生成物の1μモルは、所定の１基質に対
する第Xa因子の１酵素単位に相当する。 前記の分析法の敏感度は、その量の測定前の分
解生成物Ｈ−R5をジアゾ化合物とのカツプリン
グにより、より強く着色された化合物（この際
R5はｐ−ニトロフエルアミノ、５−ニトロ−α
−ナフチルアミノ又は８−ニトロ−キノン−５−
イル−アミノ基である）に変えることにより、更
に増大させることができる。 発明を実施するための最良の形態 次の操作例で、本発明のトリペプチド誘導体を
詳述する。温度は摂氏で示す。 実施例により得られる溶離物及び生成物の分析
は、二酸化珪素ゲル（Merck Ｆ 254）でコー
トされたガラスプレートを用いる薄層クロマトグ
ラフイにより実施した。薄層クロマトグラムは、
次の溶剤系：ｎ−ブタノール／酢酸／水（３：
１：１）を用いて展開した。 次の略語を使用する： Ac＝アセチル、 Ac2O＝無水酢酸、 AcOH＝酢酸、 Arg＝Ｌ−アルギニン、 BOC＝ｔ−ブトキシカルボニル、 Bu＝ブチル、 Ｄ−But＝Ｄ−２−アミノ酪酸、 ChA＝キノニルアミド、 Ｄ−CHA＝Ｄ−３−シクロヘキシルアラニン、 Ｄ−CHT＝Ｄ−３−（４−ヒドロキシシクロヘキ
シル）−アラニン、 ＝核中で置換されたチロシン、 Cbo＝カルボベンゾキシ、 DMF＝ジメチルホルムアミド、 TLC＝薄層クロマトグラフイ又は薄層クロマト
グラム、 Et＝エチル、 Et3N＝トリエチルアミン、 Gly＝グリシン、 HMPTA＝Ｎ，Ｎ，N′，N′，N″，N″−ヘキシ
ルメチル−燐酸トリアミド、 Ｄ−Leu＝Ｄ−ロイシン、 SS＝溶剤系、 MCA＝７−アミド−４−メチルクマリン、 MeO＝メトキシ、 MeOH＝メタノール、 NA＝ナフチルアミド、 Ｄ−Nleu＝Ｄ−ノルロイシン、 Ｄ−Nval＝Ｄ−ノルバリン、 OpNP＝ｐ−ニトロフエノキシ、 pNA＝ｐ−ニトロアニリド、 Pr＝プロピル、 TFA＝トリフルオル酢酸、 THF＝テトラヒドロフラン、 他に記載のないかぎり、アミノ酸はＬ−型を有
する。 例 １ 1a Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA・
HBrCbo−Arg−pNA・HCl 250ml三頸フラスコ中で、真空中P2O5上で乾燥
したCbo−Arg−CH・HCl16.0g（47mM）を、無
水HMPTA90ml中に、湿気不存在下に20℃で溶
かした。生じる溶液に、室温でまず、
HMPTA10ml中のEt3H4.74g（47.0mM）の溶液を
加え、次いで、イソシアン酸ｐ−ニトロフエニル
16.4g（100mM）（100％過剰）を滴下した。20℃
で24時間の反応時間の後に、HMPTAの大部分
を真空中での蒸留により除去した。残分を30％
AcOHで数回抽出した。残分を捨てた。集めた
AcOH抽出物を30％AcOHで平衡にしたセフアデ
ツクスＧ−15のカラムを通し、30％AcOHで溶離
させることにより更に精製した。トリプシンでの
処理によりｐ−ニトロアニリンの形成下に分解し
たAcOH溶離液のフラクシヨンを凍結乾燥させ
た。こうして、SS中でTLCにより示されるよう
な均質である無定形粉末12.6gが得られ。元素分
析及び実験式C20H25N6O5Clからの計算は次の値
を示した：Ｃ＝51.29％（51.67％）、Ｈ＝5.48％
（5.42％）、Ｎ＝17・92％（18.08％）、Cl＝7.50％
（7.63％）。括弧内の値は計算値である。 1b 2HBr・Ｈ・Arg・pNA 化合物Ia4.65g（10mM）を、撹拌下に、氷酢酸
中の2N HBr40mlで、20℃、湿気の不存在下に45
分間処理した。アミノ酸誘導体はCO2発生下に溶
けた。反応溶液を激しい撹拌下に、無水エーテル
250mlに滴加すると、2HBr・Ｈ−Arg−pNAは
沈澱した。エーテル相を吸引除去し、更に、固相
を、副産物として形成された臭化ベンジル並びに
過剰のHBr及びAcOHを実質的に除去するため
に、無水エーテル100mlで４回洗浄した。残分を
MeOH50ml中に溶かし、Et3N添加によりpHを
4.5に調節し、溶液を真空中、30℃で濃縮乾燥さ
せた。得られる生成物をMeOH75ml中に溶かし、
MeOHで平衡にしたセフアデツクスLH20（交叉
結合デキストランゲル）のカラムに通した。溶離
液のフラクシヨンから、無定形化合物Ib4.18g（理
論量の91.6％）が得られ、これは、TLCで示され
るようにSS中で均質であつた。元素分析及び実
験式C12H20N6O3Br2からの計算により、次の値
が得られた：Ｃ＝31.15％（31.60％）、Ｈ＝4.35％
（4.42％）、Ｎ＝18.84％（18.43％）及びBr＝34.81
％（35.03％）。 1c Cbo−Gly−Arg−pNA・HBr 化合物1b.4.56g（10mM）を新しく蒸留した
DMF30ml中に溶かし、この溶液を−10℃まで冷
却し、この溶液に、撹拌下にEt3N1.40ml
（10mM）を添加した。形成されたEt3N・HBrを
濾去し、少量の冷DMFで洗浄した。この濾液に、
撹拌下にCbo−Gly−OpNP3.65g（11mM）を加
え、湿気の不存在下に２〜３時間反応させ、この
際、反応溶液の温度は徐々に約20℃に達した。溶
液を再び−10℃まで冷却し、Et3N0.7ml（5mM）
を用いて緩衝させた。反応溶液を約−10℃で約２
時間、かつ室温で３時間反応させた。この挿作を
Et3N0.70mlを用いて繰り返し、16時間後に、反
応溶液を真空中、50℃で濃縮させた。残分を、50
％AcOH75ml中に溶かし、50％AcOHで平衡にし
たセフアデツクスＧ−15のカラム上でのゲル濾過
により精製した。トリプシンでの処理によりｐ−
ニトロアニリンの形成下に分解したAcOH溶離液
のフラクシヨンを、真空中40℃で濃縮乾燥させ
た。残分をMeOH150ml中に溶かし、再び濃縮乾
燥させた。生じる残分を真空デシケータ中、60℃
で、P2O5上で乾燥させると、無定形化合物
Ic5.85g（理論量の88.3％）が得られ、これは、
TLCで示されるようにSS中で均質であつた。元
素分析及び実験式C22H28N7O6Brから計算して、
次の値が得られた：Ｃ＝46.33％（46.65％）、Ｈ
＝5.04％（4.98％）、Ｎ＝17.88％（17.31％）、及
びBr＝14.20％（14.11％）。 1d 2HBr・Ｈ−Gly−Arg−pNA 化合物Ic4.56g（8mM）を、撹拌下に氷酢酸中
の2N HBr32mlで、20℃で40分間処理した。ジペ
プチド誘導体は徐々にCO2の発生下に溶けた。反
応溶液を激しい撹拌下に無水エーテル250mlに滴
加すると、2HBr・Ｈ・Gly−Arg−pNAが沈澱
した。エーテル相を吸引除去し、更に、固体相
を、副産物として形成された臭化ベンジル並びに
過剰のHBr及びAcOHを実質的に除去するため
に、無水エーテル100mlで４回洗浄した。残分を
MeOH50ml中に溶かした。Et3Nを用いてpH値を
4.3に調節し、溶液を、真空中、30℃で濃縮乾燥
させた。得られる残分をMeOH50ml中に溶かし、
MeOHで平衡にしたセフアデツクスLH−20のカ
ラム上で精製した。トリプシンでの処理によりｐ
−ニトロアニリンの形成下に分解したMeOH溶
離液のフラクシヨンを真空下、30℃で濃縮乾燥さ
せた。得られる残分を真空デシケータ中、40℃で
P2O5上で乾燥させると、無定形化合物Id3.78g（理
論量の92.1％）が得られ、これは、TLCで示され
るようにSS中で均質であつた。元素分析及び実
験式C14H23N7O4Brからの計算で、次の値が得ら
れた：Ｃ＝32.31（32.77％）、Ｈ＝4.59％（4.52
％）、Ｎ＝19.47％（19.11％）、及びBr＝30.78％
（31.14％）。 1e Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA・HBr 化合物Id2.57g（5mM）を新しく蒸留した
DMF20ml中に溶かし、溶液を−10℃まで冷却し、
この溶液に、撹拌下にEt3N0.70ml（5mM）を加
えた。形成されたEt3N・HBrを濾去し、少量の
DMFで洗浄した。濾液に、Cbo−Ｄ−Leu−
OpNP2.13g（25.5mM）を−10℃で、撹拌下に加
えた。反応混合物を、湿気の不存在下に２〜３時
間反応させたら、この際、反応溶液の温度は徐々
に約20℃に達した。溶液を再び−10℃まで冷却
し、Et3N0.35ml（2.5mM）で緩衝させた。反応
溶液を−20℃で約２時間、かつ室温で更に３時間
反応させた。この工程を、Et3N0.35mlを用いて
くり返し、16時間後に反応溶液を真空中、50℃で
濃縮乾燥させた。残分を50％AcOH50ml中に溶か
し、50％AcOHで平衡にしたセフアデツクスＧ−
15のカラム上でのゲル濾過により精製した。トリ
プシンでの処理によりｐ−ニトロアニリンを生じ
ながら分解したAcOH溶離液フラクシヨンを真空
中、40℃で濃縮乾燥させた。残分をMeOH100ml
中に溶かし、溶液を再び濃縮乾凅させた。生じる
残分を真空デシケータ中、60℃でP2O5で乾燥さ
せると、無定形化合物1e3.08g（理論量の90.6％）
が得られ、これはTLCで示されるようにSS中で
均質であつた。元素分析及び実験式
C28H39N8O7Brからの計算により次の値が得られ
た：Ｃ＝49.06％（49.49％）、Ｈ＝5.82％（5.78
％）、Ｎ＝16.85％（16.49％）、及びBr＝11.59％
（11.76％）。 アミノ酸分析は、正確な割合での予想アミノ酸
の存在を確認した。 Cly：1.00−Ｄ−Leu：0.99−Arg：0.97。 Rf＝0.62。 Rf値は、シリカゲルプレート（Merck
No.254）上で、ｎ−ブタノール：氷酢酸：水＝
３：１：１を用いて測定した。23〜25℃、８〜10
cmの展開距離で展開した。スポツトはUV−線
で、沃素蒸気で、かつ引続くトリプシン水溶液の
吹付けにより可視にした。すべての生成物は、こ
れらの可視化により、１個の固有のスポツトを示
した。トリプシン水溶液での処理の際に、トリペ
プチド誘導体の発色性又は蛍光性基は分解され
て、肉眼又はUV線で観察できる分解生成物の色
が現れた。本発明によるトリペプチド誘導体は、
加熱時に焼結されるので、厳密な融点を有しな
い。 例 ２ 2b Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−MCA・
HBr2HBr・Ｈ−Arg−MCA 市販のCbo−Arg−MCA・HCl13.0g（25.9mM）
