JPH0313878B2 - - Google Patents
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- JPH0313878B2 JPH0313878B2 JP60167427A JP16742785A JPH0313878B2 JP H0313878 B2 JPH0313878 B2 JP H0313878B2 JP 60167427 A JP60167427 A JP 60167427A JP 16742785 A JP16742785 A JP 16742785A JP H0313878 B2 JPH0313878 B2 JP H0313878B2
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、Ｄ−グルコサミンの単糖類を含ま
ず、主としてＤ−グルコサミンの重合度が２〜８
のオリゴ糖を含むキトサンオリゴ糖を高収率で得
ることができるキトサンオリゴ糖の製造法に関す
るものであつて、本発明により得られたキトサン
オリゴ糖は、食品添加物、化粧品成分、医薬品ま
たは医療材料などの広範な用途に利用できるもの
である。 〔技術の背景および従来技術の説明〕 キチンは、エビやカニなどの甲殻類の殻から得
られる多糖類であつて、セルロースと極めてよく
似た化学構造を有していて、セルロースを構成す
るグルコースの２位の水酸基がアセトアミド基で
置換された２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ
−グルコース（Ｎ−アセチルグルコサミン）がβ
−１，４結合した直鎖状の多糖類である。 一方において、キトサンの分解産物のキトサン
オリゴ糖、たとえば、キトビオース（GlcN）2、
キトトリオース（GlcN）3、キトテトラオース
（GlcN）4、キトペンタオース（GlcN）5、および
キトヘキサオース（GlcN）6などがアミノ糖（塩
基性の糖）であることから、これらのキトサンオ
リゴ糖を食品添加物（増量剤）、化粧品成分また
は医薬品などの広範な用途に利用することが考え
られ、これらのキトサンオリゴ糖を経済的に製造
する技術と開発が要望されている。 また最近、キトサンオリゴ糖のうちのキトヘキ
サオース（GlcN）6およびキトヘプタオース
（GlcN）7に抗カビ性が見出され〔デイー・エフ・
ケンドラおよびリー・エー・ハドウイガー：エク
スペリメンタル・マイコロジー（D.F.Kendra
and Lee A.Hadwiger：Experimental
Mycology）第８巻、第276−281頁（1984年）〕、
重合度の比較的大きいキトサンオリゴ糖の製造技
術の開発が要望されている。 これまでに、塩酸による加水分解法〔エス・テ
イー・ホロウイツツ他：ジヤーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサイエテイ（S.T.
Horowitz et al：J.A.C.S）第79巻、第5046−
5049頁（1957年）〕、亜硝酸による酸化分解法〔エ
フ・ヤク他：セルロース・ケミストリ・アンド・
テクノロジー（F.Yaku et al：Cellulose
Chemistry and Technology）第11巻、第421−
430頁（1977年）〕、および塩素による酸化分解法
（平野茂博ら：日本農芸化学会、昭和59年度大会、
講演要旨集第330頁）がキトサンの化学的な分解
法として知られている。塩酸による加水分解法
は、キトサンオリゴ糖を生産することができる
が、高濃度の塩酸および長時間の反応を必要と
し、また多量のＤ−グルコサミンの単糖類の生成
により反応液からキトサンオリゴ糖を単離する工
程を必要とし、そのための操作がはん雑になり、
そのコストも高いという難点がある。また亜硝酸
または塩素による酸化分解法は、酸化による脱ア
ミノ化のために、純粋なキトサンオリゴ糖を得る
ことが困難であるという難点がある。 これに対して、酵素法によるキトサンの分解で
は、酵素の特異性を利用することができるので、
Ｄ−グルコサミンのような単糖類の生成を少なく
して、目的とするキトサンオリゴ糖を著量に生産
することができる。これまでに報告されているキ
トサンを分解する酵素には、バチルス（Bacillus
sp.）Ｒ−４の生産するキトサナーゼ〔トミナガ
およびツジサカ：ビオヒミカ・エ・ビオフイジ
カ・アクタ（Y.Tominaga＆Y.Tsujisaka：
Biochimica et Biophysica Acta）第410巻、第
145−155頁（1975年）〕、ペニシリウム・イスラン
デイクム（Penicillium islandicum）の生産する
キトサナーゼ〔デイー・エム・フエントン等：ジ
ヤーナル・オブ・ジエネラル・ミクロバイオロジ
ー（D.M.Fenton et al：Journal of General
Microbiology）、第126巻、第151−165頁（1981
年）〕、バチルス（Bacillus.sp.）99−５の生産す
