JPH032520B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH032520B2 JPH032520B2 JP57136332A JP13633282A JPH032520B2 JP H032520 B2 JPH032520 B2 JP H032520B2 JP 57136332 A JP57136332 A JP 57136332A JP 13633282 A JP13633282 A JP 13633282A JP H032520 B2 JPH032520 B2 JP H032520B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lower alkyl
- alkyl ester
- culture
- phenylalanine
- ape
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
- C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
- C07K5/06121—Asp- or Asn-amino acid the second amino acid being aromatic or cycloaliphatic
- C07K5/0613—Aspartame
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
- Y10S435/877—Pseudomonas putida
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、フマル酸、アンモニア及びＬ−フエ
ニルアラニン低級アルキルエステルから微生物を
用いてα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラ
ニン低級アルキルエステルを製造する方法に関す
るものである。
ニルアラニン低級アルキルエステルから微生物を
用いてα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラ
ニン低級アルキルエステルを製造する方法に関す
るものである。
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン
低級アルキルエステル（以下α−APEと云う）、
特にメチルエステルは新しい甘味剤として注目さ
れている有用な物質である。α−APEの製造法
としては、Ｎ−保護Ｌ−アスパラギン酸無水物と
Ｌ−フエニルアラニン低級アルキルエステルを反
応させてＮ−保護α−APEとし、保護基を除去
してα−APEとする方法、Ｎ−保護Ｌ−アスパ
ラギン酸とフエニルアラニン低級アルキルエステ
ルとを蛋白質分解酵素の存在下で反応させてＮ−
保護α−APE、またＮ−保護α−APEとフエニ
ルアラニン低級アルキルエステルエとの付加化合
物とし、保護基を除去してα−APEとする方法
などが知られている。
低級アルキルエステル（以下α−APEと云う）、
特にメチルエステルは新しい甘味剤として注目さ
れている有用な物質である。α−APEの製造法
としては、Ｎ−保護Ｌ−アスパラギン酸無水物と
Ｌ−フエニルアラニン低級アルキルエステルを反
応させてＮ−保護α−APEとし、保護基を除去
してα−APEとする方法、Ｎ−保護Ｌ−アスパ
ラギン酸とフエニルアラニン低級アルキルエステ
ルとを蛋白質分解酵素の存在下で反応させてＮ−
保護α−APE、またＮ−保護α−APEとフエニ
ルアラニン低級アルキルエステルエとの付加化合
物とし、保護基を除去してα−APEとする方法
などが知られている。
前者の方法は、Ｎ−保護α−APEとともにＮ
−保護β−APEが副生するという問題がある。
後者の方法は、そのような問題がない点及び原料
としてラセミ体を使用できる点などで優れた方法
である。しかし、いずれの方法でも、原料のアス
パラギン酸又はその無水物は、アミノ基をベンジ
ルオキシカルボニル基のような保護基で保護した
のち用いる必要があつた。
−保護β−APEが副生するという問題がある。
後者の方法は、そのような問題がない点及び原料
としてラセミ体を使用できる点などで優れた方法
である。しかし、いずれの方法でも、原料のアス
パラギン酸又はその無水物は、アミノ基をベンジ
