JPH03103177A - 耐熱性アミラーゼ並びにその製造及び使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生澱粉に作用することができる新規な耐熱性ア
ミラーゼ、その製造方法、及び該アミラーゼを使用する
オリゴ糖の製造方法に関する。この酵素の使用により糖
化工程の簡略化及び省エネルギーが可能とする。

〔従来の技術〕

マルトースは澱粉を加水分解して得られる歴史の古い澱
粉糖であるが、近年その食品素材、甘味料としての優れ
た特性から食品加工分野での用途が広がりつつある。精
製マルトースは、輸液用として従来用いられていたグル
コースより優れているため医薬用としての需要が増えて
いる。また、精製マルトースの製造の過程で副或するマ
ル｝｝リオースを含むオリゴ糖は甘味度がマイルドで、
かつ従来のデキストリンを主成分とする水飴より粘度が
低く、また保水性が高いなどの特徴がある為、最近新し
い甘味料として期待されている。

従来、澱粉を加水分解し各種糖を製造する工程において
、澱粉粒を水と共に加熱（８５〜１２０℃）することに
より糊化し、α−アミラーゼによって液化し、次いで夫
々の目的に応じ、グルコアミラーゼあるいはβ−アミラ
ーゼによって糖化する方法が行われている。しかし、高
濃度の澱粉粒の糊化および液化には多量のエネルギーを
必要とする。

また、糊化澱粉の粘度が高い為に特殊な装置を必要とす
る。また、澱粉を高温下に糊化後液化する場合は液化生
戊物の老化および液化生硯物の還元性末端グルコース残
基の異性化により収率の低下が起るとされている。

澱粉を７０℃以下の糊化しない温度で、生澱粉分解性酵
素を作用させ糖化する事が可能となれば、その溶液は低
粘度であり、工程を簡略化出来ると同時にエネルギー的
にも有利となる。また、高温処理による還元性末端グル
コース残基の異性化も少《経済的に有利となる。一部で
生澱粉分解作用の強い糖化酵素を用いた無蒸煮アルコー
ル発酵の検討が行われているが未だ実用化の域に達して
いない。特開昭６０−８３５９５、及び同６１−８３５
９５はアスペルギルス属に属する菌の生産する生澱粉分
解性グルコアミラーゼについて開示している。特開昭６
３−５９８８１、及び同６３−５９８８７はペニシリウ
ム属に属する菌の生産する生澱粉分解性グルコアミラー
ゼがα−アミラーゼとの共存下により高い生澱粉分解性
を示す事を開示している。特開昭６１−４７１８９はフ
ミコーラ属に属する菌の生産する生澱粉分解性グルコア
ミラーゼについて開示している。しかし生澱粉から直接
糖化によりマルトースやマルトトリオースを製造する方
法は報告されていない。

工業的に生澱粉を糖化してマルトース等を製造する際に
は、糖化速度と同時に雑菌による汚染も問題となる。こ
れらの点から反応温度は澱粉が糊化しない範囲において
、出来るだけ高温側が望ましく、従って耐熱性アミラー
ゼが求められている。

マルトースの製造に用いられるβ−アミラーゼは従来は
植物由来の酵素が用いられ、大麦あるいは大豆のβ−ア
ミラーゼがよく知られている。これら植物由来のβ−ア
ミラーゼは反応温度・耐熱性においてあるいは供給の点
で問題がある。したがって工業的使用に耐える熱安定性
や安定供給が可能な微生物由来のβ−アミラーゼが望ま
れている。微生物由来のβ−アミラーゼについては多く
の報告がある（アミラーゼ；中村道徳監修、学会出版セ
ンター、Ｐ　８６　（１９８６）　）。しかしながら微
生物によるβ−アミラーゼの製造はまだ実用化の域には
達していない。

マルトースはβ−アミラーゼを澱粉鎖に使用させてそれ
をマルトース単位に加水分解することにより得られるが
、従来のβ−アミラーゼは澱粉中のα，１−６グルコシ
ル結合を加水分解できず、したがって澱粉からのマルト
ース収率を上げる目的で澱粉中の分枝すなわちα，１−
６グルコシル結合を切断する為にイソアミラーゼ、プル
ラナーゼを併用するのが通常の方法である。しかしこれ
らα，１−６結合を切断する酵素は高価である。