を、氷酢酸中の2NHBrの溶液104ml（208mM）
を用いて、例1bの方法で分解させた。乾燥残分
をMeOH400ml中に溶かし、セフアデツクスLH
−20のカラム上で精製した。トリプシンでの処理
により４−メチル−７−アミノ−クマリンの形成
を伴つて分解したMeOH溶離液フラクシヨンを
真空中、30℃で濃縮乾燥させた。生じる残分を、
真空中、40℃でP2O5上で乾燥させると、無定形
化合物2b11.2g（理論量の87.7％）が得られ、これ
は、TLCで示されるようにSS中で均質であつた。
元素分析及び実験式C16H23N5O3Br2からの計算
により次の値が得られた：Ｃ＝39.40％（38.90
％）、Ｈ＝4.61％（4.70％）、Ｎ＝14.48％（14.20
％）、及びBr＝31.90％（32.40％）。 2c Cbo−Gly−Arg−MCA・HBr 化合物2b4.93g（10mM）及びcbo−Gly−
OpNP3.65ｇ（11mM）を新しく蒸留したDMF75
mlに加えた。−10℃に冷却の後に、撹拌しながら、
まずEt3N1.40ml（10mM）、次いで0.70ml
（5mM）を添加した。混合物を湿気の不存在下
に、まず−10℃で３時間、次いで室温で４時間反
応させた。反応溶液を再び−10℃まで冷却し、
Et3N0.70mlで緩衝させ、20℃で１夜撹拌した。
反応混合物を真空中、50℃で濃縮乾燥させ、残分
を50％AcOH200ml中に溶かし、セフアデツクス
Ｇ−15のカラム上で精製した。トリプシンでの処
理により４−メチル−７−アミノ−クマリンを形
成しながら分解したMeOH溶離液フラクシヨン
を真空中、40℃で濃縮乾燥させた。このようにし
て得られた残分を、真空デシケータ中、60℃で
P2O5上で乾燥させると、無定形化合物2c 4.98g
（理論量の82.5％）が得られ、これは、TLCで示
されるようにSS中で均質であつた。元素分析及
び実験式C26H31N6O6Brからの計算により次の値
が得られた：Ｃ＝51.48％（51.75％）、Ｈ＝5.24％
（5.18％）、Ｎ＝13.70（13.93％）、及びBr＝13.14％
（13.24％）。 2d 2HBr・Ｈ−Gly−Arg−MCA 化合物2c 4.83g（8mM）を氷酢酸中の2N
HBr32mlを用いて例1d記載の方法で分解させた。
生じる粗生成物をMeOH100ml中に溶かし、セフ
アデツクスLH−20のカラム上で精製した。トリ
プシンでの処理により４−メチル−７−アミノ−
クマリンの形成下に分解したMeOH溶離液フラ
クシヨンを真空中、30℃で濃縮乾燥させた。得ら
れた残分を真空デシケータ中、40℃でP2O5上で
乾燥させると、無定形化合物2d 4.05g（理論量の
92.0％）が得られ、これは、TLCによればSS中
で均質であつた。元素分析及び実験式
C18H26N6O4Br2からの計算により次の値が得ら
れた：Ｃ＝39.02％（39.29％）、Ｈ＝4.78％（4.76
％）、Ｎ＝15.39（15.27％）、及びBr＝28.72％
（29.04％）。 2e Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−MCA・HBr 化合物2d 2.75g（5mM）を例1e記載の方法で
Cbo−Ｄ−Leu−OpNP2.13g（5.5mM）と反応さ
せた。生じた粗製化合物を50％AcOH75ml中に溶
かし、セフアデツクスＧ−15のカラム上で精製し
た。トリプシンでの処理により４−メチル−７−
アミノクマリンの形成下に分解したAcOH溶離液
フラクシヨンを真空中、40℃で濃縮乾燥させた。
残分を真空デシケータ中、60℃でP2O5上で乾燥
させると、無定形化合物2e 2.91g（理論量の81.2
％）が得られ、これは、TLCで示すようにSS中
で均質であつた。元素分析及び実験式
C32H42N7O7Brからの計算により、次の値が得ら
れた：Ｃ＝53.13％ （53.63％）、Ｈ＝6.01％（5.91％）、Ｎ＝13.91％
（13.68％）及びBr＝10.88％（11.15％）。 アミノ酸分析は、正確な割合での予想アミノ酸
の存在を確認した： Gly：1.00−Leu：1.02−Arg：0.98。 Rf＝0.64 例 ３ 3a Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−５−ChA・
HBrCbo−Arg−５−ChA−HCl 乾燥Cbo−Arg−OH・HCl34.48g（0.1モル）を
1000ml三頚フラスコ中で、新しく蒸留した無水
DMF150mlと無水THF300mlとの混合物中に20℃
で溶かした。−10℃に冷却したこの溶液に、撹拌
下に、湿気の不存在下にEt3N10.2g（0.1モル）を
添加した。次いで、この混合物にTHF50ml中の
クロルギ酸イソブチル13.65g（0.1モル）の溶液を
20分かかつて滴加し、この際反応温度は、決して
−５℃を越えなかつた。−10℃〜−５℃の温度で
の10分間の付加的反応の後に、DMF75ml中の５
−アミノ−キノリン14.42g（0.1モル）の溶液を反
応混合物に30分かかつて適加し、この際、反応温
度を常に−５℃以下に保持した。反応混合物を−
５℃で更に１時間反応させた。次いで20℃で１夜
撹拌し、引続きEt3N・HClを結晶させるために、
−15℃に冷却した。形成されたEt3N・HClを濾
去し、少量の冷DMFで洗浄した。濾液及び洗浄
液を真空中、50℃で濃縮した。残分を50％
AcOH1000ml中に溶かし、50％AcOHで平衡にし
たセフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15のカラム
上でのゲル濾過により精製した。トリプシンでの
処理により５−アミノ−キノリンを形成しながら
分解したAcOH溶離液フラクシヨンを真空中、40
℃で濃縮乾燥させた。残分を真空デシケータ中、
50℃で、P2O5上で乾燥させると、無定形化合物
3a15.02g（理論量の31.9％）が得られ、これは
TLCで示されるようにSS中で均質であつた。元
素分析及び実験式C23H27N6O3Clから計算して、
次の値が得られた：Ｃ＝58.09％（58.66％），Ｈ
＝5.84％（5.78％）、Ｎ＝18.06％（17.85％）及び
Cl＝7.44％（7.53％）。 3b 2HBr・Ｈ−Arg−５−ChA 化合物3a 9.42g（20mM）を例1b記載のように
分解した。慣用の処理の後に、生じた粗生成物を
MeOH150ml中に溶かし、セフアデツクスLH−
20のカラム上でのゲル濾過により精製した。トリ
プシンでの処理により５−アミノ−キノリンを形
成しながら分解したMeOH溶離液フラクシヨン
を真空中で乾燥させた。残分を真空デシケータ
中、40℃で、P2O5上で乾燥させると、無定形化
合物3b 7.56g（理論量の81.8％）が得られ、これ
は、HLCで示されるようにSS中で均質であつた。
元素分析及び実験式C15H22N60Br2から計算して、
次の値が得られた：Ｃ＝38.75％（38.98％）、Ｈ
＝4.83（4.80％）、Ｎ＝18.45％（18.18％）及びBr
＝33.88％（34.58％）。 3c Cbo−Gly−Arg−５−ChA・HBr 化合物3b 4.62g（10mM）例1c記載の方法で
Cbo−Gly−OpNP3.65g（11mM）と反応させた。
慣用の処理の後に得られた粗生成物を50％
AcOH200ml中に溶かし、セフアデツクスＧ−15
のカラム上で精製した。トリプシンでの処理によ
り５−アミノ−キノリンの形成下に分解した
AcOH溶離液フラクシヨンを真空中、40℃で濃縮
乾燥させた。残分を真空デシケータ中60℃で、
P2O5上で乾燥させると、無定形化合物3c 3.92g
（理論量の68.5％）が得られ、これは、TLCで示
されるようにSS中で均質であつた。元素分析及
び実験式C25H30N7O4Brからの計算により、次の
値が得られた：Ｃ＝52.17％（52.45％）、Ｈ＝5.32
％（5.28％）、Ｎ＝17.17％（17.13％）及びBr＝
13.63％（13.96％）。 3d 2HBr・Ｈ・Gly−Arg−５−ChA 化合物3c 2.86g（5mM）を例1d記載の方法で氷
酢酸中の2N HBr20mlを用いて分解した。慣用処
理の後に得られた粗生成物をMeOH100ml中にか
し、セフアデツクスLH−20のカラム上で精製し
た。トリプシンでの処理により５−アミノ−キノ
リンの形成下に分解したMeOH溶離液フラクシ
ヨンを真空中、30℃で濃縮乾燥させた。残分を真
空デシケート中、40℃でP2O5上で乾燥させると、
無定形化合物3d 2.03g（理論量の78.3％）が得ら
れ、これは、TLCで示されるようにSS中で均質
であつた。元素分析及び実験式C17H25N7O2Br2
からの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝
39.19％（39.32％）、Ｈ＝4.90％（4.85％）、Ｎ＝
19.11％（18.83％）及びBr＝30.45％（30.78％）。 3e Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−５−ChA−HBr 化合物3d 1.30g（2.5mM）を例1e記載の方法で
Cbo−Ｄ−Leu−OpNP1.07％（2.75mM）と反応
させた。慣用処理の後に得られた粗生成物を50％
AcOH50ml中に溶かし、セフアデツクスＧ−15の
カラム上で精製した。トリプシンでの処理により
５−アミノ−キノリンの形成下に分解したAcOH
溶離液フラクシヨンを真空中、40℃で濃縮乾燥さ
せた。残分を真空デシケート中、60℃でP2O5上
で乾燥させると、無定形化合物3e 1.35g（理論量
の78.5％）が得られ、これは、TLCで示されるよ
うにSS中で均質であつた。元素分析及び実験式
C31H41N8O5Brからの計算により、次の値が得ら
れた：Ｃ＝54.28％（54.31％）、Ｈ＝6.07（6.03％）
Ｎ＝16.48％（16.34％）及びBr＝11.54％（11.65
％）。 アミノ酸分析は、正しい割合での予想アミノ酸
の存在を確認した： Cly：1.00−Leu：0.98−Arg：0.98、Rf＝0.69 例 ４ 4b Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−２−NA・
HBr2HBr・Ｈ−Arg−２−NA 市販のCbo−Arg−２・NA・HCl9.40g
（20mM）を例1bに記載の方法で氷酢酸中の
