JPH0285298A - ミニ‐プロインシュリン、その製造および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、短縮されていないＢ鎖がアルギニン残基を介
してＡ鎖に結合しているのみの新規の「ミニ−プロイン
シュリン」に関する。ヒトインシュリンは、困難な化学
反応を行うことなくこのミニ−プロインシュリンから調
製される。

短縮されたＣ鎖を有するミニ−プロインシュリンは公知
である。すなわち、Ｒ，Ｗｅｔｚｅｌ　ら（（１９８１
）Ｇｅｎｅ　ＩＧ、６３−７１）は、６個のアミノ酸に
短縮されたＣ１負を有するフ゛ロインシュリンを９己載
している。

欧州特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第０．０５５，９４５号
明細書には、対応するプロインシュリンが開示されてい
る。

ここでは、Ｃ鎖は２個のアミノ酸に短縮されている。

ＥＰ−Ａ第０．１６’３．５２９号明細書には、短縮さ
れたＢ鎖を有するインシュリン前駆体が開示されており
、そのＣ鎮は全く欠損しているかまたは１個のアミノ酸
ここ短縮されている。これら前駆体は、α−スレオニン
エステルを用いるトリプシン触媒トランスペブチデーシ
ョン（ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｔｉｏｎ）によって成
熟ヒトインシュリンに変換される。

一方、本発明は、ヒトＤ　ｅ　ｓ　−（３２−６５）プ
ロインシュリンまたは次式Ｉのミニ−プロインシュリン
に関する。

Ｂ　　（１−３０）　　−Ａｒｇ−Ａ　（１−２１）　
　　（０式中、Ｂ　（１−３０）およびＡ（１−２１）
は、ヒトインシュリンのＢおよびＡ鎖を表す。この化合
物は、欧州特許（ＥＰ−８）第０．１３２，７６９号お
よび第０、ｌ：３２．７７０号明ｍ書に開示された次の
［モノ−ＡＩ・ｇ−インシュリン」と呼はれるヒトイン
シュリンＡ　ｒ　ｇ　８３１−○Ｉ（およびヒトインシ
ュリンの調製のための中間体として使用されるのみなら
ず、これ自体で、あるインシュリン活性を示す。

本発明は、したがって、医薬物、特に糖尿病（ｄｉａｂ
ｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ）の治療のための医薬物、
としての使用のための式Ｉの化合物心こも関し、さらに
、式ｌの化合物を含む医薬物、および薬理学的に許容さ
れる賦形剤および式Ｉの化合物からなる医薬物に関する
。

本発明は、さらに、次式ＩＩのモノ−Ａ　Ｈ・ｇインシ
ュリンおよび酵素的切断によるヒトインシュリンの調製
のための式Ｉの化合物の使用に関する。

式中、Ａ（１−２１）およびＢ（１−３０）は、上記と
同様の意味を有し、−５−Ｓ−架橋はインシュリンにお
けるように配置されている。「ワン・ボッ）　（ｏｎｅ
−ｐｏｔ）反応」において式Ｉの化合物をすぐにインシ
ュリンに転換することは、特に有利である。

本発明は、さらに、式Ｉの化合物の製造法に関し、これ
は宿主キ■胞、好ましくは大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）なとの細菌または酵母、特にサツカロミセス
・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）、においてこの化合物をコードする遺伝
子構造物を発現させること、および、遺伝子構造物が融
合タンパク貿をコードする場合には、この融合タンパク
質からの式Ｉの化合物を遊離させること、からなる。本
発明は、式Ｉの化合物をコートするＤＮＡ配列に加えて
、このＤＮＡを含む遺伝子構造物またはプラスミド、お
よび宿主細胞、特に大腸菌のような細菌または酵母細胞
、特にそのような遺伝子構造物またはプラスミドを含む
サツカロミセス・セレビシェの酵母株、に関する。本発
明は、ざらに、式■の化合物を含む融合タンパク質、好
ましくは式■の化合物が下記の架橋メンバー（ｂｒｉｄ
ｇｉｎｇ　ｍｅｍｂｅｒ）を介して融合タンパク質の「
バラスト部分（ｌ］ａｌｌａｓｔ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ
）　Ｊに結合している融合タンパク質、に関する。

−Ｍｅ　ｔ　−［１ｅ　−Ｇ　ｌ　ｕ　−Ｃ，Ｉ　ｙ−
Ａｒ　ｇ　−なお、本発明の好ましい態様は、次により
詳細に説明される通りである。

諸例を説明するために諸量が用いられる。第１図（およ
びそれに続く第１ａ図およびｌｂ図）は、大腸菌発現ベ
クターＰ　Ｉ　Ｋ　１０およびｐＳＷ３のｔｊ！築を示
す、説明図である。第２図（およびそれを示す、説明図
である。これらベクターはミニ−プロインシュリンをコ
ードする。

ミニ−プロインシュリンは正しい折り畳み（ｆｏｌｄｉ
ｎｇ）を有することから、モノーＡｒｇインシュリンは
トリプシンによる切断の後でほとんど定量的に形成され
ることが見出された。その結果、モノーＡｒｇインシュ
リンの製造が驚くほど簡単な工程で可能となる。ヒトイ
ンシュリンは、これから既知の方法で調製することがで
きる。モノーＡｒｇ−インシュリンは、さらに医薬物中
の活性成分として使用される（ＥＰ−８第０．１３２，
７６９号明細書）。

発現ベクターｐ　Ｋ　５０は、ＥＰ−Ａ第０　、２２９
　、９９８号明細書または対応するＡＵ−Ａ第６６．７
６０／８６号明細書に記載された。ミニ−プロインシュ
リンは、この構造に対応する融合タンパク質の形で大腸
菌などの細菌中で調製することができる。

難溶性の融合タンパク質は、中性緩衝液によるン先ン争
（こよって濃縮することができる。ミニ−プロインシュ
リンは、ハロゲン化シアン切断（Ｅ、　Ｇｒｏｓｓおよ
びＢ、　Ｗｉｔｔｋｏｐ：　（１９６１）　Ｊ、　Ａｍ
、　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、　８２、＋５１０−１５１７）によって遊離さ
せる。これはまだ生物学的に活性の形では存在しないが
、種々の分子間および分子内ジスルフィド架橋、おそら
くまた他のタンパク質断片との架橋、を有する非均質混
合物からなる。Ｓ−スルフォン酸塩の形の分子は、化学
的に均質で比較的安定な誘導体として調製される（Ｐ、
　Ｇ、　Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓら：　（１９６７）Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　６．２６３５−２６４１）。

この誘導体は、イオン交換クロマトグラフィーできわめ
て容易に精製することができ、正しいジスルフィド架橋
の形成を伴う天然の立体構造への折り畳みのための出発
材料として認められたものである（Ｙ−Ｃ，Ｄｕら：　
（１９６５）　Ｓｃｉ、　Ｓｉｎ、　１５．２２９−２
３６．１１．Ｐ。

