JPH0279990A

JPH0279990A - ホスファチジルセリンの製造方法

Info

Publication number: JPH0279990A
Application number: JP22978388A
Authority: JP
Inventors: Tsuneo Yamane; 恒夫山根; Shoichi Shimizu; 清水　祥一; Raji Jiyunejiya Reka; レカ・ラジ・ジュネジャ
Original assignee: Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 1988-09-16
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1990-03-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、新しいホスファチジルセリンの製造方法に関
する。

（従来の技術）リン脂質は細胞の生体膜の成分として存在しており、生
体膜では二分子構造を持った二重層膜を形成し、タンパ
ク賞、コレステロール等とともに物質の透過、選択的輸
送等の生命現象に欠くことのできない機能を果たしてい
る。生体中にはホスファチジルコリン、ホスファチジル
エタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチ
ジルイノシトール、スフィンゴミエリン等のリン脂質が
存在し、各々重要な役割を果たしている。これらのリン
脂質に共通した特徴は、親水基と疎水基をその分子内に
持つことであり、これによりリン脂質に特徴的なリポソ
ームと呼ばれる微小胞を作ることができ、そこに薬剤を
含有させてドラッグデリバリ−システムへの展開がはか
られている。また一方ではそのものの生理活性作用を利
用して、ＰＡＦを代表するような医薬的展開もはかられ
ている。

ホスファチジルセリンは生物界には広く分布するが、量
的にはそれ程多くない、しかしながら細胞外液にホスフ
ァチジルセリンを加えておくと、ヒスタミンの遊離が増
強される等の生理活性作用や遺伝子工学分野での細胞融
合に用いられる等の用途が知られている。

ホスファチジルセリンの製造は、従来、植物や動物の組
織より抽出後、精製分離されるのが一般的であるが、大
腸菌を用いて合成する方法（Ｉｓｈｉｎａｇａら、Ｅｕ
ｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　４２＋　４８３（１
９７４））あるいはキャベツのホスホリパーゼＤによる
合成（Ｙａｎｇら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　
２４２．４７７（１９６７））等の酵素的方法が知られ
ている。また化学的合成方法も知られている（Ｂａｅｒ
ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

ＣｈｅＩｌｌ、　２１２　３９　（１９５５）、Ｄｅｅ
ｎｅｎら、Ｒｅｃ、　Ｔｒａｖ。

Ｃｈｉｍ、　８３．９９　（１９６４）　、Ｔｕｒｎｅ
ｒら、Ｊ、　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ。

工、　６１６　（１９６４）など）。

（発明が解決しようとする課題）前記動植物よりホスファチジルセリンを抽出する方法で
は、すでに述べたようにホスファチジルセリンの量的割
合が少ないこと、およびリン脂質の種類が多いことなど
から、精製分離が非常に困難である。それに加えて、結
合脂肪酸の種類が自由に選べず、多数の脂肪酸種の混じ
り合ったホスファチジルセリンしか得られないという問
題点がある。

また大腸望やキャベツのホスホリパーゼＤを用いて酵素
的にリン脂質の塩基交換や合成を行う方法は優れた方法
であるが、従来知られているこのような酵素は塩基交換
能が低いという問題点かある。

化学合成法は大量に作ることができ、必要な脂肪酸のつ
いたホスファチジルセリンを合成できるという特徴を持
っているが、反応プロセスが非常に長く、しかもセリン
に反応性があるため、保護基の脱着といったプロセスも
加わり、工業的に非常に困難であるという問題がある。

この発明は、以上のような問題点を解決するためのもの
で、特定微生物起源のホスホリパーゼＤにより、ホスフ
ァチジルコリンとセリンを反応させてホスファチジルセ
リンを得るものであり、高収率で塩基交換ができ、かつ
簡単な工程および装置でホスファチジルセリンを製造す
る方法を提供することを目的としている。

（課題を解決するための手段）この発明は、ストレプトマイセス属の微生物を起源とす
るホスホリパーゼＤを用いて、ホスファチジルコリンと
セリンを反応させることを特徴とするホスファチジルセ
リンの製造方法である。

すなわち、ホスファチジルコリンのコリン基をセリン基
と、ストレプトマイセス属微生物起源のホスホリパーゼ
Ｄにより、交換させることを特徴とする。

本発明に用いられるホスファチジルコリンは天然型の混
合脂肪酸型、合成型の１．２位確定脂肪酸型であり、酵
素反応であるため、不飽和度の高い脂肪酸を含むホスフ
ァチジルコリンも容易に用いることができる。