〔発明が解決しようとする課題〕

以上のごとく、澱粉からマルトース又はその他のオリゴ
糖を工業的に製造するには種々の問題点があった。本発
明は、それらの種々の問題点を酵素の面から一挙に解決
しようとするものであり、具体的には、（１〉生澱粉に
直接作用してそれを加水分解することができ、（２）そ
の場合にイソアミラーゼ等のいわゆる枝切酵素を併用し
ないで澱粉を実質的に１００％分解することができ、（
３）その結果、目的とするマルトース及びマルトトリオ
ースを支配的に生成せしめることができ、（４）生澱粉
に作用される際に、雑菌の汚染を有効に防止できる程高
温で使用するのに十分な耐熱性を有し、モして（５）細
菌によって大量に製造することができる新規なアミラー
ゼを提供するものである。本発明はさらに、この新規な
耐熱性アミラーゼの製造方法、及びそれを用いるマルト
ースその他のオリゴ粒の製造方法を提供しようとするも
のである。

〔課題を解決するための手段〕

耐熱性酵素の性質 本発明は第一に生澱粉に作用することができる新規な耐
熱性アミラーゼを提供するものであり、この酵素の一例
を詳細に説明する。なお、以下に示す酵素の性質は後記
する実施例２で得た酵素を用いて得られた結果である。

（１）作用二本発明のアミラーゼは生澱粉に作用し、主
としてマルトース、マルトトリオースとする。特に６０
℃で生澱粉に作用した場合、生澱粉を実質的に１００％
分解する。各種生澱粉に対する分解のし易さは小麦澱粉
〉とうもろこし澱粉〉甘藷澱粉〉馬齢薯澱粉の順である
（第１．図参照）。

また、本発明の生澱粉分解性を有する耐熱性アミラーゼ
は各種生澱粉粒に対し強い吸着力を有し、この吸着力が
生澱粉の分解性を基礎づけている。

（２〉至適ｐＨ及びｐＨ安定性：本酵素の至適ｐＨは６
．０付近である（第２図参照）。各ｐＨの緩衝液中で室
温（２２℃〉にて１時間処理した場合ｐＨ５〜８におい
て９５％以上の残存活性を示す（第２図参照）。

（３）至適温度：ｐ８７．０において測定した至適温度
は７０℃であり（第３図参照）、７０℃で１５分間処理
した場合実質的に不活性化されず、１時間処理した場合
７０℃で９０％以上、７５℃で７０％、８０℃で５０％
の残存活性を有する（第３図参照）。

（４）分子量：ゲル濾過法（ファルマシア製ＦＰＬＳ使
用、カラム：スパーロースＴ　）Ａ　１２、溶出液：０
．２Ｍ−ＮａＣ１含有の５０ｍＭ酢酸一酢酸ナ｝　ＩＪ
ウム緩衡液ｐＨ５．０）にて５２，　０００±５，　０
００である。

（５）紫外吸収スペクトル：リン酸緩衝液中にてμｍａ
ｘ　　：２７５ｎｍ　％及び１９０ｎｍに吸収を示す。

（６）元素分析値：Ｃ；５９．４％、Ｈ　；　６．　４
％、Ｎ；１５．３％。

酸素力価の測定法 本酵素の澱粉分解活性の測定は１％一可溶性澱粉液に一
定量の酵素液を加え、所定のｐＨ及び温度にて反応させ
、５分後に生じた還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸
法（ＤＮＳ法）　〔澱粉・関連糖質実験法、中村道徳他
編、学会出版センター発行４３頁、（１９８６年）〕に
て定量する。１分間にグルコース１μｍｏｌｅ相等の還
元糖を生成する力価を１単位とする。生澱粉の分解性の
測定は、本酵素の一定量を緩衝液に溶した液に生澱粉を
濃度１％となる量を加え、温度３０〜８０℃、ｐＨ４。