2NHBr80mlの溶液を用いて分解した。慣用の処
理の後に得られた生成物をNeOH150ml中に溶か
し、セフアデツクスLH−20のカラム上で精製し
た。トリプシンで処理により２−ナフチルアミン
の形成下に分解したMeOH溶離液フラクシヨン
を真空中、30℃で濃縮乾燥させた。残分を真空デ
シケータ中、40℃で、P2O5上で乾燥させると、
無定形化合物4b 8.60g（理論量の93.2％）が得ら
れ、これは、TLCで示されるようにSS中で均質
であつた。元素分析及び実験式C16H23N5OBr2か
らの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝42.08
％（41.67％）、Ｈ＝5.12％（5.03％）、Ｎ＝14.68
％（15.19％）及びBr＝33.96％（64.65％）。 4c Cbo−Gly−Arg−２−NA・HBr 化合物4b 4.6g（10mM）を例1cに記載の方法で
Cbo−Gly−OpNP 3.63g（11mM）と反応させ
た。慣用処理の後に得られた粗生成物を50％
AcOH150ml中に溶かし、セフアデツクスＧ−15
のカラム上で精製した。トリプシンでの処理によ
り２−ナフチルアミンの形成下に分解したAcOH
溶離液フラクシヨンを真空中、40℃で濃縮乾燥さ
せた。残分を真空デシケータ中、60℃で、P2O5
上で乾燥させると、無定形化合物4c 4.32g（理論
量の75.6％）が得られ、これは、TLCで示される
ように、SS中で均質であつた。元素分析及び実
験式C26H31N6O4Brから計算して、次の値が得ら
れた：Ｃ＝54.24％（54.64％）、Ｈ＝5.52％（5.47
％）、Ｎ＝14.95％（14.71％）及びBr＝13.75％
（13.98％）。 4d 2HBr・Ｈ−Gly−Arg−２−NA 化合物4c 4.57g（8mM）を例1dに記載の方法
で、氷酢酸中の2N HBr28mlを用いて、分解し
た。慣用処理の後に得られた粗生成物を
MeOH100ml中に溶かし、セフアデツクスLH−
20のカラム上で精製した。トリプシンでの処理に
より２−ナフチルアミンの形成下に分解した
MeOH溶離液フラクシヨンを真空中、30℃で濃
縮乾燥させた。残分を真空デシケータ中、40℃で
P2O5上で乾燥させると、無定形化合物4d 3.76g
（理論量の90.6％）が得られ、これは、TLCで示
されるようにSS中で均質であつた。元素分析及
び実験式C18H26N6O2Br2からの計算により、次
の値が得られた：Ｃ＝41.50％（41.72％）、Ｈ＝
5.10％（5.06％）、Ｎ＝16.62％（16.22％）及びBr
＝30.15％（30.84％）。 4e Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−２−NA・HBr 化合物4d 2.59g（5mM）を例1eに記載の方法で
Cbo−Ｄ−Leu−Op−NP2.13g（5.5mM）と反応
させた。慣用処理により得た粗生成物を50％
AcOH100ml中に溶かし、セフアデツクスＧ−15
のカラム上で精製した。トリプシンでの処理によ
り２−ナフチルアミンの形成下に分解したAcOH
溶離液の最初の主フラクシヨンを真空中、40℃で
濃縮乾燥させ真空デシケータ中、60℃で、P2O5
上で乾燥させた。こうして、無定形化合物4e
2.72g（理論量の79.5％）が得られ、これは、TLC
で示されるように、SS中で均質であつた。元素
分析及び実験式C32H42N7O5Brからの計算によ
り、次の値が得られた：Ｃ＝55.78％（56.14％）、
Ｈ＝6.24％（6.18％）、Ｎ＝14.48％（14.32％）及
びBr＝11.45％（11.67％）。 アミノ酸分析は、予想アミノ酸が正しい割合で
存在することを確認した： Gly：1.00−Leu：1.01−Arg：0.99、Rf＝0.65 例 ５ 5b Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−４−NA・
HBr2HBr・Ｈ−Arg−４−MeO−２−NA 市販のCbo−Arg−４−MeO−２−NA・
HCl10.0g（20mM）を例1bに記載の方法で氷酢酸
中の2N HBr80mlの溶液を用いて分解した。慣用
処理の後に得られた粗生成物をNeOH150ml中に
溶かし、セフアデツクスLH−20のカラム上で精
製した。トリプシンでの処理により４−メトキシ
−２−ナフチルアミンの形成下に分解した
MeOH溶離液の主フラクシヨンを真空中、30℃
で濃縮乾燥させた。残分を真空デシケータ中、
P2O5上で乾燥させると、無定形化合物5b8.98g
（理論量の91.4％）が得られ、これは、TLCで示
されるようにSS中で均質であつた。元素分析及
び実験式C17H25N5O2Br2からの計算により、次
の値が得られた：Ｃ＝41.22％（41.57％）、Ｈ＝
5.19％（5.13％）、Ｎ＝14.40％（14.26％）及びBr
＝32.01％（32.53％）。 5c Cbo−Gly−Arg−４−MeO−２−NA・HBr 化合物5b 4.91g（10mM）を例1cに記載の方法
でCbo−Gly−OpNP3.63g（11mM）と反応させ
た。慣用処理の後に得られた粗生成物を50％
AcOH中に溶かし、セフアデツクスＧ−15のカラ
ム上で精製した。トリプシンでの処理により４−
メトキシ−２−ナフチルアミンの形成下に分解し
たAcOH溶離液フラクシヨンの真空中、40℃で濃
縮乾燥させた。残分を真空デシケータ中、60℃
で、P2O5上で乾燥させると、無定形化合物5c
5.21g（理論量の88.4％）が得られ、これは、TLC
により示されるように、SS中で均質であつた。
元素分析及び実験式C27H33N6O5Brからの計算に
より次の値が得られた：Ｃ＝53.41％（53.91％）、
Ｈ＝5.55％（5.53％）、Ｎ＝14.22％（13.97％）及
びBr＝12.95％（13.28％）。 5d 2HBr・Ｈ−Gly−Arg−４−MeO−２−NA 化合物5c 2.95g（5mM）を例1dに記載の方法
で、氷酢酸中の2N HBr20mlで分解した。慣用の
処理の後に得られた粗成成物をMeOH100ml中に
溶かし、セフイデツクスLH−20のカラム上で精
製した。トリプシンでの処理により４−メトキシ
−２−ナフチルアミンの形成下に分解した
MeOH溶離液の主フラクシヨンを真空中、30で
濃縮乾燥させた。残分を真空デシケータ中、40℃
でP2O5上で乾燥させると、無定形化合物5d
2.49g（理論量の90.9％）が得られ、これは、TLC
で示されるようにSS中で均質であつた。元素分
析及び実験式C19H28N6O3Br2からの計算により
次の値が得られた：Ｃ＝41.32％（41.62％）、Ｈ
＝5.19％、（5.15％）、Ｎ＝15.54％（15.33％）及
びBr＝28.85％（29.15％）。 5e Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−４−MeO−２
−NA・HBr 化合物5d 2.81g（5mM）を例1eに記載の方法で
Cbo−Ｄ−Leu−OpNP2.13g（5.5mM）と反応さ
せた。慣用処理の後に得られた粗生成物を50％
AcOH125ml中に溶かし、セフアデツクスＧ−15
のカラム上で精製した。トリプシンでの処理によ
り４−メトキシ−２−ナフチルアミンの形成下に
分解したAcOH溶離液の最初の主フラクシヨンを
真空中、40℃で濃縮乾燥させた。残分を真空デシ
ケータ中、60℃で、P2O5上で乾燥させると、無
定形化合物5e3.00g（理論量の84.0％）が得られ、
これは、TLCで示されるように、SS中で均質で
あつた。元素分析及び実験式C33H44N7O6Brから
計算して、次の値が得られた：Ｃ＝55.16％
（55.46％）、Ｈ＝6.25％（6.21％）、Ｎ＝13.96％
（13.72％）及びBr＝11.00％（11.18％）。Rf＝0.65 アミノ酸分析は、正しい割合での予想アミノ酸
の存在を確認した。 Gly：1.00−Leu：1.01−Arg：0.93 例 ６ Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA・AcOH Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA−HBr（例１
で製造した）6.80g（10mM）を60％MeOH水75ml
中に溶かした。溶液をアセテート型のアンバーラ
イトJRA−401のカラム上に注いだ。このカラム
を60％MeOH水を用いて溶離させ、HBrをイオ
ン交換によりAcOHで換えた。溶離液を真空中、
40℃で、P2O5上で乾燥の後にブロミド不含のCbo
−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA・AcOH6.62g（理
論量の6.62g）が得られた。他の有機酸例えばギ
酸、プロピオン酸、蓚酸、酒石酸、クエン酸、乳
酸、安息香酸、クロル安息香酸、サリチル酸又は
フタル酸との塩も同じ方法で前記トリペプチド誘
導体から製造することができる。イオン交換体は
例えば塩酸塩の形のアンバーライトJRA−401で
あつてよく、所望の酸塩の形は、前記イオン交換
体を苛性ゾーダ溶液で処理し、次いで、60％
MeOH水中の所望の有機酸とそのナトリウム塩
との１：１−混合物の溶液で処理することにより
塩基性OH型に変えることができる。 例 ７ Me−SO2−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA・HBr 2HBr・Ｈ・Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA（例7f
に記載の方法で製造、第３表参照）6.26g
（10mM）を蒸留したDMF30ml中に溶かした。溶
液を−15℃に冷却し、湿気の不存在下に撹拌しな
がらまずEt3N2.80ml（20mM）かつその後直ちに
メチルスルホニルクロリド1.15g（10mM）を添加
した。−15℃での約２〜３時間の反応時間の後に、
反応混合物を、室温で更に１夜反応させた。反応
混合物を再び−15℃に冷却した。Et3N・HBrと
Et3N・HClとの沈澱混合物を濾去し、少量の冷
DMFで洗浄した。濾液及び洗浄液を集め、真空
中50℃で濃縮乾燥させた。残分を50％AcOH75ml
中に溶かした。溶液を50％AcOHで平衡にしたセ
フアデツクスＧ−15のカラムで精製させた。トリ