ルオキシカルボニル基のような保護基で保護した
のち用いる必要があつた。
これらの公知技術では当然必要とされるアミノ
基への保護基導入及び除去の工程の不必要な方法
を開発することができれば工程の簡略化とそれに
伴なう原料、製品等の損失を避けることができ、
工業的に非常な利点が生ずる。
基への保護基導入及び除去の工程の不必要な方法
を開発することができれば工程の簡略化とそれに
伴なう原料、製品等の損失を避けることができ、
工業的に非常な利点が生ずる。
本発明者らは、Ｌ−アスパラギン酸の代りに、
有機酸であり、より経済的なフマル酸を用いるこ
とができれば、より有利なα−APEの合成法が
確立されると考え、フマル酸とフエニルアラニン
低級アルキルエステルから直接α−APEを合成
する方法について鋭意検討した結果、シユードモ
ナス属に属する微生物を用いることによつて、フ
マル酸、アンモニア及びＬ−フエニルアラニン低
級アルキルエステルからα−APEが生成するこ
とを見出した。
有機酸であり、より経済的なフマル酸を用いるこ
とができれば、より有利なα−APEの合成法が
確立されると考え、フマル酸とフエニルアラニン
低級アルキルエステルから直接α−APEを合成
する方法について鋭意検討した結果、シユードモ
ナス属に属する微生物を用いることによつて、フ
マル酸、アンモニア及びＬ−フエニルアラニン低
級アルキルエステルからα−APEが生成するこ
とを見出した。
本発明は、シユードモナス属に属し、フマル
酸、アンモニア及びＬ−フエニルアラニン低級ア
ルキルエステルからα−APEを生成させる能力
を有する微生物の培養物又はその処理物を、フマ
ル酸、アンモニア及びＬ−フエニルアラニン低級
アルキルエステルと接触させることを特徴とする
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン低
級アルキルエステルの製造法を提供するものであ
る。
酸、アンモニア及びＬ−フエニルアラニン低級ア
ルキルエステルからα−APEを生成させる能力
を有する微生物の培養物又はその処理物を、フマ
ル酸、アンモニア及びＬ−フエニルアラニン低級
アルキルエステルと接触させることを特徴とする
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン低
級アルキルエステルの製造法を提供するものであ
る。
本発明の反応を反応式で表わすと、次のようで
ある。（式中Ｒは低級アルキル基を表わす。） 本発明で用いる微生物はシユードモナス属に属
するα−APE生産菌である。本発明者らによつ
て山口県新南陽市の土壌中より分離されたこのよ
うな微生物の菌学的性質は下記の通りである。
ある。（式中Ｒは低級アルキル基を表わす。） 本発明で用いる微生物はシユードモナス属に属
するα−APE生産菌である。本発明者らによつ
て山口県新南陽市の土壌中より分離されたこのよ
うな微生物の菌学的性質は下記の通りである。
(a) 形態
肉汁寒天培地で37℃、６〜24時間生育した場
合 細胞の形及び大きさ 棹菌 0.5〜0.7×1.0〜1.5μｍ 細胞の多形性の有無 単菌又は双菌 運動性の有無 有 極 鞭毛 胞子の有無 無 グラム染色性 陰性 抗酸性 無 (b) 各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養（37℃、２日間培養） (イ) コロニー形状の遅速 普通 直径約６mm (ロ) コロニーの形 円形 (ハ) コロニー表面の形状 平滑 (ニ) コロニーの隆起状態 半レンズ状 (ホ) コロニーの周縁 全縁 (ヘ) コロニーの内容 均質 (ト) コロニーの色調 乳白色 (チ) コロニーの透明度 半透明 (リ) コロニーの光沢 鈍光 (ヌ) 可溶性色素の生成 可溶性淡縁色色素生
成 肉汁寒天斜面培養（37℃、２日間培養） (イ) 生育の良否 生育良好 (ロ) コロニーの形 平滑 (ハ) コロニーの断面の隆起状態 扁平状 (ニ) コロニーの光沢 鈍光 (ホ) コロニー表面の形状 平滑 (ヘ) コロニーの透明度 半透明 (ト) コロニーの色 乳白色 (チ) コロニーの質 バター質 肉汁液体培養（37℃、２日間培養） (イ) 表面の生育 なし (ロ) 濁度 やや濁る (ハ) 沈澱 粉末状 (ニ) ガス発生 なし (ホ) 培地の着色 なし 肉汁寒天穿刺培養（37℃、２日間培養） (イ) 生育の場所 上下一様 (ロ) コロニーの形状 乳頭状 肉汁ゼラチン穿刺培養（20℃、14日間培
