JPS63300A - 媒体中の第Ｘａ−因子、ヘパリン又は第Ｘａ−抗因子を定量分析する方法 - Google Patents

媒体中の第Ｘａ−因子、ヘパリン又は第Ｘａ−抗因子を定量分析する方法

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JPS63300A
JPS63300A JP60299814A JP29981485A JPS63300A JP S63300 A JPS63300 A JP S63300A JP 60299814 A JP60299814 A JP 60299814A JP 29981485 A JP29981485 A JP 29981485A JP S63300 A JPS63300 A JP S63300A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔式中Ｒ１は炭素原子数２〜８を有し、ω−位にアミノ
基を有していてよいアルカノイル基、アルカノイル中に
炭素原子数２〜４を有し、そのフェニル基はｐ−位でア
ミノ基で置換されていてよいフェニルアルカノイル基、
キー位でアミノメチル基で置換されていてよいシクロヘ
キシルカ、／Ｉ／セニル基、〇−又はｐ−位でメチル、
アミノ又はハロゲンで置換されていてよいベンゾイル基
、アルコキシ基中の炭素原子数１〜８を有するアルカン
スルホニル基、ｐ−位でメトキシ、メチル又は塩素で置
換されていてよいペン・クルオキシ力ルゼニル基、炭素
原子数１〜４のアルカンスルホニル基、ｐ−位でメチル
化されていてよいフェニルスルホニル基又はα−又けβ
−ナフチルスルホニル基を表ワシ、 Ｒ２は炭素原子数１〜６を有する直鎖又は分枝鎖のアル
キル基、炭素原子数１〜２のヒドロキシアルキル基、ア
ルキル中の炭素原子数１〜２及びアルコキシ中の炭素原
子数１〜手を有するアルコキシアルキル基、アルキル中
の炭素原子数１〜２を有するベンジルオキシアルキル基
、アルキル中の炭素原子数１〜３を有し、そのアルコキ
シ基は直鎖又は分枝鎖で炭素原子数１〜４を有するω−
カルボキシアルキル又はω−フルコキシカルゼ＝ルアル
キル基及びアルキル中に炭素原子数１〜３ヲ有スるω−
ベンジルオキシカルボニル７　ルキル基又ハシクロヘキ
シル−、シクロヘキシルメチル−１４−ヒドロキシシク
ロヘキシル７＋　ｆ　／Ｌ／　−、フェニル−、ベンジ
ル−１壬−ヒドロキシベンジル−又はイミダゾール−キ
ーイル−メチル基を嚢わし、 Ｒ３は水素又は炭素原子数１〜４を有する直鎖又は分枝
鎖のアルキル基を表わし、Ｒ４は水素又はメチル又はエ
チル基を表わし、 Ｒ５はｐ−ニトロフェニルアミノ、１−カルボキシ−２
−ニトロフエン−５−イル−アミノ、１−スルホ−２−
ニトロフエン−５−イル−アミノ、β−ナフチルアミノ
、４−メトキシ−β−ナフチルアミノ、５−ニトロ−α
−ナフチル−アミノ、キノン−５−イル−アミノ、δ−
ニトロ−キノン−５−イル−アミノ、４−メチル−クマ
ル−７−イル−アミノ又は１，３−ジ（メトキシカルゼ
ニ／Ｉ／）−フエン−５−イル−アミノ基（５−アミノ
インフタル酸ジメチルエステルから誘導）を表わす）の
トリペプチド誘導体（但し、Ｒ１がベンジルオキシアル
キル基 ロピル又はシクロヘキシルであるトリペプチド誘導体を
除く）又は酸とのその塩を添加し、他方で、同様な方法
であるが、稀釈血漿の代りに同量の緩衝液を用い、分解
生成物Ｈ−Ｒ５の形成により生ぜしめられた１分当りの
光学密度の増加を測定し、第Ｘａ−抗因子−ヘパリン錯
体によシ抑制された第Ｘａ−因子の量を、かつこれから
、血漿中に存在する第Ｘａ−抗因子の号を、１分当りの
盲検試料の光学密度の増加と、１分当りの被検試料の光
学密度の増加との間の差から測定することを特徴とする
、ヒト血漿中の第Ｘａ−抗因子の定量分析法。
８、　Ｒかｐ−ニトロフェニルアミノ、１−カルボキ／
−２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、１−スルホ−
２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、５−ニトロ−α
−ナフチル−アミノ又は８−ニトロキノン−５−イル−
アミノ基である場合に、分解生成物Ｈ−Ｒ５を、測定の
前に、ノアゾ化合物とのカンプリングにより、より強く
着色された化合物に変える事実を特徴とする特許祷求の
範囲第６項記載の方法。
技術分野 本発明は、酵素分類３．４．２１の特定酵素特に第値６
井奔；酵素特に第Ｘａ　　因子を定量分析するための基
質として使用６極ゐ壬わｊ広Ｉ；鳳ｉ）。
背景技術 第Ｘａ　　因子に、血液凝固カスケード中で酵素前馳体
第Ｘ因子の活性化により形成され、胴脂買及びカルンウ
ムイオンと一緒になって、第ｎ因子（プロトロンビン）
全ペプチド鎖の２点で蛋白′Ｘ分解して、前記因子を、
最終的に凝固させる第■ａ因子（トロンビン）に変じる
蛋白質分解酵素である。特定の病気例えば肝臓疾患、ビ
タミン欠乏症等の際に、かつジクマロール療法において
、第Ｘ因子の形成は減少されている。この第Ｘ因子の合
成に関する遺伝的障害により、もちろんｉＸａ　因子の
形成は、相応して減少されている。従って、間車かつ正
確な方法で、血漿中の第Ｘａ　因子を光学的に分析させ
る直接酵素分析法を自由に得ることは、］Ｉ要である。
第Ｘａ因子を分析する主要な方法は次のとおりでろる； ａ）主歪学的分析法（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　
ＢｌｅｅｄｉｎｇＤｉｓｏｒｄｅｒｓ　　、　Ｎｉ１ｓ
　Ｕ、　　Ｂａｎｇ　、　　Ｇｅｏｒｇ　Ｔｈｉｅｍｅ
　Ｖｅｒｌａｇ１９６員（１９７１年〕参照〕：典Ｘ因
子をラッセル（Ｒｕ５ｓｅｌ　）　　まむし毒及びカル
シウムイオンＴｈ用いて活性化する。ｌ工程操作で、プ
ロトロンビンを第Ｖ因子及び燐脂質の存在で第Ｘａ　因
子を用いて活性化してトロンビンにし、トロンビンはイ
ンジケータフイブリノゲンをフィブリンに変える。凝固
時間を測定する。
所要の第ｎ因子及び第Ｖ因子及びフィブリノゲンは、第
Ｘ因子不含の基質により供給される。凝固時間は。
第Ｘ因子の活性化の程度により影響される。他の条件は
一定で、この活性化度は、試料中の第Ｘ因子の濃度の係
数である。凝固時間はこの実射で主観的に読み取られる
ので、この生物学的方法は准雑な分析を実施することを
可能とするだけである。更に、処理された血漿が８貴で
あＶ、その調製の間に誤ちが起こりうる。
更に、インクケータとしての作用をするフイブリノゲン
ｈ、直接は形成されないが、活性化されたトロンビン＋
ｈて形成される（間接的方法）。
ｈ）生化学的方法（＠Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　
ＢｌｅｅｄｉｎｇＤｉｓｏｒｄｅｒｓ　＠、　Ｎ、Ｕ、
　Ｂａｎｇ　、　Ｇｅｏｒｇ　Ｔｈｉｅｍｅ　ｌ／ｅｒ
ｌａｇ　ｂ１９６〜７頁（１９７１年）参照〕；試験さ
れるべき第Ｘ因子ｖ４製物が充分に純粋であれば、より
正確な分析法が提供されうる。エステ７　（Ｅｓｎｏｕ
ｆ　）　　及びウイリアムス（Ｗ目１ｉａｍｓ　）（１
９６２年）は、第Ｘａ　因子がエステラーゼ活性を有し
、従って、合成アミノ酸エステルを分解することを示し
ている。しかしながら、この分析のためにに第Ｘ因子５
０〜１００μ２が必要で６．６゜他方、カルゼベンゾキ
／−フェニル了ニリン−Ｐ−ニトロフェニルエステルを
用い、単位時間当りの発生ｐ−ニトロフェノールの量を
測定することにより、低濃度の第Ｘａ　因子を測定する
ことができる。この分析法は次の欠点を有する二使用エ
ステルは適用ｐＨ値８で自己加水分層し、更に、これは
多くの他の＃累にも応答するので、第Ｘａ　因子に対し
て特異的ではない。このエステルは水中に不溶であるか
ら、アセトンが８安である。これらのすべての欠点の結
果として、この分析法は不正確であり、経費がかかる。
Ｃ）西ドイツ国特許出願公開第２５５２５７０号明細書
には、第Ｘａ　因子分析用基質として使用されるべきテ
トラペプチド誘導体が記載されている。
Ｂｚ　−Ｉ　Ｉｅ　−Ｇｌｕ　−Ｇｌｙ　−Ａｒｇ　−
ｐＮＡ−ＨＯＩ　　が、第Ｘａ　因子により分解されて
ｐ−ニトロアニリンを形成するテトラペプチド誘導体の
１例として記載されている。このｐ−ニトロアニリンの
形成は１分光光度法で追跡できる。この第Ｘａ　因子分
析法は、前記の生物学的及び生化学的分析法よＶはいく
らか正確である。
しかしながら、西ドイツ特許出願公開第２５５２５７０
号明絢曹に記載のテトラペプチド誘導体は、基質飽観で
実施されるべき第Ｘａ　因子の分析を９馳とする程度に
充分に水性媒体中に可溶ではない。例えば病的血漿中の
測定すべき第Ｘａ　因子の濃度が極めて低い場合には、
前記テトラペプチド誘導体は、相応する正確な測定値を
得させる程度に充分に敏感ではない、−１１定すべき第
Ｘａ　因子の量が更に血漿を加えることによシ増加し九
ら、血漿蛋白質の影響下にテトラペプチド基質の沈殿が
生じるはずであり、その結果として、＃素分析を実施す
ることが不可能となるはずである。
発明の開示 ところで、水性媒体中に非電に溶は易く、ｉＸａ因子に
対して意想外に高い敏感性を有する新規のトリペプチド
誘導体を見つけｆｃ。
本発明のこのトリペプチド誘導体は、次の一般式を有す
る： 〔式中Ｒ１は炭素原子数２〜８を有し、ω−位に１個の
７ミノ基を有していてよいアルカノイｂ基、了ルカノイ