０〜９．０にて０〜２４時間振とう後生じた糖を上述の
ＤＮＳ法でグルコースの検量線を用いて測定する。糖化
度はいわゆるＤＥ値で表わす。なお、ＤＥ値は澱粉の分
解の程度を特徴付けるものであり、純デキストロースの
還元力を１００％として、分解された澱粉の還元力を示
す数値である。

生産微生物 本発明においては、前記のごとき性質を有する酵素を生
産することができるバシルス属細菌であればいずれも使
用することができ、このような細菌は、例えば土壌中よ
り次のようにして分離することができる。

２％小麦生澱粉を含む肉エキスーポリペプトン寒天培地
で６０℃において生育するコロニーのうち、ハローを形
或するものを分離し、液体培地に接種、一定時間の培養
後培地中の生澱粉分解活性の強い株を選択する。

この様にして分離された菌株の１つについてその菌学的
性質を詳細に調べ、パージエイズ・マニュアル・オブ・
ディタミネイティブ・バクテリオロジー第７版及び８版
の記載に基づき、本菌株はバチルス・ステアロサーモフ
ィラスに属する菌株と同定し、更に、生澱粉分解性を有
する点で公知菌株のいずれとも相違することから新菌株
であると判断した。そこで、この菌株をバチルス・ステ
アロサーモフィラスＢ−１株と命名し、昭和６３年６月
３０日工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
１０１２０号として寄託し、モして平或元年５月２６日
に微工研条寄第２４４０号としてブタベスト条約に基く
国際寄託に移管した。

バチルス・ステアロサーモフィラスＢ−１の菌学的性質
は以下の通りである。

１．顕微鏡（含電顕）所見 ダラム染色：陽　性 形　　態：桿　菌 大　き　さ：　０．　６　Ｘ　１．　Ｏ　Ｘ　２〜３．
５印多形性：なし 運動性：あり 鞭　　毛：な　し 胞　　　子：あり、椿円形で１〜１．８／Ｍの大きさで
細胞の先端に存在する。

抗酸性：なし ２．培養所見 肉汁寒天平板：２４時間の培養で５ｍｍの径程の不揃い
のコロニー。白色で 辺縁不規則。

肉汁寒天斜面：白色。流れない。

肉汁液体：白濁。白色沈渣 肉汁ゼラチン穿刺：ゼラチンを液化。

リトマス・ミルク：酸性・凝固 ３．生理学的性質 硝酸塩の還元：十 ＭＲテスト： ＶＰテスト： インドールの生成： 硫化水素の生成： デンプンの加水分解性：＋ クエン酸利用性： 硝酸（ＮＯ３−）の利用： アンモニア（ＮＨ４”）の利用：＋ 色素の生成：＋。わずかに水溶性の褐色色素を生成。

カタラーゼ：＋ オキシダーゼ：± 生育の範囲（ｐＨ）：５．５〜８．０ （温度）：４５℃〜７５℃ 酸素に対する態度：好気性 ０−Ｆテスト：０ ４．糖類などの酸化とガス発生“並びに資化能糖類　　
　　酸　　ガス　　資格能 Ｌ−アラビノース　十　　一　　　　＋Ｄ−キシロース
　　十　　一　　　　＋Ｄ−グルコース　　十　　一　
　　　＋Ｄ−マンノース　　＋　　−　　　　＋Ｄ−フ
ラクトース　十　　一　　　　＋Ｄ−ガラクトース　±
　　一　　　　±麦芽糖　　　　　　十　　一　　　　
＋ショ糖　　　　　　＋　　−　　　　＋乳糖 トレハロース　　　＋　　−　　　　＋Ｄ−ソルビット Ｄ−マンニット　　十　　一　　　　＋イノシフト グリセリン　　　十　　一　　　± テ′ンプン　　　　　上　　一　　　　＋５．その他の
性質 生澱粉分解性： 生澱粉含有寒天培地にて本菌 はハローを形或するが、バチ ルス・ステアロサーモフィラ スＩＦＯ　１２５５０　はハローを形或しない。

酵素の製造方法 本発明はさらに、前記のごとき性質を有する耐熱性アミ
ラーゼの製造方法に関し、この方法は、該耐熱性アミラ
ーゼを生産することができるバシルス属細菌を培地中が
培養し、その培養物から該酵素を採取することを特徴と
する。