養） (イ) ゼラチン液化 なし リトマスミルク（37℃、７日間培養） (イ) 反応 BCPを青色に、リトマスを青紫
色にする (ロ) 凝固、液化 なし (c) 生理学的性質 硫酸塩の還元 − 脱窒反応 − MRテスト − VRテスト − インドールの生成 − 硫化水素の生成 ＋（Ｗ） デンプンの加水分解 − クエン酸の利用 ＋ 無機窒素源の利用 アンモニア態のみ利用 色素の生成 緑黄色水溶性蛍光色素生成 ウレアーゼ − オキシターゼ ＋ カタラーゼ ＋ 生育の範囲 PH５〜9.5 温度 10〜43℃ 酸素に対する態度 好気性 ０−Ｆテスト ０ 糖類からの酸及びガスの生成の有無 酸 ガス (1) Ｌ−アラビノース ＋ − (2) Ｄ−キシロース ＋ − (3) Ｄ−グルコース ＋ − (4) Ｄ−マンノース ＋ − (5) Ｄ−フラクトース − − (6) Ｄ−ガラクトース ＋ − (7) 麦芽糖 − − (8) シヨ糖 − − (9) 乳 糖 − − (10) トレハロース − − (11) Ｄ−ソルビツト − − (12) Ｄ−マンニツト − − (13) イノシツト − − (14) グリセリン − − (15) デンプン − − アルギニン ジヒドロラーゼ（Arginine
Dihydrolase） ＋ 炭素源の利用（37℃、１〜７日間培養） 利用するもの；Ｄ−グルコース、Ｌ−バリ
ン、β−Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン 利用しないもの；トレハロース、メソイノ
シトール ゲラニオール バージイズ・マニアル・オブ・デターミネイテ
イブ・バクテリオロジー（Bergey′s Menual of
Deteminative Bacteriology）、８版（1974年）
の記載に従つて帰属同定を行なうと本菌はシユー
ドモナス属の特徴を有する。
合 細胞の形及び大きさ 棹菌 0.5〜0.7×1.0〜1.5μｍ 細胞の多形性の有無 単菌又は双菌 運動性の有無 有 極 鞭毛 胞子の有無 無 グラム染色性 陰性 抗酸性 無 (b) 各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養（37℃、２日間培養） (イ) コロニー形状の遅速 普通 直径約６mm (ロ) コロニーの形 円形 (ハ) コロニー表面の形状 平滑 (ニ) コロニーの隆起状態 半レンズ状 (ホ) コロニーの周縁 全縁 (ヘ) コロニーの内容 均質 (ト) コロニーの色調 乳白色 (チ) コロニーの透明度 半透明 (リ) コロニーの光沢 鈍光 (ヌ) 可溶性色素の生成 可溶性淡縁色色素生
成 肉汁寒天斜面培養（37℃、２日間培養） (イ) 生育の良否 生育良好 (ロ) コロニーの形 平滑 (ハ) コロニーの断面の隆起状態 扁平状 (ニ) コロニーの光沢 鈍光 (ホ) コロニー表面の形状 平滑 (ヘ) コロニーの透明度 半透明 (ト) コロニーの色 乳白色 (チ) コロニーの質 バター質 肉汁液体培養（37℃、２日間培養） (イ) 表面の生育 なし (ロ) 濁度 やや濁る (ハ) 沈澱 粉末状 (ニ) ガス発生 なし (ホ) 培地の着色 なし 肉汁寒天穿刺培養（37℃、２日間培養） (イ) 生育の場所 上下一様 (ロ) コロニーの形状 乳頭状 肉汁ゼラチン穿刺培養（20℃、14日間培
養） (イ) ゼラチン液化 なし リトマスミルク（37℃、７日間培養） (イ) 反応 BCPを青色に、リトマスを青紫
色にする (ロ) 凝固、液化 なし (c) 生理学的性質 硫酸塩の還元 − 脱窒反応 − MRテスト − VRテスト − インドールの生成 − 硫化水素の生成 ＋（Ｗ） デンプンの加水分解 − クエン酸の利用 ＋ 無機窒素源の利用 アンモニア態のみ利用 色素の生成 緑黄色水溶性蛍光色素生成 ウレアーゼ − オキシターゼ ＋ カタラーゼ ＋ 生育の範囲 PH５〜9.5 温度 10〜43℃ 酸素に対する態度 好気性 ０−Ｆテスト ０ 糖類からの酸及びガスの生成の有無 酸 ガス (1) Ｌ−アラビノース ＋ − (2) Ｄ−キシロース ＋ − (3) Ｄ−グルコース ＋ − (4) Ｄ−マンノース ＋ − (5) Ｄ−フラクトース − − (6) Ｄ−ガラクトース ＋ − (7) 麦芽糖 − − (8) シヨ糖 − − (9) 乳 糖 − − (10) トレハロース − − (11) Ｄ−ソルビツト − − (12) Ｄ−マンニツト − − (13) イノシツト − − (14) グリセリン − − (15) デンプン − − アルギニン ジヒドロラーゼ（Arginine