Ｇａｔｔｎｅｒら：　（１９８１）　１ｌｏｐｐｅ−５
ｅｙｌｅｒｓ　Ｚ、　Ｐｌ＋ｙｓｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　３Ｇ２、＋９４３−１０４９、Ｂ、Ｈ，Ｆ
ｒａｎｋら：”Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：　　５ｙｎｔｌ＋ｅ
ｓｉｓ−５ｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”、　
Ｄ。

Ｉｆ、　Ｒｉｃｌ＋　ａｎｄ　Ｅ、　Ｇｒｏｓｓ出版、
１０４３−１０４９）。この折り畳みの成功は、黄色ブ
ドー球菌（Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ）プロテアーゼ■８によ
る切断で生じる断片をＨＰＬＣ分析することよって証明
される（Ｕ。

Ｇｒａｕ：　（１９８５）　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３４．
１１７４−１１８０）。

可能な切断部位の数を通常のプロインシュリンに較べて
減らすことはこの目的のために特に有利であることが証
明されることがら、モノ−Ａ　ｒ　ｇインシュリンまた
はインシュリンの遊離はトリプシンまたはカルボキシペ
プチダーゼＢの作用によってまたは同じ作用を有する酵
素（ｔＪ、　Ｋｅｍｍｌｅ＋・ら：（１９７１）　Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４Ｇ、２７８０−２７９
５）によって確実に簡単な方法で行うことができる。こ
のために、切断はかなりもっと簡単にコントロールでき
る（Ｄｅｓ−８３０−インシュリンまたはＤｅｓｏｃ　
ｔａ−Ｂ２３−Ｂ３０インシュリンの調製ζこおける副
産物の形成に関して）。モノーＡｒｇインシュリンおよ
びインシュリンはともに既知の方法でイオン交換クロマ
トグラフィーによって高純度で単離することができる。

インシュリンおよびモノ−Ａ　ｒ　ｇ誘導体の形成、精
製工程および最終産物の品質は、通常のＲＰ　−ＨＰ　
Ｌ　Ｃ法（Ｇ。

Ｓｅｉ’ｐｋｅら：　（１９８６）　Ａｎｇｅｗ、　Ｃ
ｈｅｍ、　９８．５３０−５４８）を用いて調べられる
。

驚いたことに、天然のプロインシュリンと対照後者はき
わめて困難な方法にて インシュリンから分離できるのみであることから、天然
のプロインシュリンからのインシュリンの生産において
はｒｔｓｙｏ−ｐｏｔ反応」が好ましい。すなわち、ト
リプシン切断主要産生物、インシュリン−Ａ　ｒｇ１１
３１　　ｐ、　１ｇ８３２およびモノーＡｒｇ−インシ
ュリンを既知の方法でイオン交換によってインシュリン
Ｄｅｓ−８３０から先ず分離して、次いでカルボキシペ
プチダーゼＢ　（ＥＰ−８第０．１９５，６９１号明＋
ｎＩ８　）を用いて切断して、ヒトインシュリンを得る
。これに比較して、ミニ−プロインシュリンは、ｒｏｎ
ｅ−ｐｏｔ反応」による理想的な方法で、トリプシンも
しくはカルボキシペプチダーゼＢまたは同じ作用を有す
る酵素を同時に用いることによって、ヒトインシュリン
に変換することができる。

正しく折り畳まれたプロインシュリン誘導体を直接に単
離できることから、式Ｉの化合物の酵母における発現と
続いての分泌は特に有利である。

宿主系（ｓｙｓｔｅｍ）として用いられる酵母は、例え
ば、ＥＰ−Ａ第０　、２４８　、２２７号明細書の例Ｂ
に示されるピキア・バストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ）　、ハンセヌラやポリモルフイス（Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓ）、シゝゾサッ
力ロミセス曇ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ−
ｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）または好ましくはサツカロミ
セス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）などがある。

酵母における発現ベクターは、多く知られている。本発
明に係るインシュリン誘導体の調製については、次に酵
母α−因子系を例にして記述されている。しかしながら
、他の発現系も既知の方法にしたがって用いることがで
きることから、これはＫｕｒｊａｎおよび１ｌｅｒｓｋ
ｏｖｉｔｚ　（（＋９８２）　Ｃｅ１ｌ　３０．９３３
９４３）によって鰻告されており、ここでは他の遺伝子
の発現の可能性および遺伝子産生物の分泌についても検
討されている。これに関しては、Ｂｒａｋｅら（（１９
８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　ｔＪｓＡ　８１．４６７１２４Ｇ４６）も参照する
ことができる。

別の方法として、酵母「キラートキシン（Ｋｉ　Ｉ　１
ｅｒｔｏｘ団）」系を用いることができる。または酸ホ
スファターゼまたはインへルターゼ系を介する分泌を用
いろことができる。

酵母ベクターとしては、いわゆる「シャトル」ベクター
が有利に用いられる。これは、細菌プラスミドおよび酵
母プラスミドの複製開始点、それに雨宿主系の選択のた
めの遺伝子または遺伝子群を有している。さらに、その
ようなベクターは、外来性遺伝子の発現に必要なプロモ
ーター配列および、必要に応して、収率な上げるための
ターミネータ−配列を含む。すなわち、便宜的に分泌シ
グナルと融合させたヘテロな（ｂｅｔｅｒｏ　ｌ　ｏｇ
ｏｕｓ）遺伝子をプロモーターとターミネータ−の間に
位置させる。このようなベクターは、例えば、ＵＳ−Ａ
第４　、７６６　、０７３号明細書に記載されている。

遺伝子コードは、公知のように、「縮重（ｄｅｇｅｎｅ
ｒａｔｅ）　Ｊ　Ｌ／ている。すなわぢ、唯一のヌクレ
オチド配列でコードされるアミノ酸は僅か２種であるの
に対して、コード可能な残りの１８種のアミノ酸は、２
種類から６種類のトリプレットによってコードされる。

したがって、ミニ−プロインシュリンの遺伝子の合成に
は、多様のコドンの紺合せを選択することができる。今
、ミニ−プロインシュリンをコードするＤＮＡ配列（（
二つの遺伝子断片ＩＫＩ（表１）およびＩＫＩＩ　（表
２）の形で付表に示されている）が特に有利であること
が見出された。これは、酵母および大腸菌のコドン使用
をともに最高にするからである。