ル基中に炭素原子数２〜４を有し、そのフェニル憂はｐ
−位で１１ｆｉのアミノ基で置換されていてよいフェニ
ルアルカノイル基、４位で７ミノメチル基で置換されて
いてよいノクロヘキンル力ルゼニル基、Ｏ−又はｐ−位
でメチル基、アミノ基、ハロゲン例えば０１　　又にＢ
【　で［切されていてよいベンゾイル泰、アルコキ７基
中に炭素原子数１〜８を有する了ルコキノ力ルゼニル基
、ｐ−位でメトキシ、メチル又は塩累で置換されていて
よいペンジルオキンカルゴニル基、炭素原子数１〜４を
有するアルカンスルホニル基％　ｐ　−’位テメチル化
すしていてよいフェニルヌルホニル基又ハα−又はβ−
ナフチルスルホニル基を表わし、Ｒ鵞　　は炭素原子数
１〜６特に１〜４ｔ−有する直鎖又は分枝鋼のアルキル
基、炭素原子数１〜２を有するヒドロキシアルキル基、
アルキル中の炭素原子数１〜２を有し、アルコキシ中の
炭素原子数１〜４を有するフルコキシアルキル基、アル
キル中の炭素原子数１〜２を有するベンジルオキ７アル
キル基、アルキル中の炭素原子数１〜３を有し、そのア
ルコキシ基が直鎖又は分枝鎖で炭素原子数１〜４を有す
るω−カルボキシアルキル又はω−フルコキンカルメニ
ルアルキル基、アルキル中の炭素原子数１〜３ｆｃ有す
るω−ペンツルオキ７刀ルメ二ルアルキル基又はシクロ
ヘキシＡ−，シクロヘキシルメチル−１４−ヒドロキノ
ンクロヘキシルメチルフェニルー、ベンジル−％　４−
ヒドロキシペンツルー又はイ基を表わし、Ｒ４は水素又
にメチル又はエチル基を表−−・　　　　　　　　　　
　　　　　　−二、　　　−４幻→ｔ４ば４広４訳Ｒ５
ｕ　ｐ−ニトロフェニルアミノ、１−カルハキシー２−
ニトロフエン−５−イル−アミノ、１−スルホ−２−ニ
トロフエン−５−イル−アミノ、β−ナフチルアミノ、
牛−メトキシ−β−ナフチルアミノ、５−ニトロ−α−
ナフチルアミノ、キノン−５−イル−アミノ、８−ニト
ロ−キノン−５−イル−アミノ、４−メチル−クマル−
７−イル−アミノ又は１，３−２（メトキシカルボニル
）−フエン−５−イル−アミ７基（５−アミノ−イソフ
タル酸ジメチルエステルから誘導）を表わす（但し　Ｒ
１がペンノルオキシカルぜニルでＲ２がイソプロピル又
はシクロヘキシルであるトリペプチド誘導体を除く　）
　〕。
アルギニンの強塩基性グアニジノ基は、例えば鉱酸例え
ばＨＣＩ、ＨＢｒ　、　Ｈ２Ｂｏａ又はＨ３ＰＯ４又は
有機酸例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン
酸、（４酸、酒石ば、安息香酸、７タル収、トリクロル
酢酸又はトリフルオル酢酸でプロトン化することにより
安定化されるのが有利である。プロトン化の特性は％酵
素に対するトリペプチド基質の敏感度（感受性）に対し
て影響を有しない。
１式のトリペプチド誘導体は１次に記載の自体公知の方
法で製造できる： １）色原性基Ｒ５をＣ−末端アルギニンのカルホキ／基
に付着させ、他方、そのα−フミノ基を保護基例えばカ
ルボベンゾキン又はｔ−ブトキシカルゼニル基で保護し
、アルギニンの２−グアニシンを例えばＩＣ！’に扇い
るプロトン化、窒化又はトノル化に！り保護する、Ｃ−
末端基はペプチド鎖の段階的形成の間に保護基としての
役目もする。残りの保ｊ１１基は、必要に応じて所望ペ
プチド鎖が完全に組立てられるまでに、次のアミノ酸誘
導体に付着するために、選択的に除去することができる
。最後に、影響されている基Ｒ５以外の残りの保護基を
まったく除去することができる〔例えばＭｉｋｌｏｓ　
Ｂｏｄａｎｓｋｙ　￥ｊによる＠Ｐｌ！ｐｔｉｄｅ　５
ｙｎｔｈｅｓｉｓ″、Ｉｎ１ｅｒｓｃＩｐｎｃｅＰｕｈ
ｌｉｓｈｅｒｓ　、　　１６３−１６５負、（１９６６
年）参照〕。
２）まず、ペプチド鎖を形成し、他方、アルギニンのＣ
−未爆カルボキンル基を有用なエステル基倒えはメトキ
ン、エトキン又はペンノルオキシ基で保護する（、前記
のＢｏｄａｎｓｋｙ　　の文献参ｆ＠）０選択的にトリ
フルオル酢酸を用いて除去すべきｔ−ブトキン基以外の
エステル基はアルカリ性加水分屏により除去することが
できる。アルギニンのδ−グアニノル基？プロトン化ｆ
ると、このエステル基はトリプ／ンにより除去され、こ
の場合にラセミ化は起こらない。その後、色原性基Ｒ５
を導入する。アルギニンのδ−グアニジノ基金ニトロ又
はトシル基で保護し、トリペプチド誘導体のＮ−禾みα
−了ミノ基をカルボベンゾキン基又はｐ−メチル、ｐ−
メトキ／又はｐ−クロル−ペンノルオキ／カルビニル基
又は！−ブトキン基で保護する場合は、これらすべての
保護基を同時に除去する。この除去に、保護されたトリ
ペプチド誘導体をヱ温で戸水ＨＦで処理することにより
達成でき、結果として、前記の７ミノ基及びδテグアニ
ノノ保護基のすべてが除去される。この除去は、保護さ
れたトリペプチド６導坏が保護基としてニトロ又はトシ
ル基を含有しかい場合屹。
室温で氷ｅ：酸中０２ＮＨＢｒでの処理によって実痛す
ることもできる。
１式のトリペプチド誘導体は、西ドイツ特許出願公開第
２５５２５７０号明細書に記載のテトラペプチド脚４坏
よりも著るしく容易に水中に溶け、従って、信頼しうる
測定結果を祷るために要求される基質飽和で実施される
べき酵素分析を可能とする。更に、１式のトリペプチド
基質は、西ドイツ特許出願公開第２５５２５７０号明細
曾記載のテトラペプチド誘導体よりも著るしく敏感であ
り、従って、極めて低い＃度の第Ｘａ因子を分析する友
めに便用することもできる。
西ドイツ特許出覇公開第７６０７４３３号明ｍ香には、
一般式二Ｈ−Ｄ　−Ａｔ　−Ａｌ　−Ａ３−ＮＨ−Ｒ（
Ａｔ　ｌＡｔ　ｏ　Ａｌ　＝アミノ酸残基）を有し、＃
累分類Ｅ、０゜３．４．２１　、の？＃素例えばトロン
ビン及びシラ２ミンに対して高い敏感度を有するトリペ
プチド誘導体が記載されている。この高い敏感度は、Ｎ
−末端り一了ミノ戚が非＋を俟α−了ミノ基を有する事
実に帰因する６貢隙に、この床端Ｄ−アミノ酸のα−了
ミノ憂が置換されている場合、即ち、式中の氷菓が保護
基又は遮断基飼えばベンゾイル又はカルゼペンゾキ７基
で撓えられると、酵素分類３．４．２１．０酵素に対す
るトリ４プチド誘導体の敏感度は著るしぐ低下される。
これらの発見に基づき１式中のＮ−末端Ｄ−ｒミノ酸の
α−アミノ基が保護基又は遮断基を有する１式の新規ト
リペプチド６導坏体は酵素分類３．４．２１の酵素によ
り分解されないか又は僅かに分解されることは予測でき
た。しかしながら、すべての予想に反して、新規トリペ
プチド基（は意想外に第Ｘａ　因子に対する非電に高い
敏感度を有する。
西ドイツ特許出願公開第２５５２５７０号明細書に記載
のテトラペプチド誘導体に比べ九本発明のトリペプチド
基質のもう１つの利点は、実鍬に、その合成が簡単かつ
経賀が安い事実に帰する。
本発明のトリペプチド基５ｉＬは、＃累分類Ｅ、０．３
゜４．２１．の時定酵ｇ　（−Ｅｎｚｙｍｅ　Ｎｏｍｅ
ｎｃｌａ＋ｕｒｅ　”Ｅｉｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ　Ｐｕｈｌ　ｉｓｈｉｎｇ　Ｃ！ｏｍｐａｎ
ｙ　＊　Ａｍｓ＋ｅ−ｒｄａｍ１９７３年２３８員以降
参照）例えば血漿中の第Ｘａ　因子の定量分析に使用す
ることができ、第Ｘａ因子を経て、他の生物学的に重要
な因子例えば第Ｘ因子（第Ｘａ因子のプロ酵素）、第Ｘ
ａ抗因子（＝抗トロンビン■又はへＡｔ）ン袖因子）父
に血漿中のへ・ｅ　ＩＪンの定量分析にも使用できる。
これらの槽々の分析は次に記載の方法で実施できるｌ）
第Ｘ１　因子及び第Ｘ因子の分析：クエン酸処理したヒ
ト血漿を用い、まず、血漿中に性化する。次の試薬を使
用する： 後衛液　トリス−イミダゾール＠衝板、ｐＨ８，４、イ
オン１度０．３； Ｒ■■　凍結乾燥したラッセルまむし毒調製物（Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｉｒｅ　Ｓｔａｇｏ　＋　９２６００　Ａｓ
ｎ１ＡｒｅｓＳ　／　５ｅｉｎｅ　、　Ｆｒａｎｃｅ　
　より提供）　ｔ　ｃａｃｚ、　ｏ。
０１５Ｍを含有する後衛液中に溶解したちの基　質　ｉ
ｚ氷水中溶かしたＣｈｏ　−Ｄ　−Ｌｅｕ　−Ｓａｒ　
−Ａｒｇ　−ｐＮＡ−ＡｃＯＨ（１ｌｌｌｌ：　２　ｘ
　１０−’　Ｍ　）。
試験キュベツトに、３７℃で刃口熱した几ＶＶ０．２ｍ
を装入し、次いで、クエンは処理したヒト血漿０，０２
ｄを装入する。この２種成分を直ちに混合し、次いで、
３７℃で６０秒間インキュベートする。生じる活性混合
物ｔ−３７℃に加熱された後衛液１．６　ｄで稀釈し、
２ｘｔｏ−’ｈ＜基質溶叡帆２ｄと混合する。次いで１
発生ルーニトロアニリンにより惹起される混合物の光学
密度の変化を４０５　ｎｍの波長で分光光度法で測定す
る。ツ１１定された１分当りの光学密度の増加は、活性
化された血漿中に存在する轟Ｘａ　因子の量に正比声１
する、測定された１分当りの光学密度の増加は、活性化
の結果として、第Ｘ因子の所定量が化学量ｎ的に相当量
の第Ｘａ　　因子に変じるので、出発血漿中に存在する
第Ｘ因子の量に関する尺度でもある。
２）ヂ郊Ｘａ抗因子の分析： クエン酸塩処理したヒト血漿をＴＲｌ８−後衛液でｌ：
ｌＯの割分で稀釈することにより試料を調製する。
ＴＲｌ５−イミダゾールＷＩＴ液中のヘノξりン溶／Ｊ
（ｅ面版１ｄ当りヘパリン３ＵＳＰ単位を含有）１００
μｌを前記稀釈血漿１００μＺＫ加え、祖合物を３７℃
で２分間インキュベートシ、このイノキュヘートシタも