Dihydrolase） ＋ 炭素源の利用（37℃、１〜７日間培養） 利用するもの；Ｄ−グルコース、Ｌ−バリ
ン、β−Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン 利用しないもの；トレハロース、メソイノ
シトール ゲラニオール バージイズ・マニアル・オブ・デターミネイテ
イブ・バクテリオロジー（Bergey′s Menual of
Deteminative Bacteriology）、８版（1974年）
の記載に従つて帰属同定を行なうと本菌はシユー
ドモナス属の特徴を有する。
更に細胞にポリ−β−ヒドロキシ酪酸（poly−
β−hydroxybutyrate）の蓄積がないこと。蛍光
性色素を生成すること。アルギニン・ジヒドロラ
ーゼ（arginine dihydrolase）が存在することか
らシユードモナス属のエアロギノサ種（P.
aeroginosa）、プチダ種（P.putida）、フロレセン
種（P.fluorescene）、クロラフイス種（P.
chloraphis）、オウレオフアシエンス種（P.
aureofaciens）のいずれかに該当することがわか
つた。
β−hydroxybutyrate）の蓄積がないこと。蛍光
性色素を生成すること。アルギニン・ジヒドロラ
ーゼ（arginine dihydrolase）が存在することか
らシユードモナス属のエアロギノサ種（P.
aeroginosa）、プチダ種（P.putida）、フロレセン
種（P.fluorescene）、クロラフイス種（P.
chloraphis）、オウレオフアシエンス種（P.
aureofaciens）のいずれかに該当することがわか
つた。
そして生育温度範囲はプチダ種のそれよりも高
くエアロギノサ種に近いものを示すが、硫酸塩を
還元しないこと。ゲラニオール、イノシツト及び
トレハロースを資化せず、バリン及びβ−アラニ
ンを資化することからプチダ種（Pseudomonas
putida）の変種と同定した。
くエアロギノサ種に近いものを示すが、硫酸塩を
還元しないこと。ゲラニオール、イノシツト及び
トレハロースを資化せず、バリン及びβ−アラニ
ンを資化することからプチダ種（Pseudomonas
putida）の変種と同定した。
本菌種の代表的菌株であるシユードモナス・プ
チダ（Pseudomonas putida）TS−15001は工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている
（微工研条寄第159号）。
チダ（Pseudomonas putida）TS−15001は工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている
（微工研条寄第159号）。
この微生物を培養するためな培地としては、炭
素源、窒素源、有機栄養源、無機栄養源などを含
む通常の栄養培地が使用できる。
素源、窒素源、有機栄養源、無機栄養源などを含
む通常の栄養培地が使用できる。
炭素源としては、グルコース、シユクロース、
糖蜜等の炭水化物ならびに酒石酸、フマル酸、マ
レイン酸、リンゴ酸等の有機産及びその塩類を、
窒素源としては通常の醗酵に用いられる硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、アンモニア、リン
酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素
化合物及び尿素、コーン・ステイーブ・リカー、
カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなど
の有機窒素化合物を用いることができる。
糖蜜等の炭水化物ならびに酒石酸、フマル酸、マ
レイン酸、リンゴ酸等の有機産及びその塩類を、
窒素源としては通常の醗酵に用いられる硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、アンモニア、リン
酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素
化合物及び尿素、コーン・ステイーブ・リカー、
カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなど
の有機窒素化合物を用いることができる。
その他無機栄養源としては、例えば、カルシウ
ム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、
鉱塩、マンガン塩、亜鉛塩、銅塩などが用いられ
る。
ム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、
鉱塩、マンガン塩、亜鉛塩、銅塩などが用いられ
る。
この微生物の培養は慣用の方法で行なうことが
できる。通常約20ないし約40℃、好ましくは約25
ないし約38℃で、PH約５ないし約９、好ましくは
約5.5ないし約7.5で、振とう、通気撹拌などの手
段により好気的に行なわれる。なお、培養に当つ
て、培地中にα−APE、フエニルアラニン低級
アルキルエステル等を少量添加しておくことによ
つて得られる微生物の培養物又はその処理物のα
−APE生産能を高めることができる。
できる。通常約20ないし約40℃、好ましくは約25
ないし約38℃で、PH約５ないし約９、好ましくは
約5.5ないし約7.5で、振とう、通気撹拌などの手
段により好気的に行なわれる。なお、培養に当つ
て、培地中にα−APE、フエニルアラニン低級
アルキルエステル等を少量添加しておくことによ
つて得られる微生物の培養物又はその処理物のα
−APE生産能を高めることができる。
本発明で用いる微生物の培養物他はその処理物
とは、この微生物を培養して得られた培養液、こ
の培養液等から採取した菌体、これらを処理して
得た洗浄菌体、乾燥菌体、菌体破砕物、自己消化
等による菌体消化物、菌体の超音波処理物、その
他の溶菌生成物又はこれらを固定したものなどを
云う。また、これらの培養物から得られた酵素蛋
白質区分も含むものである。
とは、この微生物を培養して得られた培養液、こ
の培養液等から採取した菌体、これらを処理して
得た洗浄菌体、乾燥菌体、菌体破砕物、自己消化
等による菌体消化物、菌体の超音波処理物、その
他の溶菌生成物又はこれらを固定したものなどを
云う。また、これらの培養物から得られた酵素蛋
白質区分も含むものである。
培養液からの菌体の分離、得られた菌体の処理
等は慣用の方法で容易に行なうことができる。
等は慣用の方法で容易に行なうことができる。
本発明は、この微生物の培養物又はその処理物
を水溶液中でフマル酸、アンモニア及びＬ−フエ
ニルアラニン低級アルキルエステルと接触させる
ことにより行なうものである。また本発明は、用
いる微生物の培養途中で、培地中にフマル酸、ア
ンモニア及びＬ−フエニルアラニン低級アルキル
エステルを添加して培養を継続し、両者と本発明
の微生物とを接触させることによつても実施でき
る。
を水溶液中でフマル酸、アンモニア及びＬ−フエ
ニルアラニン低級アルキルエステルと接触させる
ことにより行なうものである。また本発明は、用
いる微生物の培養途中で、培地中にフマル酸、ア
ンモニア及びＬ−フエニルアラニン低級アルキル
エステルを添加して培養を継続し、両者と本発明
の微生物とを接触させることによつても実施でき
る。
本発明で用いるフマル酸、アンモニア及びＬ−
フエニルアラニン低級アルキルエステルは、それ
ぞれ遊離の形のものであつてもよいし、それぞれ
の塩の形であつてもよい。フマル酸に対するアン
モニアの量比は通常当量比で、前者１に対して後
者約0.5ないし約10程度、好ましくは約１ないし
約５である。従つて、実際的にはこの両原料とし
てフマル酸アンモニウム（フマル酸水素アンモニ
ウム又はフマル酸アンモニウム）を用いるのが便
利である。
フエニルアラニン低級アルキルエステルは、それ
ぞれ遊離の形のものであつてもよいし、それぞれ
の塩の形であつてもよい。フマル酸に対するアン
モニアの量比は通常当量比で、前者１に対して後
者約0.5ないし約10程度、好ましくは約１ないし
約５である。従つて、実際的にはこの両原料とし
てフマル酸アンモニウム（フマル酸水素アンモニ
ウム又はフマル酸アンモニウム）を用いるのが便
利である。
本発明で微生物の培養物又はその処理物を、フ
マル酸、アンモニア及びＬ−フエニルアラニン低
級アルキルエステルと接触させる際の濃度には格
別の制限はないが、フマル酸及びＬ−フエニルア
ラニン低級アルキルエステルの濃度は、通常、約