るキトサナーゼ（堀内：日本農芸化学会、昭和59
年度大会、講演要旨集第550頁）、ストレプトマイ
セス（Streptomyces sp.）No.６〔ジエイ・エス・
プライス等：ジヤーナル・オブ・バクテリオロジ
ー（J.S.Price et al：Journal of Bacteriology）
第124巻、第1574−1585頁（1975年）〕およびスト
レプトマイセス・グリセウス（Streptomyces
griseus）の生産するキトサナーゼ〔オオタカ
ラ：キチン、キトサン・アンド・リレイテツド・
エンザイムス（A.Ohtakara：Chitin、Chitosan
and Related Enzymes）第147〜160頁（1985
年）、アカデミツクプレス〕が知られているが、
キトサンオリゴ糖を著量に生産するという報告は
見当らない。 本発明者らは、キトサンオリゴ糖を経済的に生
産する技術の開発を企図して、キトサナーゼを生
産する細菌の検索を行なつて得られたバチルス属
に属する微生物の変異株のバチルス（Bacillus
sp.）No.７−Ｍがキトサナーゼを生産しうること
およびこのキトサナーゼをキトサンに作用させる
と、Ｄ−グルコサミンの単糖類を生成することな
く、キトサンオリゴ糖だけを生産しうることを見
出し、これらの知見にもとづいて本発明に到達し
た。 〔発明の目的および発明の要約〕 本発明の目的は、Ｄ−グルコサミンの単糖類を
生産することなく、キトサンオリゴ糖を著量に生
産しうる経済的に実施可能のキトサンオリゴ糖の
製造法を提供することにある。 本発明は、キトサンを、バチルス属に属する微
生物により生産される酵素であつて、作用PH５〜
７、安定PH範囲５〜11及び分子量3.0万（SDSで
4.1万）を有するによつて分解し、Ｄ−グルコサ
ミンの単糖類を含むことなく、主として重合度が
２〜８のオリゴ糖を含むキトサンオリゴ糖を得る
ことを特徴とするキトサンオリゴ糖の製造法であ
る。 本発明のキトサンオリゴ糖の製造において、キ
トサナーゼは、バチルスNo.７−Ｍ（微工研菌寄第
8139号）の培養によつて生産されたキトサナーゼ
を使用することができ、キトサンは、キトサン溶
液の他に、コロイダルキトサンを使用することが
でき、さらにキトサナーゼによるキトサンの加水
分解をPH６付近の反応液において行なうのが好ま
しい。 〔発明の具体的な説明〕 本発明により製造されるキトサンオリゴ糖は、
Ｄ−グルコサミンの重合度が２〜８のオリゴ糖を
主として含み、Ｄ−グルコサミンの単糖類を含ま
ないキトサンオリゴ糖である。 このキトサンオリゴ糖は、陽イオンとして作用
し、また吸湿性を有するから、化粧品に使用した
ときに皮膚の保湿剤として有用である。またキト
サンオリゴ糖のうちの比較的高重合度のものは、
安全性が高く、かつ抗カビ性および抗菌性を有す
るから、化粧品、食品等の防腐剤、また土壌改良
剤または種子コーテイング剤などにおける抗カビ
剤および抗菌剤として使用するのに適している。 本発明のキトサンオリゴ糖の製造においては、
先ずキトサン溶液を調製する。キトサンは酸に溶
けるので、キトサンに酸水溶液を加えて、キトサ
ン溶液とする。これとは別にキトサナーゼ溶液を
調製し、前に得られたキトサン溶液とともに、反
応温度においてプレインキユベートした後、キト
サナーゼ溶液をキトサン溶液に加え、反応温度に
おいてキトサンをキトサナーゼによつて分解す
る。反応温度はキトサナーゼの作用温度の30〜80
℃とすることができるが、40℃前後の温度にする
のが好ましい。また反応液のPHは、キトサナーゼ
の作用PH範囲の３〜９とすることができるが、そ
の最適PHの６前後のPHにするのが好ましい。 本発明のキトサンオリゴ糖の製造に使用するキ
トサンは、キトサナーゼによつて分解されるもの
であれば、いかなるものであつても、これを使用
することができるが、脱アセチル化度50〜100％
のキトサンを使用するのが好ましい。これらのキ
トサンにキトサナーゼを加えて、分解する場合、
前記のキトサン溶液の他に、コロイダルキトサン
を水に懸濁した状態におくこともできる。 キトサン溶液の調製に使用する酸は、キトサン
を溶解しうるものであれば、有機酸または無機酸
のいかなるものであつても、これを使用すること
ができるが、塩酸または硝酸の希薄溶液、ギ酸、
酢酸、乳酸、グルタミン酸またはアスコルビン酸
の希薄溶液を使用するのが好ましい。 キトサンオリゴ糖の重合度分布は反応時間によ
つて変化するから、予備実験において、反応時間
と生成物のキトサンオリゴ糖の重合度分布の関係
を実験的に求めておき、これに基づいて所望の重
合度分布のキトサンオリゴ糖を得るのに必要な反
応時間とすることもできる。 所定の反応時間の経過後に、反応液中のキトサ
ナーゼを失活して、反応を停止し、反応液の遠心
分離または濾過によつて上澄液を集め、これを常
法のイオン交換樹脂によるクロマトグラフイー、
ゲル濾過または活性炭による着色物質の除去など
を行なつて、不純物を除去した後、乾燥して、所