のに、ｌａＺ当り第Ｘａ　因子８５凰位を含有する第Ｘ
ａ因子調製物ダイアゲン（Ｄｉａｇｅｎ　；提供者Ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃＲｅａｇｅｒ＋＋ｓ　＊　Ｔｈａｍｅ
　、英国）ｔ”７ＪＯえる。この混合物を３７℃で３分
間インキュベートする。このインキュベートしたものを
３７℃に刀０熱したＴＲｌ３−イミダゾール４ｖ衝販０
．６ｄで稀釈し、直ちに、３７℃に加熱し次蒸溜水中の
２Ｘ１０−’ＮｔのＯｈｏ　−Ｄ　−Ｌｅｕ　−Ｓａｒ
　−Ａｒｇ−ｐＮＡ・Ａｃ０Ｉ（（基質）の溶１ｌｏｏ
μ！とｒｐ１合する。
並行実験で、同じ方法によるが、稀釈された血漿の代り
に同量の＠衝板を用いて盲検試料を調製した。
双方の試料（被慎試料及び盲検試料）に関して、４０５
　ｎｍでの光学密度の増加を分光光に法で測定する、盲
検試料の１分当りの光学密度の４加（△ＯＤ盲横７＋ｎ
１ｎ）と′Ｍり試料の１分当りの光学密度の増加（△Ｏ
Ｄ被検／ｍ１ｎ）との間の差は、〆第Ｘａ　抗因子−へ
、ｒｌＪン錯体により抑制されたｉ　Ｘ　ａ　因子の量
に１′Ａする尺度であり、従って血漿中に存在する第Ｘ
ａ　抗因子（＝抗トロンビン■）の童の尺度である。
３）血漿中のへＡ＋）ンの分析： ヘパリン処理した患者の血漿をＴＲｌ５−イミダゾール
緩衛液で１：１０の割合で稀釈することにより被検試料
をｖ４ｆＪする。この稀釈した血漿を３７℃で１〜２分
間インキユペートシ、このインキュベートしたものに第
Ｘａ　因子調製物ダイアゲン（提供者：　Ｄｉａｇｎｎ
ｓｔｉｃＲｅａｇｅｎｔｓ　、　Ｔｈａｍｅ　ｓ英国〕
の溶液（ＩＩｌｔ当り第Ｘａ因子８５単位含有）１００
μ！を添加し＆混合物ヲ３７℃で３分間インキュベート
する。このインキュベート物音３７℃に加熱したＴＲｌ
５−イミダゾール緩衛液０゜６ｄで稀釈し、直ちに、蒸
溜水中のＯｈｏ　−Ｄ　−Ｌｅｕ　−８ａｒ　−Ａｒｇ
　−ｐＮ入４ｃＯＨ（基質）の２ＸｌＯＭ溶液１００μ
！と混合する。
並行実験で、同じ方法であるが、稀釈されたヘパリン処
理血漿の代りに相応して稀釈された１冨血漿（ヘパリン
ネ含）同量を用いて、盲検試料を＋ｉ１４製する。
双方の試料に関して４０５　ｎｍにおける１分当りの光
学密度の増加を測定する。１検試料の１分当りの光学密
度の増７Ｉｌｌｌ（△ＯＤＮ検ｙ　ｍ＋、　）と被検試
料の１分当りの光学Ｗ［の増７１０　（△ＯＤ　被＠　
７□、）との間の差は、ヘノにリン−補因子（抗トロン
ビン）に結合したヘパリンの抑制活性の尺度である。
第Ｘａ抗因子（＝ヘパリンー補因子又に抗トロンビンＩ
Ｄ）は単独で第Ｘａ　因子を抑制するが、糧かいインキ
ュペーンヨン時間（例えば３分）内に少量の第Ｘａ因子
だけが抑制される程度に連い。しかしながら、第Ｘａ　
抗因子がへノぞりンと接触するなら、２成分は、第Ｘａ
　因子の迅速抑制成分でらシ、短かいインキュペーンヨ
ン時間（例１えば３分）内に第Ｘａ　因子と完全に結合
する錯体を形成する。
第Ｘａ　因子の抑制は、存在するヘパリンの量に比例す
るので、充分な第Ｘａ　抗因子が存在するかぎり、患者
の血漿中に存在するへ、ｅ　１７ンの量は、王宮血漿で
得られる平衡曲−を用いて、かつ添児したヘノぞリンの
強化作用の理由で、添加ヘノぞリンの量を増加すること
によＶ測定できる。
第Ｘａ因子と本発明のトリペプチド誘導体との間の反応
で生じた着色された分解生成物Ｈ−Ｒ’（ｐ−ニトロア
ニリン）の量の測定において、利点は１分解生成物が基
質のそれとは！４なるＵＶヌベクトルを有し、長波長の
方向にノットしている事実に基づく。本発明の基質は約
３１０　ｎｍで最大吸収を示し、約１３０００のモル吸
光係数を示す。４　Ｑ　５　ｎｍでの基質の吸収は笑買
的に０である。基質の酵素的加水分解により形成される
分解生成物即ちｐ−ニトロアニリンは、３８Ｑ　ｎｍで
最大吸収及び約１３２０００モル吸光係数を示す＋＋４
０５ｎｍでの吸光係数は、徐々に、！０ち約１０４００
まで減少する。
色原性基としてβ−ナフチｂ了ミノ、４−メトキ７−／
−ナフチル了ミノ、フマル−ツーイル−アミノ又はイノ
７タリル了ミノ基を有する基（の揚台に、第Ｘａ因子に
より形成された分解生成物Ｈ−Ｒ８のｉを螢光分光光度
法により測定する。第ｘ３　因子、昏衝板及び基質より
なる試験系において、螢光分解生成物を３００〜４００
　ｎｍのエネルギーの多い光で連続的に知Ｊ起した後に
、４００〜４７　Ｑ　ｎｍでエネルギーの少ない光を連
続的に測定する。単位時間当りに形成される分解生成物
の量は、存在する第Ｘａ　因子活性の尺度である。定義
によれば、１分当りに形成される分解生成物の１μモル
は、所定の１基質に対する第Ｘａ因子のｌ酵素単位に相
当する。
前記の分析法の敏感度は、その量の測定前の分解生成物
Ｈ−Ｒ’１ノアゾ化合切とのカップリングにより。
より強く着色された化合物（この際Ｒ５はｐ−ニトロフ
ェニル７ミ／、１−刀ルチキンー２−二トローフエン−
５−イル−アミノ、１−スルホ−２−ニトロ−フエン−
５−（ルーアミ゛］、５−ニトロ−α−す７テルアミノ
又は８−ニトロ−キノン−５−イル−アミノ基でろ匂に
変えることにより、更に増大させることができる。
次の操作例で１本発明のトリペプチド誘導体を詳述する
１ｍ度は摂氏で示す。
実施例により得られる溶離物及び生成物の分析は。
二酸化連累ゲｂ（＼（ｐ−ｒｃｋ　Ｆ　２５４　）でコ
ートされたガラヌプレートを用いる薄層クロマトグラフ
ィにより実施した。薄層クロマトグラムは、次の溶剤系
：ｎ−ブタノール／酢酸／水（３：１：１）を用いて展
開した次の略語を使用する： Ｄ　−Ａａｄ　ｉ　＝　Ｄ−Ｑ−了ミノー７ジビン酸、
Ａｃ　　　　＝アセチル。
Ａｃ２０　　＝無水酢酸。
ＡｃＯＨ＝匪酸。
Ａｌａ　　　＝Ｌ−アラ二ノ。
Ｄ−ＡＩａ＝Ｄ−アラニン。
ＡＯＡ　　　＝Ｄ−α−アミノーオクタノイック酸、Ａ
ｒｇ　　　＝Ｌ−フルギニン。
Ｄ−Ａｓｐ＝Ｄ−７７パラギン酸、 Ｂｏｏ　　　＝ｔ−ブトキン力ルゼニル。
Ｂｕ　　　　＝ブチル、 Ｂｕｔ　　　＝Ｌ−２−アミノ狛酸。
Ｄ−Ｂｕｔ　　＝　Ｄ　−２−了ミノ酪酸、８□　　　
＝ベンゾイル。
Ｂｚｌ　　　”ペンノル。
Ｂｚ２０　　＝無水安息香酸・ ＣｈＡ　　　−キノニルアミド、 Ｄ−ＣＨＡ　　＝　Ｄ　−３−アン口へキノルアラニン
、Ｄ−ＣＨＧ＝　Ｄ　−２−７クロヘキンルグリノン、
Ｃ−０ＨＴ＝Ｄ　−３−（４−ヒＦ’ｏ＊ノン１　ｏへ
’ｅンｈ）−アラニン、 ＝核中で置換されたチロンン、 Ｃｈｏ　　　＝カルゼペンゾキン、 ＤＭＦ　　　＝ジメチルホルムアミド、ＤＰ入　　＝５
−７ミドーイン７タルばのツメチルエステル、 ＴＬＣ’＝薄層クロマトグラフィ又は４鳩クロマトグラ
ム。
Ｄ−Ｇｌｕ　　＝Ｄ−グルタミン酸。
Ｄ−Ｈｉｓ　　＝Ｄ−ヒヌチジン。
ＨＭＰＴＡ　＝Ｎ　、　Ｎ　、　Ｍ　、　Ｎ’、　Ｎ’
、　Ｙ−ヘ＊ンｈメｆルー燐酸トリアミ　ド、 Ｄ−１１ｅ−Ｄ−インロインン、 Ｄ−Ｌｅｕ＝Ｄ−ロイシン。
ＳＳ　　　＝溶剤系、 ＭＣＡ　　　ニア−アミド−４−メチルクマリン、Ｍａ
Ｏ＝メトキノ。
ＭｅＯＨ＝メタノール。
ＮＡ　　　＝ナフチル了ミド。
Ｄ−ＮＩｅｕ＝Ｄ−ノルロイノン。
Ｄ−Ｎｖａｌ−Ｄ−ノルバリン。
０＋Ｂｕ　　＝ｔ−ブトキン。
０ｐＮＰ　　＝　ｐ−ニトロフェノキノ、ｐＮ入　　＝
ｐ−ニトロ了エリすド。
Ｐｒ　　　　＝プロピル。
Ｄ−Ｐｈ’Ｃｌ１ｙ＝　Ｄ　−２−フェニルグリンン。
Ｄ−Ｐｈｅ　　＝　Ｄ−フェニルアラニン。
Ｓａｒ　　　＝サルコンン＝Ｎ−メチルグリンン。
Ｄ−８ｅｒ＝Ｄ−セリン、 ＴＦＡ　　　−トＩＪフルオル酢酸。
ＴＨＦ　　　＝＝テトラヒドロフラン、Ｄ−Ｔｈｒ　　
＝Ｄ−スレオニン、 Ｔｏｓ　　　＝ｐ−トルエンスルホニル。
Ｄ−Ｔｙｒ　　＝Ｄ−チロンン。
Ｄ−Ｖａｌ＝Ｄ−バリン。
他に記絨のないかぎり、アミノ＠はＬ−型を臂する例　
１ ２５０ｄ三頚フラスコ中で、真空中Ｐ、　Ｏ５上で乾燥
したＣｂｏ−Ａｒｇ−ＯＨ−Ｈ（Ｊ　　ｌ　６．０　？
　（４７ｍＭ　）　ｔ”％無水ＨＭＰＴＡ　９０ｄ中に
、湿気不存在下に２０℃で泪がした。生じる溶液に、室
温でまず、ＨＭＰＴＡＩＣ１ｄ中のＥｔｓＮ　　４．７
４　ｆ　（４７，ＯｍＭ　　）の溶液を加え、コイで１
イノンアン［ｐ−二）ｏ７！ニル１６．４ｐ（１００ｍ
Ｍ）（１００Ｘ過剰）ｔ”；’ｉｒ＋カロした。２０℃
で２４時間の反応時間の後に、ＨλＩＰＴＡの大部分を
真空中での蒸溜により除去した。残分’ｋ　３０　Ｘ　
ＡｃＯＨＴ　＊回抽出した。残分を捨てた。集めたんｃ
ＯＨ抽出物を３０％ＡｃＯＨで平衡にしたセフ了デソク
スＧ−１５０カラムを通し、３０％ＡｃＯＨで溶離させ
ることにより更に精製した。トリプシンでの処理により
ｐ−ニトロ了ニリンの形成下に分解したＡ　ｃ　ＯＨ溶
離液の７ラク７ヨンを凍結乾燥させた。こうして、ＳＳ
中でＴＬＣにより示されるような均質である無定形粉本
１２．６９が得られた。元素分析及び実験式Ｃｔｎ　Ｈ
ｔｓ　Ｈｓ　Ｏｓ　（Ｊ　　からの計算は次の値を示し
た：０＝５１．２９％（５１，６７％）、Ｈ＝５４８％
（５，４２Ｘ　）、Ｎ＝１７．９２％（＋８．０８％）
、ｃｚ＝７．ｓｏ％（７６３％〕。括弧内の値に計算値
である。
ｌｂ、　２ＨＢｒ−Ｈ−Ａｒｇ−ｐＮＡ化合物１ａ　　
４．６　ＳＬ（１０ｍＭ　　Ｌｔ、攪拌下Ｋ、氷酢酸中
の２ＮＨＢｒ４０＋＋＋／で％２０℃、湿気の不存在下
に４５分間処理した。７ミノ酸誘導体はＣＯ，発生下に
溶けた６反応溶液を激しい攪拌下に、無水エーテル２５
（ｌｄＫ滴加すると、　　２ＨＢｒ・Ｈ−Ａｒｇ　−ｐ