１重量％ないし溶解度の許す範囲、好ましくは約
５重量％ないし約40重量％程度である。
マル酸、アンモニア及びＬ−フエニルアラニン低
級アルキルエステルと接触させる際の濃度には格
別の制限はないが、フマル酸及びＬ−フエニルア
ラニン低級アルキルエステルの濃度は、通常、約
１重量％ないし溶解度の許す範囲、好ましくは約
５重量％ないし約40重量％程度である。
本発明の微生物の培養物又はその処理物の使用
量にも格別の制限はないが、これらは通常モル濃
度でより低い濃度の基質１モル当り、湿菌重量で
約10ｇないし約1000ｇ、好ましくは約50ｇないし
約500ｇの菌体に相当する培養物又は処理物を用
いる。
量にも格別の制限はないが、これらは通常モル濃
度でより低い濃度の基質１モル当り、湿菌重量で
約10ｇないし約1000ｇ、好ましくは約50ｇないし
約500ｇの菌体に相当する培養物又は処理物を用
いる。
本発明の方法の反応温度は、通常約10℃ないし
約50℃、好ましくは約25℃ないし約40℃である。
また、反応液の液性は、PH約４ないし約７、好ま
しくは約５ないし約６である。従つてこの調節の
ために緩衝剤、酸又は塩基等を適当に添加してよ
い。
約50℃、好ましくは約25℃ないし約40℃である。
また、反応液の液性は、PH約４ないし約７、好ま
しくは約５ないし約６である。従つてこの調節の
ために緩衝剤、酸又は塩基等を適当に添加してよ
い。
反応時間は何ら限定的でないが、通常約１時間
ないし約40時間、好ましくは約10時間ないし約20
時間程度が便利である。
ないし約40時間、好ましくは約10時間ないし約20
時間程度が便利である。
本発明で用いるＬ−フエニルアラニン低級アル
キルエステルの低級アルキル基は、メチル基、エ
チル基、イソプロピル基などの基である。
キルエステルの低級アルキル基は、メチル基、エ
チル基、イソプロピル基などの基である。
フエニルアラニン低級アルキルエステルのＤ−
体は利用されず、また反応に関与しないので、そ
のＬ−体に代えてラセミ体を用いてもよい。
体は利用されず、また反応に関与しないので、そ
のＬ−体に代えてラセミ体を用いてもよい。
生成したα−APEは公知の分離精製手段によ
り分離精製することができる。例えば、反応液に
菌体等の固形分を含むときは、遠心分離、過等
によりこれを分離したのち、必要に応じて除蛋白
等の処理を行ない、慣用のカラムクロマトグラフ
イー、薄層クロマトグラフイー、晶析、滅圧下で
の乾燥等の分離精製手段によりα−APEを精製
単離することができる。
り分離精製することができる。例えば、反応液に
菌体等の固形分を含むときは、遠心分離、過等
によりこれを分離したのち、必要に応じて除蛋白
等の処理を行ない、慣用のカラムクロマトグラフ
イー、薄層クロマトグラフイー、晶析、滅圧下で
の乾燥等の分離精製手段によりα−APEを精製
単離することができる。
本発明によれば、Ｌ−アスパラギン酸や、その
Ｎ−保護体の代りに、より容易に得られ、かつよ
り経済的なフマル酸を用いて、直ちにα−APE
を製造することができる。また生化学反応を利用
するので、原料としてラセミ体を用いてもα−
APEのLL−体のみを選択的に製造することがで
きる。更にまた、本発明ではβ−APEの副生が
ない。
Ｎ−保護体の代りに、より容易に得られ、かつよ
り経済的なフマル酸を用いて、直ちにα−APE
を製造することができる。また生化学反応を利用
するので、原料としてラセミ体を用いてもα−
APEのLL−体のみを選択的に製造することがで
きる。更にまた、本発明ではβ−APEの副生が
ない。
以下、実施例で本発明を更に詳細に説明する。
実施例中、百分率はいずれも重量百分率を示す。
実施例中、百分率はいずれも重量百分率を示す。
実施例 １
フマール酸水素アンモニウム２％、リン酸２水
素１カリウム0.1％、リン酸１水素２カリウム0.1
％、硫酸マグネシウム・７水塩0.05％、硫酸第２
鉄・７水塩0.01％、塩化マンガン0.01％、塩化ナ
トリウム0.01％及び残部水からなる培地（PH5.5）
1.0を２容ミニジヤー型醗酵槽に入れ、120
℃、15分間滅菌を行なつた。
素１カリウム0.1％、リン酸１水素２カリウム0.1
％、硫酸マグネシウム・７水塩0.05％、硫酸第２
鉄・７水塩0.01％、塩化マンガン0.01％、塩化ナ
トリウム0.01％及び残部水からなる培地（PH5.5）
1.0を２容ミニジヤー型醗酵槽に入れ、120