望のキトサンオリゴ糖の粉末を得る。 本発明のキトサンオリゴ糖の製造に使用される
キトサナーゼは、５〜11のPH領域において安定で
あり、キトサンを分解したときに、Ｄ−グルコサ
ミンの単糖類を生成することなく、主として重合
度２〜８のオリゴ糖を生成するキトサナーゼであ
つて、このようなキトサナーゼは、バチルス
（Bacillus sp.）No.７−Ｍ（微工研菌寄第8139号）
を培養した時に、培地中に生産される。 バチルスNo.７−Ｍは、長崎県南高来郡小浜町雲
仙の原生沼の土壌よりキチンまたはキトサンを唯
一の炭素源とする培地に生育しうる細菌として分
離されたバチルス（Bacillus sp.）No.７株を親株
として、この親株をＮ−メチル−N'−ニトロソ
ーＮ−ニトロソグアニジン（NTG）で処理して
突然変異を誘発させ、得られたストレプトマイシ
ン耐性の変異株の中から、高活性のキトサナーゼ
を生産しうるものとして分離された変異株であつ
て、微工研菌寄第8139号（FERM Ｐ−8139）と
して通商産業省微生物工業技術研究所に寄託され
ている。 バチルスNo.７−Ｍの菌学的性質は以下に示され
る。 Ａ 細胞の形態 (1) 細胞の形および大きさ：短桿菌、 （肉汁および肉汁寒天斜面培養、37℃、24
〜72時間の培養） (2) 細胞の多形性の有無：無し、 (3) 運動性の有無：有り、 （肉汁寒天半流動高層穿刺培養） (4) 胞子の有無：有り、内生胞子および裸の胞
子、球状、 〔ドーナー（Dorner）の染色法およびウ
イツツ（Witz）変法〕 (5) グラム染色性：陽性、〔肉汁寒天斜面培養、
37℃、18時間、ヒユツカー（Hucker）の変
法により染色〕 Ｂ 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養（37℃、24〜168時間）： 糸状の周縁を有する円形で、隆起した乳白
色のコロニーを形成する。コロニーの表面は
凹凸でやや光沢があり、半透明である。時間
の経過とともに盛上つてくる。色素は生産し
ない。 (2) 肉汁寒天斜面培養（37℃、24〜168時間）： 拡布状に盛上つた乳白色のコロニーを形成
する。コロニーは凸円形の隆起があり、光沢
がある。生育は良好で、時間とともに拡がつ
てくる。色素は生産しない。 (3) 肉汁液体培養（37℃、24〜168時間）： 表面に膜を形成しない。時間とともに全体
的に濁つてくる。底部に絮状（顆粒状）の沈
デンが形成され、徐々に多くなつてくる。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養（25℃、24〜168時
間）： 穿刺線に沿つて生育し、液化する。表面お
よび内部は漏斗状に生育し、液化する。液化
部分は白濁する。 (5) リトマスミルク（37℃、24〜168時間）： ２日後から上部が少しずつ液化し、４日目
には色は完全に変色し、酸性となつた。凝固
はしない。時間の経過とともに、液化は進
み、半透明になつた。 Ｃ 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：− （硝酸塩肉汁培地、37℃、24〜120時間） (2) 脱窒反応：− （駒形らの方法、発酵管を使用、37℃、24
〜120時間） (3) MRテスト：＋ （37℃、24〜168時間） (4) VPテスト（アセチルメチルカルビノール
生成試験：＋ （37℃、24〜168時間） (5) インドールの生成：− （37℃、24〜168時間） (6) 硫化水素の生成：− （TSI寒天法、37℃、24〜168時間） (7) デン粉の加水分解：＋ （37℃、24〜168時間） (8) クエン酸の利用 （コーザーの培地、37℃、24〜168時間）：
− （クリステンセンの培地、37℃、24〜168
時間）：＋ (9) 無機窒素源の利用（37℃、24〜168時間） 硝酸塩：未定、 アンモニウム塩：未定、 (10) 色素の生成 （マンニツト・酵母エキス寒天斜面培
地）：− 〔キング（King）Ａ寒天斜面培地〕：− (11) 蛍光の有無：無し (12) ウレアーゼ：＋ （クリステンセン−ウレア寒天培地、37
℃、24〜168時間） (13) オキシダーゼ：＋ （肉汁寒天培地、37℃、24〜48時間） (14) カタラーゼ：＋ （肉汁寒天培地、37℃、24〜48時間） (15) 生育の範囲：（肉汁寒天培地） 温度：未定、 PH：５〜10、 添加食塩濃度：未定、 (16) 酸素に対する態度：好気性 （１％グルコース肉汁高層寒天培地、37
℃、24〜72時間） (17) ０−Ｆテスト〔ヒユー−ライフソン
（Hugh−Leifson）法、37℃、Ｄ−グルコー
ス〕：発酵的に酸を生成する。
（fermentative） (18) 糖類からの酸およびガスの生成の有無