ＤＮＡ配列Ｉのコード鎖の５′末端には、制限エンドヌ
クレアーゼＫ　Ｉ）　ｎ　Ｉ部位に対応する「突出して
いるＪ　ＤＮＡ配列がある。これに対して、制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩに対応する一本鎖配列はコード鎖の３′末
端に突出を有している。これら二つの異なる制限酵素認
識配列によって、ＤＮＡ配列ｌをプラスミドの所望の位
置方向に挿入できることが保証される。２個の翻訳／終
結コドン（終止コドン）がアスパラギンをコードするト
リブレット第６５のコード配列に続いている。制限酵素
Ｐｓｔｌ（コドン４１／４２）の唯一の内部切断部位の
存在によって、二つの遺伝子断片をサブクロニングする
ことが可能になる。これらを、ｐＵｃ１８などのよく研
究されているプラスミドまたはこれらプラスミドの誘導
体などに導入することができる。

さらに、多数の制限酵素の唯一認識配列を構造遺伝子中
に導入することができ、これによって、一方ではプロイ
ンシュリンの部分配列へのアクセスが提供され、他方で
は突然変異を起こすことができる。

制限酵素 下記ヌクレオチド番号の 後を切断（コード鎖） Ａｃｅよ りｒａエエＩ ＦｎｕＤエエ Ｈｇａ工 ＨｉｎｄＩエエ Ｈｉｎｆ工 Ｈｐａ工 Ｈｐｈ工 Ｍａｅ工 とａｅ工ＩＩ Ｍ］）０エエ 凪ｕ工 Ｎｅｏ工 Ｎ１ａＩエエ Ｐｙｕエエ Ｓａｌ工 Ｓｐｅ工 Ｓｔｙ工 ａｑＸ ＤＮＡ配列■は、天然の配列から必須の部分を修飾して
得られた。二つべそ、こ、で、多数の制限酵素の唯一切
断部位の挿入が可能になった。

ＤＮＡ配列Ｉは、４７〜９６ヌクレオチドユニツトの鎖
長の全部で６個のオリゴヌクレオチドから構築すること
ができる。このための工程は以下に説明する通りである
。

遺伝子断片Ｉ　Ｋ　Ｉ　（表１）は、４７〜７４ユニツ
トの鎖長の４個のオリゴヌクレオチドから構築すること
ができる。すなわちこれらを先ず化学合成し、次いて３
個のヌクレオチドの「粘着性末端」を介して酵素的連結
を行わせる。この粘着性末端は制限酵素ＤｒａｌＩＩに
対応するもので、これは後の修飾に有利である。

遺伝子断片ＩＫＩＩ（表２）は、８８および９６ヌクレ
オチドユニツトの長さの２個の化学合成オリゴスクレオ
チドから得ることができる。

例１ ａ）−本鎮オリゴヌクレオチトの化学合成りＮＡ構築ブ
ロックの合成をオリゴヌクレオチド第４（表１）を例に
用いて説明する。同相合成のために、３′末端に位置す
るヌクレオシド、すなイつちこの場合にはアデニン（ヌ
クレオチド第１２５）、を支持体に３″水酸基を介して
共有結合させて用いる。支持体物質は、長鎖アミノアル
キル基を官能基として有するｃｐｃ　＜　ｒ調整された
有孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｒｅ　ｇｌａ
ｓｓ）」）である。

次の請合成工程において、塩基構成分は、β−シアノエ
チルＮ、Ｎ−ジアルキル−５′−〇−ジメトキシートリ
チルヌクレオシド−３′−燐酸アミダイトとして用いる
。ここて、アデニンはＮ６−ベンゾイル化合物として、
シトシンはＮ４−ベンゾイル化合物として、グアニンは
Ｎ２−イソブチル化合物として、およびチミンは保護基
をもたないかたちで、存在する。

０．２７１ｍｏｌの結合された５′−〇−ジメトギシト
リチルーＮ４−ベンゾイル−２゛−デソキシアデノシン
を含有する重合支持体の２５Ｂを次のような作用物で連
続的に処理する。

Ａ）アセ！・ニトリル ［１）　　３％トリクロロ酢酸のジクロロメタンイ容；
夜Ｃ）アセトニトリル Ｄ）　　５μｍｏｌの適当なヌククレオントー３’−０
−ポスファイトおよび２５μｍｏｌテトラソーテトラヒ
ドロ５ｍ１の無水アセトニトリル溶τ＋２） Ｅ）アセトニトリル Ｆ）ｆｆｉｌｏ％ルチジンおよび１０％ジメチルアミノ
ピリジンを含有するテトラヒドロフランに溶かした２０
％無水酢酸 Ｇ）アセトニトリル １１）容量比で５　：４　：　１のルチジン／水／テト
ラヒＦロフラン混液に溶かした３％イオジンここで「ホ
スファイト」とは、β−シアノエチル２°−デソギシリ
ボースー３′−モノフォスファイトであって、第三価を
ジイソプロピルアミノ基で飽和させたものであることを
理解されたい。個々の合成工程の収率は、各々、デトリ
チシーション（ｄｅｔｒｉ　ｔｙｌａｔｉｏｎ）反応Ｂ
）によって、分光光度計て４９６ｎｍの波長てジメトキ
シトリチルの陽イオンの吸収をｉ！！’Ｉ定することに
よって決定することができる。

合成が完了した後、ジメトキシトリチル基を八）〜Ｃ）
で記述したよう（こして切断する。アンモニア処理によ
ってオリゴヌクレオチドを支持体から切り離し、同時に
、β−シアノエチル基を除去する。

オリゴマーを５０℃で１６時間濃アンモニアで処理する
ことによって、塩基のアミノ保護基を定量的に切断する
。このようにして得られる粗生産物をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によって精製する。

オリゴヌクレオチド１〜３（表１）、５および６（表２
）を、同様の方法で調製する。

ｂ　）−本鎖オリゴヌクレオチドの酵素的連結オリゴヌ
クレオチドの５″末端の酵素的燐酸化のために、各々１
μｍｏｌのオリゴヌクレオチド１および４を４ユニツト
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（２０７１１の５０ｍ
Ｍ）リス塩酸緩衝液＜　Ｉ）　Ｈ７，６）、１０ｍＭ塩
化マグネシウムおよび１０ｍＭジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）に溶かしたもの）で３７℃で３０分間処理する。

９５℃で５分間加熱して酵素を失活させる。「突出して
いる」−本鎖配列を形成するオリゴヌクレオチド２およ
び３は燐酸化しない。これによって、より大きい遺伝子
断片が次の連結反応において形成されるのを阻止するこ
とができる。

オリゴヌクレオチド１〜４を次のようにして連結させる
。各１μｍｏｌのオリゴヌクレオチド１と２または３と
４を各々対にして、２０　Ｉｔ　ｌの５０ｍＭ）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ塩化マグネシウムお
よび１０ｍＭＤＴＴの中に溶かして、この溶液を９５°
Ｃて５分間加熱して、それを２時間以内に室温まで冷却
してハイブリダイズさせる。この目的のために、オリゴ
ヌクレオチド１および４を５°燐酸塩の形で用いる。形
成された二重螺旋状のＤＮＡ断片をさらに連結させるた
めに、これら断片の溶液を一緒に合わせて１５分間で６
０℃に加温した後、室温にまで冷却する。次いて、２１
１１の０．１ＭＤＤＴ、１６μｍの２．５ｍＭアデノシ
ン３燐酸（ｐＨ７）および１１１１の７４　　ＤＮＡノ
ガーゼ（４００ユニツト）を次いて加えて、この混合物
を２２℃で１６時間インキュベートする。

