JPS5838155B2 - オリゴ糖の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、でん粉からマルトヘキサオースを含有する糖
化物を製造する方法に関するものである３従来、アミラ
ーゼとしては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グル
コアミラーゼなど、でん粉に対する分解様式を異にする
種々のアミラーゼが知られ、グルコースやマルトースの
製造に使用されてきた。

そして最近は、より分子量の太きい、例えば、マルトト
リオースＧ３、マルトテトラオースＧ４），マルトベン
クオースＧ５、マルトヘキサオース０６などのオリゴ糖
製造技術の開発が要望されている。

これらの糖は食品の甘味料、栄養剤、増量剤、賦形剤、
包接剤として食品及び薬品工業に広く使用できるものと
考えられている。

そして現在までに、例えば、マルトトリオースについて
はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒ ｉｃｅｕｓの生産
するＮ−Ａ４６８酵素←持開昭５１−９７３９号及び特
開昭５１−１１００４９号）が知られ、マルトテトラオ
ースについてはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓ ｔｕｚ−
ｅｒｉのアミラーゼ｛Ａｒｃｈｉｖｅ ｏｆ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉ−ｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ
第１４５巻、１０５〜１１４頁（１９７１年）｝が知
られている。

そしてマルトヘキサオースについては， Ａｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓの生産する細胞壁に結合す
るアミラーゼが、でん粉をその非還元性末端からマルト
ヘキサオース単位で加水分解すると云われている｛特開
昭４８−３９６８８号、特開昭４８−３９６４９号及び
Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ−ｉｃａ
Ａｃｔａ第４１０巻、３３３〜３４６頁（ １ ９７
５年）｝。

本発明者は、でん粉又はその部分分解物からオリゴ糖生
産能の強い微生物を求め検索を行ってきた結果、一種の
α−アミラーゼがでん粉からマルトヘキサオースを主成
分とする糖化物に分解するアミラーゼを菌体外に著量に
生産することを認めた。

そして、この酵素によるでん粉の糖化条件について詳細
に検討を行った結果。

でん粉を先づ、酸又はα−アミラーゼにより液化した液
化でん粉のＤＥ（固形分中の還元糖をグルコースとして
表わした１００分率）が約２以上約１５以下のものを使
用したとき、マルトヘキサオースの収量が最も高く、且
つ マルトヘキサオースＧ６以外のグルコースＧ１，マ
ルトースＧ２、マルトリオースＧ３、マルトテトラオー
スＧ４とマルトペンタオースＧ５の生成量が少なく抑え
ることがわかった（第１図）。

そしてＤＥ約２以下及びＤＥ約２５以上ではマルトヘキ
サオースの収量が少なくなるはかりか、ＤＥ約１５以上
では、Ｇｌ，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４とＧ５の生或量が多くな
ることがわかった。

糖化物中にＧｌ，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４とＧ５の成分が多く
なると、Ｇ６の分離精製は当然のことながら著しく困難
となり、且つ、糖化物中のマルトヘキサオースの収量が
相対的に低下する。

更に、本発明者は、アミラーゼＧ６で液化でん粉を糖化
するに際し、液化でん粉の濃度を約５％（Ｗ／’Ｖ）以
上で行うとき、マルトヘキサオースの収量が高くなるば
かりでなく、Ｇｌ ， Ｇ２ ，Ｇ３ ，Ｇ４とＧ５の
生成量を低く抑えることができることを認めた。

液化でん粉濃度は濃いほど望ましいが、ＤＥ約２〜約１
５の液化でん粉の溶解性と高濃度基質での酵素反応阻害
を考慮すると、実質的には約４０％以下が望ましい。

本発明は、これらの知見にもとずいてなされたものであ
る。

すなわち、本発明はでん粉からマルトヘキサオースを生
成するアミラーゼＧ６を、ＤＥ２以上１５以下、且つ約
５％以上の液化でん粉に作用させることを特徴とするア
ミラーゼＧ６によるマルトヘキサオースの製造方法に関
するものである。

以下に本発明の内容をより具体的に説明する。

本発明でいうアミラーゼＧ６とは、以下に示す酵素的性
質を有するものであり、例えば、微生物工業技術研究所
に寄託されている微工研菌寄第５８５３号など、バシル
ス属細菌により生産されるものである。