（37℃、24〜168時間）： 糖 類 酸 ガス Ｄ−グルコース ＋ − Ｄ−マンノース − − Ｄ−ガラクトース − − Ｄ−フラクトース ＋ − Ｌ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−ソルビツト − − Ｄ−マンニツト − − イノシツト − − マルトース ＋ − サツカロース ＋ − ラクトース − − デン粉 ＋ − セルロース − − グリセリン − − 以上の菌学的性質について、バージエイス・マ
ニユアル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリ
オロジー（Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology）の第８版（1974年）を検索した
ところ、No.７−Ｍ株はバチルス（Bacillus）属に
属するのが相当であることがわかつた。 バチルスNo.７−Ｍにより生産されたキトサナー
ゼの酵素化学的性質は以下に示すとおりである。 (1) 作 用： キトサンに作用し、分子の内部鎖から任意に
β−１，４結合を分解して、主としてキトサン
オリゴ糖（GlcN）o（ｎ＝２〜８）（２量体〜８
量体）を生成する。キトサンオリゴ糖は高速液
体クロマトグラフイーを用いてキトサン分解液
から分離することができる。この分解液におけ
るキトサンの分解度は約45％である。カルボキ
シメチルセルロース（CMC）にも作用し、あ
る程度はこれを分解するが、キチンには全く作
用しない。 (2) 作用温度範囲および最適作用温度： 可溶性キトサンを基質とした場合、80℃まで
作用し、最適作用温度は50℃である。 PH6.0において10分間反応させた場合の温度
と比活性の関係を第１図に示す。 (3) 作用PH範囲および最適PH： PH３〜９の範囲において作用し、最適PHはPH
６である。 １％可溶性キトサン１mlに各PHの緩衝液２ml
および酵素液１mlを加えた反応液を37℃におい
て10分間反応させた場合のPHと酵素の比活性の
関係を第２図に示す。 (4) 熱安定性： 50℃における15分間の保温まで、ほぼ安定
で、60℃における15分間の加熱により、酵素の
約40％が失活し、70℃における15分間の加熱に
より、完全に失活した。 温度と比活性の関係を第３図に示す。 (5) PH安定性： 0.1M緩衝液中で30℃において２時間放置し
た後、残存する酵素活性を測定したが、PH５〜
11の範囲において安定であつた。PH10〜11にお
いて安定であることは、バチルスNo.７−Ｍによ
り生産されたキトサナーゼの大きな特徴の一つ
である。PHと比活性の関係を第４図に示す。 (6) 阻害剤： バチルスNo.７−Ｍにより生産されたキトサナ
ーゼは、１×10-3Mの終濃度のHgCl2、PbCl2、
AgNO3、およびPCMBの存在によりほぼ100
％が阻害された。 (7) 基質特異性： 種々の基質を使用し、基質の終濃度を0.25％
とした時に、酵素反応液４ml当り酵素蛋白質１
mgによつて１時間後に遊離する全還元糖とヘキ
サミンの量（mg／mg蛋白質／時）を測定した。
その結果が第１表に示される。
ず、主としてＤ−グルコサミンの重合度が２〜８
のオリゴ糖を含むキトサンオリゴ糖を高収率で得
ることができるキトサンオリゴ糖の製造法に関す
るものであつて、本発明により得られたキトサン
オリゴ糖は、食品添加物、化粧品成分、医薬品ま
たは医療材料などの広範な用途に利用できるもの
である。 〔技術の背景および従来技術の説明〕 キチンは、エビやカニなどの甲殻類の殻から得
られる多糖類であつて、セルロースと極めてよく
似た化学構造を有していて、セルロースを構成す
るグルコースの２位の水酸基がアセトアミド基で
置換された２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ
−グルコース（Ｎ−アセチルグルコサミン）がβ
−１，４結合した直鎖状の多糖類である。 一方において、キトサンの分解産物のキトサン
オリゴ糖、たとえば、キトビオース（GlcN）2、
キトトリオース（GlcN）3、キトテトラオース
（GlcN）4、キトペンタオース（GlcN）5、および
キトヘキサオース（GlcN）6などがアミノ糖（塩
基性の糖）であることから、これらのキトサンオ
リゴ糖を食品添加物（増量剤）、化粧品成分また
は医薬品などの広範な用途に利用することが考え
られ、これらのキトサンオリゴ糖を経済的に製造
する技術と開発が要望されている。 また最近、キトサンオリゴ糖のうちのキトヘキ
サオース（GlcN）6およびキトヘプタオース
（GlcN）7に抗カビ性が見出され〔デイー・エフ・
ケンドラおよびリー・エー・ハドウイガー：エク
スペリメンタル・マイコロジー（D.F.Kendra
and Lee A.Hadwiger：Experimental
Mycology）第８巻、第276−281頁（1984年）〕、
重合度の比較的大きいキトサンオリゴ糖の製造技
術の開発が要望されている。 これまでに、塩酸による加水分解法〔エス・テ
イー・ホロウイツツ他：ジヤーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサイエテイ（S.T.