前述の如き培養に於いて、培地の炭素源としては各種澱
粉、澱粉加水分解物、コーンミール、小麦粉、廃糖密度
等を単独で又は組合わせて使用可能である。これらの使
用量はその種類により異るが０．１％〜３０％が好まし
い。窒素源としては大豆粉、綿実油カス、ペプトン、カ
ゼイン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、無機アン
モニウム塩、無機硝酸塩等を単独で又は組み合わせて使
用することができる。これらの使用量は種類により異る
が０．０５％〜２０％が好ましい。その他リン酸塩、マ
グネシウム塩、ＦｅＳＯ．，　ＫＣＩ，　ＣａＣ１２等
の無機塩類、さらに必要に応じて有機微量栄養源を培地
に添加する事ができる。

本発明のアミラーゼの生産は通常アミラーゼ生産に用い
られる培地中で該アミラーゼ生産能を有する微生物を４
５〜７５℃好ましくは５０〜６５℃の温度、５，５〜８
，０好ましくは６．０〜７，５のｐＨで固体または液体
培養すれば良く、１〜３日で著量の生澱粉分解性を有す
る耐熱性アミラーゼが得られる。

本発明の酵素の精製は、酸素の精製に常用されている方
法に従って行うことができる。例えば、前記のようにし
て得られた培養液をまず、遠心分離、濾過等の方法によ
り処理して菌体を除去する。

こうして得た培養濾液又は上清液を硫分画、さらにはゲ
ル濾過、イオン交換カラム分離等により処理して精製酵
素を得ることができる。

オリゴ糖の製造方法 本発明はさらに、オリゴ糖の製造方法に関する。

本発明の前記酵素を生澱粉に作用させることにより主と
してマルトースとマルトトリオースとから或るオリゴ糖
混合物が生成する。これらを一緒に採取してオリゴ糖製
品を得ることもでき、これらの混合物を常法に従って分
離して、マルトース及び／又はマルトトリオースを単独
に得ることもできる。これらの方法はいずれも本発明の
範囲に属する。

本発明において、オリゴ糖の製造方法で用いる耐熱性ア
ミラーゼは、単に単離又は精製された耐熱性アミラーゼ
を意味するのみならず、この様なアミラーゼを含有する
すべての酵素源を意味する。

すなわち、酵素生産菌を培養して得られた培養液はその
まま酵素源として用いることができ、有利には培養液か
ら菌体を分離し培養濾液又は上清液を酵素液として用い
る。また、必要に応じて硫安分画法、膜分離法、クロマ
ト分離法等通常酵素の精製に用いられる方法による部分
精製品又は完全に精製した高純度酵素として用いること
も可能である。

糖化は生澱粉を水に懸濁し（通常１０〜５０％）、加熱
による糊化を行なうことなく生澱粉分解活性を有する耐
熱性アミラーゼによる直接分解を行なう。この場合従来
の澱粉糖化と異なりいわゆる液化型α−アミラーゼによ
る澱粉の液化は必要としない。生澱粉の糖化は室温〜７
０℃、ｐＨ４．５〜９．０にて行なう。澱粉の糊化温度
は、澱粉の種類により異なりこの場合澱粉が糊化せず粒
状を保つ範囲で反応温度を高温とするのが望ましい。よ
り好ましくは５０〜６５℃、ｐＨ５〜８が望ましい。分
解反応は静置して行なうことも可能であるが、澱粉乳が
均一に懸濁する程度に攪拌して行なうのが望ましい。

澱粉１ｇあたりの酵素の使用料は１〜３００単位が適当
であるが、反応温度、反応時間により酵素量を加減する
のが望ましい。分解される澱粉は、地下澱粉、地上澱粉
にかかわらず用いることができる。各種澱粉の分解のし
やすさは小麦澱粉〉とうもろこし澱粉〉かんしょ澱粉〉
馬鈴薯澱粉の順である。

