JPH03183495A

JPH03183495A - 単一の分子量を有するアミノ酸オリゴマーの酵素的合成方法

Info

Publication number: JPH03183495A
Application number: JP24943889A
Authority: JP
Inventors: Hiroki Ri; 李　浩喜; Hideaki Fukushi; 英明福士; Masazumi Uchino; 正純内野; Kaoru Oyama; 大山　薫
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1989-09-26
Filing date: 1989-09-26
Publication date: 1991-08-09
Anticipated expiration: 2011-08-14
Also published as: JP2525253B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はプロテアーゼを用いた単一の分子量を有するア
ミノ酸オリゴマーの酵素的合成方法に関する。アミノ酸
オリゴマーは、生体適合材料、機能性担体、膜材料、エ
レクトロニクス材料としての利用のばかドラッグデリバ
リ−システムの基材として重要である。

［従来の技術］アミノ酸オリゴマーの製造方法としては化学的な方法、
微生物発酵法若しくは酵素的合成方法が知られている。

このうち代表的な化学的合成法としては、α−アミノ酸
からＮ−カルボキシ−α−アくノ酸無水物（ＮＣＡと略
す）を合成し、適当な重合開始剤の存在下、重合させる
ＮＣＡ法が挙げられる。

ＮＣＡ法以外の化学的合成法としては活性エステルによ
る方法、混合酸無水物、Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシルカ
ルボシイ主ドなどの縮合剤を用いる方法がある。微生物
発酵の例としてポリグルタミン酸、ポリリジンの合成が
、報告されている。又、酵素的合成方法としてはタンパ
ク質分解酵素（プロテアーゼ）によるタンパク質加水分
解反応の逆反応あるいはエステル交換反応を利用した合
成法が報告されている。

［発明が解決しようとする課題］化学的合成法のうちＮＣＡ法は、アミノ酸オリゴマー若
しくはポリマーの合成に最も汎用的に用いられている方
法であるがその使用にあたっては幾つかの制限がある。

すなわち、極めて毒性の高いホスゲンを使用するアミノ
基のホスゲン化工程が含まれることや側鎖にアミノ基、
カルボキシル基、水酸基、チオール基などの官能基を有
するアミノ酸誘導体を用いる場合には合成の前に適切な
保護基によりこれら官能基を保護し、合成終了後その脱
保護が必要であるなど合成工程が複雑になる。

更にホスゲンまたは重合開始剤や生成するオリゴマーを
溶解する適切な有ｍ溶媒を選択する必要がある。その他
、一般に化学的合成法では操作が多段階に互りさらに生
成物のラセミ化を伴うことが多く光学活性なポリマーを
得ることは困難である。

一方、微生物発酵によるアミノ酸オリゴマーポリマーの
合成では目的物を効率良く産生ずる微生物のスクリーニ
ング、改質に莫大な労力が必要であり、培地の成分に生
成物が左右されることや得られるオリゴマーは一般的に
分子量分布の極めて広いものが得られるなどの短所があ
る。

これに対して、酵素によるペプチド合成では、反応を水
溶液系または有機溶媒を含む水溶液系において穏やかな
条件下で反応を行う事ができ、ラセミ化が起こらず高い
光学純度を有する生成物を得ることが可能であるとされ
ている。

しかし、これまでじ開示されたプロテアーゼによるペプ
チド合成反応は、同種または異種のアミノ酸あるいはそ
の誘導体間に加水分解反応の逆反応を利用し、ペプチド
結合を形成させるものであるが、生成物が各ｆ！溶媒に
溶けにくいため分析手段がなく単離、構造解析された例
は少ない。

前記のごとくアミノ酸オリゴマー若しくはポリマーの化
学合成では、極めて毒性の高いガスを使用することやア
くノ酸側鎖への保護基の導入、脱保護や生成物のラセミ
化など合成工程が煩雑であった。