ホスファチジルセリンはホスファチジルコリンの構造に
従ったものを得ることができる。

もう一方の原料であるセリンはＬ体、０体とも用いるこ
とができ、本発明で用いられるストレプトマイセス属微
生物起源のホスホリパーゼＤはホスファチジルセリンの
立体異性体の合成も可能である。ホスホリパーゼＤは従
来よりホウレン草、キャベツ、ニンジン等から抽出され
、研究されてきているが、一般にその活性を発現させる
ためにはＣａ”が必要であるとされている。また、その
反応はエーテル、ケトン、エステル類により促進され、
ドデシル硫酸、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノ
シトールによっても促進される。反対に、陽イオン界面
活性剤、コリン、エタノールアミン等は阻害的に働く。

ホスホリパーゼＤは本発明においては塩基交換反応に用
いられるが、下式のように加水分解活性も持っている。

それ故加水分解作用を少なくし、合成反応側に反応を進
める技゛術も重要である。即ち、反応に用いられるホス
ホリパーゼＤが低加水分解性であることが重要である。

Ｏ− （ホスファチジルセリン）（ホスファチジン酸）本発明で用いられるホスホリパーゼＤは低加水分解性の
特徴を有しており、反応時に用いられる水の量により、
その加水分解性はほとんど影響を受けず、塩基交換反応
が優先的に進行し、特にホスファチジルセリンの合成に
は最適なものであり、放線菌目、特にストレプトマイセ
ス属菌より特異的に生産される。ストレプトマイセス属
菌としては、例えばストレプトマイセス・クロモフォラ
カス、ストレプトマイセス・プルニコーラ、ストレプト
マイセス・キサンスポリア、ストレプトマイセス・クロ
モジエニア、ストレプトマイセス・ハチジョーエンシス
、ストレプトマイセス・ベルティシジュムシナノニウム
等がある。

本発明に用いるホスホリパーゼＤは市販品が利用できる
。

本発明におけるホスファチジルセリン合成反応は具体的
には次のようにして行なう。

すなわち、攪拌装置および温度コントロール装置を有し
た反応装置で酢酸バッファーまたはリン酸バッファー水
溶液（約０．２　Ｍ、　ｐＨは酵素種により異なるがｐ
Ｈ５〜７が適当である）に塩化カルシウム（０，０１〜
０．２　Ｍ）　、ホスホリパーゼＤ（酵素活性力により
その必要量は異なるが、０．１ユニツト以上あれば反応
は可能である。ユニット数は３０℃で１分間に生成する
ホスファチジン酸のマイクロモル数）およびセリン（濃
度が高い方が好ましく、基本的には飽和濃度（約５Ｍ）
がホスファチジルセリン生成の最大速度を与える）を所
定量加え、溶解させる。

次いでホスファチジルコリンを酢酸エチル、エーテルな
どに溶解させて所定量（セリン／ホスファチジルコリン
比が大きい程、基本的には反応性が高い）を加え、２５
〜３５℃に保ち、１〜５時間攪拌して反応させる。反応
生成物はフォルチ法でクロロホルム層に抽出し、シリカ
ゲルカラムでクロロホルム・メタノール系溶出剤によっ
て精製分離する。

以上の工程を行うことにより、高純度のホスファチジル
セリンを所望の脂肪酸種を持って製造することができる
。

（発明の効果）本発明によれば、ホスファチジルコリンとセリンをスト
レプトマイセス属微生物起源のホスホリパーゼＤにより
、加水分解反応をほとんどおこさずに塩基交換反応する
ことができるので、安全で簡単な工程により、高収率で
ホスファチジルセリンを製造することができる。

（実施例）以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１０．２Ｍのリン酸バッファー１０−に塩化カルシウム６
０■およびストレプトマイセス属由来のホスホリパーゼ
Ｄ（ヤクルト製）　１０ｍｇ（０，１ユニツト）および
４．１８のし一セリンを溶解させ３０℃に保った。

次いで、やはり３０℃に保って、２０−の酢酸エチルに
溶解した卵黄リン脂質より精製したホスファチジルコリ
ン６００■を加え、３０℃で撹拌下、ｐＨ７で２時間反
応した。

