JPH03247271A

JPH03247271A - 新規なキトサナーゼ生産菌

Info

Publication number: JPH03247271A
Application number: JP4351490A
Authority: JP
Inventors: Kazutoshi Yoshihara; 一年吉原; Jun Hosokawa; 細川　純; Masashi Nishiyama; 西山　昌史; Takamasa Kubo; 久保　隆昌
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1990-02-23
Filing date: 1990-02-23
Publication date: 1991-11-05
Also published as: JPH0523740B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は新規なキトサナーゼ生産菌、さらに詳しくは、
医薬品などに有用な低分子化キトサンの製造に好適に用
いられる高活性キトサナーゼを生産するプソイドモナス
属に属する新規なキトサナゼ生産菌に関するものである
。

従来の技術近年、未利用海洋資源の１つとして、キチン、キトサン
が注目を浴びている。キチンは海洋バイオマスのカニ殻
やエビ殻に含まれるアミノ糖から成る塩基性多糖類の１
種であり、キトサンはこのキチンの脱アセチル化物であ
って、ある種のカビにも高含量で含まれている。その用
途としては、例えは酵素なとの固定化用担体、生分解性
フィルムの原料、金属の選択的吸着剤、有機物の凝固剤
などが注目され、一部はすでに商品化されている。

そして、そのキトサンの低分子化されたオリゴ糖につい
ても植物病原菌の生育阻害剤、核酸・エンドトキシン除
草剤など、様々の分野での応用が脚光を浴びており、さ
らに、キトサンの各種重合度の低分子化物については、
種々の生理活性の効果が期待されている。

このようなキトサン低分子化物の製法としては、例えば
、キトサン分解菌による分解法や化学薬品を用いる方法
などがあるが、キトサンの加水分解酵素であるキトサナ
ーゼを用いる酵素法が副反応の防止などの点で有効であ
る。

該キトサナーゼを生産する菌としては、これまで例えは
バチルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕ
ｌａｎｓ）　Ｌ　ＣＣ−１株やアルカリゲネス（Ａｌｃ
ａｌｉｇｅｎｅｓ）Ｍ　ＨＫ　−１株なと数菌株が知ら
れている〔（特公昭６２−２０１５７１号公報、６３−
９４９７１号公報、「キチン・キトサンの開発と応用」
第１７１〜１７６ページ（１９８７年工業技術会刊行）
〕。しかしながら、これらの菌株が生産するキトサナー
ゼは、その活性などについては必ずしも十分に満足しう
るものではなかった。

発明が解決しようとする課題本発明は、従来のキトサナーゼ生産菌が生産するキトサ
ナーゼとは異なる性質を有し、低分子化キトサンの製造
に好適に用いられる高活性のキトサナーゼを生産する新
規な微生物を提供することを目的としてなされｔこもの
である。

課題を解決するだめの手段本発明者らは、前記目的を達成するために、キトサナー
ゼを生産する微生物を自然界より広く検索した結果、従
来公知のキトサナーゼ生産菌とは異なるプソイドモナス
属の特定の細菌が、キトサンを効率よく分解しうる高活
性キトサナーゼを著量生産しうろことを見い出し、この
知見に基づいて本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、プソイドモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ）Ｈ−１４株（微工研菌寄第１１１４３号）
から成るキトサナーゼ生産菌を提供するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明のキトサナーゼ生産菌は、種々の土壌をスクリー
ニングし、次に示す方法により分離した。

すなわち、キトサン２重量％、ＫＨ，Ｐｏ、　０．１重
量％、寒天１．５重量％を含有する平板培地上に、土壌
試料懸濁液を画線し、３０°Ｃの温度で７日間培養しｔ
；のち、ハローを形成するコロニーを採取し、次いで、
このコロニーを再び前記と同様にして培養する操作を繰
り返すことにより、純粋菌株を分離した。このようにし
て得られた菌株は、前記分離の際に用いた組成の斜面培
地に移植し、３０°Ｃの温度において７日間培養したの
ち、５°Ｃの温度にて保存した。なお、継代移植は３か
月毎に、新鮮な培地に植え継ぐことにより行った。