そこで、本発明者は、均一な重合度を有するアミノ酸オ
リゴマーを単一の操作で合成できる反応系を検討してき
た。アミノ酸誘導体を基質としてプロテアーゼを用いた
酵素反応の諸条件（ｐＨ，）Ｊｔ街液の種類、塩濃度、
反応温度０反応時間、基質／酵素の比率など）を極々検
討した結果、単一の操作で阜−の分子量を有するアミノ
酸オリゴマーを得る合成法を確立した。実施例に示すよ
うに本発明によりラセミ体など光学的に不純なアくノ酸
エステルを出発原料として光学活性なアミノ酸オリゴマ
ーを得ることが可能となった。また文献（）ｌｅｌｖｅ
ｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ、　６２．４８８
（１９７９）及びＪ、　Ｃｈｅｗ、　Ｔｅｃｈ、　ＢＩ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ、、　３５Ｂ、　２８２（＋９８５）
）に開示されているところではロイシンあるいはフェニ
ルアラニンのメチルエステルは単独ではオリゴマーを生
成しないとされている。しかし、本発明によりこれらの
アミノ酸のメチルエステルを基質としてそのホモオリゴ
ペプチドの製造が可能となった。

［問題点を解決するための手段］本発明は、下記（１）の構成を有する。

（１）　アミノ酸誘導体を用いて単一の分子量を有する
α−アミノ酸オリゴマーを製造し、または２種以上のア
ミノ酸誘導体を用いて単一の分子量を有するコオリゴマ
ーを製造する方法において触媒としてプロテアーゼを用
い、ワンポットで合成することを特徴とするアミノ酸オ
リゴマーの酵素的合成方法。

本発明の構成と効果につき以下に詳述する。

本発明を概説すれば、セリンプロテアーゼ若しくはシス
ティンプロテアーゼで例示される酵素による単一の分子
量を有するアミノ酸オリゴマーの簡便１（酵素的製造法
であって、基質としてアミノ酸または、そのカルボキシ
ル末端をエステル化した種々の天然アミノ酸を用い、緩
衝液中でプロテアーゼの存在下反応させ、生成物を沈殿
物として反応系外に出すことにより均一な分子量を有す
るホモまたはコポリアミノ酸を合成する方法に関する。

本発明に用いられる酵素としては、キモトリプシン、ト
リプシン、ズブチリシン、カルボキシペプチダーゼなど
のセリンプロテアーゼ、パパイン、プロメイン、フィシ
ンなどのシスティンプロテアーゼ、サーモライシンなど
の金属プロテアーゼである。これら酵素をそのまま、ま
たはポリエチレングリコールなどの修飾剤で修飾して用
いる事もできる。

基質としては、２０ｆ！の天然ア主）酸およびその他の
合成アミノ酸または、そのエステルを用いる事ができる
。ただし、酵素のもつ基質特異性により基質を選ぶ必要
がある。エステルとしては、アルキル、アリール若しく
はフェニルエステルなどが使用出来る。

緩衝液のｐＨは、２−１０の領域で用いる事ができるが
、個々の酵素はそれぞれ至適ｐＨを有している０例えば
、パパインでは６−８、キモトリプシンでは７付近、ペ
プシンでは４付近である。ｍＷＩ液用の塩は、酢酸塩、
リン酸塩、コハク酸塩、炭酸塩を０．１Ｍ−８の領域で
用いることができるが好ましくは０．５−２Ｍである。

本発明の方法において基質と酵素の使用比率は、　１０
０倍からｔｏ、ｏｏｏ倍であるが好ましくは１．０００
−　２，５００倍である。

反応温度は、０度から８０度（摂氏）で好ましくは、２
０度から４０度で、反応終了は生成物が完全に沈殿する
時点でもって終点とする。

本発明により、ラセミ体アミノ酸エステルを出発原料と
して光学活性なアミノ酸オリゴマーを得ることが可能に
なった。

以下、実施例によって本発明を説明する。

１［例１　　　（Ｌ−ロイシンのオリゴマーの合成）１
８２ＩＩｇのＬ−ロイシンメチルエステル塩酸塩の０．
５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液　（ｐＨａ、５）ｉｏ■ｌに
溶解し、あらかじめ還元剤ジチオスレイトール、および
エチレンジアミン四酢酸で活性化したパパイン（シグマ
社、タイプＩＩＩ　）をｌＯμＭとなるように加え、２
５℃にて緩やかに２日間振どう攪拌する。

反応液より析出した沈殿を濾取し、数回純水にて洗浄す
る。得られた結晶を自然乾燥し、９３−ｇのＬ−ロイシ
ンのオリゴマーを得た（収率５１％）、生成物をＦＴ−
ＮＭＲ，ＦＡＢ−ＭＳなどで分析したところ、スペクト
ルより明らかなとおり６量体オリゴペプチドであった。