プシンでの処理によりｐ−ニトロアニリンの形成
下に分解したAcOH溶離液の主フラクシヨンを真
空中、40℃で濃縮乾燥させた。残分をMeOH100
ml中に溶かし、溶液を再び濃縮乾燥させた。残分
を真空デシケータ中、60℃でP2O5上で乾燥させ
ると、無定形化合物Me−SO2−Ｄ−Leu−Gly−
Arg−pNA・HBr5.64g（理論量の90.5）が得ら
れ、これはTLCで示されるようにSS中で均質で
あつた。元素分析及び実験式C21H35N8SO7Brか
らの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝40.90
％（40.45％）、Ｈ＝5.71％（5.66％）、Ｎ＝18.28
％（17.97％）、Ｓ＝5.01％（5.14％）及びBr＝
12.55％（12.82％）。Rf＝0.61
４個を有するアルコキシカルボニル基、bp−位
でメチル、メトキシ又は塩素で置換されていてよ
いベンジル基を有するベンジルオキシカルボニル
基又はｃ炭素原子数１〜４個を有するアルカンス
ルホニル基を表わし、R2はａ炭素原子数１〜３
個を有する直鎖又は分枝鎖のアルキル基又はｂシ
クロヘキシル又は４−ヒドロキシシクロヘキシル
基を表わし、R5はｐ−ニトロフエニルアミノ、
β−ナフチルアミノ、４−メトキシ−β−ナフチ
ルアミノ、５−ニトロ−α−ナフチルアミノ、キ
ノン−５−イル−アミノ、８−ニトロ−キノン−
５−イル−アミノ又は４−メチル−クマール−７
−イル−アミノ基を表わす〕のトリペプチド誘導
体又は酸とのその塩。 ２ アルギニンの強塩基性グアニジノ基は無機又
は有機酸でのプロトン化により安定化されてい
る、請求の範囲第１項記載のトリペプチド誘導
体。 ３ アルギニンのグアニジノ基は酢酸でのプロト
ン化により安定化されている、請求の範囲第１項
又は第２項記載のトリペプチド誘導体。 技術分野 本発明は、酵素分類３，４，21、の特定酵素特
に第Xa因子により非常に容易に分解されるトリ
ペプチド誘導体に関する。従つて、この新規トリ
ペプチド誘導体は、前記酵素特に第Xaを定量分
折するための基質として使用される。 背景技術 第Xa因子は、血液凝固カスケード中で酵素前
駆体第Ｘ因子の活性化により形成され、燐脂質及
び（プロトロンビン）をペプチド鎖の２点で蛋白
質分解して、前記因子を、最終的に凝固させる第
ａ因子（トロンビン）に変じる蛋白質分解酵素
である。特定の病気例えば肝臓疾患、ビタミン欠
乏症等の際に、かつジクマロール療法において、
第Ｘ因子の形成は減少されている。この第Ｘ因子
の合成に関する遺伝的障害により、もちろん第
Xa因子の形成は、相応して減少されている。従
つて、簡単かつ正確な方法で、血漿中の第Xa因
子を光学的に分析させる直接酵素分析法を自由に
得ることは、重要である。 第Xa因子を分析する主要な方法は次のとおり
である； ａ 生物学的分析法〔Thrombosis and
Bleeding Disorders，Nils U.Bang、Ceorg
Thieme Verlag196頁（1971年）参照〕：第Ｘ
因子をラツセル（Russel）まむし毒及びカル
シウムイオンを用いて活性化する。１工程操作
で、プロトロンビンを第Ｖ因子及び燐脂質の存
在で第Xa因子を用いて活性化してトロンビン
にし、トロンビンはインジケータフイブリノゲ
ンをフイブリンに変える。凝固時間を測定す
る。所要の第因子及び第Ｖ因子及びフイブリ
ノゲンは、第Ｘ因子不含の基質により供給され
る、凝固時間は、第Ｘ因子の活性化の程度によ
り影響される。他の条件は一定で、この活性化
度は、試料中の第Ｘ因子の濃度の係数である。
凝固時間はこの実験で主観的に読み取られるの
で、この生物学的方法は、粗雑な分析を実施す
ることを可能とするだけである。更に、処理さ
れた血漿が必要であり、その調製の間に誤ちが
起こりうる。更に、インジケータとしての作用
をするフイブリノゲンは、直接は形成されない
が、活性化されたトロンビンを経て形成される
（間接的方法）。 ｂ 生化学的方法〔“Thrombosis and Bleeding
Disorders”、N.U.Bang、Georg Thieme
Verlag、196〜７頁（1971年）参照〕；試験さ
れるべき第Ｘ因子調製物が充分に純粋であれ
ば、より正確な分析法が提供されうる。エスナ
フ（Esnouf）及びウイリアムズ（Williams）
（1962年）は、第Xa因子がエステラーゼ活性を
有し、従つて、合成アミノ酸エステルを分解す
ることを示している。しかしながら、この分析
のためには第Ｘ因子50〜100μgが必要である。
他方、カルボベンゾキシ−フエニルアニリン−
ｐ−ニトロフエニルエステルを用い、単位時間
当りの発生ｐ−ニトロフエノールの量を測定す
ることにより、低濃度の第Xa因子を測定する
ことができる。この分析法は次の欠点を有す
る：使用エステルは適用pH値で自己加水分解
し、更に、これは多くの他の酵素にも応答する
ので、第Xa因子に対して特異的ではない。こ
のエステルは水中に不溶であるから、アセトン
が必要である。これらのすべての欠点の結果と
して、この分析法は不正確であり、経費がかか
る。 ｃ 西ドイツ国特許出願公開第2552570号明細書
には、第Xa因子分析用基質として使用される
べきテトラペプチド誘導体が記載されている。 BZ−Ile−Glu−G1y−Arg−pNA−HClが、第
Xa因子により分解されてｐ−ニトロアニリンを
形成するテトラペプチド誘導体の１例として記載
されている。このｐ−ニトロアニリンの形成は、
分光光度法で追跡できる。この第Xa因子分析法
は、前記の生物学的及び生化学的分析法よりはい
くらか正確である。 しかしながら、西ドイツ特許出願公開第
2552570号明細書に記載のテトラペプチド誘導体
は、基質飽和で実施されるべき第Xa因子の分析
を可能とする程度に充分に水性媒体中に可溶では
ない。例えば病的血漿中の測定すべき第Xa因子
の濃度が極めて低い場合には、前記テトラペプチ
ド誘導体は、相応する正確な測定値を得させる程
度に充分に敏感ではない。測定すべき第Xa因子
の量が更に血漿を加えることにより増加したら、
血漿蛋白質の影響下にテトラペプチド基質の沈澱
が生じるはずであり、その結果として、酵素分析
を実施することが不可能となるはずである。 発明の開示 ところで、水性媒体中に非常に溶け易く、第
Xa因子に対して意想外に高い敏感性を有する新
規のトリペプチド誘導体を見つけた。 本発明のこのトリペプチド誘導体は、次の一般
式を有する： 式： 〔式中R1はａアルコキシ中に炭素原子数１〜
４個を有するアルコキシカルボニル基、bp−位
でメチル、メトキシ又は塩素で置換されていてよ
いベンジル基を有するベンジルオキシカルボニル
基又はｃ炭素原子数１〜４個を有するアルカンス
ルホニル基を表わし、R2はａ炭素原子数１〜３
個を有する直鎖又は分枝鎖のアルキル基又はｂシ
クロヘキシル又は４−ヒドロキシシクロヘキシル
基を表わし、R5はｐ−ニトロフエニルアミノ、
β−ナフチルアミノ、４−メトキシ−β−ナフチ
ルアミノ、５−ニトロ−α−ナフチルアミノ、キ
ノン−５−イル−アミノ、８−ニトロ−キノン−
５−イル−アミノ又は４−メチル−クマール−７
−イル−アミノ基を表わす〕。 アルギニンの強塩基性グアニジノ基は、例えば
鉱酸例えばHCl、HBr、H2SO4又はH3PO4又は
有機酸例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、
クエン酸、蓚酸、酒石酸、安息香酸、フタル酸、
トリクロル酢酸又はトリフルオル酢酸でプロトン
化することにより安定化されるのが有利である。
プロトン化の特性は、酵素に対するトリペプチド
基質の敏感度（感受性）に対して影響を有しな
い。 式のトリペプチド誘導体は、次に記載の自体
公知の方法で製造できる。 １ 色原性基R5をＣ−末端アルギニンのカルボ
キシ基に付着させ、他方、そのα−アミノ基を
保護基例えばカルボベンゾキシ又はｔ−ブトキ
シカルボニル基で保護し、アルギニンのδ−グ
アニジンを例えばHClを用いるプロトン化、窒
化又はトジル化により保護する。Ｃ−末端基は
ペプチド鎖の段階的形成の間に保護基としての
役目もする。残りの保護基は、必要に応じて所
望ペプチド鎖が完全に組立てられるまでに、次
のアミノ酸誘導体に付着するために、選択的に
除去することができる。最後に、影響されてい
る基R5以外の残りの保護基をまつたく除去す
ることができる〔例えばMiklos Bodansky等
による“Peptide Synthesis”、Interscience
Publishers、163〜165頁、（1966年）参照〕。 ２ まず、ペプチド鎖を形成し、他方、アルギニ
ンのＣ−末端カルボキシル基を有用なエステル
基例えばメトキシ、エトキシ又はベンジルオキ
シ基で保護する（前記のBodanskyの文献参
照）。選択的にトリフルオル酢酸を用いて除去
すべきｔ−ブトキシ基以外のエステル基はアル
カリ性加水分解により除去することができる。
アルギニンのδ−グアニジル基をプロトン化す
ると、このエステル基はトリプシンにより除去
され、この場合にラセミ化は起こらない。その
後、色原性基R5を導入する。アルギニンのδ
−グアニジノ基をニトロ又はトシル基で保護
し、トリペプチド誘導体のＮ−末端α−アミノ
基をカルボベンゾキシ基又はｐ−メチル、ｐ−
メトキシ又はｐ−クロル−ベンジルオキシカル
ボニル基又はｔ−ブトキシ基で保護する場合
は、これらすべての保護基を同時に除去する。
この除去は、保護されたトリペプチド誘導体を
室温で無水HFで処理することにより達成で
き、結果として、前記のアミノ基及びδ−グア
ニジノ保護基のすべてが除去される。この除去
は、保護されたトリペプチド誘導体が保護基と
してニトロ又はトシル基を含有しない場合は、
室温で氷酢酸中の2N HBrでの処理によつて実
施することもできる。 式のトリペプチド誘導体は、西ドイツ特許出
願公開第2552570号明細書に記載のテトラペプチ
ド誘導体よりも著しく容易に水中に溶け、従つ
て、信頼しうる測定結果を得るために要求される
基質飽和で実施されるべき酵素分析を可能とす
る。更に、式のトリペプチド基質は、西ドイツ
特許出願公開第2552570号明細書記載のテトラペ
プチド誘導体よりも著しく敏感であり、従つて、
極めて低い濃度の第Xa因子を分析するために使
用することもできる。 西ドイツ特許出願公開第7607433号明細書には、
一般式：Ｈ−Ｄ−A1−A2−A3−NH−Ｒ（A1，
A2，A3＝アミノ酸残基）を有し、酵素分類E.
