JPS6054682A - キトビアーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明Ｕｌｒ規なキトビアーゼ及びその製造法に関する
。

本発明者らは天然の土壌より数多くの微生物を単離し、
その生産物について種々研究を行った結果、今回本発明
者によって分離さ九た細菌がキチン分解酵素全多量に産
生ずることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明＃′ｉ新規なキトピアーゼ及びその製
造法を提供するものである。

本発明のキトヒアーゼを産生ずる細菌は次のような菌学
的性質を肩する。

（１）形態 直状、球形末端を有する桿形、太き嘔１．０〜２．４μ
ｍ、運動性あり、極単毛性で鞭毛を有する、グラム陰性 （２）　生育状態 ■　０．２％コロイドキチン、ｏ、１％ペフトン、０．
１％肉汁エキス、０．３％塩化ナトリウム及び２．０％
寒天含有（ｐＨ７，０）キチン−寒天平板培地中、３０
’Ｃで７２時間インキュベーションすると、明確なコロ
ニーを形歳する。

■　肉汁液体培地中、３７℃で生育する。

■　７．５％塩化す）　ＩＪウム含有肉汁液体培地中で
生育しない。

■　単一窒素源としてアンモニア、単一炭素源としてグ
ルコース、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−ヒ
スチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−セリン又はＬ−アラ
ニンを含有する無機培地中で生育する。

■　トリブチケースダイズ寒天培地上で褐色の水溶性色
累を生成しない。

■　アルキニン、アスパラギン、ロイシン及ヒメチオニ
ンを含有する混合培地中で生育する。

（３）　生理学的性質 ■　硝酸塩の還元：陽性 ■　ｖ−ｐテスト：陰性 ■　インドールの生成：陽性（０６１％トリプト７７ン
含有トリプトンプロス中） ■　硫化水素の生成二陽性（２，５％ペプトン水中） ■　デンプンの加水分解：陽性 ■　ウレアーゼ：陰性 ■　オキシダーゼ二ｗ＃性 ■　カタラーゼ：陽性 ■　チトクローム　オキシダーゼ：陽性Ｏ生育の温度範
囲＝１３〜４２℃で生育し、２７〜３０℃において最も
よく生育 ０生育のｐＨ範囲＝５．５〜９．０ ＠酸素に対すゐ態度二進性嫌気性 ＠糖類に対する資化性、酸およびガスの生成（資化性、
酸およびガスの生成があるもの、ないものを、それぞれ
＋、−で示す）二以下余白 （４）その他の性質 ■　グルコン酸の酸化：陰性（グルコン酸オキシダーゼ
試験） ■　リジンの脱炭酸反応：陰性〔モラー（Ｍｏｌｌａｒ
）法〕 ■　塩化ナトリウムの耐性：陽性（１，ｏ％ＮａＣｔ含
有ブロスにおいて生育最大） ■　シアン化カリウムの耐性：陽性（モラー法）■　フ
ォスファターゼ：陽性 ■　カゼインの加水分解：　１１Ｍ性 ■　上２チン溶解性＝＠性 ■　デオキシリボヌクレアーゼ：陽性 ■　リボヌクレアーゼ：陽性 Ｏアルギニン脱水素酵素：　＠性 ０グルタミン酸の脱炭酸反応：陰性 Ｏビブリオスタディツク試薬、２１４−ジアミノ−６，
７−ジイツプロプル・プテリジン（０／１２９　）に対
する反応性：陰性Ｑ２，３−ブタンジオールからアセト
インが生産てれるが、グルコースからは生産嘔れない。