ＮＡはｆａした。エーテル相を吸引除去し、斐シζ、固
相全、副産吻として形成された臭化ベンノル１びに過剰
のＨｌｌｒ及びＡｃＯＨを実質的に除去するために、活
水エーテル１００ｄで４回洗浄した。残分をＭｅＯＨ５
０ｍｌ中にｇ；かし、　Ｅｌ、Ｎの添加によりｐＨを４
５に調節し、溶液を真空中、３０℃で′ａ縮乾燥させた
。縛られる生成物をＭｅＯＨ７５ｍｌ中に溶かし、八Ｉ
ｅ　ＯＨで平衡にしたセファ７’ツク７ＬＨ２０（父叉
結合デキストランゲル）のカラムに通した。溶離液の７
ラク／ヨンから、無定形化合物Ｉｂ４．１８ｙ（理論量
の９１６％）が得られ、これζ、ＴＬＯで示されるよう
にＳＳ中で均質であった、元素分析及び実験式Ｃｕ　Ｈ
ｔｎ　Ｎｓ　Ｏ３Ｂ　ｒｔからの計ＪＬより、次の値が
得られた：Ｃ＝３１．１５％（３１，６０％）、Ｈ＝４
．３５％（４４２％）、Ｎ＝１８．８４％（１８４３グ
≦）及びＢｒ　＝３４．８１Ｘ（３５，０３％）ｐ化合
吻ｔｎ４．５６り（１０ｍＭ）を新しぐ蒸溜したＤ　Ｎ
（Ｆ　３　Ｑ　ｄ中に溶かし、この溶液を一１０１ｍま
で冷却し、この溶液に、攪拌下にＥｔ３Ｎ　　１．４　
ｆ）ｙＩ／（１０ｍＭ　）を添加した。形厄されたＥ＋
３Ｎ−ＨＢｒをｒ去し、少量の冷Ｄ　Ｍ　Ｆで洗浄した
。このＰ液に、攪拌下にＣｈｎ−Ｇｌｙ　−０ｐＮＰ　
　３．６５　ｙ　（１１ｍＭ）　’に加え、湿気の不存
在下に２〜３時間反応させ、この際１反応溶液の温度は
徐々に約２０℃に達した。溶液を再び一１０℃まで冷却
し、Ｅｌｓ　Ｎ　０．７　ａ／（５ｍＭ　　）　ｔ−用
いて援衝させ九。反応溶徹を約−１０℃で約２時間、か
つ室温で３時間反応させた。この操作をＥＩ３ＮＯ０７
０＃／を用いて４９色し、１６時１１に１反応溶液全真
空中＋５０℃でＪｌｅｔさせた。残分を、５０．％Ａｃ
ＯＨ７５＃Ｉ／中に溶かし、５０％入ｃＯＨで平衡にし
たセファデックス０−１５のカラム上でのゲル濾過によ
り精製した。トリプシンでの処理によりｐ−ニトロアニ
リンの形成下に分解した入ｃＯＨ溶離液の７ラクシヨン
を、真空中４０℃で濃縮乾燥させた。残分をＭｅＯＨ１
５０ａ／中に溶かし、再び１縮乾燥させた。生じる残分
を真空ダンケータ中、６０℃で、ｐ、ｏＳ　　上で乾燥
させると、無定形化合物１ｃｓ、５ｓｐ（理論量の８Ｉ
ＩＬ３％）が得られ、これは、ＴＬＣで示されるように
ＳＳ中で均質であった。
元素分析及び実験式Ｃ＊　ｔ　Ｈｔｓ　Ｎ７０ｓ　Ｂ　
ｒから計算して１次の値が得られた：０＝４６．３３％
（４６，６５％）、Ｈ＝５０４％（４９８％）、Ｎ＝１
７．８８％（１７，３１％）、及びＢｒ＝１４．２０％
（１４，１１％）。
化合物Ｉｃ　　４．５６９　（８ｍＭ　　）を、攪拌下
に氷酢酸中の２ＮＨＢｒ　３２＃／で、２０℃で４０分
間処理した。
ノペゾテド誘導体は徐々にＣＯ２の発生下に溶けた。
反応ｆＩｊ液を激しい攪拌下に無水エーテル２５０−に
滴加すると％２ＨＢｒ・Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ　
が沈殿した。エーテル相を吸引除去し、更に、固体相を
、副産物として形成された臭化ベンジル並びに過剰のＨ
Ｂｒ及びＡｅＯＨを実質的に除去するために、無水エー
テル１００Ｉｄで４回洗浄した。残分をＭｅＯＨ５０−
中に溶かした。
＋ｉ＋３Ｎ　を用いてｐＨ値を４３に調節し、溶液を、
真空中％３０℃で濃縮乾燥させ良、？４られる残分子　
ＭｅＯＨ５ｏＩＩＩ中に溶かし、八１ｅＯＨで平衡にし
たセフ了デノクスＬＨ−２００カラム上で精製した。ト
リプシンでの処理によりｐ−ニトロアニリンの形成下に
分解したへＩｐＯＨＰ離液のフラクションをＪｌｃ空中
、３０℃で濃縮乾燥させた。得られる残分を真空ダンケ
ータ中、４０℃でＰ！０＄　　上で乾燥させると、無定
形化合物Ｉｄ３．７８ｆ（理論量の９１１％）が得られ
、これは、ＴＬＣで示されるようにＳＳ中で均質でめっ
た１元素分析及び実験式０ｕＨｎＮｒ０４Ｂｒ　　から
の計算で、次の値が得られた：０＝３２．３１Ｘ（３Ｌ
７７Ｘ）、Ｈ＝４．５９％（４゜５２％）、Ｎ＝１９．
４７％（１９，１１％）及びＢｒ＝　３０．７８％（３
１，１４％） ｌｅ、　Ｃｈｎ−Ｄ−Ｌｅｕ４１ｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−
ＨＢｒ化合物１ｄ　　２．５７ｆ（５ｍＭ　　）を新し
く蒸溜したＤＭＦ　２　Ｑａ／中に溶かし、溶ｇを−ｌ
Ｏ℃まで冷却し、この溶液に、攪拌下にＥｔ３Ｎ　　Ｏ
，７０ｄＣ５ｒｎＭ　　）ｔ−加えた。形成されたＥｔ
３Ｎ−ＨＢｒ　　をＰ去し、少量のＤ　ＭＦで洗浄した
。Ｆ液に、Ｃｈｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯｐＮＰ　　ｌ　ｌ　
３　ｆ　（５，５ｍＭ）ｔ−−１０℃で、攪拌下に加え
た０反応混合＃！ｌを、湿気の不存在下に２〜３時間反
応させたら、この＠、反応溶液の温度は徐々に約２０℃
に達した。溶液を丹び一１０″Ｃまで冷却し、　　ＥＩ
３Ｎ　　Ｏ，３５ｄ　（２，５ｍＭ　　）で砕衛させた
０反応溶液を一２０℃で約２時間１かつ室温で更に３時
間反応させた。この工程を、Ｅｔ３Ｎ　　Ｏ，３５ｄを
用いて（り返し％　ｌＧｑ間後に反応溶液を真空中＋５
０℃でａ非乾燥させた。残分を５゜％Ａｃ０Ｈ５０−中
に溶かし、５０　Ｘ　ＡｅＯＨで平衡にしたセファデッ
クスＧ−１５のカラム上でのゲルＦ遼によりＭ製した。
トリプシンでの処理によりｐ−ニトロアニリンを生じな
がら分解したＡｅＯＨ溶離液フラクションを真空中、４
０℃でＩＩＪＩｉｌ乾燥させた。残分をＭｅＯＨＩＱＯ
−中に溶かし、溶液を再び濃縮転置させた。生じる残分
を真空ダンケータ中、６０℃でｈ　Ｏｓで乾燥させると
、Ｓ定形化合匈１ｅ３．０８ｒ（理ｆｉ＠菫の９０．６
％）が得られ、これはＴＬＣで示されるようにＳＳ中で
均質であった。元素分析及び実験式Ｃｘ５Ｈｓ＊Ｎ＊０
ｔＢｒ　　からの計算により次の値が得られた；Ｃ＝　
４９．０６　Ｘ　（４９，４９％）、Ｈ＝５．８２％（
５７８％）、Ｎ＝１６．８５％（１６，４９％）、及び
Ｂｒ　＝１１、５９　′Ｋ（１１，７６％）。
アミノ酸分析に、正確な割合での予想了ミノばの存在を
確認した： Ｇｌｙ　：　１．　’ＯＯ−ＤＬｅｕ　：　Ｏ−９９−
Ａｒｇ　：　０．９７゜Ｒ１＝０．６２ Ｒｆ値は、シリカゲルプレート（Ｍｅｒ：ｃｋ　Ｎｏ。
２５４）上で、ｎ−ブタノール：氷酢酸：水＝３：ｌ：
ｌを用いて測定した。２３〜２５°Ｃ１８〜１０ｃｒＩ
Ｌの展開距離で展開した。スポットはＵｖ−線で、沃素
蒸気で、かつ引続くトリプシン水溶液の吹き付けにより
可視にした。すべての生成物は、これらの可視化により
、１個の固有のスポットを示した。トリプシン水溶液で
の処理の際に、トリプシン水溶液の発色性又は螢光性基
は分解されて、肉眼又はＵＶ線で観察できる分解生成物
の色が現われた。本発明によるトリペゾチド誘導体は、
加熱時に焼結されるので、厳密な輪点を有しない。
例　　２ 市販のＣｂｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ−ＨＣ１１３，Ｏｆｌ　
（２５，９ｍＭ）を、氷酢酸中の２ＮＨＢｒの溶液１０
４ｍ１（２０８ｒｒＭ）を用いて、例１ｂの方法で分解
させた。乾燥残分をＭｅＯＨ４ｏｏｍｔ中に溶かし、セ
ファデックスＬＨ−２００カラム上で精製した。トリプ
シンでの処理により４−メチル−７−アミノ−クマリン
の形成を伴なって分解したＭｅＯＨ溶離液フラクンヨン
を真空中％　３０℃で濃縮乾燥させた。生じる残分を、
真空中、４０℃でＰ！Ｏｓ上で乾燥させると、＃定形化
合物２ｂ１１．２ｆ（理論量の８７７％）が得られ、こ
れは、ＴＬＯで示されるようにＳＳ中で均質であった０
元素分析及び実験式ＣＩＩＨｔｓ　Ｎｓ　Ｏｓ　Ｂ　ｒ
ｔからの計算により次の値が得られた：　Ｏ＝　３９．
４０％（３＆９０％）、Ｈ＝４．６１％（４７０Ｘ）、
Ｎ＝１４．４８％（１４，２０％）及びＢｒ　＝３１、
ｑｏＸ（３ｚ４ｏ％）。
２ｃ、０ｂｏ−Ｇｌｙ−人ｒｇ−ＭＣＡ−ＨＢｒ化合物
２　ｂ　４．９３　ｔ　（１０ｍＭ　　）及びＣｂｏ−
Ｇｌ　ｙ−ＯｐＮＰ３．６５Ｆ（１１ｍＭ）？新しく蒸
溜したＤＭＰ７５ｍに加え九、−１０℃に冷却の後に、
攪拌しながら、まずｌｉ：１３Ｎ　　１．４０ａ＋Ｊ（
１０ｍ八（）１次いで０．７０ｍ（５ｍＭ　）を添加し
た。混合物ｆｔ湿気の不存在下に、まず−１０℃で３時
間１次いで室温で４時間反応させた。
反応溶液を再び−ｌＯ℃まで冷却し−ＥｔｓＮ　　０．
７０ｄで後衛させ、２０℃で１夜攪拌した６反応混合物
を真空中、５０℃で１１ｍ乾燥させ、残’ｉｆ　ｔ　５
０　ＸＡｃＯＨ２００ａｔ中に溶かし、セファデックス
Ｇ−１５のカラム上で精製した。トリプシンでの処理に
より４−メチル−７−アミノ−クマリンを形成しながら
分解したＡｃＯＨ溶離液フラクンヨンを真空中、４０℃
でａ縮乾燥させた。このようにして得られた残分を真空
デフケータ中、６０’Ｃでｐｔｏｉ　上で乾燥させると
１％定形化合’１ｉｆｆ２ｃ　４．９８　ｆ　（理論量
の８２．５％）が得られ、これはＴＬＯで示されるよう
にＳＳ中で均質であった。
元素分析及び実一式Ｏｖａ　Ｈａ　ｔ　Ｎ＠Ｏｓ　Ｂｒ
　　からの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝５１．
４８％（５１，７５％）、　Ｈ＝５．２４Ｘ（５，１８
％）、Ｎ＝１３．７０％（１３９３％ン、２憂−びＢｒ