無添加、４０Ｘ２０Ｘ０．１ｃｍ）上でのゲル電気泳動
によって精製する。このとき、Ｈｉｎｆｌで切断したφ
Ｘ　１７４ＤＮＡ　（ＢＲＬ社製）またはＨａｅＩＩＩ
で切断したｐＢＲ３２２を標識物質として用いる。

例２ ａ）合成りＮＡ断片のクローニング 市販のプラスミドｐＵｃ１９を制限酵素Ｋｐ、ｎｌおよ
びＰ−ｓｔｌを用いて開環して、大きい断片（１）を０
．８％ｒｓｅａｐｌａｑｕｅＪゲルを通して分離する。

この断片を表１のようにして合成したＤＮＡ　（２）を
用いてＴ４ＤＮＡリガーゼと反応させて、ライゲイジョ
ン混合物をコンピテントにした大腸菌７９１０２細胞と
インキュベートする。形質転換混合物を２０　ｍｇ／リ
ットルのアンピシリンを含むＩＰＴＣ；／Ｘｇａｌプレ
ートにプレートする。プラスミドＤＮＡを、白色コロニ
ーから単離して、制限酵素およびＤＮＡ配列分析によっ
て特徴付けを行う。目的のプラスミドをｐ　Ｉ　Ｋ　ｌ
と称する。

同様にして、表２（こよるＤＮＡ　（５）を、Ｐｓｔｌ
およびＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩて開環しておいたｐ　ＵＣ
ｌ　９に連結させる。プラスミド［）　Ｉ　Ｋ　２（６
）がマ：Ｆられる。

１））ミニ−プロインシュリン遺伝子の構築表１および
２によるＤＮＡ配列（２）および（５）をプラスミドｌ
）［Ｋ１（３）およびｌ】Ｉ　［（２（６）から再び単
離して、Ｋ　［）　ｎ　ＩおよびＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ
を用いて開環しておいたｐＵｃ１９と連結させる（７）
。このようにしてプラスミド１）ＩＫ３（８）が得られ
る。これは、修飾されたヒトインシュリン配列をコード
する。

プラスミドＩ）ＩＫ３（８）をＭ　ｌ　ｕ　ＩおよびＳ
ｐｅ　Ｉを用いて開環して、大きい断片（９）を単離す
る。これを下記のＤＮＡ配列（１０）と連結させる。

Ｂ２ＯＡＩ　　Ａ２　　Ａ３　　Ａ４　　Ａ５　　Ａ６
　　Ａ７（Ｔｈｒ）　（Ａｒｇ）　Ｇｌｙ工１ｅ　Ｖａ
ｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｃｙｇ　Ｃｙｓ５’　　　ＣＧ　
　ＣＧＴ　　ＧＧＴ　ＡＴＣＧＴＴ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　
ＴＧＴ　ＴにＴ３’　　　　　　Ａ　　　Ｃ（スＴＡＧ
　ＣＡＡ　ＣＴＴ　ＧＴＴ　ＡＣＡ　ＡＣＡ（ＭＬＵ工
） ＡＩ３　　　　Ａ９ （Ｔｈｒ）　　（Ｓｅｒｌ ＴＣＡ　　　ＴＣ ３′ Ｌ （Ｓｐｅ工） この配列は、Ｂ鎖（Ｂ３０）の最後のコドンを一つのア
ルギニンコドンで補い、切り取られたへ鎖の最初の７個
のアミノ酸のコドンを置換し、この鎖のアミノ酸８およ
び９のコドンを補っている。

プラスミドｐＩＫ４（１１）は、このようにして得られ
る。これは、本発明によるヒトミニープロインシュリン
をコードする。

Ｃ）ミニ−プロインシュリンの発現ベクター１）　　Ｉ
　　Ｋ　　Ｉ　　： ＥＰ−Ａ第０．２２９，９９８号明細書（その例３、第
３図（３３））から知られるプラスミドｌ）　Ｋ　５０
（１２）をＥｃｏＲＩおよびＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩを用
いて切断する。断片（１３）および（１４）の両方を単
離する。次いで、ＩＬ−２の部分配列を含む小さい断片
（１４）をＭ　Ｌ　ｕ　Ｉで切断して、ＩＬ−２部分配
列（１５）を単離する。

プラスミドｌ）　［Ｋ４　（１１）をＥｃｏＲＩおよび
Ｈｐａｌを用いて切断して、大きい断片（１６）を単離
する。ここで、これをＩＬ−２部分配列（１５）および
合成りＮＡ　（１７） Ｂ”　　Ｂ２ Ｍｅｔ工ｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｖａ
１５’　ＣＧ　ＣＧＴ　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＧＧ
ＣＣＧＴ　ＴＴＣＧＴＴ　　３’　　（１７）３’　　
　　Ａ　ＴＡＣＴＡＡ　ＣＴＣＣＣＧ　ＧＣＡ　ＡＡＧ
　ＣＡＡ　　５’（ＭｌｕＩ）　　　　　　　　　　　
　　　　　（Ｈｐａｌ）に連結し、プラスミドｐＩＫ８
（１Ｂ）を得る。

これは、架橋メンバーＭｅ　ｔ　−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｃ；　
ｌ　ｕ　−Ｃ１ｙ−Ａｒｇおよび次いでミニ−プロイン
シュリンのアミノ酸配列がＩ　Ｌ−２の最初の３８個の
アミノ酸に続いている、融合タンパク質をコードする。

記述した融合タンパク質をコートする ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｌＩ［断片を、プラスミドｐｌＫ
Ｂ（１８）から切゛り出す。この断片を、ｐ　［（５０
の切断で得られた大きい断片（１３）と連結させる。前
に特徴付けした融合タンパク質をコードする発現ベクタ
ーｒ）ＩＫＩＯ（２０）をこのようにして得る。

ｐＳＷ３： ｒｂｏｍ　５ｉｔｅＪを含むＮｄｅｌ−ＢｓｔＥ■断片
がベクターｐＩＫ１０（２０）から除去される場合には
、ベクターは、比較的高いコピー数で細胞中に存在して
得られて、　ｒｂｏｍ　５ｉｔｅＪを欠くため、もはや
抱合（ｃｏｎ　ｊ　ｕ３ａ　ｔ　ｉ　ｖｅ）プラスミド
ｉこよって動員（ｍｏｂｉ　ｌ　１ｚｅｄ）され得ない
。