プキャナン（Ｂｕｃｈａｎａｎ　、　Ｐ、）等（１９７
４年）、コワン（Ｃｏｗａｎ　、　Ｓ、Ｔ、　）　（１
９７４年）、及びゲ）Ｉｉ　ハルト（Ｇ＠ｒｈａｒｄｔ
　、　Ｐ、）等（１９８１年）の系統的方法により調べ
られた上記性状と本発明に係るキチン溶解性に基づき、
本細菌の種属を検索すると、キチン分解性を有する生物
としては、コワン（１９７４年）のとブリオ（ベネツケ
ア）・パラへモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ　（Ｂｅｎ＠
ｃｋ＠ａ　）　ｐａｒａｈ＠ｍｏｌｙｔｌｅｕｓ　〕及
びバウマン（Ｂａｕｍａｎ　ｅ　Ｐ、Ｌ、　）等のとプ
リオ（クロモバクテリウム）・アルキノリティカス［Ｖ
、　（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔ＠ｒｉｕｍ　）　ａｌｇｉ
ｎｏｌｙｔ−１ｅｕｓ　’］が認められる〔ブキャナン
等（１９７４）によれば、この２種の生物はビブリオ・
パラへモリティカスに分類されている〕。キチン溶解性
の細菌は既に報告があり、それらはセラティア（５ｅｒ
ｒ亀ｔｉｔ　）属〔モラリアル（Ｍｏｎｒｅａｌ　、　
Ｊ、ｅ）等（１９６９年）、レイド（ｎ５ｔｄ＊　Ｊ、
Ｄ　）等（１９８１年）〕、ビブリオ属〔内円等（１９
７９年）〕、ベネツケア楓〔高校等（１９８２年）〕及
びストレプトミセス属〔レイノルズ（Ｒ＠７ｎ（ｌｌｄ
ｍ、Ｄ、Ｍ、　）（１９５４年）〕であると記載されて
いる〔ブキャナン等（１９７４年）に依ればベネッケア
はビブリオ属に属すると考えられている〕。これらを参
考にすると、本細菌はビブリオナセ工科に属するものと
考えられる。因みに、本細菌はペプトンから硫化水素を
生成する能力があし、またビブリオスタティック（Ｖｉ
ｂｒｌｏａｔａｔｉｅ　）試薬０／１２９に感作しない
点でビブリオ属とは全く相違する。

斜上の証拠より、本細菌は菌株アエロモナス・ヒドロフ
イラ・亜アネロゲネス　人ＴＣＣ１５４６７（ＩＰｏ　
１３２８２　）に類似する。なぜなら、本細菌はｖ−ｐ
反応、グルフン酸オキシダーゼ試験が陰性であり、グリ
セリン及びグルコースからガスを生成しない〔ブキャナ
ン等（１９７４年〕〕。然し、本細菌が強いキチン溶解
活性を有するのに対し、上記菌株はキチン溶解性を全く
示さない点で全く相違する。そこで本発明者は、本細菌
を公知の菌株と区別するために、アエロモナス・ヒトロ
フィラ・亜アネロゲネス　Ａ３２（人ｅｒｏｍｏｎａｍ
ｈｙｄｒｏｐｈｌ　ｌａ　ｓｕｂす、ａｎａａｒｏｇｅ
ｔｌｅｓ表５２；以下において細菌５２と略称すること
がある）と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所に
受託番号微工研菌寄第７２０６号（ＦＥＢＭＰ−７２０
６）として寄託した。

本細菌は次の如くして分離、純化される。

分離Ｈ１０，２％コロイドキチン、０．１％ペプトン、
０．１％肉汁エキス、０．３％塩化ナトリウム及び２．
０％寒天含有キチン−寒天平板培地（、Ｈ７，０）上で
、試料の懸濁液を１白金耳童画線する（画線平板法）こ
とにより行った。

３０℃で７２時間インキュベーション後、コロニーを採
取し、上記と同組成の斜面キチン−寒天培地に保存する
。コロニーの周囲にはコロイドキチンが溶解している明
確な領域が形成てれる。分離したコロニーからの当該細
菌の純化はキチン−寒天培地及び普通プロス−寒天培地
上で交互に６回平板培養することにより行う。最後に４
７個の分離物のうち、キチン−寒天培地上で生育が早く
、大きく明確なコロニーを形成するものを細菌Ａ５２と
して適訳した。

斯くして得られた細菌は、１．０％肉汁エキス、１．０
％ペプトン、０，５％塩化ナトリウム、２．０％寒天含
有普通ブロスー傾斜培地（ＩＮ−ＮａＯＨでｐＨ７，Ｏ
Ｋ調整）中、２８℃で３日間培養した後室温で保存し、
１箇月ごとに新しい培地に植え継ぎ保存する。