　　＝　１３．１４Ｘ（１３，２４％）。
２ｄ、２ＨＢｒ−Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍ（！Ａ化合物
２ｃ　　４．８３ｆ（８ｍＭ　　）を氷酢酸中の２ＮＨ
Ｂｒ３２−を用いてｆｌｌｌｄ記載の方法で分解させた
。生じる粗生成物をＭｅＯＨ１００ａｌ中に溶がし、セ
フアデノ／スＬＨ−２００カラム上で精製した。トリプ
シンでの処理により４−メチル−７−アミノ−クマリン
の形成下に分解したＭｅＯＨ溶離販７ラク／ヨンを真空
中、３０℃でａｍ乾燥させた。祷られた残分を真空デフ
ケータ中、４０℃でｋ　ｐｔｏｓ　　上で乾燥させると
、無定形化合吻２ｄ、４．０５ｐ（理論量の９ＺＯ％）
が得られ。
これはＴＬＣによればＳＳ中で均質であった１元素分析
及び５！一式０＋ｍ　Ｈａｓ　Ｎ＠０４　Ｂ　ｒｔから
の計算により次の値７）Ｅｌ１られた：　Ｏ＝　３９．
０２％（３９，２９％）、Ｈ＝４７８％（４，７６％）
、Ｎ＝１５．３９％（１５，２７％）及びＢｒ　＝２８
．７２Ｘ（２９，０４Ｘ〕。
２ｅ、　Ｃｈｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＯ＾
・ＨＢ「化合Ｗ２ｄ　２．７５ｔ（５ｍＭ　　）’ｔｆ
ｌｌｅ記載の方法でＣｈａ　−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯｐＮＰ　
ｌ　１３　ｙ　（５，５ｍＭ　　）と反応させた。生じ
た粗製化合一＝１ｋｓｏ％ＡｃＯＨ７５−中に溶かし、
セファデックスＧ−Ｌ５０カラム上で精製した、トリプ
シンでの処理により４−メチル−７−アミノクマリンの
形成下に分解し九入ｃＯＨ溶離液フラクションを真空中
、４０℃で濃縮乾燥させた。残分を真空ダンケータ中、
６０℃でＰ２Ｏ５上で乾燥させると、活定形化合物２ｅ
１９１ｒ（理論量の８１２％）が得られ、これは、ＴＬ
Ｏで示すようにＳＳ中で均質であった。元素分析及び実
験式０ｉｔＨ＜＊ＮｙＯｔ　Ｂｒ　　からの計ｇにより
、次の値が得られた：Ｃ＝５３．１３Ｘ（５３，６３Ｘ
〕、Ｈ＝　６．０　Ｉ　Ｘ　（５，９１Ｘ　）、Ｎ＝１
３．９１％（１３６８％）及びＢｒ＝１０．８８％（１
１，１５％）。
アミノぼ分析は、正確な割合での予想アミノ酸の存在を
確認し次： Ｇｌｙ　：　１．００−Ｌｅｕ　：　１．０２−Ａｒｇ
　　：　ｏ９ｓ、Ｒｐｏ、６４仰　　３ 乾￥ＡＣｈｎ−Ａｒｇ−ＯＨ−ＨＣ７３４，４８ｆ　（
０，１モル）を１０００−三！１Ｊ１７ラスコ中で、　
ｗｒシ＜蒸溜した無水ＤＭＦ１５０ｍｌと無水ＴＨＰ３
００ａ７との混合栃中に２０℃で溶かした。−１０℃に
冷却したこの溶液に、攪拌下に、湿気の不存在下にＥＩ
３Ｎ　　１０．２ｙ（０，１モル）をＩＩＹＳ７Ｘｌし
た。次いで、この混合物にＴＨＦ５０ｒｌ中のクロルギ
酸イノブチル１３．６５９　（０，１モル）ノ溶液を２
０分かかつて滴加し、この隙は、決して一５℃を越えな
かった。−１０℃〜−５℃のｉ度での１ｏ分間の付加的
反応の後に、Ｄλ【Ｅｌ５−中の５−アミノ−イソフタ
ル酸ジメチル２０．９２９　（０，１モル）の溶液を反
応混合物に３０分かかって滴加し、この際５反し、引続
きＥＩ、Ｎ−Ｈ（１’ｋｍ晶さセルたメ１Ｃ１−１５℃
に冷却した。形成されたＥｌ、Ｎ−ＨＣｊＪ−をＰつし
、少量の冷ＤＭＦで洗浄し九。Ｆ液及び洗浄Ｍ、を真空
中。
５０℃で濃縮した。残分’ｅ５０％ＡｃＯＨ１０００−
中に溶かし、５０％入ｃＯＨで平衡にしたセファデック
スＧ−１５０カラム上でのゲルＰ通により精製した。ト
リプシンでの処理により５−アミノ−イノフタル酸ツメ
チルを形成しながら分解したＡｃＯＨ溶離躾フラクノヨ
ンを真空中、４０’Ｃで′ａｉｉｉｉ乾燥させた。残分
をＸ窒、これはＴＬＣで示されるようにＳＳ中で均質で
あった０元素分析及び実験式Ｃｗｔ　Ｈ３ｏ　Ｎ５０ア
Ｃ！から計Ｘして、次の値が得られた：０＝３３．２１
％（５３，７８％）、　Ｈ＝５．７１Ｘ（５，６４％）
　、　Ｎ　＝　１３．２０　Ｘ　（１３０７Ｘ　）及び
Ｃ７＝６．５２メイ（６，６２Ｘ）。
化合物３ａ　　２１．４４ｐ（４０ｍλＩ）ｔｆＦ！ｌ
ｌｂ記載のように分解した。慣用の処理の後に、生じた
粗生放列ｔ−ＭｅＯＨ２５０＃＋／中に溶かし、セファ
デックスＬＨ−２０のカラム上でのゲル濾過により精製
した。トリプシンでの処理により５−フミノーイン７タ
ル酸ジメチルを形成しながら分解したＭ　ｅ　ＯＨ溶離
液７ラクンヨンを真空中で乾燥させた。残分を冥窒デノ
ケータ中、４０℃で、Ｐ、０．上で乾燥させると、無定
形化合物３ｈが僧られ、これは、ＴＬＯで示されるよう
にＳＳ中で均質であった６元素分析及び実験式Ｃｔｓ　
Ｈｆｓ　Ｎｓ　Ｏｓ　Ｂ　ｒｔから計算して、次の値が
得られ九：ｃ＝３６．８２％（３６４５％）、Ｈ＝４．
６７％（４，７８Ｘ　）　、　Ｎ　＝　１３．４５Ｘ（
１３，２８％）及びＢｒ＝２９．８５％（、３０，３１
％）。
化合ｙ３ｂ　５．２７９　（１０ｍＭ　）を例ＩＣ記載
の方法で０ｈｏ−Ｇｌ　ｙ−ＯｐＮＰ　３．６５５１　
（１１ｍＭ　　）と反応させた。慣用の処理の銹に得ら
れた粗生成物を５０％ＡｃＯＨ２００ｄ中に溶かし、セ
ファデックスＧ−１５０カラム上で精製した。トリプシ
ンでの処理により５−了ミノーイン７タル酸ツメチルの
形成下に分解したＡｃＯＨ溶ｌｌ１ｇ、フラクンヨンを
７１１空中、４０℃でＩＩ縮乾燥させた。残分を真仝デ
ンケータ中６０℃で＊　ｐ、ｏ。
上で乾燥させると、無定形化合ｖ３ｃ　　５．２９　ｙ
　（理論量の８３０％）が得られ、これは、ＴＬＯで示
されるようにＳＳ中で均質であった６元素分析及び実験
式Ｃ＊＊　Ｈｓｓ　Ｎｇ　Ｏｎ　Ｂ　ｒからの計算によ
り１次の値が得られた：Ｃ＝４８．５０％（４８，９９
％）、Ｈ＝　５．２８％（５゜２２％）、　Ｎ＝　１１
９２Ｘ（１３，１８％）及びａｒ　＝１２３３％（１１
５３％）、。
化合物３ｃ　　５．１Ｏｆ（８ｍＭ　　）をｆ［１１ｄ
記載の方法で木酢酸中の２ＮＨＢｒ　　３２ａｊｔ用い
て分解した。慣用処理の後に得られ次組生成？ＩをＭｅ
ＯＨ１００−中に溶カし、セファデックスＬＨ−２０の
カラム上で精製した。トリプシンでの処理により５−ア
ミノ−イノ７タルはツメチルの形成下に分解した１ｄｅ
ＯＨ溶ｌ１ｉｉＩ液フラクンヨンを真空中、３０℃で′
ａ縮乾燥させた。残分を真空デシケータ中％　４０℃で
Ｐ、Ｏｓ　上で乾燥させると。
ｊｌ定形化合ｖ３ｄ　　４．２　Ｓ　？　（理論量の９
Ｑ、９％）が得られ、これは、ＴＬＯで示されるように
ＳＳ中で均質であった０元素分析及び実験式０＋ｓＨｚ
ｓＮｇＯｓ　Ｂｒ＊からの計算により５次の値が得られ
た：　ａ　＝　３６．　ｓ　ｓ％（３７、Ｏ０％）、Ｈ
＝４．９０％（４，８３％）、Ｎ＝１４．７２％（１４
，３８％）及びＢｒ＝２６．９５％（２７，３％）。
１と合物３ｄ　　２．９２ｆ（５ｍＭ　　）ｔ−例１ｅ
記城の方法でＣｂｏ−Ｄ　−Ｌｅｕ−ＯｐＮＰ　　２．
１３　ｆ　（５，５ｍＭ　　）と反応させた。慣用処理
の後に得られた粗生成物を５０％ＡｃＯＨＩ　Ｏ０−中
に溶かし、セファデックスＧ−１５のカラム上で楕製し
九、トリプシンでの処理により５−アミノ−イノフタル
酸ツメチルの形成下に分解したＡｃＯＨ溶電液フラクン
ヨンを真空中、４０℃で濃縮乾燥させた。残分を真空デ
シケータ中、６０℃でｐ、ｏ。
上で乾燥させると、無定形化合物３ｅ３．１１ｐ（３ｍ
論量の８２９％）が侍られ、これは、ＴＬＣで示される
ようＫＳＳ中で均質で６つ九。元素分析及び実線式Ｃ３
１Ｈ４４Ｎ７０ｓ　Ｂ　ｒ　　からの計算により１次の
値が得られた：０＝５０８８％（ｓ　１．２０％）ｔ　
Ｈ＝５．９９　（５，９１メに）Ｎ、＝１３．２６％（
１１０６％）及びＢｒ＝１０４８％（１０，６４％）。
アミノ酸分析は、正しい割合での予想了ミノばの存在ｆ
ｔ確認した： Ｇｌｙ　：　　１．００−Ｌｅｕ　：　１．００−Ａｒ
ｇ　：　０．９７、す；Ｑ、６２ｆＡＩ　　　　　４ 市販のＣｂｏ−Ａｒｇ−２・ＮＡ−Ｈ（！７　９．４　
Ｏｆ　（２Ｑ　ｍ＆Ｉ）ｔ、ｆｌｌｌｂに記載の方法で
氷酢酸中の２ＮＨＢｒ　８０　ａ／の溶液を用いて分解
した。慣用の処理の後に得られた生成ｖｔＭｅＯＨ１５
０ｒｔ中に漆かし、セファデックスＬＨ−２０のカラム
上で精製した。トリプシンでの処理により２−す７テル
了ミンの形成下に分解したＳｌ　ｐ　ＯＨ溶離げ７ラク
／ヨンを真空中、３０℃でｔ農縮乾燥させた。残分を冥
墾デンケータ中、４０℃で、ｐ、ｏ。
上で乾燥させると、無定形１ヒ合切４ｈ８．６Ｏｒ（理
論量の９３２％）が傅られ、これは、ＴＬＣ！で示され
るようにＳＳ中で均質であつ友６元素号析及び実験式０
＋＠Ｐｂ５ＮｓＯＢｒｔ　　からの計算により、次の値
が得られた：ａ＝４ｚｏｓ％（４１，６７％）、Ｈ＝５
．１２％（５０３％）、Ｎ＝１４．６８Ｘ（１５，１９
％）及びＢｒ　＝３３９６Ｋ（３４，６５％）。
４ｃ、０ｈｏ−５ａｒ−Ａｒ、ｇ−２−ＮＡ・ＨＢｒ１
１１、合＜６４ｂ　　４．６　ｔ　（１０ｍＭ　　）　
ｔ９’！ｌｌ　ｃに記載の方法で０ｈｏ−８ａｒ−Ｏｐ
ＮＰ　　３．８０　ｆ　（１１ｍＭ　　）と反応させた
。慣用処理の後に得られた粗生成物を５０％ＡｃＯＨ１
５０ｍ／中に溶かし、セフ了デソクヌＧ−１５０カラム
上で一製した。トリプシンでの処理により２−ナフチル
アミノの形成下に分解したＡｃＯＨ溶離げフラクンヨン
をＪｉｒ、空中、４０℃で１１稲乾燥させた。残分を真
空アンケーク中、６０℃で、Ｐ２Ｏ５上で乾燥させると
。