本発明のプソイドモナス菌Ｈ−１４株は、次に示す菌学
的性質を有している。なお、菌学的諸性質の試験は、ニ
ス・チー・コーワンの１マニユアル・フォー・ザ・アイ
デンティフィケーション・オブ・メディカル・バクテリ
ア」　〔“Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒｔｈｅ　Ｉｄｅｎｔｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉａ”（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　ｔｌｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ　Ｐｒｅｓｓ））及び「バーシーズψマニュアル・オ
ブ・システマチック・バクテリオロジー、第１巻（１９
８４年）」〔“Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　　Ｍａｎｕａｌ　ｏ
ｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、
Ｖｏｌｕｍ　ｌ　（１９８４）″（Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆
　Ｗｉｌｋｉｎｓ））に基づいて行った。

１、ダラム染色：陰性２、形態的性質：大きさ０．８〜１．９μｍの桿菌。

単極毛で運動する。菌は無色で、肉汁寒天培地上では光
沢がある。

３、生理的性質：（１）酵素を要求する絶対好気性菌である。

（２）生育ｐＨ：　４．０〜８．８、生育最適ｐＨ：　
６．７（３）生育温度＝１３〜３８°Ｃ１生育最適温度：３０°Ｃ（４）オキンダーゼ反応１弱陽性（５）生育に１２％以上のＮａＣＱを要求しない。

（６）エタノールから酢酸の生産は認められない。

（７）窒素の固定はしない（８）カタラーゼを産生する（９）炭水化物を酸化的に分解する（１０）グルコース、グリセローノ呟　クエン酸、酢酸
、ｐ−ヒドロキシ安息香酸などを唯一のＣ源として利用
する（１１）システィンや鉄塩を要求しない以上の菌学的諸
性質より、前記文献の分類方法により本菌株の同定を行
っｔ；結果、プソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
　）属に属することを認め、本菌株をプソイドモナスＨ
−１４と命名した。

次に、本発明の菌株より生産されるキトサナゼの理化学
的性質を下記に示す。

作用：キトサンに作用し、これを分解する。

作用ｐＨ：　３．０−７．０　（至適ｐＨ：　４．０）
ｐＨ安定性：２５°Ｃで５時間処理した場合、ｐＨ４，
０〜７．０で１００％の残存活性を示す温度安定性＝２
５°Ｃで１８時間以上処理した場合、９０％以上の残存
活性を示す液中に分泌生産されるで、ろ過、あるいは遠心分離など
の操作で菌体を除いた培養液をそのまま酵素液として使
用することができる。また、キトサナーゼを単離する場
合は、通常の精製手段、例えば塩析法、溶媒沈殿処理法
、電気泳動法、ゲルろ適法などにより、容易に高純度の
標品を得ることができる。

発明の効果本発明のプソイドモナス菌Ｈ−１４株は、高活性のキト
サナーゼを著量生産しうる新規なプソイドモナス属に属
する細菌であって、この細菌から得られるキトサナーゼ
は、キトサンを高効率で低分子化キトサンに分解するこ
とができる。この低分子化キトサンは種々の生理活性を
有することから、例えは医薬品や農薬などとして有用で
ある。

実施例次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらの例によってなんら限定されるものでは
ない。

％、Ｎ８２ＨＰ０．０．１７重量％、Ｍｇ５ｏ、　Ｈ７
ｎｚｏ　ｏ、ｏｓ重量％より成る培地を、４Ｎ　ＮａＯ
Ｈ水溶液でｐＨ６，５とし、その１００１を５００ｍ１
２容三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌したの
ち、これに、保存培地から、プソイドモナスＨ−１４株
（ＦＥＲＭ　ｐ−［１４３）を−白金耳量接種し、２８
℃で６日間培養した。

培養中、適宜３ｍＱの培養液を無菌的に抜きとり遠心分
離で菌体を除いた上澄液を粗キトサナーゼ液として採取
した。

この粗キトサナーゼ液を適宜希釈したもの１２５ｍＱに
、０．５重量％のキトサン液（ｐＨ４の酢酸ナトリウム
バッファに溶解したもの）　０．２５＋＋＋１２を加え
、３０°Ｃで２０分間反応させた。

反応終了後、反応後のキトサナーゼ活性を測定した。な
お、キトサナーゼ活性は、全還元糖をソモギー不ルソン
法〔「還元糖の定量法」第１０〜１２ページ（１９６９
年東大出版会刊行）〕にて定量することにより測定し、
また、還元糖量は、グルめた。キトサナーゼ活性１単位
（Ｕｎｉｔ）とは、上記の条件下、１分間に１μモルの
グルコサミンに相当する還元糖を生成させる酵素量をい
う。

培養中のキトサナーゼの生産経過を法要に示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１　プソイドモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｈ−
１４株（微工研菌寄第１１１４３号）から成るキトサナ
ーゼ生産菌。