℃、15分間滅菌を行なつた。
これにこれと同一組成の培地（PH5.5）にシユ
ードモナス プチダTS−15001を37℃で16時間培
養して得た前培養液50mlを接種し、培養期間中PH
5.5〜6.0を維持するように2N−HCl水溶液、2N
−NaOH水溶液を添加しながら培養温度37℃、
撹拌器回転数500rpm、通気量１空気／分の条
件下で通気撹拌培養を行なつた。16時間培養後、
得られた培養液のうち、その500mlを遠心分離し
て菌体を集め（湿潤菌体量５ｇ）、これを１／
50Mリン酸塩緩衝液（PH5.5）25mlに懸濁した。
この懸濁液をフマル酸水素アンモニウム3.3ｇ、
Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル4.5ｇを含
む水溶液25mlに加え、振とうしながら37℃で16時
間反応を行なつた。反応了終後、反応液を15℃、
10000rpmで30分間遠心分離して菌体を除いた。
得られた上清液を水：エタノール（容量比80：
20）を溶離液とするカラムクロマトグラフイー
（充填剤トヨパール55F商標、東洋曹達工業(株)製）
により分画を行なつた。α−Ｌ−アスパルチルー
Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルに相当する
分画区分を減圧下で濃縮を行ない白色粉末50mgを
得た。このものの元素分析値及び物理化学的性質
は以下の通りであつた。
ードモナス プチダTS−15001を37℃で16時間培
養して得た前培養液50mlを接種し、培養期間中PH
5.5〜6.0を維持するように2N−HCl水溶液、2N
−NaOH水溶液を添加しながら培養温度37℃、
撹拌器回転数500rpm、通気量１空気／分の条
件下で通気撹拌培養を行なつた。16時間培養後、
得られた培養液のうち、その500mlを遠心分離し
て菌体を集め（湿潤菌体量５ｇ）、これを１／
50Mリン酸塩緩衝液（PH5.5）25mlに懸濁した。
この懸濁液をフマル酸水素アンモニウム3.3ｇ、
Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル4.5ｇを含
む水溶液25mlに加え、振とうしながら37℃で16時
間反応を行なつた。反応了終後、反応液を15℃、
10000rpmで30分間遠心分離して菌体を除いた。
得られた上清液を水：エタノール（容量比80：
20）を溶離液とするカラムクロマトグラフイー
（充填剤トヨパール55F商標、東洋曹達工業(株)製）
により分画を行なつた。α−Ｌ−アスパルチルー
Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルに相当する
分画区分を減圧下で濃縮を行ない白色粉末50mgを
得た。このものの元素分析値及び物理化学的性質
は以下の通りであつた。
実測値（％） α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ
−フエニルアラニンメチル
エステルとしての計算値
（％） Ｃ 57.70 57.14 Ｈ 6.20 6.12 Ｎ 10.05 9.52 融点：235〜236℃で、分解した。
−フエニルアラニンメチル
エステルとしての計算値
（％） Ｃ 57.70 57.14 Ｈ 6.20 6.12 Ｎ 10.05 9.52 融点：235〜236℃で、分解した。
比旋光度：〔α〕25/D＋32.0（Ｃ＝1.0、酢酸）
アミノ基をトリフロロアセチル化、カルボキシ
ル基をメチル化したものの分子量は404であつた。
ル基をメチル化したものの分子量は404であつた。
また、これをＬ−フエニルアラニル−Ｌ−フエ
ニルアラニン、Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエ
ニルアラニンメチルエステル、ジケトピペラジ
ン、Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−フエニルアラニ
ンメチルエステル、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−ア
スパラチル−Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−アスパ
ルチル−Ｌ−アスパラギン酸、α−Ｌ−アスパル