評定形化合物４Ｃ４，９５５＋（理論量の８４５％）が
侍られ、これは、ＴＬＯで示されるように、ＳＳ中で均
質でらりた６元素号析及び′ｊ！馴式ＣｕＨｓｓＮｓＯ
４Ｂｒ　　から針具して１次の値が得られた：Ｃ−５５
゜７２％（５５３９％）、Ｈ＝６．７３ンＧ　（５，６
８イ）、Ｎ＝１４．６８メに（１４，３５％）及びＢｒ
＝１３．４２％（１，３，６５Ｘ）。
化合物４ｃ　　４．６８ｐ（８ｍＭ　　）ｔ−ｏｌｄに
記載ノア法で、氷酢酸中の２ＮＨＢｒ　２８　ｍｌを用
いて、分解した。慣用処理の後に得られた粗生成物を１
ｋｌｅＯＨ１００ｓ＋／中に溶かし、セファデックスＬ
Ｈ−２００カラム上で精製した。トリプシンでの処理に
より２−ナフチルアミノの形成下に分解したＭｅ　ＯＨ
ｌ！Ｊ　Ｊｌｉ　Ｑ　７ラクンヨンを真空中、３０℃で
ＩＩＩＷＩ乾燥させた。残分を冥窒デンケータ中、４０
℃で、　　ｐ、ｏ、上で乾燥させると、無定形化合４Ｗ
４ｄ４．０８ｙ（理論量の９５８％）が得られ。
これは、ＴＬＯで示されるようにＳＳ中で均質であった
０元素分析及び実験式０１９　Ｈａｓ　Ｎｓ　０２Ｂ　
ｒ！からの計算により、次（’）　（［２１’得られｆ
ｔ、：Ｃ＝４３．９％（４１８７％）、Ｈ＝５．３２に
（５，３０％）、Ｎ＝１６．０２％（１！１Ｌ７９％）
及びＢｒ　＝　２９．６８　’に；　（３０，０２％）
。
４ｅ、　Ｏｂｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−８ａｒ−Ａｒｇ−２−Ｎ
Ａ、ＨＢｒ化合＠４　ｄ　１６６９　（５ｍＭ　）　’
Ｊ’ｆ！１１　ｅに記載の方法で、　Ｏｂｏ　−Ｄ−Ｌ
ｅｕ−Ｏｐ　−ＮＰ　ｌ　１３　ｆ　（５，５ｍＭ　）
と反応させた。慣用処理により得た粗生成物を５０５Ｘ
ＡｅＯＨ１００ｄ中に溶かし、セファデックスＧ−１５
のカラム上で精製した。トリプシンでの処理により２−
す７チルアミノの形成下に分解したＡｃＯＨ溶離液の鼠
初の主７ラクンヨンを具仝中、４０℃で′ａ縮乾燥させ
、真空デシケータ中、６０℃でｂ　ｐ、ｏ、上で乾燥さ
せた。こうして無定形化合物４ｅ３．０１ｆ（理論量の
８６２％）が得られ、これは、ＴＬＯで示されるように
ＳＳ中で均質で６った６元￥分肝及び”５４４１１式Ｃ
ｓ３Ｈａ＊ＮｔＯｓＢｒ　　からの計算により１次の値
が祷られた：　Ｏ＝　５７．０５％（５６，７３％）、
Ｈ＝６．４０％（６３５％）、Ｎ＝１４．３０％（１４
，０３％）及びＢｒ　＝１１、１２％（１１，４４Ｘ　
）　。
アミノ酸分析は、予想アミノ酸が正しい割合で存在する
ことを確認した： Ｓａｒ　　：　　１．　　ＯＯ−Ｌｅｕ　　：　　１．
　０　２　−人ｒｇ　　：　　０．　９　７、Ｐ、ｆ−
Ｑ、ｕ例　　　５ 市販ＯＯｈｏ−Ａｒｇ−４−ＭｅＯ−２−ＮＡ−Ｈ（、
＃　　１０．　Ｏｙ　（２０ｍＭ　　）を例１ｂに記載
の方法で氷酢酸中の２ＮＨＢｒ　８０−を用いて分解し
九、慣用処理の後に得られ九柁生Ｎｌ　ｍ　’Ｉｔ　Ｍ
ｅＯＨ１５０ｄ中に溶かし、セファデックスＬＨ−２０
のカラム上でＮ製した。トリプシンでの処理によｒ）４
−メトキシ−２−す７チルアミノの形成下に分所したＭ
ｅｏ）［溶ｗｉ液の主７ラクンヨンを真空中、３０℃で
＃爾乾燥させ次、残分をＸ２デンケータ中。
ＰｔＯ，上で乾燥させると、無定形化合物５ｂ３．９８
ｙ（理論量の９１．４％）が得られ、これは、ＴＬＣで
示されるようにＳＳ中で均質であった０元素分析及び冥
一式Ｃ！ｔｙ　Ｉ（２ｓ　Ｎｓ　０２Ｂ　ｒ＊　からの
計算により、仄の１１が祷られた：　Ｏ＝　４１．２２
　Ｘ（４１，５７Ｘ　）％Ｈ＝５．１９％（５１３％）
、Ｎ＝−１４，４０％（１４，２６Ｘ）及びＢ「＝３λ
Ｏ１％（３２，５３ンに）。
化合ｗｓｈ　　４．９１１　（１０ｍＭ　　）を例１ｃ
に記載の方法で０ｈｏ−８ａｒ−ＯｐＮＰ　　３．８　
Ｏｆ　（１１ｍＭ　　）と反応させた。慣用処理の後に
得られた粗生成物を５０％入ｃＯＨ中に溶かし、セファ
デックスＧ−１５０カラムで精製した。トリプシンでの
処理により４−メトキノ−２−ナフチルアミノの形成下
に分解したＡｃＯＨ溶離液の最初の王７ラクンヨンを真
空中、４０℃で濃縮乾燥させた。残分をＸ空デンケータ
中、６０℃で＊　ｐ、　ｏｓ上で乾燥させると、無定形
化合物５Ｃ４，８６９＜理論量の７９０％）が得られ、
これは、ＴＬＯにより示されるように、ＳＳ中で均質で
めった０元素分析及び実軸式ＣｔｓＨｓａＮｓＯｓＢｒ
　　からの計算により次の値が得られた：０＝５４．３
８％（５４，６４％）％Ｈ＝５．８１％（５，７３％）
、Ｎ＝１３．９３％（１３，６５％）及び５ｒ＝１２．
７５％（１２，９８％）。
化合物５ｃ　　４．３１　Ｐ　（７ｍＭ　　）を例１ｄ
に記載の方法で氷酢酸中の２ＮＨＢｒ　２８−で５＋解
し九。慣用の処理の後に得られた粗生成＠をＭｅＯ８１
００ｍｌ中に溶かし、セファデックスＬＨ−２００カラ
ムで精製した。
トリプシンでの処理により４−メトキノ−２−ナフチル
アミノの形成下に分解したＭｅＯＨ溶駈腹の主７ラクン
ヨンを真空中、３０℃でｍ　（ＩＩ　Ｗ、　Ｃ！させた
。残か金具窒デンケーク中、４０℃で、Ｐ、Ｏｓ　　上
で乾燥させると％急定形化合’ａ’Ｊ　５ｄ　　３．７
４　ｆ　（ｄｔｆ４飯の９５．０％）が得ら交、これは
ＴＬＣで示されろようにＳＳ中で均質であつ九。元素分
析及び実珈式自ｏＨｉｎＮｓｏｔ　Ｂｒｚからの計算に
より次の値が祷られた：　Ｃ！　＝　４３．０　Ｉ　Ｘ
　（４Ｚ７２％）、Ｈ＝５．４４％（５，３８％）、Ｎ
＝１５．２５Ｘ（１４，９５％）　ｈ（ＪＢｒ　＝　２
８．０３％（２８，４２９ｃ）。
アミノは分析は、正しい割合での予想アミノ酸の存在を
確認した： Ｓａｒ　：　１．００−Ｌｅｕ　：　１．０１−Ａｒｇ
　：０．９８５ｅ、　Ｃｉｂｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−８ａｒ−
Ａｒｇ−４−ＭｅＯ−２−ＮＡ−ＨＢｒ化合化合ｄ　　
２．８１　？　（５ｍＭ　　）？？！ＩＩ　ｅＬ／Ｃ記
載０方法でＣｂｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯｐＮＰ　　２．１３
　ｆ　（５，５ｍＭ　　）と反応させ友。慣用処理の波
に得られた粗生成Ｖを５ｅ％Ａｃ０）１１２５　ｍｌ中
に溶かし、セファデックスＧ−１５のカラムで精製し友
、トリプシンでの処理により４−メトキ／−２−ナフチ
ルアミノの落成下に分解したＡｃＯＨ溶ＸＩ液の最初の
王りラク／ヨンを、真空中、４０℃でａｍ乾燥させた。
残０を冥仝デ／ケータ中、６０℃でＰ２Ｏ５上で乾燥さ
せると、無冗形化合’？／＋５ｅ２９８ｖ（理論量の８
１８％）が得られ、これはＴＬＣで示されるようにＳＳ
中で均質でらつ次。元）１％分析及び芙謂式Ｃ３４Ｈ２
Ｓ　Ｎ７０＠Ｂ　ｒ　　から１昇して１次の−が得らｎ
　ｆｃ　：　Ｏ＝　５６．２８　Ｘ　（５６，０４メｏ
）、Ｈ＝６．３４％（６，３６，％）、Ｎ＝ｔ　３．７
５％（１３，４６％）及びＢ「＝１０．６８Ｘ（１０，
９７％）　、　　　ＦＺｆ島ｏ、ｔｙケ例　　　　６ Ｃｎｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＡｃＯ
ＨＯｂｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・ＨＢ
ｒ　（ｆＩｌ　ｌで製造した）６８０ｙ（１０ｍＭ　　
）ｔ６０％ＭｅＯＨ水７５ｄ中に溶かし次、溶液をアセ
テート型のアンバーライトＪＲＡ−４０１０カラム上に
注いだ、このカラムを６０％八Ｉへ　ＯＨ水を用いて溶
離させ、　ＨＢｒをイオン交会によりＡｃＯＨで換えた
。溶離液を真空中、４０℃で濃縮乾燥させた。真空ダン
ケータ中、４０℃でｂ　ｐｔｏｓ　上で乾燥の後にプロ
ミド１不含のＣｈｏ−Ｄ−Ｌｅｕ　（）Ｉ　ｙ−ｋｒｇ
−９Ｎ入・Ａｌ１−ａ１６．６２Ｆ（理論量の６．６２
７　）が得られた。他の有機叡例えばギば、ゾロピオン
ぼ、修藏、酒石酸、クエンば、乳ば、安息香改、クロル
安息香瞭、サリチル敗又はフタル酸との塩も同じ方法で
前記トリペプチド誘導体から製造することができる。イ
オン父挨体は例えば［［塩の形のアンバーライトＪＲ＾
−４０１でろってよく、所望のは塩の形は、前記イオン
又換体を苛性ソーダ溶酸で処理し１次いで、６０％Ｍｅ
ＯＨ水中の所望の有慎ハとそのナトＩＪウム４との１：
１−１屁金製の溶液で処理することにより墳墓性ＯＨ型
に変えることができる。
例　　７ ２ＨＢｒ−Ｈ−Ｄ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
　（ｆＩｌ　７１　ｉＣ記載の方法で製造、ａ！３表参
照）６．２６ｉＦ（１０℃八（）を蒸溜したＤ　Ｍ　Ｐ
　３０８ｇ中に溶かした。溶敵七−１５℃に冷却し、湿
気の不存在下に攪拌しながらまずＥｔ、Ｎ２８０ｍｇ（
２０ｍＭ）かつその後直ちに塩化トノル１，９１ｆ（１
ｏｍＭ　）を添加した。−１５℃での約２〜３時間の灰
石時間の後に１反応屁合ｖＪを、室温で更に１夜反厄さ
せた６反応混合物を再び−１５℃に冷却した。
ＢＩＪＮ−ＨＢｒ　とＥｌ、　Ｎ−ＨｏＪとの沈ＭＵ合
物ｔＦ去し、少量の冷ＤＭＦで洗浄し九、ＦＭ及び洗浄
液を集め、真空中５０℃で濃縮乾燥させた。残分を５０
％Ａｃ０Ｈ７５ｄ中に溶かし次、溶液を５０％＾ｃＯＨ
で平衡にし次セファデックス０−ＸＳのカラムで精製さ
せた。トリプ／ンでの処理によりｐ−ニトロアニリンの
形成下に分解したＡｃＯＨ溶埴液の王７ラクンヨンを真
空中。
４０℃で濃編乾ｊｖＡさせた。残分ｉＭｅＯＨ１００ｘ