アミラーゼＧ６の酵素的性質 （１） 作用：でん粉、アミロース、アミロペクチン
、デキストリンなどからマルトヘキサオースを主成分と
する糖分解物を生戒する。

生成物がα一型であり、一種のα−アミラーゼである。

マルトヘキサオースの゛収量は基質の液化度に依存する
か通常、２５〜３５係である。

可溶性でん粉に対するｋｍは約０．０６５％。

可溶性でん粉を基質としたときの典型的な糖化物の組成
は第１表に記載されている通りである。

（２）作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ ： ｐＨ ４〜
１１の範囲に作用し、最適ｐＨは８付近｛１条可溶性性
でん粉、０．０５ＭトＩＪス緩衝液の下で、４０℃でｌ
時間反応｝ （３）作用温度範囲及び最適作用温度：約７０℃まで作
用し、最適作用温度は約６０℃｛１係可溶性でん粉、０
．０ ５Ｍ トＩＪス緩衝液の下で、各温度で３０分間
反応｝ （４） ｐ｝１安定性：ｐＨ約５〜約１１で安定｛０
．０５Ｍ緩衝液の下で３０℃で３時間放置後、残存活性
を測定｝ （５）熱安定性：０．０５ＭトＩＪス緩衝液の下で、各
温度で１０分間加熱後、残存活性を測定した。

その結果、５０℃１０分間の加熱で約１０φ失活し、５
５℃１０分間の加熱で約５０係失活し６０℃１０分間の
加熱で約８０％失活した。

（６冫 阻害剤二本酵素は５Ｘ１０−’ＭのＨｇ０１２
，ＦｅＳ０４ｔ Ｏ ｏｃｌ ２ ｔ ＺｎＳＯ４ ｊ
ＣｕＳ０４ により、それぞれ約９９％、約８９俤
、約７９優、約７６饅、約６６φ阻害された。

又５Ｘ１０−５ＭＣａＣＩ２ によっても約４０饅阻
害された。

（７）安定化：カルシウムによる熱安定性の増加は認め
られなかった。

（８）精製方法：本酵素は培養済液から硫安４０〜７０
φ飽和で沈殿物として回収され、次いで、ＤＥＡＥ−セ
ファローズ・カラムクロマトグラフイ−（０．０２５Ｍ
ＩＪン酸緩衝液に溶解した塩化カリウム０．２〜０．６
Ｍでグラジエント溶出）同カラムによる再クロマトグラ
フイー、セファデツクスＧ−２００ガラム・クロマトグ
ラフイーによりクロマト的に単一アミラーゼに精製する
ことができる。

（９）分子量：セファデツクスＧ−２００カラム・クロ
マトグラフイーによる分子量は約７６０００であった。

（１０）力価測定法二本酵素の活性測定は、０． １
Ｍ ｝リス緩衝液に溶解させた１饅可溶性でん粉０．５
７７１ｌに適量の酵素を加え、水で全量１７ｎｊ！とじ
、４０℃で反応させる。

この条件で１時間に１９のグルコースに相当する還元力
を生成する酵素量を１単位とした。

以上の酵素的性質について、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅ
ｒｏｇｅｎｅｓの酵素と比較した結果を第１表に示す。

第１表から明らかなように、本発明のアミラーゼＧ６に
よるでん粉糖化物は、主戒分であるマルトヘキサオース
の他に、反応初期よりマルトースマルトトリオース、マ
ルトテトラオース及びマルトペンタオースを生成するこ
とから、でん粉性基質の非還元性末端からマルトヘキサ
オース単位で分解する酵素と断定できない。

本発明のアミラーゼＧ６はＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅ
ｒｏｇｅｎｅｓの酵素に比べアルカリ性側に安定であり
、作用ｐＨもアルカリ性側にある。

又、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓのアミ
ラーゼＧ６はカルシウムイオンにより熱失活から保護さ
れるのに比べ、本発明のアミラーゼＧ６にはこのような
効果は認められない。

本発明のアミラーゼＧ６は菌体外に生産される酵素であ
るが、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓの酵
素は細胞壁に結合した酵素である。