C.3，４，21の酵素例えばトロンビン及びプラス
ミンに対して高い敏感度を有するトリペプチド誘
導体が記載されている。この高い敏感度は、Ｎ−
末端Ｄ−アミノ酸が非置換α−アミノ基を有する
事実に起因する。実際に、この末端Ｄ−アミノ酸
のα−アミノ基が置換されている場合、即ち、式
中の水素が保護基又は遮断基例えばベンゾイル又
はカルボベンゾキシ基で換えられると、酵素分類
３，４，21の酵素に対するトリペプチド誘導体の
敏感度は著しく低下される。 これらの発見に基づき、式中のＮ−末端Ｄ−ア
ミノ酸のα−アミノ基が保護基又は遮断基を有す
る式の新規トリペプチド誘導体は酵素分類３，
４，21の酵素により分解されないか又は僅かに分
解されることは予測できた。しかしながら、すべ
ての予想に反して、新規トリペプチド基質は意想
外に第Xa因子に対する非常に高い敏感度を有す
る。 西ドイツ特許出願公開第255257号明細書に記載
のテトラペプチド誘導体に比べた本発明のトリペ
プチド基質のもう１つの利点は、実際に、その合
成が簡単かつ経費が安い事実に帰する。 本発明のトリペプチド基質は、酵素分類E.C.3，
４，21の特定酵素（“Enzyme Nomenc1−ature”
Elsevier Scientific Publishing Com−pany，
Amsterdam1973年238頁以降参照）例えば血漿中
の第Xa因子の定量分析に使用することができ、
第Xa因子を経て、他の生物学的に重要な因子例
えば第Ｘ因子（第Xa因子のプロ酵素）、第Xa抗
因子（＝抗トロンビン又はヘパリン補因子）又
は血漿中のヘパリンの定量分析にも使用できる。 これらの種々の分析は次に記載の方法で実施で
きる： １ 第Xa因子及び第Ｘ因子の分析： クエン酸処理したヒト血漿を用い、まず、血漿
中に存在する第Ｘ因子を第Xa因子に変えるため
に、ラツセルまむし毒（RVV＝Russel viper
venom）又はトロンボプラスチン試薬で活性化
する。次の試薬を使用する： 緩衝液 トリス−イミダゾール緩衝液、
pH8.4、イオン濃度0.3； RVV 凍結乾燥したラツセルまむし毒調製物
（Laboratoire Stago，92600Asnieres
Ｓ／Seine，Franceより提供）を CaCl2 0.015Mを含有する緩衝液中に溶解したも
の； 基 質 蒸留水中に溶かしたMeSO2−Ｄ−
CHA−Gly−Arg−pNA・AcOH（濃度：
２×１ 0-3M）。 試験キユベツトに、37℃で加熱したRVV0.2ml
を装入し、次いで、クエン酸処理したヒト血漿
0.02mlを装入する。この２種成分を直ちに混合
し、次いで、37℃で60秒間インキユベートする。
生じる活性混合物を37℃に加熱された緩衝液1.6
mlで希釈し、２×１ 0-3M基質溶液0.2mlと混合
する。次いで、発生ｐ−ニトロアニリンにより惹
起される混合物の光学密度の変化を405nmの波長
で分光度法で測定する。測定された１分当りの光
学密度の増加は、活性化された血漿中に存在する
第Xa因子の量に正比例する。測定された１分当
りの光学密度の増加は、活性化の結果として、第
Ｘ因子の所定量が化学量論的に相当量の第Xa因
子に変じるので、出発血漿中に存在する第Ｘ因子
の量に関する尺度でもある。 ２ 第Xa抗因子の分析： クエン酸塩処理したヒト血漿をTRIS−緩衝液
で１：10の割合で希釈することにより試料を調製
する。TRIS−イミダゾール緩衝液中のヘパリン
溶液（緩衝液１ml当りヘバリン3USP単位を含
有）100μlを前記希釈血漿100μlに加え、混合物を
37℃で２分間インキユベートし、このインキユベ
ートしたものに、１ml当り第Xa因子8.5単位を含
有する牛の第Xa因子調製物ダイアゲン
（Diagen；提供者Diagnostic Reagents、
Thame、英国）を加える。この混合物を37℃で
３分間インキユベートする。このインキユベート
したものを37℃に加熱したTRIS−イミダゾール
緩衝液0.6mlで希釈し、直ちに、37℃に加熱した
蒸留水中の２×10-3MのCH3SO2−Ｄ−CHA−
Gly−Arg−pNA・AcOH（基質）の溶液100μlと
混合する。 並行実験で、同じ方法によるが、希釈された血
漿の代わりに同量の緩衝液を用いて盲検試料を調
製した。 双方の試料（被検試料及び盲検試料）に関し
て、405nmでの光学密度の増加をを分光光度法で
測定する。盲検試料の１分当りの光学密度の増加
（ΔOD盲検／min）と被検試料の１分当りの光学
密度の増加（ΔOD被検／min）との間の差は、
第Xa抗因子−ヘパリン錯体により抑制された第
Xa因子の量に関する尺度であり、従つて血漿中
に存在する第Xa抗因子（＝抗トロンビン）の
量の尺度である。 ３ 血漿中のヘパリンの分析： ヘパリン処理した患者の血漿をTRIS−イミダ
ゾール緩衝液で１：10の割合で希釈することによ
り被検試料を調整する。この希釈した血漿を37℃
で１〜２分間インキユベートし、このインキユベ
ートしたものにウシの第Xa因子調製物ダイアゲ
ン（提供者：Diagnostic Rra gents、 Thame、
英国）の溶液（１ml当り第Xa因子8.5単位含有）
100μlを添加し、混合物を37℃で３分間インキユ
ベートする。このインキユベート物を37℃に加熱
したTRIS−イミダゾール緩衝液0.6mlで希釈し、
直ちに、蒸留水中のCH3SO2−Ｄ−CHA−Gly−
Arg−pNA・AcOH（基質）の２×10-3M溶液
100μlと混合する。 並行実験で、同じ方法であるが、希釈されたヘ
パリン処理血漿の代わりに相応して希釈された正
常血漿（ヘパリン不含）同量を用いて、盲検試料
を調製する。 双方の試料に関して405nmにおける１分当りの
光学密度の増加を測定する。盲検試料の１分当り
の光学密度の増加（ΔOD盲検／min）と被検試
料の１分当りの光学密度の増加（ΔOD被検／
min）との間の差は、ヘパリン−補因子（抗トロ
ンビン）に結合したヘパリンの抑制活性の尺度で
ある。 第Xa抗因子（＝ヘパリン−補因子又は抗トロ
ンビン）は単独で第Xa因子を抑制するが、短
いインキユベーシヨン時間（例えば３分）内に少
量の第Xa因子だけが抑制される程度に遅い。し
かしながら、第Xa抗因子がヘパリンと接触する
なら、２成分は、第Xa因子の迅速抑制成分であ
り、短いインキユベーシヨン時間（例えば３分）
内に第Xa因子と完全に結合する錯体を形成する。 第Xa因子の抑制は、存在するヘパリンの量に
比例するので、充分な第Xa抗因子が存在するか
ぎり、患者の血漿中に存在するヘパリンの量は、
正常血漿で得られる並行曲線を用いて、かつ添加
したヘパリンの強化作用の理由で、添加へパリン
の量を増加することにより測定できる。 第Xa因子と本発明のトリペプチド誘導体との
間の反応で生じた着色された分解生成物Ｈ−R5
（ｐ−ニトロアニリン）の量の測定において、利
点は、分解生成物が基質のそれとは異なるUVス
ペクトルを有し、長波長の方向にシフトしている
事実に基づく。本発明の基質は約310nmで最大吸
収を示し、約13000のモル吸光係数を示す。
405nmでの基質の吸収は実質的に０である。基質
の酵素的加水分解により形成される分解生成物即
ちｐ−ニトロアニリンは、380nmで最大吸収及び
約13200のモル吸光係数を示す。405nmでの吸光
係数は、徐々に、即ち約10400まで減少する。 色原性基としてβ−ナフチルアミノ、４−メト
キシ−β−ナフチルアミノ又はクマル−７−イル
−アミノ基を有する基質の場合に、第Xa因子に
より形成された分解生成物Ｈ−R5の量を蛍光分
光光度法により測定する。第Xa因子、緩衝液及
び基質よりなる試験系において、蛍光分解生成物
を300〜400nmのエネルギーの多い光で連続的に
励起した後に、400〜470nmでエネルギーの少な
い光を連続的に測定する。単位時間当りに形成さ
れる分解生成物の量は、存在する第Xa因子活性
の尺度である。定義によれば、１分当りに形成さ
れる分解生成物の1μモルは、所定の１基質に対
する第Xa因子の１酵素単位に相当する。 前記の分析法の敏感度は、その量の測定前の分
解生成物Ｈ−R5をジアゾ化合物とのカツプリン
グにより、より強く着色された化合物（この際
R5はｐ−ニトロフエルアミノ、５−ニトロ−α
−ナフチルアミノ又は８−ニトロ−キノン−５−
イル−アミノ基である）に変えることにより、更
に増大させることができる。 発明を実施するための最良の形態 次の操作例で、本発明のトリペプチド誘導体を
詳述する。温度は摂氏で示す。 実施例により得られる溶離物及び生成物の分析
は、二酸化珪素ゲル（Merck Ｆ 254）でコー
トされたガラスプレートを用いる薄層クロマトグ
ラフイにより実施した。薄層クロマトグラムは、
次の溶剤系：ｎ−ブタノール／酢酸／水（３：
１：１）を用いて展開した。 次の略語を使用する： Ac＝アセチル、 Ac2O＝無水酢酸、 AcOH＝酢酸、 Arg＝Ｌ−アルギニン、 BOC＝ｔ−ブトキシカルボニル、 Bu＝ブチル、 Ｄ−But＝Ｄ−２−アミノ酪酸、 ChA＝キノニルアミド、 Ｄ−CHA＝Ｄ−３−シクロヘキシルアラニン、 Ｄ−CHT＝Ｄ−３−（４−ヒドロキシシクロヘキ
シル）−アラニン、 ＝核中で置換されたチロシン、 Cbo＝カルボベンゾキシ、 DMF＝ジメチルホルムアミド、 TLC＝薄層クロマトグラフイ又は薄層クロマト
グラム、 Et＝エチル、 Et3N＝トリエチルアミン、 Gly＝グリシン、 HMPTA＝Ｎ，Ｎ，N′，N′，N″，N″−ヘキシ
ルメチル−燐酸トリアミド、 Ｄ−Leu＝Ｄ−ロイシン、 SS＝溶剤系、 MCA＝７−アミド−４−メチルクマリン、 MeO＝メトキシ、 MeOH＝メタノール、 NA＝ナフチルアミド、 Ｄ−Nleu＝Ｄ−ノルロイシン、 Ｄ−Nval＝Ｄ−ノルバリン、 OpNP＝ｐ−ニトロフエノキシ、 pNA＝ｐ−ニトロアニリド、 Pr＝プロピル、 TFA＝トリフルオル酢酸、 THF＝テトラヒドロフラン、 他に記載のないかぎり、アミノ酸はＬ−型を有
する。 例 １ 1a Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA・
HBrCbo−Arg−pNA・HCl 250ml三頸フラスコ中で、真空中P2O5上で乾燥
したCbo−Arg−CH・HCl16.0g（47mM）を、無
水HMPTA90ml中に、湿気不存在下に20℃で溶
かした。生じる溶液に、室温でまず、
HMPTA10ml中のEt3H4.74g（47.0mM）の溶液を
加え、次いで、イソシアン酸ｐ−ニトロフエニル
16.4g（100mM）（100％過剰）を滴下した。20℃
で24時間の反応時間の後に、HMPTAの大部分
を真空中での蒸留により除去した。残分を30％
AcOHで数回抽出した。残分を捨てた。集めた
AcOH抽出物を30％AcOHで平衡にしたセフアデ
ツクスＧ−15のカラムを通し、30％AcOHで溶離
させることにより更に精製した。トリプシンでの
処理によりｐ−ニトロアニリンの形成下に分解し
たAcOH溶離液のフラクシヨンを凍結乾燥させ
た。こうして、SS中でTLCにより示されるよう
な均質である無定形粉末12.6gが得られ。元素分
析及び実験式C20H25N6O5Clからの計算は次の値
を示した：Ｃ＝51.29％（51.67％）、Ｈ＝5.48％
（5.42％）、Ｎ＝17・92％（18.08％）、Cl＝7.50％
（7.63％）。括弧内の値は計算値である。 1b 2HBr・Ｈ・Arg・pNA 化合物Ia4.65g（10mM）を、撹拌下に、氷酢酸
中の2N HBr40mlで、20℃、湿気の不存在下に45
分間処理した。アミノ酸誘導体はCO2発生下に溶
けた。反応溶液を激しい撹拌下に、無水エーテル
250mlに滴加すると、2HBr・Ｈ−Arg−pNAは
沈澱した。エーテル相を吸引除去し、更に、固相
を、副産物として形成された臭化ベンジル並びに
過剰のHBr及びAcOHを実質的に除去するため
に、無水エーテル100mlで４回洗浄した。残分を
MeOH50ml中に溶かし、Et3N添加によりpHを
4.5に調節し、溶液を真空中、30℃で濃縮乾燥さ
せた。得られる生成物をMeOH75ml中に溶かし、
MeOHで平衡にしたセフアデツクスLH20（交叉
結合デキストランゲル）のカラムに通した。溶離
液のフラクシヨンから、無定形化合物Ib4.18g（理
論量の91.6％）が得られ、これは、TLCで示され
るようにSS中で均質であつた。元素分析及び実
験式C12H20N6O3Br2からの計算により、次の値
が得られた：Ｃ＝31.15％（31.60％）、Ｈ＝4.35％
（4.42％）、Ｎ＝18.84％（18.43％）及びBr＝34.81
％（35.03％）。 1c Cbo−Gly−Arg−pNA・HBr 化合物1b.4.56g（10mM）を新しく蒸留した
DMF30ml中に溶かし、この溶液を−10℃まで冷
却し、この溶液に、撹拌下にEt3N1.40ml
（10mM）を添加した。形成されたEt3N・HBrを
濾去し、少量の冷DMFで洗浄した。この濾液に、
撹拌下にCbo−Gly−OpNP3.65g（11mM）を加
え、湿気の不存在下に２〜３時間反応させ、この
際、反応溶液の温度は徐々に約20℃に達した。溶
液を再び−10℃まで冷却し、Et3N0.7ml（5mM）
を用いて緩衝させた。反応溶液を約−10℃で約２
時間、かつ室温で３時間反応させた。この挿作を
Et3N0.70mlを用いて繰り返し、16時間後に、反
応溶液を真空中、50℃で濃縮させた。残分を、50
％AcOH75ml中に溶かし、50％AcOHで平衡にし
たセフアデツクスＧ−15のカラム上でのゲル濾過
により精製した。トリプシンでの処理によりｐ−
ニトロアニリンの形成下に分解したAcOH溶離液
のフラクシヨンを、真空中40℃で濃縮乾燥させ
た。残分をMeOH150ml中に溶かし、再び濃縮乾