Horowitz et al：J.A.C.S）第79巻、第5046−
5049頁（1957年）〕、亜硝酸による酸化分解法〔エ
フ・ヤク他：セルロース・ケミストリ・アンド・
テクノロジー（F.Yaku et al：Cellulose
Chemistry and Technology）第11巻、第421−
430頁（1977年）〕、および塩素による酸化分解法
（平野茂博ら：日本農芸化学会、昭和59年度大会、
講演要旨集第330頁）がキトサンの化学的な分解
法として知られている。塩酸による加水分解法
は、キトサンオリゴ糖を生産することができる
が、高濃度の塩酸および長時間の反応を必要と
し、また多量のＤ−グルコサミンの単糖類の生成
により反応液からキトサンオリゴ糖を単離する工
程を必要とし、そのための操作がはん雑になり、
そのコストも高いという難点がある。また亜硝酸
または塩素による酸化分解法は、酸化による脱ア
ミノ化のために、純粋なキトサンオリゴ糖を得る
ことが困難であるという難点がある。 これに対して、酵素法によるキトサンの分解で
は、酵素の特異性を利用することができるので、
Ｄ−グルコサミンのような単糖類の生成を少なく
して、目的とするキトサンオリゴ糖を著量に生産
することができる。これまでに報告されているキ
トサンを分解する酵素には、バチルス（Bacillus
sp.）Ｒ−４の生産するキトサナーゼ〔トミナガ
およびツジサカ：ビオヒミカ・エ・ビオフイジ
カ・アクタ（Y.Tominaga＆Y.Tsujisaka：
Biochimica et Biophysica Acta）第410巻、第
145−155頁（1975年）〕、ペニシリウム・イスラン
デイクム（Penicillium islandicum）の生産する
キトサナーゼ〔デイー・エム・フエントン等：ジ
ヤーナル・オブ・ジエネラル・ミクロバイオロジ
ー（D.M.Fenton et al：Journal of General
Microbiology）、第126巻、第151−165頁（1981
年）〕、バチルス（Bacillus.sp.）99−５の生産す
るキトサナーゼ（堀内：日本農芸化学会、昭和59
年度大会、講演要旨集第550頁）、ストレプトマイ
セス（Streptomyces sp.）No.６〔ジエイ・エス・
プライス等：ジヤーナル・オブ・バクテリオロジ
ー（J.S.Price et al：Journal of Bacteriology）
第124巻、第1574−1585頁（1975年）〕およびスト
レプトマイセス・グリセウス（Streptomyces
griseus）の生産するキトサナーゼ〔オオタカ
ラ：キチン、キトサン・アンド・リレイテツド・
エンザイムス（A.Ohtakara：Chitin、Chitosan
and Related Enzymes）第147〜160頁（1985
年）、アカデミツクプレス〕が知られているが、
キトサンオリゴ糖を著量に生産するという報告は
見当らない。 本発明者らは、キトサンオリゴ糖を経済的に生
産する技術の開発を企図して、キトサナーゼを生
産する細菌の検索を行なつて得られたバチルス属
に属する微生物の変異株のバチルス（Bacillus
sp.）No.７−Ｍがキトサナーゼを生産しうること
およびこのキトサナーゼをキトサンに作用させる
と、Ｄ−グルコサミンの単糖類を生成することな
く、キトサンオリゴ糖だけを生産しうることを見
出し、これらの知見にもとづいて本発明に到達し
た。 〔発明の目的および発明の要約〕 本発明の目的は、Ｄ−グルコサミンの単糖類を
生産することなく、キトサンオリゴ糖を著量に生
産しうる経済的に実施可能のキトサンオリゴ糖の
製造法を提供することにある。 本発明は、キトサンを、バチルス属に属する微
生物により生産される酵素であつて、作用PH５〜
７、安定PH範囲５〜11及び分子量3.0万（SDSで
4.1万）を有するによつて分解し、Ｄ−グルコサ
ミンの単糖類を含むことなく、主として重合度が
２〜８のオリゴ糖を含むキトサンオリゴ糖を得る
ことを特徴とするキトサンオリゴ糖の製造法であ
る。 本発明のキトサンオリゴ糖の製造において、キ
トサナーゼは、バチルスNo.７−Ｍ（微工研菌寄第
8139号）の培養によつて生産されたキトサナーゼ
を使用することができ、キトサンは、キトサン溶
液の他に、コロイダルキトサンを使用することが
でき、さらにキトサナーゼによるキトサンの加水
分解をPH６付近の反応液において行なうのが好ま
しい。 〔発明の具体的な説明〕 本発明により製造されるキトサンオリゴ糖は、
Ｄ−グルコサミンの重合度が２〜８のオリゴ糖を
主として含み、Ｄ−グルコサミンの単糖類を含ま
ないキトサンオリゴ糖である。 このキトサンオリゴ糖は、陽イオンとして作用
し、また吸湿性を有するから、化粧品に使用した
ときに皮膚の保湿剤として有用である。またキト
サンオリゴ糖のうちの比較的高重合度のものは、
安全性が高く、かつ抗カビ性および抗菌性を有す
るから、化粧品、食品等の防腐剤、また土壌改良
剤または種子コーテイング剤などにおける抗カビ
剤および抗菌剤として使用するのに適している。 本発明のキトサンオリゴ糖の製造においては、
先ずキトサン溶液を調製する。キトサンは酸に溶
けるので、キトサンに酸水溶液を加えて、キトサ
ン溶液とする。これとは別にキトサナーゼ溶液を
調製し、前に得られたキトサン溶液とともに、反
応温度においてプレインキユベートした後、キト
サナーゼ溶液をキトサン溶液に加え、反応温度に
おいてキトサンをキトサナーゼによつて分解す