本発明のキトビアーゼは、上記細菌を栄養源培地に接種
し培養せしめることにより製造てれる。培養に用いられ
る培地としては、酵素防導基質であるキチンと当該菌が
利用する栄養源を含むものであれは何れでもよいが、例
えば１．０％エビ殻キチン、０．２％ブドウ糖、０．５
％ペプトン、１．０％酵母エキス、０．７ｆ／ｌリン酸
二水素カリウム、０．３％塩化ナトリウムを含有（Ｉ　
Ｎ　−ＮＩＬＯＨでｐＨ７，０に調整）するものが挙け
られる。

培養法としては、振盪培養が好適である。

培養に適当な温度に２５〜３０℃であるが多くの場合２
８℃付近で培養する。２〜３日間培養後、培養液は次の
操作に付でれる。

キトビアーゼの単離は、後記実施例に示す如く、キトビ
アーゼの理化学的性状を考慮して種々の方法を適当に組
合せることによって行う。

すなわち、キトビアーゼは通常、培養Ｆ液中に存在する
ので、遠心分離又は濾過等の手段によって培養物から細
菌を分離した後、培養Ｆ液に傭酸アンモニウムを添加し
て塩析を行う。次いで塩析により析出したタンパクの沈
澱を０．１Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶か
し、これを遠心分離してその上澄液を粗酵素液とする。

粗酵素液はキトピアーゼ及びキチナーゼを含有する。

粗酵素液からキトビアーゼの単離ハ、キトビアーゼ及び
キチナーゼのコロイドキチンへのｗＪｔ、陽性の相違を
利用して行う。すなわち、粗酵素液及びコロイドキチン
をトリス−塩酸緩衝液と混ぜ、キチナーゼをコロイドキ
チンに吸着させた後遠心分離し上清を得、これをキトビ
アーゼ画分とする。なお、キチナーゼは遠心分離により
得られた沈澱から得られる。

キトビアーゼ画分から、キトビアーゼの分離ｔＭ製は、
ＣＭ−セルロース　り四マドグラフィー及びＤＥＡＥ−
セファデックス人−５０によるカラムクロマトグラフィ
ーを利用して行なわれる。

以上の如くして得られたキトビアーゼは次のような理化
学的性質を有する。

■　作用：キチナーゼと共に作用してキチンを分解する
。

■　至適ｐ’Ｈ：　ｐＨ７，０ Ｃ１，ｌ　Ｋｍ”：　ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニド０．１７　ｍＭ ■　ｐＨ安定性二３７℃で３０分処理した場合、ｐＨ６
，０〜ｐＨ９，０において９０％以上の残存活性を示す
。

■　至適温度：ｐＨ７，０において、ｐ−ニトロフェニ
ル−Ｎ−アセチルグルコサミニドを基質とした場合５０
℃付近にある。

■　温度安定性：ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニド基質でｐＨ７，０において、０〜４０℃、
３０分処理で８０％以上の残存活性を示す。

■　等電点　、ｐＨ６，８付近 ■　分子量　：１１５，０００ ＊　（Ｋｍ値の測定） ５、　ＯｍＭ　ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチルグル
コサミニド０，２−１５０　ｍＭ　）リス−マレイン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）　０．７ｍｇ、及び酵素液０．１
−からなる反応液を３７℃で１０分間インキュベートす
る。次いで、この反応液に０．２５Ｍ炭酸ナトリウム溶
液２，０−を加え反応を停止し、同時にｐ−ニトロフェ
ノールの発色を起こさせた。生成しｆｃＮ−アセチルグ
ルコサミンはｐ−ニトロフェシールド等モルであるから
、４０５ｎｍの吸光度を測り、ｐ−二トロフェノールの
検量線からその量をめた。キトビアーゼ活性は、ｐ−ニ
トロフェニル−Ｎ−アセチルグルコサミニドから１分間
に１μｍｏｌのＮ−アセチルグルコサミンを生成する酵
素′Ｉｋを１単位とした。結果はラインライ−バー−バ
ーク（Ｌｉｎｅｖｅａｖｅｒ　−Ｂｕｒｋ　）プロット
からＫｍ値をめた。なお、酵素液は精製キトビアーゼ標
品を用い、１反応液中の酵素量は０．０５４υで行った
。