この目的のために、ベクターｐＩＫ１０（２０）をＢｓ
　ｔＥＩＩおよびＮｄｅＩを用いて切断して、これをエ
タノールで沈澱させて、ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液に移
して、クレノウボリメラーゼ反応に供する。このように
して形成した先端を切断されたＤＮＡ断片をゲル電気泳
動によって分離して、大きい断片（２１）を単離する。

ベクターｐＳＷ３　（２２）をライゲーションによって
得る。

コンピテントにした大腸菌Ｍｃ１０６１細胞を形質転換
させて、増幅させた後、プラスミドｐｓＷ３　（２２）
を単離して、特徴付けをする。

例３：大腸菌Ｗ３１１０株における発現プラスミド［）
ＩＩ（１０（２０）またはｐ　５Ｗ３（２２）を含む大
腸菌細胞の一晩培養菌液を、５０７１ｇ／　ｍｌアンピ
シリンを含むＬＢ培地（Ｊ、ＩＩ。

Ｍｉｌｌｅｒ：　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　＋ｎ　Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　１９７２）で約１＝１００に希釈して、増
殖をＯＤ測測定よって追う。

ＯＤ　＝　０．５において、培養菌液をＩＰＴＣＳａ度
ｌ　ｍＭに：Ａ整して、１５０〜１８０分の後、細菌を
遠心分離する。これら細菌を緩衝混合液（７Ｍ尿素、０
．１％ＳＤＳ、０．１Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ７，０）
中で約５分間煮沸して、試料をＳＤＳゲル電気泳動プレ
ートに供する。ゲル電気泳動分析の後、追加のバンドが
約１０Ｋｄからの領域に認められる。これは目的の融合
タンパク質に対応する。このバンドは、「ウェスタンプ
ロット」実験においてインシュリンに対する抗体と反応
する。

細胞を加圧下で破砕してから破砕物を遠心分離すると、
融合タンパク質は他の不溶性細胞成分とともに沈澱中に
見出される。

上記の誘導条件は、振どう培養にも適用される。

より大規模の培養では、他の培地の選択および、ｌｌ７
１１えは、変更したＯ、Ｄ、値を得るための条件などを
適宜設定する。

例４： ａ）モノーＡｒｇインシュリンの調製 遠心分離して燐酸緩衝液（ｐＨ７）または水で洗浄する
ことによって濃縮した融合タンパク質（乾燥物含有置駒
２５％）の４０ｇを７５ｍ１の９８〜１００％の燐酸に
溶解させて、これに５ｇのＢ　ｒＣＮを加える。室温で
６時間反応させた後、混合物に２リツトルの水を加えて
、凍結乾燥させる。

断片混合物（１０ｇ）を１リツトルの緩衝溶液（８Ｍ尿
素、０．２Ｍトリス−ＨＣｌ　　（ｐＨ８，５））に溶
解して、３０℃に加温してから１０ｇ亜硫酸ナトリウム
および２．５ｇの四チオン酸ナトリウムを加える。３０
℃で９０分間保持した後、３リツトルの冷水を加えて、
ｐＨを７．０に調整する。得られる沈澱を遠心分離する
。ｐＨを３．５に調整することによってミニ−プロイン
シュリンのヘキサ−８−スルホン酸塩な上清液から沈澱
させる。＋４°Ｃで１５分間インキュベートした後、混
合物を遠心分離する。沈澱を２００ｍ１の水で洗浄して
から凍結乾燥する。ＲＰ−ＨＰＬＣによって９００ｍｇ
のミニ−プロインシュリン含有量が測定された物質混合
物４．８ｇが得られる。Ｓ−スルホン酸塩の濃縮を次の
二つの工程によって行う。

１、　　３Ｍ尿素および０．０５Ｍ）リス−ＨＣＩ（ｐ
Ｈ８，３）中のフラクトゲル（ＲＦｒａｃｔｏｇｅ　ｌ
　）ＴＳ［（ＤＥＡＥ６５０Ｍを含む５Ｘ６０ｃｍのカ
ラムを通すアニオン交換クロマトグラフィー　溶出を０
．０５〜０．５Ｍ　ＮａＣｌ　（各々６リツトル）の勾
配を用いて行う。溶出液を等電点焦点（１ｓｏｅｌｅｃ
ｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ）によって分析した後、産
生物を、合わせた画分からＩＭ尿素濃度への希釈および
ｐＨの３．５への調整によって沈澱させる。

２、　３Ｍ尿素、０．０５Ｍ）リス−ＨＣｌおよび０．
０５Ｍ　ＮａＣＩ　　（ｐＨ８，３）中のセファクリル
（Ｒ５ｅｐｔ＋ａｃｒｙｌ）　Ｓ　２００を通すゲル濾
過による高および低分子不純物の除去。分画物の分析お
よび単離物の単離を上記の工程のようにして行う。

沈澱物を２０ｍ１の水で洗浄してから凍結乾燥する。

１．１０ｇの６９％純度に濃縮された産生物が得られる
。

折り畳み（ｆｏＮ団ｇ）およびジスルフィド架橋形成の
ために、Ｓスルホン酸塩を５０ｍ１の８Ｍ尿素および０
．０２Ｍ）リス−ＨＣｌ　（、ｐ　Ｈ８，６）に溶解す
る。２．３滴のオクタツールを加えた後、精製された窒
素を１５分間混合物に通す。１　、１　ｍ（１６ｍＭｏ
１）の２−メルカプトエタノールを加えて室温で１時間
で完全な還元を行う。溶？αをセファデックス（Ｒ５ｅ
ｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　２５カラム（５Ｘ６０ｃｍ）に供
して、０．０５Ｍグリシン／Ｎａ０Ｆ（（ｐＨ１０，６
）を用いて溶出する。検査の後、グリシン緩衝液３００
ｍ１中のタンパク質画分を検査の後、４℃で２日間保持
する。必要であれは、ｐＨｆ直（１０，６）の修正を行
う。次いで、溶ンαをｐＨ６，８に調整して、溶ン夜を
１ｍｇ（３，５Ｕ）のトリプシン（メルク社製、Ｌ−１
−ｐ−）シルアミノ−２−フェニルエチルクロロメチル
ケトン（Ｔ　Ｐ　ＣＫ　）で処理）とともに室温で４時
間インキュベートする。次いて、ｐ　Ｈを３．５に調整
して、１ｍｇの大豆トリプシンインヒビター（シグマ社
製）および３ｍｌの１０％ＺｎＣ１２を加えて、溶液を
再びｐＨ６，８に調整する。得られる沈澱を遠心分離に
よって分離する。これは、主にモノ−Ａ　ｒ　ｇインシ
ュリンを含む。これを５０ｍＭ乳酸および３０％イソプ
ロパツール（ｐＨ３，５）からなる緩ン打ン夜中のＳ−
セファ０−ス（ＳｅｐｈａｒｏｓｅＲ）　　（２，５Ｘ
４０ｃｍ）によるイオン交換クロマトグラフィーによっ
て精製する。溶出を、０．０５〜０．５０ＭＮａＣＩ（
各１リツトル）の勾配によって行う。