る。反応温度はキトサナーゼの作用温度の30〜80
℃とすることができるが、40℃前後の温度にする
のが好ましい。また反応液のPHは、キトサナーゼ
の作用PH範囲の３〜９とすることができるが、そ
の最適PHの６前後のPHにするのが好ましい。 本発明のキトサンオリゴ糖の製造に使用するキ
トサンは、キトサナーゼによつて分解されるもの
であれば、いかなるものであつても、これを使用
することができるが、脱アセチル化度50〜100％
のキトサンを使用するのが好ましい。これらのキ
トサンにキトサナーゼを加えて、分解する場合、
前記のキトサン溶液の他に、コロイダルキトサン
を水に懸濁した状態におくこともできる。 キトサン溶液の調製に使用する酸は、キトサン
を溶解しうるものであれば、有機酸または無機酸
のいかなるものであつても、これを使用すること
ができるが、塩酸または硝酸の希薄溶液、ギ酸、
酢酸、乳酸、グルタミン酸またはアスコルビン酸
の希薄溶液を使用するのが好ましい。 キトサンオリゴ糖の重合度分布は反応時間によ
つて変化するから、予備実験において、反応時間
と生成物のキトサンオリゴ糖の重合度分布の関係
を実験的に求めておき、これに基づいて所望の重
合度分布のキトサンオリゴ糖を得るのに必要な反
応時間とすることもできる。 所定の反応時間の経過後に、反応液中のキトサ
ナーゼを失活して、反応を停止し、反応液の遠心
分離または濾過によつて上澄液を集め、これを常
法のイオン交換樹脂によるクロマトグラフイー、
ゲル濾過または活性炭による着色物質の除去など
を行なつて、不純物を除去した後、乾燥して、所
望のキトサンオリゴ糖の粉末を得る。 本発明のキトサンオリゴ糖の製造に使用される
キトサナーゼは、５〜11のPH領域において安定で
あり、キトサンを分解したときに、Ｄ−グルコサ
ミンの単糖類を生成することなく、主として重合
度２〜８のオリゴ糖を生成するキトサナーゼであ
つて、このようなキトサナーゼは、バチルス
（Bacillus sp.）No.７−Ｍ（微工研菌寄第8139号）
を培養した時に、培地中に生産される。 バチルスNo.７−Ｍは、長崎県南高来郡小浜町雲
仙の原生沼の土壌よりキチンまたはキトサンを唯
一の炭素源とする培地に生育しうる細菌として分
離されたバチルス（Bacillus sp.）No.７株を親株
として、この親株をＮ−メチル−N'−ニトロソ
ーＮ−ニトロソグアニジン（NTG）で処理して
突然変異を誘発させ、得られたストレプトマイシ
ン耐性の変異株の中から、高活性のキトサナーゼ
を生産しうるものとして分離された変異株であつ
て、微工研菌寄第8139号（FERM Ｐ−8139）と
して通商産業省微生物工業技術研究所に寄託され
ている。 バチルスNo.７−Ｍの菌学的性質は以下に示され
る。 Ａ 細胞の形態 (1) 細胞の形および大きさ：短桿菌、 （肉汁および肉汁寒天斜面培養、37℃、24
〜72時間の培養） (2) 細胞の多形性の有無：無し、 (3) 運動性の有無：有り、 （肉汁寒天半流動高層穿刺培養） (4) 胞子の有無：有り、内生胞子および裸の胞
子、球状、 〔ドーナー（Dorner）の染色法およびウ
イツツ（Witz）変法〕 (5) グラム染色性：陽性、〔肉汁寒天斜面培養、
37℃、18時間、ヒユツカー（Hucker）の変
法により染色〕 Ｂ 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養（37℃、24〜168時間）： 糸状の周縁を有する円形で、隆起した乳白
色のコロニーを形成する。コロニーの表面は
凹凸でやや光沢があり、半透明である。時間
の経過とともに盛上つてくる。色素は生産し
ない。 (2) 肉汁寒天斜面培養（37℃、24〜168時間）： 拡布状に盛上つた乳白色のコロニーを形成
する。コロニーは凸円形の隆起があり、光沢
がある。生育は良好で、時間とともに拡がつ
てくる。色素は生産しない。 (3) 肉汁液体培養（37℃、24〜168時間）： 表面に膜を形成しない。時間とともに全体
的に濁つてくる。底部に絮状（顆粒状）の沈
デンが形成され、徐々に多くなつてくる。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養（25℃、24〜168時
間）： 穿刺線に沿つて生育し、液化する。表面お
よび内部は漏斗状に生育し、液化する。液化
部分は白濁する。 (5) リトマスミルク（37℃、24〜168時間）： ２日後から上部が少しずつ液化し、４日目
には色は完全に変色し、酸性となつた。凝固
はしない。時間の経過とともに、液化は進
み、半透明になつた。 Ｃ 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：− （硝酸塩肉汁培地、37℃、24〜120時間） (2) 脱窒反応：− （駒形らの方法、発酵管を使用、37℃、24
〜120時間） (3) MRテスト：＋ （37℃、24〜168時間） (4) VPテスト（アセチルメチルカルビノール
生成試験：＋ （37℃、24〜168時間） (5) インドールの生成：− （37℃、24〜168時間） (6) 硫化水素の生成：− （TSI寒天法、37℃、24〜168時間） (7) デン粉の加水分解：＋ （37℃、24〜168時間） (8) クエン酸の利用 （コーザーの培地、37℃、24〜168時間）：
− （クリステンセンの培地、37℃、24〜168
時間）：＋ (9) 無機窒素源の利用（37℃、24〜168時間） 硝酸塩：未定、 アンモニウム塩：未定、 (10) 色素の生成 （マンニツト・酵母エキス寒天斜面培