燥させた。生じる残分を真空デシケータ中、60℃
で、P2O5上で乾燥させると、無定形化合物
Ic5.85g（理論量の88.3％）が得られ、これは、
TLCで示されるようにSS中で均質であつた。元
素分析及び実験式C22H28N7O6Brから計算して、
次の値が得られた：Ｃ＝46.33％（46.65％）、Ｈ
＝5.04％（4.98％）、Ｎ＝17.88％（17.31％）、及
びBr＝14.20％（14.11％）。 1d 2HBr・Ｈ−Gly−Arg−pNA 化合物Ic4.56g（8mM）を、撹拌下に氷酢酸中
の2N HBr32mlで、20℃で40分間処理した。ジペ
プチド誘導体は徐々にCO2の発生下に溶けた。反
応溶液を激しい撹拌下に無水エーテル250mlに滴
加すると、2HBr・Ｈ・Gly−Arg−pNAが沈澱
した。エーテル相を吸引除去し、更に、固体相
を、副産物として形成された臭化ベンジル並びに
過剰のHBr及びAcOHを実質的に除去するため
に、無水エーテル100mlで４回洗浄した。残分を
MeOH50ml中に溶かした。Et3Nを用いてpH値を
4.3に調節し、溶液を、真空中、30℃で濃縮乾燥
させた。得られる残分をMeOH50ml中に溶かし、
MeOHで平衡にしたセフアデツクスLH−20のカ
ラム上で精製した。トリプシンでの処理によりｐ
−ニトロアニリンの形成下に分解したMeOH溶
離液のフラクシヨンを真空下、30℃で濃縮乾燥さ
せた。得られる残分を真空デシケータ中、40℃で
P2O5上で乾燥させると、無定形化合物Id3.78g（理
論量の92.1％）が得られ、これは、TLCで示され
るようにSS中で均質であつた。元素分析及び実
験式C14H23N7O4Brからの計算で、次の値が得ら
れた：Ｃ＝32.31（32.77％）、Ｈ＝4.59％（4.52
％）、Ｎ＝19.47％（19.11％）、及びBr＝30.78％
（31.14％）。 1e Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA・HBr 化合物Id2.57g（5mM）を新しく蒸留した
DMF20ml中に溶かし、溶液を−10℃まで冷却し、
この溶液に、撹拌下にEt3N0.70ml（5mM）を加
えた。形成されたEt3N・HBrを濾去し、少量の
DMFで洗浄した。濾液に、Cbo−Ｄ−Leu−
OpNP2.13g（25.5mM）を−10℃で、撹拌下に加
えた。反応混合物を、湿気の不存在下に２〜３時
間反応させたら、この際、反応溶液の温度は徐々
に約20℃に達した。溶液を再び−10℃まで冷却
し、Et3N0.35ml（2.5mM）で緩衝させた。反応
溶液を−20℃で約２時間、かつ室温で更に３時間
反応させた。この工程を、Et3N0.35mlを用いて
くり返し、16時間後に反応溶液を真空中、50℃で
濃縮乾燥させた。残分を50％AcOH50ml中に溶か
し、50％AcOHで平衡にしたセフアデツクスＧ−
15のカラム上でのゲル濾過により精製した。トリ
プシンでの処理によりｐ−ニトロアニリンを生じ
ながら分解したAcOH溶離液フラクシヨンを真空
中、40℃で濃縮乾燥させた。残分をMeOH100ml
中に溶かし、溶液を再び濃縮乾凅させた。生じる
残分を真空デシケータ中、60℃でP2O5で乾燥さ
せると、無定形化合物1e3.08g（理論量の90.6％）
が得られ、これはTLCで示されるようにSS中で
均質であつた。元素分析及び実験式
C28H39N8O7Brからの計算により次の値が得られ
た：Ｃ＝49.06％（49.49％）、Ｈ＝5.82％（5.78
％）、Ｎ＝16.85％（16.49％）、及びBr＝11.59％
（11.76％）。 アミノ酸分析は、正確な割合での予想アミノ酸
の存在を確認した。 Cly：1.00−Ｄ−Leu：0.99−Arg：0.97。 Rf＝0.62。 Rf値は、シリカゲルプレート（Merck
No.254）上で、ｎ−ブタノール：氷酢酸：水＝
３：１：１を用いて測定した。23〜25℃、８〜10
cmの展開距離で展開した。スポツトはUV−線
で、沃素蒸気で、かつ引続くトリプシン水溶液の
吹付けにより可視にした。すべての生成物は、こ
れらの可視化により、１個の固有のスポツトを示
した。トリプシン水溶液での処理の際に、トリペ
プチド誘導体の発色性又は蛍光性基は分解され
て、肉眼又はUV線で観察できる分解生成物の色
が現れた。本発明によるトリペプチド誘導体は、
加熱時に焼結されるので、厳密な融点を有しな
い。 例 ２ 2b Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−MCA・
HBr2HBr・Ｈ−Arg−MCA 市販のCbo−Arg−MCA・HCl13.0g（25.9mM）
を、氷酢酸中の2NHBrの溶液104ml（208mM）
を用いて、例1bの方法で分解させた。乾燥残分
をMeOH400ml中に溶かし、セフアデツクスLH
−20のカラム上で精製した。トリプシンでの処理
により４−メチル−７−アミノ−クマリンの形成
を伴つて分解したMeOH溶離液フラクシヨンを
真空中、30℃で濃縮乾燥させた。生じる残分を、
真空中、40℃でP2O5上で乾燥させると、無定形
化合物2b11.2g（理論量の87.7％）が得られ、これ
は、TLCで示されるようにSS中で均質であつた。
元素分析及び実験式C16H23N5O3Br2からの計算
により次の値が得られた：Ｃ＝39.40％（38.90
％）、Ｈ＝4.61％（4.70％）、Ｎ＝14.48％（14.20
％）、及びBr＝31.90％（32.40％）。 2c Cbo−Gly−Arg−MCA・HBr 化合物2b4.93g（10mM）及びcbo−Gly−
OpNP3.65ｇ（11mM）を新しく蒸留したDMF75
mlに加えた。−10℃に冷却の後に、撹拌しながら、
まずEt3N1.40ml（10mM）、次いで0.70ml
（5mM）を添加した。混合物を湿気の不存在下
に、まず−10℃で３時間、次いで室温で４時間反
応させた。反応溶液を再び−10℃まで冷却し、
Et3N0.70mlで緩衝させ、20℃で１夜撹拌した。
反応混合物を真空中、50℃で濃縮乾燥させ、残分
を50％AcOH200ml中に溶かし、セフアデツクス
Ｇ−15のカラム上で精製した。トリプシンでの処
理により４−メチル−７−アミノ−クマリンを形
成しながら分解したMeOH溶離液フラクシヨン
を真空中、40℃で濃縮乾燥させた。このようにし
て得られた残分を、真空デシケータ中、60℃で
P2O5上で乾燥させると、無定形化合物2c 4.98g
（理論量の82.5％）が得られ、これは、TLCで示
されるようにSS中で均質であつた。元素分析及
び実験式C26H31N6O6Brからの計算により次の値
が得られた：Ｃ＝51.48％（51.75％）、Ｈ＝5.24％
（5.18％）、Ｎ＝13.70（13.93％）、及びBr＝13.14％
（13.24％）。 2d 2HBr・Ｈ−Gly−Arg−MCA 化合物2c 4.83g（8mM）を氷酢酸中の2N
HBr32mlを用いて例1d記載の方法で分解させた。
生じる粗生成物をMeOH100ml中に溶かし、セフ
アデツクスLH−20のカラム上で精製した。トリ
プシンでの処理により４−メチル−７−アミノ−
クマリンの形成下に分解したMeOH溶離液フラ
クシヨンを真空中、30℃で濃縮乾燥させた。得ら
れた残分を真空デシケータ中、40℃でP2O5上で
乾燥させると、無定形化合物2d 4.05g（理論量の
92.0％）が得られ、これは、TLCによればSS中
で均質であつた。元素分析及び実験式
C18H26N6O4Br2からの計算により次の値が得ら
れた：Ｃ＝39.02％（39.29％）、Ｈ＝4.78％（4.76
％）、Ｎ＝15.39（15.27％）、及びBr＝28.72％
（29.04％）。 2e Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−MCA・HBr 化合物2d 2.75g（5mM）を例1e記載の方法で
Cbo−Ｄ−Leu−OpNP2.13g（5.5mM）と反応さ
せた。生じた粗製化合物を50％AcOH75ml中に溶
かし、セフアデツクスＧ−15のカラム上で精製し
た。トリプシンでの処理により４−メチル−７−
アミノクマリンの形成下に分解したAcOH溶離液
フラクシヨンを真空中、40℃で濃縮乾燥させた。
残分を真空デシケータ中、60℃でP2O5上で乾燥
させると、無定形化合物2e 2.91g（理論量の81.2
％）が得られ、これは、TLCで示すようにSS中
で均質であつた。元素分析及び実験式
C32H42N7O7Brからの計算により、次の値が得ら
れた：Ｃ＝53.13％ （53.63％）、Ｈ＝6.01％（5.91％）、Ｎ＝13.91％
（13.68％）及びBr＝10.88％（11.15％）。 アミノ酸分析は、正確な割合での予想アミノ酸
の存在を確認した： Gly：1.00−Leu：1.02−Arg：0.98。 Rf＝0.64 例 ３ 3a Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−５−ChA・
HBrCbo−Arg−５−ChA−HCl 乾燥Cbo−Arg−OH・HCl34.48g（0.1モル）を
1000ml三頚フラスコ中で、新しく蒸留した無水
DMF150mlと無水THF300mlとの混合物中に20℃
で溶かした。−10℃に冷却したこの溶液に、撹拌
下に、湿気の不存在下にEt3N10.2g（0.1モル）を
添加した。次いで、この混合物にTHF50ml中の
クロルギ酸イソブチル13.65g（0.1モル）の溶液を
20分かかつて滴加し、この際反応温度は、決して
−５℃を越えなかつた。−10℃〜−５℃の温度で
の10分間の付加的反応の後に、DMF75ml中の５
−アミノ−キノリン14.42g（0.1モル）の溶液を反
応混合物に30分かかつて適加し、この際、反応温
度を常に−５℃以下に保持した。反応混合物を−
５℃で更に１時間反応させた。次いで20℃で１夜
撹拌し、引続きEt3N・HClを結晶させるために、
−15℃に冷却した。形成されたEt3N・HClを濾
去し、少量の冷DMFで洗浄した。濾液及び洗浄
液を真空中、50℃で濃縮した。残分を50％
AcOH1000ml中に溶かし、50％AcOHで平衡にし
たセフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15のカラム
上でのゲル濾過により精製した。トリプシンでの
処理により５−アミノ−キノリンを形成しながら
分解したAcOH溶離液フラクシヨンを真空中、40
℃で濃縮乾燥させた。残分を真空デシケータ中、
50℃で、P2O5上で乾燥させると、無定形化合物
3a15.02g（理論量の31.9％）が得られ、これは
TLCで示されるようにSS中で均質であつた。元
素分析及び実験式C23H27N6O3Clから計算して、
次の値が得られた：Ｃ＝58.09％（58.66％），Ｈ
＝5.84％（5.78％）、Ｎ＝18.06％（17.85％）及び
Cl＝7.44％（7.53％）。 3b 2HBr・Ｈ−Arg−５−ChA 化合物3a 9.42g（20mM）を例1b記載のように
分解した。慣用の処理の後に、生じた粗生成物を
MeOH150ml中に溶かし、セフアデツクスLH−
20のカラム上でのゲル濾過により精製した。トリ
プシンでの処理により５−アミノ−キノリンを形
成しながら分解したMeOH溶離液フラクシヨン
を真空中で乾燥させた。残分を真空デシケータ
中、40℃で、P2O5上で乾燥させると、無定形化
合物3b 7.56g（理論量の81.8％）が得られ、これ
は、HLCで示されるようにSS中で均質であつた。
元素分析及び実験式C15H22N60Br2から計算して、
次の値が得られた：Ｃ＝38.75％（38.98％）、Ｈ
＝4.83（4.80％）、Ｎ＝18.45％（18.18％）及びBr
＝33.88％（34.58％）。 3c Cbo−Gly−Arg−５−ChA・HBr 化合物3b 4.62g（10mM）例1c記載の方法で
Cbo−Gly−OpNP3.65g（11mM）と反応させた。
慣用の処理の後に得られた粗生成物を50％
AcOH200ml中に溶かし、セフアデツクスＧ−15
のカラム上で精製した。トリプシンでの処理によ
り５−アミノ−キノリンの形成下に分解した
AcOH溶離液フラクシヨンを真空中、40℃で濃縮
乾燥させた。残分を真空デシケータ中60℃で、
P2O5上で乾燥させると、無定形化合物3c 3.92g
（理論量の68.5％）が得られ、これは、TLCで示
されるようにSS中で均質であつた。元素分析及
び実験式C25H30N7O4Brからの計算により、次の
値が得られた：Ｃ＝52.17％（52.45％）、Ｈ＝5.32
％（5.28％）、Ｎ＝17.17％（17.13％）及びBr＝
13.63％（13.96％）。 3d 2HBr・Ｈ・Gly−Arg−５−ChA 化合物3c 2.86g（5mM）を例1d記載の方法で氷
酢酸中の2N HBr20mlを用いて分解した。慣用処
理の後に得られた粗生成物をMeOH100ml中にか
し、セフアデツクスLH−20のカラム上で精製し
た。トリプシンでの処理により５−アミノ−キノ
リンの形成下に分解したMeOH溶離液フラクシ
ヨンを真空中、30℃で濃縮乾燥させた。残分を真
空デシケート中、40℃でP2O5上で乾燥させると、
無定形化合物3d 2.03g（理論量の78.3％）が得ら
れ、これは、TLCで示されるようにSS中で均質
であつた。元素分析及び実験式C17H25N7O2Br2
からの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝
39.19％（39.32％）、Ｈ＝4.90％（4.85％）、Ｎ＝