反応液を分液ロートにとり、２：１のクロロホルムとメ
タノール５００−と水１８０ｄを加え、クロロホルム層
を濃縮し、リン脂！　５３０ｍｇを得た。これを展開剤
：クロロホルム／メタノール／酢酸１５％ＮａＨＳＯｚ
＝４０／１５／６／２を用い、イヤトロスキャンで分析
したところ９５．２％のホスファチジルセリンを含有し
ていた。このホスファチジルセリンをシリカゲルカラム
（クロロホルム／メタノール／水＝　６５／２５／４）
で精製し、４２０ＩＩｗの純粋ホスファチジルセリンを
得た。

実施例２０．２Ｍの酢酸バッファー１０−に塩化カルシウム６０
ｆｆ１ｒおよびストレプトマイセス属由来のホスホリパ
ーゼＤ（東洋醗造製）　２０ｍｇ（０，２ユニツト）お
よび２．０５　ｇのし一セリンを溶解させ３０℃に保っ
た。

次いで、やはり３０℃に保って、２０−の酢酸エチルに
溶解したジパルミトイルホスファチジルコリン６００■
を加え、３０℃で攪拌下、ｐＨ５，６で４時間反応した
。

実施例１と同様に処理し、９３．３％の純度をもつジパ
ルミトイルホスファチジルセリン５１０■を得た。実施
例１と同様に精製し、純ジパルミトイルホスファチジル
セリン４００ｍｒを得た。

実施例３０．２Ｍのリン酸バッファー１０−に塩化カルシウム６
０■およびストレプトマイセス属由来のホスホリパーゼ
Ｄ（ヤクルト製）１０■（０，１ユニツト）および５．
３ｇのＤ−セリンを溶解させ、実施例１と同様に反応さ
せ処理した。その結果、９２．９％の純度をもつホスフ
ァチジルセリン５２０■を得、シリヵゲＪｌ／　＄＃製
後後４３０■純り−セリン型ホスファチジルセリンを得
た。

実施例４０．２Ｍのリン酸バッファー１０−に塩化カルシウム６
０■およびストレプトマイセス属由来のホスホリパーゼ
Ｄ（ヤクルト製）２０■（０，２ユニツト）および４．
１８のし一セリンを溶解させ３０℃に保った。

次いでやはり３０℃に保って、２０ｄの酢酸エチルに溶
解したシリルイルホスファチジルコリン１．２ｇを加え
、３０℃でＮｔ雰囲気下、ｐＨ１で４時間反応させた。

実施例１と同様に処理し、８２．２％の純度をもつシリ
ルイルホスファチジルセリン１．０３ｇを得た。

実施例１と同様に精製し、純シリルイルホスファチジル
セリン７４０■を得た。

実施例５０．２Ｍのリン酸バッファー５０−を用い、実施例１と
同様に反応、精製し、９３．８％のホスファチジルセリ
ンを含有したリン脂質５１０■を得た。実施例１と同様
に精製し、純ホスファチジルセリン４１０■を得た。

比較例１キャベツ約３　ｋｇをジューサーで処理し、遠心分離後
、上滑を５０℃で５分間処置し、その後ｌＯ℃に急冷し
、再遠心分離した。上清に一２０℃に冷却したアセトン
を２倍容量加え、沈澱を析出させた。

沈澱を回収し、凍結乾燥して粗ホスホリパーゼＤとした
。

０．２Ｍの酢酸バッファー１０ｍ１に塩化カルシウム６
０■および上記キャベツ由来の粗ホスホリパーゼＤ５０
■（０，８ユニツト）および４．１ｇのＬ−セリンを溶
解させ、ジパルミトイルホスファチジルコリン１．２ｇ
を実施例２と同様に反応させ処理した。その結果、２２
．３％の純度をもつ粗ジパルミトイルホスファチジルセ
リン４３０■を得た。ホスファチジルセリン以外のリン
脂質は７４．９％のジパルミトイルホスファチジン酸と
２．８％の未反応ホスファチジルコリンであった。

比較例２比較例１で得たキャベツホスホリパーゼＤにより比較例
１と同様にＤ−セリンを反応させたがホスファチジルセ
リンは全く生成しなかった。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ストレプトマイセス属の微生物を起源とするホス
ホリパーゼＤを用いて、ホスファチジルコリンとセリン
を反応させることを特徴とするホスファチジルセリンの
製造方法。