林〔等電点電気泳動〕 ポリアクリルアミドゲルディスク等電点電気泳動はディ
ビス、ビー、ジェー、　Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ。

Ａｅａｄ、Ｓｃ１．．１２１＝４０４（１，９６４）に
基き、７．５％ゲル、トリス−グリシン緩衝液（ｐＨ８
，４）中で行った。チューブ一本あた抄２〜４　ｍＡの
電流を流し、５℃で泳動した。

神＊〔分子量〕 ５Ｄ８−ポリブクリルアミドゲル電気泳動法による。

斯くして得られる本発明のキトビアーゼは細胞壁溶解酵
素としてプロトプラストの形成等に利用できるものであ
る。

次に実施例及び参考例を挙けて説明する。

参考例１ （１）　エビ殻キチンの調製 冷凍エビ殻を解凍し、ｌＯ分間ワーリングプレンダー処
理を行ない、水道水で３回以上水洗する。得られたエビ
殻フレークヲ、ＩＮ水酸化ナトリウムに１晩浸漬して除
タンパクを行ない、水道水で３回以上水洗する。次いで
得られた除タンパクエビ殻フレークをＩＮ塩酸に１晩浸
漬してカルシウム分を除く。以上の操作により得られた
精製エビ殻フレークを水道水で水洗後、ＩＮ水酸化ナト
リウムでｐＨ７，０に調整後、１０分間ワーリングブレ
〉ダー処理し、乾物量を２％に調整して、オートクレー
ブで１２０℃にて２０分間滅菌する。

（２）　コロイドキチンの調製 （１）で得たエビ殻キチンをボールミルで約２４時間粉
砕しボールミルキチンとした。このボールミルキチンを
以下の操作に付しコロイドキチンを得た。

ａ　冷却した乳鉢をアセトンで湿らせ、ボールミルキチ
ンと濃塩酸をよく混合する。

ｂ　大量の冷水中によく攪拌しながら滴下分散８せる。

ｅ　１８０００ｇで１０分間遠心分離することにより水
洗する。

ｄ　ワーリングブレンダーで１０分間処理する。

６　１８００（ｌで１０分間遠心分離してコロイドキチ
ンを集め、央に０．０２５Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，２）で洗う。

斯くして得ら？たコロイドキチンは、適宜緩衝液に分散
させ使用に供てれる。

実施例１ （１）酵素生産のための培養 水道水１ｔにペプトン１５９％酵母エキス５ｆ、リン酸
二水素カリウム０．６８Ｆを加え、ＩＮ−水酸化ナトリ
ウムでＰＨ７，０に調整した前培養培地を、綿栓試験管
に５−ずつ入れ、常法に従い滅菌する。次いでこれに保
存培地から細菌Ａ５２を一白金耳接種し、２８℃で２４
時間振盪培養を行なう。本培養は、水道水１ｔに、エビ
殻キチン１０ｆ、グルコース２９．ペプトン５ｆ、酵母
エキス１０ｆ、リン酸二水素カリウム０．６８ｆ、塩化
ナトリウム３９を加え、ＩＮ−水酸化ナトリウムでｐＨ
７，０に調整した本培養培地を、５０〇−容フラスコに
７０−ずつ分注し、常法に従い滅菌する。次いでこれに
培養終了後の前培養培地１−を接種し、２８℃で７２時
間振盪培養（２４Ｏｒｐｍ　）　ｌ、た〇 （２）　粗酵素液の調製 培養終了後、本培養培地から１８０００ｆで２０分間遠
心分離することにより菌体を除いた後、細菌による汚染
を防ぐために最終濃度０．０２％となるようにアジ化ナ
トリウムを加え培養ろ液とした。次いで０℃冷却下、ス
ターラーで静かに攪拌しながら、培養ろ液に８０％飽和
になるように固形硫安を徐々に加え塩析を行った。との
とぎ、培養Ｐ液のｐＨが酸性側に傾かないように、ＩＮ
−水酸化ナトリウムｆ　ｐＨ７，０付近に保持しながら
行った。塩析は０〜４℃に冷却しながら１時間以上行っ
た。塩析により析出したタンパクの沈澱は、１８０００
ｆで２０分間遠心分離して集めた。この沈澱を培養Ｆ液
の１０分の１容の０．１Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
，０）に溶かし、０〜４℃に冷却して１時間静置後、不
溶物を１８００Ｏｆで２０分間遠心分離で除き、上ｆＩ
ｔ’を粗酵素液とし、−２０℃で凍結保存した。