19.11％（18.83％）及びBr＝30.45％（30.78％）。 3e Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−５−ChA−HBr 化合物3d 1.30g（2.5mM）を例1e記載の方法で
Cbo−Ｄ−Leu−OpNP1.07％（2.75mM）と反応
させた。慣用処理の後に得られた粗生成物を50％
AcOH50ml中に溶かし、セフアデツクスＧ−15の
カラム上で精製した。トリプシンでの処理により
５−アミノ−キノリンの形成下に分解したAcOH
溶離液フラクシヨンを真空中、40℃で濃縮乾燥さ
せた。残分を真空デシケート中、60℃でP2O5上
で乾燥させると、無定形化合物3e 1.35g（理論量
の78.5％）が得られ、これは、TLCで示されるよ
うにSS中で均質であつた。元素分析及び実験式
C31H41N8O5Brからの計算により、次の値が得ら
れた：Ｃ＝54.28％（54.31％）、Ｈ＝6.07（6.03％）
Ｎ＝16.48％（16.34％）及びBr＝11.54％（11.65
％）。 アミノ酸分析は、正しい割合での予想アミノ酸
の存在を確認した： Cly：1.00−Leu：0.98−Arg：0.98、Rf＝0.69 例 ４ 4b Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−２−NA・
HBr2HBr・Ｈ−Arg−２−NA 市販のCbo−Arg−２・NA・HCl9.40g
（20mM）を例1bに記載の方法で氷酢酸中の
2NHBr80mlの溶液を用いて分解した。慣用の処
理の後に得られた生成物をNeOH150ml中に溶か
し、セフアデツクスLH−20のカラム上で精製し
た。トリプシンで処理により２−ナフチルアミン
の形成下に分解したMeOH溶離液フラクシヨン
を真空中、30℃で濃縮乾燥させた。残分を真空デ
シケータ中、40℃で、P2O5上で乾燥させると、
無定形化合物4b 8.60g（理論量の93.2％）が得ら
れ、これは、TLCで示されるようにSS中で均質
であつた。元素分析及び実験式C16H23N5OBr2か
らの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝42.08
％（41.67％）、Ｈ＝5.12％（5.03％）、Ｎ＝14.68
％（15.19％）及びBr＝33.96％（64.65％）。 4c Cbo−Gly−Arg−２−NA・HBr 化合物4b 4.6g（10mM）を例1cに記載の方法で
Cbo−Gly−OpNP 3.63g（11mM）と反応させ
た。慣用処理の後に得られた粗生成物を50％
AcOH150ml中に溶かし、セフアデツクスＧ−15
のカラム上で精製した。トリプシンでの処理によ
り２−ナフチルアミンの形成下に分解したAcOH
溶離液フラクシヨンを真空中、40℃で濃縮乾燥さ
せた。残分を真空デシケータ中、60℃で、P2O5
上で乾燥させると、無定形化合物4c 4.32g（理論
量の75.6％）が得られ、これは、TLCで示される
ように、SS中で均質であつた。元素分析及び実
験式C26H31N6O4Brから計算して、次の値が得ら
れた：Ｃ＝54.24％（54.64％）、Ｈ＝5.52％（5.47
％）、Ｎ＝14.95％（14.71％）及びBr＝13.75％
（13.98％）。 4d 2HBr・Ｈ−Gly−Arg−２−NA 化合物4c 4.57g（8mM）を例1dに記載の方法
で、氷酢酸中の2N HBr28mlを用いて、分解し
た。慣用処理の後に得られた粗生成物を
MeOH100ml中に溶かし、セフアデツクスLH−
20のカラム上で精製した。トリプシンでの処理に
より２−ナフチルアミンの形成下に分解した
MeOH溶離液フラクシヨンを真空中、30℃で濃
縮乾燥させた。残分を真空デシケータ中、40℃で
P2O5上で乾燥させると、無定形化合物4d 3.76g
（理論量の90.6％）が得られ、これは、TLCで示
されるようにSS中で均質であつた。元素分析及
び実験式C18H26N6O2Br2からの計算により、次
の値が得られた：Ｃ＝41.50％（41.72％）、Ｈ＝
5.10％（5.06％）、Ｎ＝16.62％（16.22％）及びBr
＝30.15％（30.84％）。 4e Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−２−NA・HBr 化合物4d 2.59g（5mM）を例1eに記載の方法で
Cbo−Ｄ−Leu−Op−NP2.13g（5.5mM）と反応
させた。慣用処理により得た粗生成物を50％
AcOH100ml中に溶かし、セフアデツクスＧ−15
のカラム上で精製した。トリプシンでの処理によ
り２−ナフチルアミンの形成下に分解したAcOH
溶離液の最初の主フラクシヨンを真空中、40℃で
濃縮乾燥させ真空デシケータ中、60℃で、P2O5
上で乾燥させた。こうして、無定形化合物4e
2.72g（理論量の79.5％）が得られ、これは、TLC
で示されるように、SS中で均質であつた。元素
分析及び実験式C32H42N7O5Brからの計算によ
り、次の値が得られた：Ｃ＝55.78％（56.14％）、
Ｈ＝6.24％（6.18％）、Ｎ＝14.48％（14.32％）及
びBr＝11.45％（11.67％）。 アミノ酸分析は、予想アミノ酸が正しい割合で
存在することを確認した： Gly：1.00−Leu：1.01−Arg：0.99、Rf＝0.65 例 ５ 5b Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−４−NA・
HBr2HBr・Ｈ−Arg−４−MeO−２−NA 市販のCbo−Arg−４−MeO−２−NA・
HCl10.0g（20mM）を例1bに記載の方法で氷酢酸
中の2N HBr80mlの溶液を用いて分解した。慣用
処理の後に得られた粗生成物をNeOH150ml中に
溶かし、セフアデツクスLH−20のカラム上で精
製した。トリプシンでの処理により４−メトキシ
−２−ナフチルアミンの形成下に分解した
MeOH溶離液の主フラクシヨンを真空中、30℃
で濃縮乾燥させた。残分を真空デシケータ中、
P2O5上で乾燥させると、無定形化合物5b8.98g
（理論量の91.4％）が得られ、これは、TLCで示
されるようにSS中で均質であつた。元素分析及
び実験式C17H25N5O2Br2からの計算により、次
の値が得られた：Ｃ＝41.22％（41.57％）、Ｈ＝
5.19％（5.13％）、Ｎ＝14.40％（14.26％）及びBr
＝32.01％（32.53％）。 5c Cbo−Gly−Arg−４−MeO−２−NA・HBr 化合物5b 4.91g（10mM）を例1cに記載の方法
でCbo−Gly−OpNP3.63g（11mM）と反応させ
た。慣用処理の後に得られた粗生成物を50％
AcOH中に溶かし、セフアデツクスＧ−15のカラ
ム上で精製した。トリプシンでの処理により４−
メトキシ−２−ナフチルアミンの形成下に分解し
たAcOH溶離液フラクシヨンの真空中、40℃で濃
縮乾燥させた。残分を真空デシケータ中、60℃
で、P2O5上で乾燥させると、無定形化合物5c
5.21g（理論量の88.4％）が得られ、これは、TLC
により示されるように、SS中で均質であつた。
元素分析及び実験式C27H33N6O5Brからの計算に
より次の値が得られた：Ｃ＝53.41％（53.91％）、
Ｈ＝5.55％（5.53％）、Ｎ＝14.22％（13.97％）及
びBr＝12.95％（13.28％）。 5d 2HBr・Ｈ−Gly−Arg−４−MeO−２−NA 化合物5c 2.95g（5mM）を例1dに記載の方法
で、氷酢酸中の2N HBr20mlで分解した。慣用の
処理の後に得られた粗成成物をMeOH100ml中に
溶かし、セフイデツクスLH−20のカラム上で精
製した。トリプシンでの処理により４−メトキシ
−２−ナフチルアミンの形成下に分解した
MeOH溶離液の主フラクシヨンを真空中、30で
濃縮乾燥させた。残分を真空デシケータ中、40℃
でP2O5上で乾燥させると、無定形化合物5d
2.49g（理論量の90.9％）が得られ、これは、TLC
で示されるようにSS中で均質であつた。元素分
析及び実験式C19H28N6O3Br2からの計算により
次の値が得られた：Ｃ＝41.32％（41.62％）、Ｈ
＝5.19％、（5.15％）、Ｎ＝15.54％（15.33％）及
びBr＝28.85％（29.15％）。 5e Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−４−MeO−２
−NA・HBr 化合物5d 2.81g（5mM）を例1eに記載の方法で
Cbo−Ｄ−Leu−OpNP2.13g（5.5mM）と反応さ
せた。慣用処理の後に得られた粗生成物を50％
AcOH125ml中に溶かし、セフアデツクスＧ−15
のカラム上で精製した。トリプシンでの処理によ
り４−メトキシ−２−ナフチルアミンの形成下に
分解したAcOH溶離液の最初の主フラクシヨンを
真空中、40℃で濃縮乾燥させた。残分を真空デシ
ケータ中、60℃で、P2O5上で乾燥させると、無
定形化合物5e3.00g（理論量の84.0％）が得られ、
これは、TLCで示されるように、SS中で均質で
あつた。元素分析及び実験式C33H44N7O6Brから
計算して、次の値が得られた：Ｃ＝55.16％
（55.46％）、Ｈ＝6.25％（6.21％）、Ｎ＝13.96％
（13.72％）及びBr＝11.00％（11.18％）。Rf＝0.65 アミノ酸分析は、正しい割合での予想アミノ酸
の存在を確認した。 Gly：1.00−Leu：1.01−Arg：0.93 例 ６ Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA・AcOH Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA−HBr（例１
で製造した）6.80g（10mM）を60％MeOH水75ml
中に溶かした。溶液をアセテート型のアンバーラ
イトJRA−401のカラム上に注いだ。このカラム
を60％MeOH水を用いて溶離させ、HBrをイオ
ン交換によりAcOHで換えた。溶離液を真空中、
40℃で、P2O5上で乾燥の後にブロミド不含のCbo
−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA・AcOH6.62g（理
論量の6.62g）が得られた。他の有機酸例えばギ
酸、プロピオン酸、蓚酸、酒石酸、クエン酸、乳
酸、安息香酸、クロル安息香酸、サリチル酸又は
フタル酸との塩も同じ方法で前記トリペプチド誘
導体から製造することができる。イオン交換体は
例えば塩酸塩の形のアンバーライトJRA−401で
あつてよく、所望の酸塩の形は、前記イオン交換
体を苛性ゾーダ溶液で処理し、次いで、60％
MeOH水中の所望の有機酸とそのナトリウム塩
との１：１−混合物の溶液で処理することにより
塩基性OH型に変えることができる。 例 ７ Me−SO2−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA・HBr 2HBr・Ｈ・Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA（例7f
に記載の方法で製造、第３表参照）6.26g
（10mM）を蒸留したDMF30ml中に溶かした。溶
液を−15℃に冷却し、湿気の不存在下に撹拌しな
がらまずEt3N2.80ml（20mM）かつその後直ちに
メチルスルホニルクロリド1.15g（10mM）を添加
した。−15℃での約２〜３時間の反応時間の後に、
反応混合物を、室温で更に１夜反応させた。反応
混合物を再び−15℃に冷却した。Et3N・HBrと
Et3N・HClとの沈澱混合物を濾去し、少量の冷
DMFで洗浄した。濾液及び洗浄液を集め、真空
中50℃で濃縮乾燥させた。残分を50％AcOH75ml
中に溶かした。溶液を50％AcOHで平衡にしたセ
フアデツクスＧ−15のカラムで精製させた。トリ
プシンでの処理によりｐ−ニトロアニリンの形成
下に分解したAcOH溶離液の主フラクシヨンを真
空中、40℃で濃縮乾燥させた。残分をMeOH100
ml中に溶かし、溶液を再び濃縮乾燥させた。残分
を真空デシケータ中、60℃でP2O5上で乾燥させ
ると、無定形化合物Me−SO2−Ｄ−Leu−Gly−
Arg−pNA・HBr5.64g（理論量の90.5）が得ら
れ、これはTLCで示されるようにSS中で均質で
あつた。元素分析及び実験式C21H35N8SO7Brか
らの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝40.90
％（40.45％）、Ｈ＝5.71％（5.66％）、Ｎ＝18.28
％（17.97％）、Ｓ＝5.01％（5.14％）及びBr＝
12.55％（12.82％）。Rf＝0.61
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
本発明のトリペプチド誘導体の第Xa因子に対
する感受性を次の第４表で数値的に説明し、公知
文献の基質Bz−Ile−Glu（γ−OH）−Gly−Arg
−pNA・HClと比較した：
する感受性を次の第４表で数値的に説明し、公知
文献の基質Bz−Ile−Glu（γ−OH）−Gly−Arg
−pNA・HClと比較した：
【表】
【表】
第４表に記載の第Xa因子活性の値は、次に記
載の方法で実験的に測定した： ウシ第Xa因子の活性を測定するために、
pH8.4及びイオン濃度0.3を有するTRIS−イミダ
ゾール緩衝液1.8mlを37℃で、水0.5ml中のダイア
ゲンのバイアルの内容物の溶解により得たウシの
第Xa因子製剤ダイアゲン（供給者：Diagnostic
Reagents Ltd.Thame英国）の水溶液0.025mlと
充分に混合した。この混合物に、本発明の２×