ｄ中に溶かし、溶液を再び濃ＱｒｌＬ燥させた。残分を
冥仝デンケーク中、６０℃でＰ！０５　上で乾燥させる
と、急足形化合＠　Ｔｏｓ　−Ｄ−Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌ　
ｙ　−＆ｒ　ｇ−ｐＮＡ・ＨＢｒ　６．６５　ｙ　（理
論量の９５．０％）が倚られ、これはＴＬＯで示される
ようにＳＳ中で均質であった。元累分析及び実験式０２
１Ｈ３ｓＮ感Ｓ　Ｏｙ　Ｂ　ｒからの！ｔＴ真により１
次の値が侍られた二〇　二４６．８５　Ｘ　（４６，３
５９６）　ｂ　Ｈ＝５．６６シ、；　（５゜６２％）、
Ｎ＝１６．２８％（１６，０２％）、Ｓ＝４．４３　Ｎ
　（４，５８Ｘ　）及びＢｒ　＝１１．２２％（１１，
４２％）０ｇチ＝０．６＋ アンん化剤としての塩化トノｂを用いる代りに、相応す
る量の塩化アセチル、順化ブチリル、塩化オクタノイル
、安息香酸クロリド、ｐ−メチル安、シ、香殴クロリド
、２−クロル安息香酸クロリド、メタンスルホニルクロ
リド、ｎ−１タンスルホニルクロリド、ベンゼンスルホ
ニルクロリド、α−ナフタリンスルホニルクロリド、ク
ロルギ飲ジチル、クロルギ叡イソブチル、クロルギ酸オ
クチル、無水安息香酸、蒸水酢酸、７エ二ｈｒｎ１１ｉ
！−０ｐＮＰ、７ｘ二ｈプロピ＃　ンＰａ　−０ｐＮＰ
　、　シ／　。
ヘキ／ルヵｈ、ｆン＃−０ｐＮＰ、Ｎ−Ｃｈｏ−４−７
ｉ／１テんンクロヘキ／ルヵルゼン版−〇ｐＮＰ　、　
Ｎ　−Ｃｂｏ　　−ω−了ミノーｎ　−１ｌＩＪ−Ｏｐ
ＮＰ、Ｎ−ｃｈｎ−ω−アミノオクタノイック改−０ｐ
Ｎｐ　又はＮ　−Ｏｈｏ　−４−７ミノメテル安息香酸
−０ｐＮＰ　　も便用できる。
本発明のトリペプチド誘導体の第Ｘａ　因子に対する感
受性を次の第４表で数値的に説明し、公知又献の基ｊｉ
　Ｂｚ　−１１ｅ−Ｇｌｕ　（ｒ　−ＯＨ）　−５１ｙ
−Ｌｒｇ−ｐＮ入・ＨＯＡ　　と比較。
し九二 第４表 ランの第Ｘａ因子及び工業のヒト血清ｌｄ中の第Ｘ因子
＆ｊｉ−几■ｖを用いて活性化することにより得られた
第Ｘａ因子の水溶液１ｄの活性ｔ−１分当９に形成さ例
による基質 ８　　　　　　２７８０　　　　　　１５６ｇ２　　　
　　　　　’　　　　　　　　−ｗ明細書の浄書（内容
に変更なし） 第４表（続き） ２＋　　　　１２０５　　　　４９５ ２５　　．１０２５　　　　４３５ ３１　　　１５６０　　　　　Ｇ１７ 明ｍ書の浄書（内容に変更ない ４０　　　　　　　３０　　　　　　’　　２０＋３　
　　　　　２５０　　　　　　１１２明細書の浄書（内
容に変更なし） 第４表（続き） ８５　　　　３３０　　　　１４．６ 比較基質“　　　　　　　４９０　　　　　　８２０本
Ｂｚ−１１ｅ−Ｇｌｕ（ｒ−ＯＨ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
ｐＮＡ、ＨｃＩ−−Ｑ！ｊｌ’（で吹許世碍公工Ｉに２
５５２５７０ｉ）　　−−−第４表に記載の第Ｘａ因子
活性の値は、次に記載の方法で実験的に測定した： ウシ第Ｘａ因子の活性ご測定するために、ｐＨ８４及び
イオン濃度０．３　ｔ−有するＴＲｌ５−イミダジール
ミＳ液１．８ｄｔ”３７℃で、水０．５ａｄ中のパイフ
ルの内、ゲ 容物の溶解により得た第Ｘａ因子製剤ダイアＶへ〜（供
飴者：　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ＲｅａｇｅｎＩｓ　Ｌ
ｔｄ、　Ｔｈａｍｅ　英ｒ！Ａ）の水溶液０．０２５ａ
／と充分に混合した。この庇金物に、本発明の２ｘｌＯ
−’Ｍ水溶液０．２ｄｔ−添加した。その後、１分当り
の分解生成物の量（ナノモル）を測定し、纂Ｘａ　因子
１−に対する相応する値を計算した。
ヒト第Ｘ２因子の活性測定のために、王宮のクエン酸処
理した血漿０．０１　ｄ’ｋｐＨ８，４及びイオン濃度
０３を有し％　ｌｄ当りＯａＯ＾１５ミリモルを含有す
るＴＲＩＢ−イミグゾール復衝液中のラッセルまむＬｍ
の溶液０．２０　ｄと混合した。混合ｖＩＪを、血漿中
に存在する第Ｘ因子を活性化し、これを完全に第）（ａ
　因子に変えるために、３７℃で７５秒間インキュベー
トした。
このインキュベート物に、まず、３７℃に刀Ｉｌｌ熟し
たＴＲｌ５−１ミ／ゾール緩衝Ｕ（１）Ｈ８，４，イオ
７ｆａＫ０．３）を１次いで本発明の基質の２Ｘ１０−
”Ｍ水溶液０．４０ｄｉ７７０えた。その後１分当りの
形成された分解°　− 生成ｖＨ−Ｂｓ　　の蓋（ナノモル）を測足し、クエン
酸処理した血漿ｌｄに対する相応する値を１無した。
手続補正書Ｃ発） 、昭和６１年１０月３１日

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、第Ｘａ−因子を含有する媒体中又は第Ｘａ−因子が
    形成されるか又は消費される媒体中の第Ｘａ−因子を定
    量分析するために、前記媒体を式： ▲数式、化学式、表等があります▼　 I 〔式中Ｒ＾１は炭素原子数２〜８を有し、ω−位にアミ
    ノ基を有していてよいアルカノイル基、アルカノイル中
    に炭素原子数２〜４を有し、そのフェニル基はｐ−位で
    アミノ基で置換されていてよいフェニルアルカノイル基
    、４−位でアミノメチル基で置換されていてよいシクロ
    ヘキシルカルボニル基、ｏ−又はｐ−位でメチル、アミ
    ノ又はハロゲンで置換されていてよいベンゾイル基、ア
    ルコキシ基中の炭素原子数１〜８を有するアルコキシカ
    ルボニル基、ｐ−位でメトキシ、メチル又は塩素で置換
    されていてよいベンジルオキシカルボニル基、炭素原子
    数１〜４のアルカンスルホニル基、ｐ−位でメチル化さ
    れていてよいフェニルスルホニル基又はα−又はβ−ナ
    フチルスルホニル基を表わし、 Ｒ＾２は炭素原子数１〜６を有する直鎖又は分枝鎖のア
    ルキル基、炭素原子数１〜２のヒドロキシアルキル基、
    アルキル中の炭素原子数１〜２及びアルコキシ中の炭素
    原子数１〜４を有するアルコキシアルキル基、アルキル
    中の炭素原子数１〜２を有するベンジルオキシアルキル
    基、アルキル中の炭素原子数１〜３を有し、そのアルコ
    キシ基は直鎖又は分枝鎖で炭素原子数１〜４を有するω
    −カルボキシアルキル又はω−アルコキシカルボニルア
    ルキル基及びアルキル中に炭素原子数１〜３を有するω
    −ベンジルオキシカルボニルアルキル基又はシクロヘキ
    シル−、シクロヘキシルメチル−、４−ヒドロキシシク
    ロヘキシルメチル−、フェニル−、ベンジル−、４−ヒ
    ドロキシベンジル−又はイミダゾール−４−イル−メチ
    ル基を表わし、 Ｒ＾３は水素又は炭素原子数１〜４を有する直鎖又は分
    枝鎖のアルキル基を表わし、 Ｒ＾４は水素又はメチル又はエチル基を表わし、 Ｒ＾５はｐ−ニトロフェニルアミノ、１−カルボキシ−
    ２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、１−スルホ−２
    −ニトロフエン−５−イル−アミノ、β−ナフチルアミ
    ノ、４−メトキシ−β−ナフチルアミノ、５−ニトロ−
    α−ナフチル−アミノ、キノン−５−イル−アミノ、８
    −ニトロ−キノン−５−イル−アミノ、４−メチル−ク
    マル−７−イル−アミノ又は１、３−ジ（メトキシカル
    ボニル）−フエン−５−イル−アミノ基（５−アミノイ
    ソフタル酸ジメチルエステルから誘導）を表わす〕のト
    リペプチド誘導体（但し、Ｒ＾１　がベンジルオキシカ
    ルボニルで、Ｒ＾２がイソプロピル又はシクロヘキシル
    であるトリペプチド誘導体を除く）又は酸とのその塩と
    反応させ、分光法、スペクトル分光法、螢光分光法又は
    電子化学的方法で、トリペプチド誘導体上の第Ｘａ−因
    子の接触的加水分解作用による単位時間当りに形成され
    る着色又は螢光性分解生成物Ｈ−Ｒ＾５の量を測定する
    ことを特徴とする、媒体中の第Ｘａ−因子を定量分析す
    る方法。 ２、Ｒ＾５がｐ−ニトロフェニルアミノ、１−カルボキ
    シ−２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、１−スルホ
    −２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、５−ニトロ−
    α−ナフチル−アミノ又は８−ニトロキノン−５−イル
    −アミノ基である場合に、分解生成物Ｈ−Ｒ＾５を、測
    定の前に、ジアゾ化合物とのカップリングにより、より
    強く着色された化合物に変える事実を特徴とする、特許
    請求の範囲第１項記載の方法。 ３、ヒト又は温血動物の血漿を、血漿中に存在する不活
    性第Ｘ因子を定量的に活性第Ｘａ−因子に変えるために
    、ラツセルまむし毒（ＲＶＶ）又はトロンボプラスチン
    試薬で処理し、この活性化された血漿を緩衝液中の前記
    トリペプチド誘導体と反応させ、トリペプチド誘導体か
    ら、第Ｘａ−因子の作用により形成された単位時間当り
    の分解生成物Ｈ−Ｒ＾５の量を測定することを特徴とす
    る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、Ｒ＾５がｐ−ニトロフェニルアミノ、１−カルボキ