溶出（αをＩ（ＰＬＣで分析する。水で１：ｌに希釈し
た後、１リットル当り１０ｍ１の１０％ＺｎＣ１，、を
加えてｐ　Ｈを６．８に調整することによって、モノー
Ａｒｇインシュリンを産生物を含む両分から沈澱させる
。遠心分離によって分離される沈澱を、Ｉｇ／リットル
のフェノール、１０．５ｇ／リットルのクエン酸および
２００　ｍｇ／リットルのＺｎＣ１２からなる緩衝液か
らｐ　ＨＧで結晶化させる。水で洗浄した結晶を凍結乾
燥した後、純度９０％以上のモノーＡｒｇインシュリン
の３９０ｍｇが得られる。

例５： インシュリンの調製 ２００ｍｇのモノ−Ａ　ｒ　ｇインシュリン（例４を参
照されたい）を１００ｍ１の０．０５Ｍ）リス−ＨＣｌ
　（＋）８８．５）に溶解する。次いで、ＩＵ（約４μ
ｇ）のカルボキシペプチダーゼＢを加えて、溶ンＵを室
温で緩やかに攪はんする。３時間の後、１）８３．５ま
で酸性化し、１ｍｌの１０％ＺＩＩＣＩ２■誹÷ｒこと
によってヒトインシュリンを結晶化させる。８５％以上
の純度の結晶化インシュリンの２００ｍ３が得られる。

この材料を、０．１％ルチンツル（Ｌｕｔｅｎｓｏｌ）
　ＯＮ　１００　（Ｂ　ＡＳ　Ｆ　ＡＧ、実質的に１２
個の炭素原子の直鎮状飽和脂アルコール（ｌｉｎｅａｒ
　５ａｔｕｒａｔｅｄ　ｆａｒｒｙ　ａｌｃｏｈｏｌ）
のオクスエチシー）　（ＯＸｅｎ）ｙｌａｔｅ））およ
び０．０５Ｍ）リス−ＨＣｌ　　（ｐＨ８，３）中のフ
ラクトゲルＴ　Ｓ　ＫＤＥＡＥ６５０Ｍを含むカラム（
２，ｉ５Ｘ４０ｃｍ）でのイオン交換クロマトクラフィ
ーによる精製に供する。溶出をＯ〜Ｏ，＝’ＬＭ　Ｎａ
Ｃｌ　（各ｌリットル）の勾配を用いて行う。ＨＰＬＣ
によって同定された産生物を含む両分から、１０ｍ１の
１０％ＺｎＣｌ２および１ｍｌの１０％クエン酸を加え
た後にｐＨ５，５てインシュリンを結晶化させる。−晩
援やかに撹はんした後、混合物を遠心分離して、得られ
る沈澱物を、５ｇ／リットルのクエン酸、１２５ｍ１／
リツトルのアセトンおよび２００　ｍｇ／リットルのＺ
ｎＣｌ２からなる緩衝液の２０ｍ１からｐＨ５，５で再
結晶化させる。９５％以上の純度を有するインシュリン
の１６０ｍｇが得られる。

例６： トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢとの■合せ使用
によるモノー八！・ｇインシュリンからのインシュリン
の調製 ５ｍｇのモノーＡｒｇインシュリンを２０ｍ１の０　、
１　Ｍ　）リス−ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０）に；６解し
て、溶液を３０°Ｃに加温する。同時に、２．５７１１
のトノプシン溶？１（ＩＵ／ｍｌ）および１５０７１１
の力ルポギシベプチダーゼＢ溶液（ｌ　Ｕ　／　ｍｌ）
を加える。

３時間の後、溶液をｐ　Ｈ３，５に調整して、２．５μ
ｍのトリプシンインヒビター溶液（１（Ｊ／ｍｌ）およ
び２００μｍの１０％ＺｎＣ１２溶液を加える。

ｐＨを６．８に調整することによってヒトインシュノン
を沈澱させて、遠心分離してから例５のように結晶化さ
せる。結晶化されたインシュリンの純度は、９５％以上
である。

例７：酵母発現ベクターの構築 ＤＮＡ配列（２３）（表３）を先ずホスファイト法によ
って合成する。このＤＮＡ配列（２３）はＭＦα前駆体
タンパク質のアミノ酸４９〜８０をコードし、本質的に
天然ＤＮＡ配列に対応する。

先ず、Ｄ　Ｎ　Ａ配列（２３）をα因子の遺伝子を単離
するためのプローブとして用いる。この目的のために、
このＤＮＡ配列を３２　ｐで標識する。このプローブを
用いて、遺伝子をゲノム入ｇｔｌ　１酵母遺伝子バンク
（例えは、Ｃ１ｏｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓ　
Ｉｎｃ、、４０５５　Ｆａｂｉａｎ　ｔＪａｙ、　Ｐａ
ｌ。

ＡＩｔｏ、（：Ａ９／ｌ３０３から市販もされている人
手可ｆ１后かもの）からＯｉ離する。この目的のために
、α因子遺１云子を有するλｇｔｌｌファージを、プラ
ークハイブリダイゼーション実験において同定する。陽
性と同定されたプラークからのファージを単離して、複
製してからＤＮＡを得る。これをＥｃｏＲＩを用いて切
断して、０．８％のアガロースゲル上で分析する。「サ
ザントランスファー」実験によって膜を３２　ｐ−標識
ＤＮＡ配列（２３）に対してハイブリダイズさせる。Ｄ
ＮＡ配列（２３）に対してハイブリダイズさせる約１．
７５ｋｂの断片（２４）を含むファージＤＮＡを、酵素
で再び切断して、対応する断片（２４）を単離する。ヘ
クターｐＵｃ１９をＥｃｏＲＩで開環して（２５）、Ｔ
／Ｌリカーゼを用いて１．７５ｋｂの断片（２４）と反
応させる。クローニングヘクター（２６）が得られる。

大腸菌７９１０２株をライゲーション混合物を用いて形
質転換させる。白色のコロニーを単離して、これらから
プラスミドＤＮＡを得て、１．７５ｋｂＥｃｏＲＩ断片
を含むプラスミド　（２６）を同定する。