’ＨＮＭＲ（ＣＦ、ＧＯＯＤ−ＴＭＳ）δ：　４．４８
　（１）１．ｔ、−Ｃ）Ｉ−）Ｎ−末端メチン、４．８
５−４．７６　（ＩＨ，ａ、−ＣＨ−）　Ｎ−末端以外
のメチン、前者と後者の比率は１：５゜ＦＡＢ−ＭＳｍ／ｅ　：　７１１（Ｍ＋Ｈ）、５８２，５６８，４２
７，３７１，３５４，３３７゜２８４．２５６，２４３
，２００，１４５．８６いずれも６量体のフラグメント実施１１ｄ２（Ｌ−フェニルアラニンオリゴマーの合成
）２１８１ｇのし一フェニルアラニンメチルエステル塩酸
塩を用いること以外、酵素、反応温度、反応時間、基質
／酵素の比率などの諸条件を実施例１と同じにして反応
した。

８８ｍｇのし一フェニルアラニジメチルエステルオリコ
マーヲ得た（収率４Ｇ、７％）　、　ＦＴ−ＮＭＲ及び
ＦＡＢ−ＭＳによる分析の結果得られたものは５量体オ
リゴマーであった。

’ＨＮＭＲ（ＣＦ、ＧＯＯＤ−ＴＭＳ）δ：　４．６３
　（ＩＨ，ｔ、−Ｃ：Ｈ−）Ｎ−末端メチン、４．８３
−５．００　（１）１．ｍ、−Ｃ）ｌ−）　Ｎ−末端以
外のメチン、前者と後者の比率は１：４゜ＦＡＢ−ＭＳ＋＊／ｅ　：　７５４　（（Ｍ−Ｃ）Ｉｓ）＋２Ｈ）　
、７０８，６２１，２９５，２６７゜１４９．１２１，
１１９．５７いずれも５量体のフラグメント実施例３　　（Ｌ−ロイシン及びし−フェニルアラニン
のコオリゴペプチドの製造法）Ｌ−ロイシンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−フェニルアラ
ニンメチルエステル塩酸塩を下表のモル比率で加えたｐ
ｎ　ａ、ｓの炭酸ナトリウムｌＩ衝液にパパインを各１
１μＭ加え、実施例１と同様に２５℃にて振とう攪拌す
る。得られた生成物は、ＦＴ−ＮＭＲの結果ロイシン、
フェニルアラニンを当初の混合モル比で含むオリゴコベ
ブチドであった。

’ＨＮＭＲ（ＣＦｓＣＯＱＤ−ＴＭＳ）δ：　７．４２
−７．Ｈｌ　　（５）１．＊、フェニル）、１．０５−
０．９８（２Ｘ　３Ｆｌ、ｍ、−Ｃ８４）表実施例４（Ｄ、Ｌ−ロイシンメチルエステル（ラセ果体
）よりＬ−ロイシンメチルエステルオリゴマーの合成）３Ｂ４＋ｅｇの［１，Ｌ−ロイシンメチルエステル塩酸
塩を用いること以外反応の諸条件を実施例１と同じにし
て反応した。　７Ｇ園Ｈのし一ロイシンメチルエステル
オリゴマーを得た。オリゴマーの　’　ＨＮＭＲより６
量体であることが明らかである。収率２ｏ、８％。

第１図に実施例１で得たオリゴマーと実施例４で得たオ
リゴマーの　’　ｌ（ＮＭＲを示す。

【図面の簡単な説明】

第１図（＾）は実施例！で得られたし一ロイシンメチル
エステル６量体の　’　ＨＮＭＲスペクトルを第１図（
Ｂ）は実施例４で得られたＬ−ロイシンメチルエステル
６量体の’ＨＮＭＲスペクトルを示す。以上特許出願人チッソ株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アミノ酸誘導体を用いて単一の分子量を有するα
−アミノ酸オリゴマーを製造し、または２種以上のアミ
ノ酸誘導体を用いて単一の分子量を有するコオリゴマー
を製造する方法において触媒としてプロテアーゼを用い
、ワンポットで合成することを特徴とするアミノ酸オリ
ゴマーの酵素的合成方法。