地）：− 〔キング（King）Ａ寒天斜面培地〕：− (11) 蛍光の有無：無し (12) ウレアーゼ：＋ （クリステンセン−ウレア寒天培地、37
℃、24〜168時間） (13) オキシダーゼ：＋ （肉汁寒天培地、37℃、24〜48時間） (14) カタラーゼ：＋ （肉汁寒天培地、37℃、24〜48時間） (15) 生育の範囲：（肉汁寒天培地） 温度：未定、 PH：５〜10、 添加食塩濃度：未定、 (16) 酸素に対する態度：好気性 （１％グルコース肉汁高層寒天培地、37
℃、24〜72時間） (17) ０−Ｆテスト〔ヒユー−ライフソン
（Hugh−Leifson）法、37℃、Ｄ−グルコー
ス〕：発酵的に酸を生成する。
（fermentative） (18) 糖類からの酸およびガスの生成の有無
（37℃、24〜168時間）： 糖 類 酸 ガス Ｄ−グルコース ＋ − Ｄ−マンノース − − Ｄ−ガラクトース − − Ｄ−フラクトース ＋ − Ｌ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−ソルビツト − − Ｄ−マンニツト − − イノシツト − − マルトース ＋ − サツカロース ＋ − ラクトース − − デン粉 ＋ − セルロース − − グリセリン − − 以上の菌学的性質について、バージエイス・マ
ニユアル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリ
オロジー（Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology）の第８版（1974年）を検索した
ところ、No.７−Ｍ株はバチルス（Bacillus）属に
属するのが相当であることがわかつた。 バチルスNo.７−Ｍにより生産されたキトサナー
ゼの酵素化学的性質は以下に示すとおりである。 (1) 作 用： キトサンに作用し、分子の内部鎖から任意に
β−１，４結合を分解して、主としてキトサン
オリゴ糖（GlcN）o（ｎ＝２〜８）（２量体〜８
量体）を生成する。キトサンオリゴ糖は高速液
体クロマトグラフイーを用いてキトサン分解液
から分離することができる。この分解液におけ
るキトサンの分解度は約45％である。カルボキ
シメチルセルロース（CMC）にも作用し、あ
る程度はこれを分解するが、キチンには全く作
用しない。 (2) 作用温度範囲および最適作用温度： 可溶性キトサンを基質とした場合、80℃まで
作用し、最適作用温度は50℃である。 PH6.0において10分間反応させた場合の温度
と比活性の関係を第１図に示す。 (3) 作用PH範囲および最適PH： PH３〜９の範囲において作用し、最適PHはPH
６である。 １％可溶性キトサン１mlに各PHの緩衝液２ml
および酵素液１mlを加えた反応液を37℃におい
て10分間反応させた場合のPHと酵素の比活性の
関係を第２図に示す。 (4) 熱安定性： 50℃における15分間の保温まで、ほぼ安定
で、60℃における15分間の加熱により、酵素の
約40％が失活し、70℃における15分間の加熱に
より、完全に失活した。 温度と比活性の関係を第３図に示す。 (5) PH安定性： 0.1M緩衝液中で30℃において２時間放置し
た後、残存する酵素活性を測定したが、PH５〜
11の範囲において安定であつた。PH10〜11にお
いて安定であることは、バチルスNo.７−Ｍによ
り生産されたキトサナーゼの大きな特徴の一つ
である。PHと比活性の関係を第４図に示す。 (6) 阻害剤： バチルスNo.７−Ｍにより生産されたキトサナ
ーゼは、１×10-3Mの終濃度のHgCl2、PbCl2、
AgNO3、およびPCMBの存在によりほぼ100
％が阻害された。 (7) 基質特異性： 種々の基質を使用し、基質の終濃度を0.25％
とした時に、酵素反応液４ml当り酵素蛋白質１
mgによつて１時間後に遊離する全還元糖とヘキ
サミンの量（mg／mg蛋白質／時）を測定した。
その結果が第１表に示される。
【表】
Ｄ−グルコサミンの単糖類を生成することな
く、主として重合度２〜８のオリゴ糖を含むキト
サンオリゴ糖を効率的に製造しうる。
く、主として重合度２〜８のオリゴ糖を含むキト
サンオリゴ糖を効率的に製造しうる。
第１図は、キトサナーゼの作用温度範囲におけ
る温度と比活性の関係を示す図表、第２図はキト
サナーゼの作用PH範囲におけるPHと比活性の関係
を示す図表、第３図は、キトサナーゼの熱安定性
における温度と比活性の関係を示す図表、第４図
は、キトサナーゼのPH安定性におけるPHと比活性
の関係を示す図表、第５図および第６図はキトサ
ナーゼの分子量測定の結果を示す図表、第７図
は、実施例１における反応時間と還元糖の生成量
の関係を示す図表、第８図は、実施例１における
キトサンオリゴ糖の重合度別の割合を示す図表、
第９図は、実施例２における反応時間と還元糖の
生成量の関係を示す図表、第１０図は、実施例３
における反応時間と還元糖の生成量の関係を示す
図表、第１１図は、実施例４における反応時間と
還元糖の生成量の関係を示す図表、第１２図は、
実施例５におけるキトサンオリゴ糖の重合度別の
割合を示す図表、そして第１３図は、実施例６に
おけるキトサンオリゴ糖の重合度別の割合を示す
図表である。
る温度と比活性の関係を示す図表、第２図はキト
サナーゼの作用PH範囲におけるPHと比活性の関係
を示す図表、第３図は、キトサナーゼの熱安定性