次に実施例を挙げて説明する。

実施例１．酵素生産のための培養 ０．５％肉エキス、ｌ％ポリベプトン、０．５％ＮａＣ
１および可溶性澱粉１％を含みＮａＯＨにてｐＨ７．０
に調整後滅菌処理した培地にバチルス・ステアロサーモ
フィラスＢ−１株を植菌し５５℃にて２４時間振とう培
養を行った。菌体を遠心分離により除去した上澄はアミ
ラーゼ活性１．０６単位／ｒｄ！を示した。

実施２．酵素の精製法 培養液を遠心分離（１０．００Ｏｒｐｍ　，　２０分間
）し、菌体を除いた上澄液に硫安を７０％飽和となる様
に添加し２４時間放置した。遠心分離（１０．　００Ｏ
ｒｐｍ、２０分間）により粗酵素沈澱を得た。粗酵素を
１０ｍ！４−リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶し、不溶
物を遠心分離（１５．０００ｒｌ）ｍ　，　２０分間）
した後、上澄液をセファデックスＧ−１００を用いゲル
濾過を行いアミラーゼ活性を示す分画を分散した。

次いテＤＥＡＩＥセルロース３２にアミラーゼ活性分画
を吸着させ１０ｍＭ−！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ８．５）で
溶出しアミラーゼ活性分画を採取した。再度ＤＥＡＥセ
ルロース３２にアミラーゼ活性分画を吸着させ１０ｍＭ
−！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出しアミラーゼ活
性分画を採取した。純水にて透析後凍結乾燥し酵素標品
を得た。本酵素標品はディスク電気泳動的に単一バンド
を示した。この精製の経過を第ｌ表に示す。

第　　１　　表 各精製工程の収率と比活性 培養液　　　　　　　　　１００　　　　　１．００７
０％硫安分画　　　　　　４０６、２５セファデックス
Ｇ−１００　　　２４　　　　　７．２０ＤεＡＥセル
ロース　　　　　　　６．７　　　　３５．０５０ｍｌ
！容三角フラスコに４０ｍｇの各種生澱粉を入れ、リン
酸緩衝液（ｐＨ　７．　２　）で調製した酵素溶液４　
ｒｒＩ！（５．　９２５単位、６０℃）を加えて５０℃
、６０℃で振とうした。毎６時間目にサンプリングし、
遠心分離（１．　００Ｏｒｐｍ，　５分間）し適当に希
釈後生じた還元糖をＤＮＳ法にて測定した。生じた還元
糖量はＤＥ値にて示した（第１図）。生澱粉分解により
生じた還元糖の組戊はＨＰＬＣ法（装置：日立６６５Ａ
　−　１２ＬＣ、検出器：示差屈折計ウォータースＥｌ
ｅｃｘｔｒｏｎｉｃｓ　［Ｉｎｉｔ　，カラム：半井Ｃ
ｏｓｍｏｓ　ｉ　ＩＰａｃｋｅｄカラム４．　６　ｘ１
５０　ｍｌｌ＋，溶離液：アセトニトリル／水＝７５／
２５）により分析した。生じた還元糖中でマルトースが
主戊分で次いでマルトトリオース、グルコース（マルト
ース〉マルトトリオース〉グルコース）であった。ＤＥ
値および還元糖組或を勘案すると６０℃での生ｉｌ粉分
解率はほぼ１００％であった。

実施例４． とうもろこし澱粉を５ｇ秤量し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（
ｐＨ６．　０　）　１５−に懸濁し、耐熱性アミラーゼ
５０単位含有するように調製した酵素液５ａｉ’を加え
５５℃で１２時間振とうした。反応液をＨＰＬＣ法（装
置：日立６６５−１２ＬＣ、検出器：示差屈折計ウォー
タースＥ１ｅｃｔｏｒｏｎ＋ｃｓ　Ｌｌｎｉｔ，カラム
：半井Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　Ｐａｃｋｅｄ力ラム４．　６
　Ｘ１５０　ｍｍ，溶離液：アセトニトリル／水＝７５
／２５）により分析した。