10-3M水溶液0.2mlを添加した。その後、１分当
りの分解生成物の量（ナノモル）を測定し、第
Xa因子１mlに対する相応する値を計算した。 ヒト第Xa因子の活性測定のために、正常のク
エン酸処理した血漿0.01mlをpH8.4及びイオン濃
度0.3を有し、１ml当たりCaCl215ミリモルを含有
するTRIS−イミダゾール緩衝液中のラツセルま
むし毒の溶液0.20mlと混合した。混合物を、血漿
中に存在する第Ｘ因子を活性化し、これを完全に
第Xa因子に変えるために、37℃で75秒間インキ
ユベートした。このインキユベート物に、まず、
37℃に加熱したTRIS−イミダゾール緩衝液
（pH8.4、イオン濃度0.3）を、次いで本発明の基
質の２×10-3M水溶液0.40mlを加えた。その後１
分当たりの形成された分解生成物Ｈ−R5の量
（ナノモル）を測定し、クエン酸処理した血漿１
mlに対する相応する値を計算した。
載の方法で実験的に測定した： ウシ第Xa因子の活性を測定するために、
pH8.4及びイオン濃度0.3を有するTRIS−イミダ
ゾール緩衝液1.8mlを37℃で、水0.5ml中のダイア
ゲンのバイアルの内容物の溶解により得たウシの
第Xa因子製剤ダイアゲン（供給者：Diagnostic
Reagents Ltd.Thame英国）の水溶液0.025mlと
充分に混合した。この混合物に、本発明の２×
10-3M水溶液0.2mlを添加した。その後、１分当
りの分解生成物の量（ナノモル）を測定し、第
Xa因子１mlに対する相応する値を計算した。 ヒト第Xa因子の活性測定のために、正常のク
エン酸処理した血漿0.01mlをpH8.4及びイオン濃
度0.3を有し、１ml当たりCaCl215ミリモルを含有
するTRIS−イミダゾール緩衝液中のラツセルま
むし毒の溶液0.20mlと混合した。混合物を、血漿
中に存在する第Ｘ因子を活性化し、これを完全に
第Xa因子に変えるために、37℃で75秒間インキ
ユベートした。このインキユベート物に、まず、
37℃に加熱したTRIS−イミダゾール緩衝液
（pH8.4、イオン濃度0.3）を、次いで本発明の基
質の２×10-3M水溶液0.40mlを加えた。その後１
分当たりの形成された分解生成物Ｈ−R5の量
（ナノモル）を測定し、クエン酸処理した血漿１
mlに対する相応する値を計算した。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH113080 | 1980-02-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JPH032879B2 true JPH032879B2 (ja) | 1991-01-17 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP60299814A Granted JPS63300A (ja) | 1980-02-12 | 1985-12-28 | 媒体中の第Ｘａ−因子、ヘパリン又は第Ｘａ−抗因子を定量分析する方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60299814A Granted JPS63300A (ja) | 1980-02-12 | 1985-12-28 | 媒体中の第Ｘａ−因子、ヘパリン又は第Ｘａ−抗因子を定量分析する方法 |
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| Country | Link |
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| EP (1) | EP0034122B1 (ja) |
| JP (2) | JPH032879B2 (ja) |
| AT (1) | ATE4702T1 (ja) |
| AU (1) | AU581050B2 (ja) |
| CA (1) | CA1161432A (ja) |
| DE (1) | DE3160903D1 (ja) |
| DK (1) | DK154221C (ja) |
| ES (1) | ES8302780A1 (ja) |
| IL (1) | IL62096A (ja) |
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| DE3311287A1 (de) * | 1983-03-28 | 1984-10-04 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur fotometrischen bestimmung der aktivierten partiellen thromboplastinzeit und reagenz dazu |
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| SE8601327D0 (sv) * | 1986-03-21 | 1986-03-21 | Kabivitrum Ab | Nya peptidderivat |
| SE461494B (sv) * | 1986-03-21 | 1990-02-19 | Thorsman & Co Ab | Faestanordning foer en elektrisk kopplingsdosa |
| EP0255341B1 (en) * | 1986-07-29 | 1993-02-03 | Sunstar Kabushiki Kaisha | Reagent for testing periodontal diseases |
| DE3629175A1 (de) * | 1986-08-28 | 1988-03-17 | Behringwerke Ag | Chromogene verbindungen, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung |
| US5110727A (en) * | 1987-04-03 | 1992-05-05 | Cardiovascular Diagnostics, Inc. | Method for performing coagulation assays accurately, rapidly and simply, using dry chemical reagents and paramagnetic particles |
| US5115099A (en) * | 1988-06-14 | 1992-05-19 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Substrates for determination of enzyme activity and intermediates for synthesis of the substrates as well as process for producing the intermediates |
| JPH06104079B2 (ja) * | 1988-07-14 | 1994-12-21 | 日東紡績株式会社 | 新規な酵素活性測定用基質 |
| WO1990003577A1 (en) | 1988-09-30 | 1990-04-05 | The University Of Vermont And State Agricultural College | Immunoassays for catalytically-active, serine proteases |
| US5320945A (en) * | 1989-07-14 | 1994-06-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method and reagent for the determination of antithrombin III |
| WO1991002813A1 (en) * | 1989-08-17 | 1991-03-07 | Baxter International Inc. | Factor ix chromogenic assay |
| FR2658519B1 (fr) * | 1990-02-19 | 1995-07-07 | Serbio | Substrats peptidiques pour identification du facteur xa. |
| US6348570B1 (en) * | 1991-08-16 | 2002-02-19 | Merck & Co., Inc. | Chromophore containing compounds and their use in determining interleukin-1β convertase activity |
| US5308756A (en) * | 1991-11-20 | 1994-05-03 | Baxter Diagnostics Inc. | Protein S chromogenic assay |
| US6087119A (en) * | 1996-10-31 | 2000-07-11 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for determining the catalytic activity of factor IXa |
| US6297024B1 (en) | 1998-10-15 | 2001-10-02 | Cell Activation, Inc. | Methods for assessing complement activation |
| US6235494B1 (en) | 1999-02-08 | 2001-05-22 | The Scripps Research Institute | Substrates for assessing mannan-binding protein-associated serine protease activity and methods using the substrates |
| ATE314386T1 (de) * | 1999-02-23 | 2006-01-15 | Pentapharm Ag | Oligopeptidderivate zur elektrochemischen messung der aktivität von proteasen |
| WO2003022873A1 (de) * | 2001-09-10 | 2003-03-20 | Novel Science International Gmbh | Organische verbindungen mit biologischer wirkung als thrombinhemmer und ihre verwendung |
| DE102005003145B4 (de) | 2005-01-21 | 2006-10-19 | Dade Behring Marburg Gmbh | Stablies, chromogenes Flüssigreagenz und dessen Verwendung in gerinnungsdiagnostischen Tests |
| US8941631B2 (en) | 2007-11-16 | 2015-01-27 | Qualcomm Mems Technologies, Inc. | Simultaneous light collection and illumination on an active display |
| EP2333555A1 (de) | 2009-12-09 | 2011-06-15 | Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH | Heterogener Gerinnungstest |
| EP2465941A1 (de) | 2010-12-20 | 2012-06-20 | Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH | Verfahren zur simultanen Bestimmung mehrerer Gerinnungsproteasen |
| EP2484775A1 (de) | 2011-02-07 | 2012-08-08 | Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH | Heparin-insensitives Verfahren zur Bestimmung von direkten Gerinnungsfaktorinhibitoren |
| EP2843416A1 (de) | 2013-09-02 | 2015-03-04 | Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH | Kontroll- und Kalibratormaterial für die Bestimmung von direkten Antikoagulanzien |
| EP3348649A1 (de) | 2017-01-16 | 2018-07-18 | Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH | Universales kontrollmaterial für gerinnungsfaktorinhibitor-teste |
Family Cites Families (13)
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