における温度と比活性の関係を示す図表、第４図
は、キトサナーゼのPH安定性におけるPHと比活性
の関係を示す図表、第５図および第６図はキトサ
ナーゼの分子量測定の結果を示す図表、第７図
は、実施例１における反応時間と還元糖の生成量
の関係を示す図表、第８図は、実施例１における
キトサンオリゴ糖の重合度別の割合を示す図表、
第９図は、実施例２における反応時間と還元糖の
生成量の関係を示す図表、第１０図は、実施例３
における反応時間と還元糖の生成量の関係を示す
図表、第１１図は、実施例４における反応時間と
還元糖の生成量の関係を示す図表、第１２図は、
実施例５におけるキトサンオリゴ糖の重合度別の
割合を示す図表、そして第１３図は、実施例６に
おけるキトサンオリゴ糖の重合度別の割合を示す
図表である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ キトサンを、パチルス属に属する微生物によ
り生産される酵素であつて、作用PH５〜７、安定
PH範囲５〜11及び分子量3.0万（SDSで4.1万）を
有するキトサナーゼによつて分解して、Ｄ−グル
コサミンの単糖類を含むことなく、主として重合
度が２〜８のオリゴ糖を含むキトサンオリゴ糖を
得ることを特徴とするキトサンオリゴ糖の製造
法。 ２ バチルス属に属する微生物が、バチルスNo.７
−Ｍ（微工研菌寄第8139号）であることを特徴と
する特許請求の範囲第１項に記載のキトサンオリ
ゴ糖の製造法。 ３ キトサンが、コロイダルキトサンであること
を特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項
に記載のキトサンオリゴ糖の製造法。 ４ キトサナーゼによるキトサンの分解をPH６の
前後において行なうことを特徴とする特許請求の
範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載のキト
サンオリゴ糖の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60167427A JPS6230103A (ja) | 1985-07-31 | 1985-07-31 | キトサンオリゴ糖の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60167427A JPS6230103A (ja) | 1985-07-31 | 1985-07-31 | キトサンオリゴ糖の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6230103A JPS6230103A (ja) | 1987-02-09 |
| JPH0313878B2 true JPH0313878B2 (ja) | 1991-02-25 |
Family
ID=15849500
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60167427A Granted JPS6230103A (ja) | 1985-07-31 | 1985-07-31 | キトサンオリゴ糖の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6230103A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2702144B1 (fr) * | 1993-03-03 | 1995-04-21 | Biochimie Appliquee | Produits de dégradation du chitosane, procédé de préparation et utilisation en cosmétique. |
| KR100348804B1 (ko) * | 1998-12-07 | 2002-11-18 | 주식회사 태평양 | 키토산글루코노델타락톤염및이염을이용하여올리고키토산을제조하는방법 |
| KR100483847B1 (ko) * | 2002-07-11 | 2005-04-20 | 주식회사 건풍바이오 | 수족냉증 완화효과를 나타내는 키틴/키토산올리고당 |
| CN102174064B (zh) * | 2011-03-22 | 2014-01-15 | 肇庆长龙生物科技有限公司 | 一种凝胶层析制备壳寡糖单体的方法 |
| CN102851239B (zh) * | 2012-08-22 | 2013-08-14 | 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 | 一株壳聚糖酶生产菌株及应用该菌株生产壳寡糖的方法 |
| CN110387392A (zh) * | 2019-08-12 | 2019-10-29 | 青岛博智汇力生物科技有限公司 | 一种特定聚合度壳寡糖的制备方法及其在化妆品上的应用 |
-
1985
- 1985-07-31 JP JP60167427A patent/JPS6230103A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6230103A (ja) | 1987-02-09 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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