    シ−２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、１−スルホ
    −２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、５−ニトロ−
    α−ナフチル−アミノ又は８−ニトロキノン−５−イル
    −アミノ基である場合に、分解生成物Ｈ−Ｒ＾５を、測
    定の前に、ジアゾ化合物とのカップリングにより、より
    強く着色された化合物に変える事実を特徴とする、特許
    請求の範囲第３項記載の方法。 ５、ヘパリン処理した血漿水のヘパリンを第Ｘａ−因子
    を経て定量分析するために、予備測定した第Ｘａ−因子
    の量を緩衝液系中で血漿と共にインキュベートし、中和
    されていない第Ｘａ因子を式： ▲数式、化学式、表等があります▼　 I 〔式中Ｒ＾１は炭素原子数２〜８を有し、ω−位にアミ
    ノ基を有していてよいアルカノイル基、アルカノイル中
    に炭素原子数２〜４を有し、そのフェニル基はｐ−位で
    アミノ基で置換されていてよいフエニルアルカノイル基
    、４−位でアミノメチル基で置換されていてよいシクロ
    ヘキシルカルボニル基、ｏ−又はｐ−位でメチル、アミ
    ノ又はハロゲンで置換されていてよいベンゾイル基、ア
    ルコキシ基中の炭素原子数１〜８を有するアルコキシカ
    ルボニル基、ｐ−位でメトキシ、メチル又は塩素で置換
    されていてよいベンゾイルオキシカルボニル基、炭素原
    子数１〜４のアルカンスルホニル基、ｐ−位でメチル化
    されていてよいフェニルスルホニル基又はα−又はβ−
    ナフチルスルホニル基を表わし、 Ｒ＾２は炭素原子数１〜６を有する直鎖又は分枝鎖のア
    ルキル基、炭素原子数１〜２のヒドロキシアルキル基、
    アルキル中の炭素原子数１〜２及びアルコキシ中の炭素
    原子数１〜４を有するアルコキシアルキル基、アルキル
    中の炭素原子数１〜２を有するベンジルオキシアルキル
    基、アルキル中の炭素原子数１〜３を有し、そのアルコ
    キシ基は直鎖又は分枝鎖で炭素原子数１〜４を有するω
    −カルボキシアルキル又はω−アルコキシカルボニルア
    ルキル基及びアルキル中に炭素原子数１〜３を有するω
    −ベンジルオキシカルボニルアルキル基又はシクロヘキ
    シル−、シクロヘキシルメチル−、４−ヒドロキシシク
    ロヘキシルメチル−、フェニル−、ベンジル−、４−ヒ
    ドロキシベンジル−又はイミダゾール−４−イル−メチ
    ル基を表わし、 Ｒ＾３は水素又は炭素原子数１〜４を有する直鎖又は分
    枝鎖のアルキル基を表わし、 Ｒ＾４は水素又はメチル又はエチル基を表わし、 Ｒ＾５はｐ−ニトロフェニルアミノ、１−カルボキシ−
    ２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、１−スルホ−２
    −ニトロフエン−５−イル−アミノ、β−ナフチルアミ
    ノ、４−メトキシ−β−ナフチルアミノ、５−ニトロ−
    α−ナフチル−アミノ、キノン−５−イル−アミノ、８
    −ニトロ−キノン−５−イル−アミノ、４−メチル−ク
    マル−７−イル−アミノ又は１、３−ジ（メトキシカル
    ボニル）−フエン−５−イル−アミノ基（５−アミノイ
    ソフタル酸ジメチルエステルから誘導）を表わす〕のト
    リペプチド誘導体（但し、Ｒ＾１がベンジルオキシカル
    ボニルで、Ｒ＾２がイソプロピル又はシクロヘキシルで
    あるトリペプチド誘導体を除く）又は酸とのその塩と反
    応させて中和されていない第Ｘａ−因子の量を測定し、
    最初に使用した第Ｘａ−因子の量と残留第Ｘａ−因子の
    量との間の差からヘパリン濃度を測定することを特徴と
    するヘパリン含有血漿中のヘパリンの定量分析法。 ６、Ｒ＾５がｐ−ニトロフェニルアミノ、１−カルボキ
    シ−２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、１−スルホ
    −２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、５−ニトロ−
    α−ナフチル−アミノ又は８−ニトロキノン−５−イル
    −アミノ基である場合に、分解生成物Ｈ−Ｒ＾５を、測
    定の前に、ジアゾ化合物とのカップリングにより、より
    強く着色された化合物に変える事実を特徴とする、特許
    請求の範囲第５項に記載の方法。 ７、ヒト血漿中の第Ｘａ−抗因子を第Ｘａ−因子を経て
    定量分析するために、一方で、クエン酸処理した血漿を
    緩衝液溶液で稀釈することにより被検試料を調製し、ヘ
    パリン及び次いで第Ｘａ−因子をこの稀溶液に添加し、
    混合物に、式： ▲数式、化学式、表等があります▼　 I 〔式中Ｒ＾１は炭素原子数２〜８を有し、ω−位にアミ
    ノ基を有していてよいアルカノイル基、アルカノイル中
    に炭素原子数２〜４を有し、そのフェニル基はｐ−位で
    アミノ基で置換されていてよいフエニルアルカノイル基
    、４−位でアミノメチル基で置換されていてよいシクロ
    ヘキシルカルボニル基、ｏ−又はｐ−位でメチル、アミ
    ノ又はハロゲンで置換されていてよいベンゾイル基、ア
    ルコキシ基中の炭素原子数１〜８を有するアルコキシカ
    ルボニル基、ｐ−位でメトキシ、メチル又は塩素で置換
    されていてよいベンジルオキシカルボニル基、炭素原子
    数１〜４のアルカンスルホニル基、ｐ−位でメチル化さ
    れていてよいフェニルスルホニル基又はα−又はβ−ナ
    フチルスルホニル基を表わし、 Ｒ＾２は炭素原子数１〜６を有する直鎖又は分枝鎖のア
    ルキル基、炭素原子数１〜２のヒドロキシアルキル基、
    アルキル中の炭素原子数１〜２及びアルコキシ中の炭素
    原子数１〜４を有するアルコキシアルキル基、アルキル
    中の炭素原子数１〜２を有するベンジルオキシアルキル
    基、アルキル中の炭素原子数１〜３を有し、そのアルコ
    キシ基は直鎖又は分枝鎖で炭素原子数１〜４を有するω
    −カルボキシアルキル又はω−アルコキシカルボニルア
    ルキル基及びアルキル中に炭素原子数１〜３を有するω
    −ベンジルオキシカルボニルアルキル基又はシクロヘキ
    シル−、シクロヘキシルメチル−、４−ヒドロキシシク
    ロヘキシルメチル−、フエニル−、ベンジル−、４−ヒ
    ドロキシベンジル−又はイミダゾール−４−イル−メチ
    ル基を表わし、 Ｒ＾３は水素又は炭素原子数１〜４を有する直鎖又は分
    枝鎖のアルキル基を表わし、 Ｒ＾４は水素又はメチル又はエチル基を表わし、 Ｒ＾５はｐ−ニトロフェニルアミノ、１−カルボキシ−
    ２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、１−スルホ−２
    −ニトロフエン−５−イル−アミノ、β−ナフチルアミ
    ノ、４−メトキシ−β−ナフチルアミノ、５−ニトロ−
    α−ナフチル−アミノ、キノン−５−イル−アミノ、８
    −ニトロ−キノン−５−イル−アミノ、４−メチル−ク
    マル−７−イル−アミノ又は１、３−ジ（メトキシカル
    、ニル）−フエン−５−イル−アミノ基（５−アミノイ
    ソフタル酸ジメチルエステルから誘導）を表わす〕のト
    リペプチド誘導体（但し、Ｒ＾１がベンジルオキシカル
    ボニルで、Ｒ＾２がイソプロピル又はシクロヘキシルで
    あるトリペプチド誘導体を除く）又は酸とのその塩を添
    加し、他方で、同様な方法であるが、稀釈血漿の代りに
    同量の緩衝液を用い、分解生成物Ｈ−Ｒ＾５の形成によ
    り生ぜしめられた１分当りの光学密度の増加を測定し、
    第Ｘａ−抗因子−ヘパリン錯体により抑制された第Ｘａ
    −因子の量を、かつこれから、血漿中に存在する第Ｘａ
    −抗因子の量を、１分当りの盲検試料の光学密度の増加
    と、１分当りの被検試料の光学密度の増加との間の差か
    ら測定することを特徴とする、ヒト血漿中の第Ｘａ−抗
    因子の定量分析法。 ８、Ｒ＾５がｐ−ニトロフェニルアミノ、１−カルボキ
    シ−２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、１−スルホ
    −２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、５−ニトロ−
    α−ナフチル−アミノ又は８−ニトロキノン−５−イル
    −アミノ基である場合に、分解生成物Ｈ−Ｒ＾５を、測
    定の前に、ジアゾ化合物とのカップリングにより、より
    強く着色された化合物に変える事実を特徴とする、特許
    請求の範囲第６項記載の方法。
JP60299814A 1980-02-12 1985-12-28 媒体中の第Ｘａ−因子、ヘパリン又は第Ｘａ−抗因子を定量分析する方法 Granted JPS63300A (ja)

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