ＭＦαの前駆体タンパク質の天然のＤＮＡ配列は、アミ
ノ酸８〜ｌＯ領域のＰｓｔｌ切断部位およびアミノｖｉ
４８／４９領域のＴａｑ　Ｉ切断部位を含む。単離され
るプラスミドＤＮＡ　（２６）から、ＰｓｔＩおよびＴ
ａｑ　Ｉとの反応によって、ＭＦα前駆体配列のアミノ
酸９〜４８をコードする断片（２７）が単離される。ベ
クターｐＵＣ１８をＰｓｔＩおよびＫｐｎＩを用いて開
環して、Ｔ４リガーゼを用いて、Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ−Ｔａ
ｑ　Ｉ断片（２７）および合成りＮＡ配列（２３）と反
応させる。大腸菌７９１０２をライゲーション混合物を
用いて形質転換させる。形質転換混合物をＩＰＴＧ−Ｘ
ｇａ　１−Ａｐプレートにプレートする。白色コロニー
を単離して、このクローンのプラスミドＤＮＡを制限酵
素分析によって特徴付けする。ＭＦα前駆体配列のアミ
ノ酸８〜８０をコードするクローニングベクター（２９
）がこのようにして得られる。

記述したコード配列（３０）をＰｓｔｌおよびＫ　ｐ　
ｎ　Ｉとの反応によってクローニングベクター（２９）
から切り出し、下記のライゲーションにおいて組み入れ
を行う。この目的のために、クロニングベクター（２Ｇ
）をＥｃｏＲＴと反応させて、一部なＰｓｔＩと反応さ
せて、ＭＦα前駆体配列の晶初の８個のアミノ酸のコー
ド配列を含む断片（３１）を単離する。さらに、ベクタ
ーｐ　ＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎｌ（３２）を
用いて開環して（３２）、記述した二つの断片（３０）
および記述した（３１）とに連結させる。

その結果、クローニングベクター（３３）が形成される
。これは、ＭＦα前駆体の全配列のアミノ酸８０まてを
コードする。

クローニングベクター（３３）をＫ　Ｉ）　ｎ　Ｉおよ
びＨｉ　ｎ　ｄ　［Ｉを用いて開環して、大きい断片（
３４）を単離する。これをミニ−プロインシュリンをコ
ードするプラスミド（１１）からのＫｐｎ　Ｉ−Ｈｉ　
ｎｄＩＩＩ断片（３５）を用いて連結する。プラスミド
ｐｌＫ２０（３Ｇ）は、このようにして得られる。その
構造は制限酵素分析によって確認される。

プラスミドＹ　ｅ　ｐ　ｌ　３　（Ｂｒｏａｃｈら：　
（＋９７９）Ｇｅｎｅ　８．１２１）をＢａｍＨＩを用
いて開環して、突出末端をクレノウボリメラーゼを用い
て埋填する（３８）。エタノールを用いてＤＮＡを沈澱
させてからウシアルカリホスファーターゼで処理する。

インシュリン誘導体およびＭＦαの前駆体配列をコード
する断片を、ＨｉｎｄＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いてク
ローニングベクター（３６）から切り出して、突出末端
を記述したようにして埋填する（３７）。

先端を切断した二つのＤＮＡ配列（３７）および（３８
）を互いに連結させて、プラスミドｐａｆＢ１０２　（
３９）およびｐａｆＢ１０４（４０）を形成させる。こ
れら二つのプラスミドは、挿入断片の位置方向が異なる
のみである。

ＥＰ−Ａ第０．１７１，０２４号明細書に記載されてい
るように、ターミネータ−を挿入配列の後方に挿入する
ことができる（　ＥＰ−Ａ第０．１７１，０２４号明細
書の第４〜６図）。この目的のためには、Ｎｃｏｌおよ
び／またはＢａｍＨＩ切断部位が適している。

大腸菌ＭＭ２９４でのプラスミドＤＮＡの増幅の後に、
プラスミドｐαｆＢ１０２を用いて、１１゜ｔｏら（（
１９８３）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、＋５３．１
６３）のリチウム法によって、ロイシン要求性酵母株Ｙ
７９（α、ｔ　ｒ　ｐ　Ｌ　　ｌ　ｅｕ２−１）　　（
Ｃａｎｔｒｅｌｌ　ら：（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｎａｔｌ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．６２
５０）およびＤＭ６−６　＜ａ／ａ　Ｉ　ｅ　ｕ　２−
３．１１２：　：ｕｒａ３＋／１ｅｕ２：　　：　１ｙ
ｓ２＋ｔｒｐｌ　　／１ｒｐｌ　　　ｈｉｓ３−１１．
１５／　ｈ　ｉ　ｓ　３−１１．１５、ｕｒａ３　　／
ｕｒａ３　　１ｙｓ２　　／ｌｙｓ２−１ａｒｇｌＬ−
１７／ａｒｇ４＋　ａｄｅｌ／ａｄｅｌ＋）（Ｍａｙａ
　Ｈａｎｎａ、　Ｄｅｐｔ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　
ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＧｅｎｅｒａｌ　）Ｉｏｓ
ｐｉｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、　ＵＳＡ）を形質変換させ
た。ロイシンを添加しない選択培地で増殖できるコロニ
ーを単離して合わせる。酵母ミニマム培地に個々のコロ
ニーを接種して、２８°Ｃて２４時間インキュベートす
る。細胞を遠心分離して、上清液のインシュリン活性な
ＲｒＡ試験で調べる。

プラスミドＤＮＡを、上清かインシュリン活性を下す酵
母クローンから再び単離して、制限酵素分折によって特
徴付けした。形質転換させた酵母株を次の発現に用いる
。

例日：酵母における発現 新鮮な選択培地−晩培養物から例７の方法によって得ら
れる酵母株細胞を、吸光度０Ｄ６ｏ＝０．１になるよう
に１０ｍ１の酵母完全培地に接種する。培養物を２８°
Ｃで８時間振とうさせる。その後、９０ｍ１の新鮮培地
を加える。次いで、培養物をさらに２０時間振とうさせ
る。細胞を遠心分離して、上清液のインシュリン濃度を
測定する。より大規模の培養では、条件を改変する。例
えば、新鮮培地を連続的に添加することができる。

例９：酵母上清液からのモノーＡｒｇ−プロインシュリ
ンの精製 培養上清液を、スチレンおよびジビニルヘンゼンのコポ
リマーからなる多孔性吸着樹脂（Ｄ　ｉ　ａ　ｉ　ｏｎ
　　ＨＰ２０）を含む吸着カラムに通して加える。カラ
ムは、２０〜５０ｍＭ酢酸緩衝液（１）　）（５）によ
って予め平衡にした。トリス緩衝液（ｐＨ８）で洗浄し
た後、１０倍のカラム容量のイソプロパツール勾配（０
〜５０％）を適用する。インシュリンを含む両分をｐＨ
６に調整して、ＲＭＡＴＲＥＸ　ＣＥＬＬＩＪＦＩＮＥ
　ＡＭ　　（７ミコン社製）を加えて、混合物を攪はん
して、吸引によって濾過を行って、５０ｍ１の酢酸緩衝
液（ｐＨ６）で洗浄する。洗浄画分と主画分とを合わせ
て、乳酸を用いてｐＨを３．５に調整して、５０ｍＭ乳
酸（ｐＨ５）／３０％イソプロパツールを用いて平衡に
させておいたＳ　−５ＥＰＩＩＡＲＯ５Ｅカラムを通し
て加える。