なお、本発明はアミラーゼＧ６生産能を有する微生物の
アミラーゼＧ６に適用することができるが、例示菌とし
て、微工研菌寄第５８５３号を使用して、以下に具体的
に説明する。

本菌は下記の菌学的性質を有する。

（１）形態：単桿菌、大きさ０．７〜１．ＯＸ２．４〜
４．０μ、非運動性、ダラム陰性 （２）胞子：胞子嚢細胞はふくらみ、球形〜楕円形の胞
子を形成する。

（３）ゼラチン：殆んど液化しない。

（４）肉汁寒天：生育中程度、表面平滑で薄く、半透明
乳白色。

（５）グルコース肉汁寒天：肉汁寒天培地よりも生育不
良。

（６）クエン酸寒天：わずかに生育。

（７）グルコース硝酸塩寒天：わずかに生育。

（８）肉汁：わずかに混濁、沈澱する。

（９）食塩肉汁＝１〜８φ食塩濃度でも生育、ＩＯ饅食
塩濃度では生育しないが、わずかに生育。

（１０）ミルク：ゆっくり凝固、その後ペプトン化。

αυ ポテト：生育微弱。

（１２）チロシン寒天：生育中程度、チロシナーゼ陰性
。

α３）グルコースーアスパラギン寒天：生育微弱。

０４）インドール：生成しない。

０５）アセチルメチルカルビノール：生成スる。

α６）硫化水素：生成する。

（１７）硝酸塩の還元：陰性 αね ウレアーゼ：生成Ｌない （１９）カタラーゼ：生成しない （２０）グルコース肉汁培地のｐＨ：約５（２１）でん
粉の加水分解：陽゛性 （２２）炭水化物の利用：グルコース、フラクトースマ
ンノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、シュー
クロース、ラクトース、マルトースラフイノース、マン
ニトール、イヌリン、でん粉、Ｌ−ソルボース、ソルビ
トールヲ利用生酸するが、ガスの発生なし （２３）生育温度：最適生育温度は３５〜４５℃、最高
生育温度は５０〜５５℃ （２４）死滅温度： ｉｏｏ℃で１０分間加熱しても死
滅しない。

（２５）最適生育ｐＨ：８〜９ 以上の医学的性質について、Ｂｅｒ ｇｅｙ＋ ｓＭａ
ｎｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏ−１ｏｇｙの第７版及び第８版（Ｔ
ｈｅ Ｗｉ Ｉ ｌ ｉａｍ ｓ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ
Ｃｏｍｐａｎｙ １ ９ ５ ７年及びｌ９７４年）
を参照し、本微生物はバシルス・サーキュランスに近縁
の微生物であると思われる。

本発明による酵素生産のための培養は、通常用いられる
固体培地または液体培地が使用され、液体培養のための
培地の炭素源としては、ペプトン肉エキス、酵母エキス
、カゼイン、コーン・ステイープ・リカーなとのいずれ
かと、炭素源としてでん粉、デキストリン、マルトース
、グルコース、シュークロースなどのいずれか、及びこ
れを補足する無機窒素源、リン酸塩、マグネシウム塩及
び少量の金属塩を含む培地が使用される。

培養温度は２５〜５５℃、ｐＨ７〜９で行う。

アミラーゼＧ６は菌体外に生産される酵素であるので、
培養終了後、炉過又は遠心分離して除菌し、上澄液を回
収する。

そして、必要に応じて濃縮し、硫安、硫酸ナトリウムな
どによる塩析、又はアセトン、エタノール、メタノール
、イソプロパノールなどの有機溶剤を加え、酵素を沈澱
物として収得する。