反応に用いた澱粉に対してグルコース２，６％、マルト
ース５６．５％、マルトトリオース３２．８％が生成し
た。

実施例５． 実施例２の基質を小麦粉澱粉に変え、反応温度を６０℃
とした以外はすべて実施例２に記載した方法と同一の方
法のよって生澱粉の分解を行なったところ、グルコース
２．　１％、マルトース５１．　３％、マルトトリオー
ス３９．４％を含有するオリゴ糖液が得られた。

実施例６． とうもろこし澱粉、馬鈴薯澱粉、かんしょ澱粉、及び小
麦澱粉をそれぞれ５ｇずつ秤量し、耐熱性アミラーゼ１
００単位を含む０．　１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）
を加え、６０℃で２４時間振とうした。反応液中の糖を
ＨＰＬＣで分析したところ各反゜応液の組戊は第２表に
示す如くであった。

第２表 反応液中の糖組或（％） 澱粉の種類　　グルコース とうもろこし　　３．２ 馬鈴薯　　　　　３．７ かんしょ　　　　　３．５ マルトース　マルトトリオース ５０．　７　　　　　　３６．　５ ５２．　８　　　　　　３３．　４ ５５．　５　　　　　　３０．　８ 〔発明の効果〕 マルトース、マルトトリオースを製造するに際して、生
澱粉分解活性を有する耐熱性アミラーゼを用い生澱粉を
直接分解する本法を採用すると、従来のβ−アミラーゼ
を用いる方法と比較し、いわゆる枝きり酵素を必要とせ
ず用いる、また装置的、エネルギー的に有利な殿粉糖化
プロセスを構築することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の生澱粉分解活性を有する耐熱性アミラ
ーゼによる各種生澱粉の分解タイムコースを示すグラフ
である。 第２図において、左側は該酵素の至適ｐＨを示すグラフ
であり、そして右側は該酵素を各ｐＨで室温（２２℃）
、ｌ時間処理した時の残存酵素活性を示すグラフである
。 第３図において、左側は該酵素の至適温度を示すグラフ
であり、そして右側は温度安定性すなわち各温度で一定
時間処理した後の該酵素の残存酵素活性を示すグラフで
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の性質： （１）作用：生澱粉に作用して主としてマルトース及び
   マルトトリオースを生成し、６０℃において生澱粉を実
   質的に１００％分解する； （２）至適ｐＨ：６．０付近； （３）ｐＨ安定性：緩衝液中で室温にて１時間処理した
   ときｐＨ５〜８において９５％以上の残存活性を示す； （４）至適温度：７０℃； （５）温度安定性：ｐＨ７．０にて７０℃で１５分間処
   理した場合実質的に失活せず、７０℃で１時間処理した
   場合９０％以上の残存活性を示す；並びに （６）分子量：ゲル濾過法にて測定した時５２，０００
   ±５，０００； を有する耐熱性アミラーゼ。 ２、次の性質： （１）作用：生澱粉に作用して主としてマルトース及び
   マルトトリオースを生成し、６０℃において生澱粉を実
   質的に１００％分解する； （２）至適ｐＨ：６．０付近； （３）至適温度：７０℃；並びに （４）分子量：ゲル濾過法にて測定した時５２，０００
   ±５，０００； を有するバシルス属（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細菌によ
   り生産される耐熱生澱粉アミラーゼ。 ３、請求項１に記載の耐熱性アミラーゼの製造方法であ
   って、該アミラーゼを生産する能力を有するバシルス属
   細菌を培地中で培養し、培養物から該アミラーゼを採取
   することを特徴とする方法。 ４、前記バシルス属細菌がバシルス・ステアロサーモフ
   ィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ
   ｈｉｌｕｓ）Ｂ−１株である請求項３に記載の方法。 ５、マルトース及びマルトトリオースを主成分とするマ
   ルトオリゴ糖を製造する方法であって、請求項１又は２
   に記載の耐熱性アミラーゼを生澱粉に作用させることを
   特徴とする方法。 ６、マルトース及び／又はマルトトリオースの製造方法
   であって、請求項１又は２に記載の耐熱性アミラーゼを
   生澱粉に作用させることによってマルトース及びマルト
   トリオースを主成分とするマルトオリゴ糖を生成せしめ
   、次にマルトース及び／又はマルトトリオースを単離す
   ることを特徴とする方法。