（３）　キチン吸着によるキチナーゼとキトビアーゼの
分離 コロイドキチンに対する両酵素の親和力の違いにより次
の如くして分離した。

粗酵素液７５−（キチナーゼ約８８．．７Ｕ）と、コロ
イドキチン２．５９（乾物重量）を含む２５ｍＭ）リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）３００ｄを混ぜ、時々攪拌
しながら水冷下で１時間、キチナーゼをコロイドキチン
に吸着させた。次いで１８０００ｆで２０分間遠心分離
を行ない、上清をキトビアーゼ画分とした。

（４）　キトビアーゼの精製 実施例１の（３）で得られたキトビナーゼ画分を１　ｍ
Ｍ　ＰＭＳＦの存在下でエバダレ−ター濃縮後、５　ｍ
Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）に対して一晩透
析した標品を、５　Ｑ　ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，２）
で平衡化したＣＭ−セルロースのカラム（２，６Ｘ　４
５ｃｒｎ）でイオン交換した。

なお、溶出は塩化ナトリウム濃度勾配０→０．３Ｍで、
流速は４０−７時とした。次いで、溶出液を限外濾過に
より濃縮・脱塩した後、０、０５　Ｍ塩化ナトリウム含
有２５　ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）で平
衡化させ；７’（ＤＫＡＥ−セファデックス人−５０の
カラムクロマトグラムに付しくカラムサイズ２．６　ｘ
　４ｓ　ｃｍ　）精製キトビアーゼを得た。なお、溶出
は塩化す）　ＩＪウム濃度勾配０．０５→０，２Ｍで、
流速は４４ｄ／時とした。

以上の各操作段階におけるトキピアーゼの精製度及び回
収率を第１表に、ま７’（ＤＥＡＲ−セファデックス人
−５０によるカラムクロマトゲラムを第１図に示す。第
１表より明らかな如く、上記操作により粗酵素液中のキ
トビアーゼは１４４倍に精製された。

第１表

【図面の簡単な説明】

ｓｔ図ａｃＭ−セルロースのカラムによりイオン交換し
て得られたキトビアーゼ溶出液のＤＥＡＥ−セファデッ
クス人−５０によるカラムクロマトグラムを示す図面で
ある。 以上 出願人　矢　吹　稔

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の理化学的性質を有するキトビアーゼ。 ■　作用：キチナーゼと共に作用してキチンを分解する
   。 ■　至適ｐＨ：ｐＨ７，Ｑ ■　Ｋｍ　：　ｐ−二トｐフェニルーＮ−アセチルグル
   コサミニド０．１７鯛 ■　ｐＨ安定性：３７℃で３０分処理した場合、ｐＨ６
   ，０〜ｐｎ９．ｏにおいて９０％以上の残存活性を示す
   。 ■　至適温度：　ｐＨ７，０においてｐ−ニトロフェ二
   Ａ　−Ｎ−アセチルダルコサミニドを基質とし７’（場
   合５０℃付近にある。 ■　温度安Ｗ性：　ｐ−二トロフェニルーＮ−７セチル
   グルコサミニド基質でＰＨ７，Ｏにおいて、０〜４０℃
   、３０分処理で８０％以上の残存活性を示す。 ■　等電点：ｐＨ６，８付近 ■　分子量：１１５，０００ ２、　アエロモナスｉＫ鵬するキトビアーゼ生産菌を培
   地に培養し、その培養物からキトビアーゼを採取するこ
   と’に％徴とするキトビアーゼの製造法。 ３、　キトビアーゼ生産菌がアエロモナス・ヒドロフィ
   ラ・亜ア不ログ不ス人５２である特許請求の範囲第２項
   記載のキトピアーゼの製造法。