本発明において使用される、液化でん粉は、各種でん粉
を酸又はバシルス属ａ−アミラーゼを用いて、通常ので
ん粉の液化方法により製造される。

液化方法の詳細については例えば、シュガーハンドブッ
ク（浜口栄次郎、桜井芳人編、朝倉書店、Ｐ４８７〜６
１０）に記載されている。

糖化反応は、通常、ｐＨ６〜９、望ましくはｐＨ７．５
〜８．５、温度４０〜６０℃で行われる。

以下に実施例により本発明の詳細を説明する。

実施例 １ ２ｌの三角フラスコに、カツオ肉エキス５％、Ｋ２ＨＰ
Ｏ４０．３咎、ＭｇＳ０４・７Ｈ２０ ０．１係、可溶
性でん粉１饅からなる培地４００ｒｕｌを入れ、常法に
より殺菌後、バシルス・サーキュランスＧ６（微工研菌
寄第５８５３号）を接種し、３０℃で４８時間振盪後、
得られた上澄液について生産されたアミラーゼＧ６を測
定した結果、培地ｍｌ当り４１．１単位であった。

この上澄液２２ｌから硫安４０〜７０φ飽和沈澱区分を
集め、蒸溜水で透析した（２５０ｍｇ）。

このもののアミラーゼＧ６活性は２５３単位／ｒｕｌで
あった。

ポテトスクーチを常法により、市敗バシルス・ズブチル
スのα−アミラーゼ（大和化成製、商品名クライスラー
ゼ）で液化調製した、ＤＥ１．５〜２７の液化でんぷん
、各１００Ｔｌ？に前記の酵素剤各０．７単位を添加し
、全量１ ｍｌｐＨ ８ 〜８． ５で、５０℃で反応
させた。

経時的（７，１０．１３時間後）に一定量試料を採取し
、液体クロマトグラフ（カラム、昭和電工株式会社製Ｎ
Ｈ ｐａｃｋ Ｊ−４１１、溶出液アセトニｌ− ＩＪ
ル６５％、水３５％）で分離定量した。

同時に溶出液を分画採取し、蒸発乾燥後、蒸溜水に溶解
し、フエノールー硫酸法で定量した。

得られた各種ＤＥ糖化物のうち、マルトヘキサオース含
量が最高値を示した糖化物の糖組成を第１図に示す。

図から明らかなように、マルトヘキサオーズの収量はＤ
Ｅ２．４〜１２．６のの範囲において、ほゾ一定し、約
３０優の収量で得られたが、クルコース、マルトース、
マルトトリオース、マルトヘキサオースとマルトペンタ
オースはＤＥが高くなるにつれて増加し、特に、ＤＥが
約Ｘ１０以上、特にＤＥ約１５付近から、著しく増大す
ることが明らかになった。

また、ＤＢが約２以下では、マルトヘキサオースの収量
が低下することがわかった。

実施例 ２ 第２表記載の各量の液化でん粉（ＤＥ４．３）に実施例
１で調製したアミラーゼＧ６酵素剤を、液化でん粉ｇｒ
当り０．７単位添加し、全量約１ＴｌｌにしｐＨ８〜８
．５で５０℃で反応させた。

経時的に試料を採し、実施例１と同様にして、糖化物中
の糖組成を定量した。

第２表及び第２図は、マルトヘキサオースの生或かほゾ
最高値を示したときの糖化物の糖組威を示している。

第２図から明らかなように、糖化物のマルトヘキサオー
スの含量は各基質濃度において、ほゾ一定（３１〜３
５％ ）を示した。

しかし、糖質濃度が約５係以下では、マルトース、マル
トトリオース、マルトテトラオース及びマルトペンクオ
ースの含量が多くなること特に、マルトースとマルトテ
トラオースの含量が多くなることがわかった。

これは、低濃度の基質下では、生成ずたマルトヘキサオ
ースがマルトースとマルトテトラオースに分解されやす
いためと考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各種ＤＥの液化でん粉をバシルス属アミラー
ゼＧ６で糖化した時の糖化物中のグルコースＧ１，マル
トースＧ２、マルトトリオースＧ３、マルトテトラオー
スＧ４、マルトペンタオースＧ５とマルトヘキサオース
Ｇ６含量を示す。 第２図は、各種濃度の液化でん粉を使用したときのＧ１
，Ｇ２，Ｇ３ ，Ｇ４ ，Ｇ５とＧ６含量を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ でん粉からマルトヘキサオースを生成するアミラー
   ゼＧ６をＤＥ約２以上約１５以下、且つ約５斜以上の液
   化でん粉に作用させることを特徴とするアミラーゼＧ６
   によるマルトヘキサオースの製造力法。