溶出を、０〜０．６ＭＮａＣ１勾配によって行う。ミニ
−プロインシュリンは、０．２５〜０．３Ｍの範囲で溶
出される。

プロインシュリンを含む両分を１７４の容量に濃縮して
、６％酢酸（ｐＨ２）で平衡にしたＢｉｏｇｅｌＰ　１
０　（Ｂｉｏｉａｄ社製）を含むカラムを通して加える
。インシュリンを含む溶出液を凍結乾燥して、調製用［
逆相Ｊ　ＨＰＬＣ工程（ＲＰ１Ｂ材料、０．１％ＴＦＡ
、アセトニトリル勾配２０〜４０％）に通して精製する
。続いての凍結乾燥の後、凍結乾燥物をトリス緩衝液（
ｐＨ６，８）に溶解して、モノーＡｒｇ−プロインシユ
リン１グラム当り４ユニツトのトリプシンとともに室温
で３〜５時間インキュベートする。反応過程を「逆相」
分析によって追跡する。それによると、モノーＡｒｇイ
ンシュリンはほぼ定量的に形成されることがわかる。反
応路わりに、ｐＨを３．５に調整して、等量のトリプシ
ンインヒビターを加えることによって反応を終結させる
。次いで、塩化亜鉛濃度を０．２１　ｇ／リットルに、
ｐＨを６．８に調整する。綿状の沈澱を得て、これを乳
酸緩衝液に溶解する。Ｓ−５ＥＰＨＡＲＯ５Ｅクロマト
グラフイーによって成分を各々分離する。モノ−Ａ　ｒ
　ｇインシュリンを含む両分を合わせて、水と１：　ｌ
の割合で混合する。次いで、１リットル当り１０ｍ１の
１０％ＺｌＩＣＩ２を溶液に加える。次いで、モノーＡ
ｒｇインシュリンを１）Ｈ６，８で沈澱させ、既知の方
法（インシュリンについて）によって再結晶させる。

例１Ｏ：ヒトインシュリンの調製 例９の方法で調製したモノーＡｒｇインシュリンを、カ
ルボキシペプチダーゼＢ切断の出発物質として用いる。

この目的のために、インシュリン誘導体をトリス緩衝液
（ｐＨ８，５）に溶解して、モノ−Ａ　ｒ　ｇインシュ
リン１グラム当り５ユニツトのカルボキシペプチダーゼ
を加える。緩やかに撹はんしながら室温にて３時間にわ
たって反応を行う。

次いて、産生物を例９に記載のようにしてＺｎＣｌ２で
沈澱させる。次いで、ヒトインシュリンを既知の方法（
ＤＥ−８第２　、６２９　、５６８号明細書）によって
精製する。

ｂｂ− 表３＝ Ｄ　Ｎ　Ａ配列（２３） ＣＣＨＡＴ　　ＧＴＴ　　ＧＣＴ　　ＣＴＴ　　ＴＴＧ
　　ＣＣＡ　　ＴＴＣＴＣＣＴＡ　　ＣＡＡ　　ＣＧＡ
　　ＣＡＡ　　ＡＡＣＧＧＴ　　ＡＡＧ　　ＡＧＣ；（
ＴａｑＩ） ΔＡＣＡＧＴ　ＡＣＴ　ＡＡＴ　ＡＡＣＧＧＴ　ＴＴＡ
　ＴＴＧ　ＴＴＣＴＴＧ　　ＴＣＡ　　ＴＧＡ　　ＴＴ
Ａ　　ＴＴＧ　ＣＣＡ　　ＡＡＴ　ＡＡＣＡＡにＡＴＴ
　ＡＡＴ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＡＴＴ　ＧＣＴ　ＡＧＣＡ
ＴＴ　ＧＣＴＴＡＡ　　ＴＴＡ　　ＴＧＡ　　ＴＧＡ　
　ＴＡＡ　　ＣＣ；Ａ　　ＴＣＧ　ＴＡＡ　　ＣＧＡＧ
ＣＴ　　ＡＡＡ　　にＡＡ　　ＧＡＡ　　ＧＧＧ　　Ｇ
ＴＡ　　ＣＣＣＡ　　ＴＴＴ　　ＣＴＴ　　ＣＴＴ　　
ＣＣＣ（Ｋｐｎ句

【図面の簡単な説明】

第１図（およびそれに続く第１ａ図およびｌｂ図）は、
大腸菌発現ベクターＰＩＫＩＯおよびｐＳＷ３の構築を
示す、説明図である。 第２図（およびそれに続く第２ａ図および第２ｂ図）は
、酵母発現ベクターｐαｆＢ１０２およびｐαｆＢ１０
４の構築を示す、説明図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次式 I で示される化合物。 Ｂ（１−３０）−Ａｒｇ−Ａ（１−２１）（ I ）［式
   中、Ｂ（１−３０）およびＡ（１−２１）はヒトインシ
   ュリンのＢおよびＡ鎖を表す。］２、医薬物として、特
   に糖尿病（ｄｉａｈｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ）の治療
   に、用いるための式 I の化合物。 ３、式 I の化合物を含んでなる、医薬物。 ４、薬理学的に認容できる賦形剤および式 I の化合物
   からなる、医薬物。 ５、次式IIの化合物の調製のための、式 I の化合物の
   使用。 ▲数式、化学式、表等があります▼（II） ［式中、Ａ（１−２１）およびＢ（１−３０）は請求項
   １に記載の意味と同様であり、−Ｓ−Ｓ−架橋はインシ
   ュリンにおけるように、またはインシュリンと同じく、
   好ましくはワン・ポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）反応で、配
   置されるものである。］６、式 I の化合物をコードす
   る遺伝子構造物（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を宿主細胞、好
   ましくは細菌または酵母、において発現させること、お
   よび、遺伝子構造が融合タンパク質をコードする場合に
   は、得られる融合タンパク質から式 I の化合物を遊離
   させること、からなる、式 I の化合物の製造法。 ７、式 I の化合物をコードする、ＤＮＡ。 ８、請求項７に記載のＤＮＡを含んでなる、遺伝子構造
   物またはプラスミド。 ９、請求項８に記載の遺伝子構造物またはプラスミドを
   含んでなる、宿主細胞、好ましくは細菌または酵母。 １０、式 I の化合物、好ましくは次の架橋メンバー（
   ｂｒｉｄｇｉｎｇ　ｍｅｍｂｅｒ）を介して融合タンパ
   ク質の「バラスト部分（ｂａｌｌａｓｔ　ｃｏｍｐｏｎ
   ｅｎｔ）」に結合した式 I の化合物、を含んでなる、
   融合タンパク質。 −Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−