チル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル、β
−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンを標
準物質として薄層クロマトグラフイー、高速液体
クロマトグラフイー及びアミノ酸分析計で分析を
行なつた。更に塩酸メタノールによるメチル化及
びトリフロロアセテートメチルエステルによるト
リフロロアセチル化処理を行なつた試料のガスク
ロマトグラフイーならびにガスクロマトグラフイ
ー・マススペクトルグラフイー分析によりこれが
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメ
チルエステルであることを同定確認した。
ニルアラニン、Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエ
ニルアラニンメチルエステル、ジケトピペラジ
ン、Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−フエニルアラニ
ンメチルエステル、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−ア
スパラチル−Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−アスパ
ルチル−Ｌ−アスパラギン酸、α−Ｌ−アスパル
チル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル、β
−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンを標
準物質として薄層クロマトグラフイー、高速液体
クロマトグラフイー及びアミノ酸分析計で分析を
行なつた。更に塩酸メタノールによるメチル化及
びトリフロロアセテートメチルエステルによるト
リフロロアセチル化処理を行なつた試料のガスク
ロマトグラフイーならびにガスクロマトグラフイ
ー・マススペクトルグラフイー分析によりこれが
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメ
チルエステルであることを同定確認した。
実施例 ２
シユードモナス プチダTS−15001を実施例１
と同一組成の培地に同一条件で培養した。得られ
た培養液のうち、その500mlから遠心分離により
菌体を集め（湿潤菌体量５ｇ）、1/50Ｍリン酸塩
緩衝液25mlに懸濁した。こうして得た菌体懸濁液
を５℃で15分間超音波処理して菌体を破砕した。
破砕液を５℃、10000rpmで15分間遠心分離して
得た上清液をフマル酸水素アンモニウム3.0ｇ及
びＬ−フエニルアラニンメチルエステル4.5ｇを
含む水溶液25mlに加え、振とうしながら37℃で16
時間反応を行なつた。以下実施例１と同様に処理
を行ない、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラ
ニンメチルエステルの白色粉末30mgを得た。
と同一組成の培地に同一条件で培養した。得られ
た培養液のうち、その500mlから遠心分離により
菌体を集め（湿潤菌体量５ｇ）、1/50Ｍリン酸塩
緩衝液25mlに懸濁した。こうして得た菌体懸濁液
を５℃で15分間超音波処理して菌体を破砕した。
破砕液を５℃、10000rpmで15分間遠心分離して
得た上清液をフマル酸水素アンモニウム3.0ｇ及
びＬ−フエニルアラニンメチルエステル4.5ｇを
含む水溶液25mlに加え、振とうしながら37℃で16
時間反応を行なつた。以下実施例１と同様に処理
を行ない、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラ
ニンメチルエステルの白色粉末30mgを得た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ シユードモナス属に属し、フマル酸、アンモ
ニア及びＬ−フエニルアラニン低級アルキルエス
テルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルア
ラニン低級アルキルエステルを生成させることの
できる微生物の培養物又はその処理物を、フマル
酸、アンモニア及びＬ−フエニルアラニン低級ア
ルキルエステルと接触させることを特徴とするα
−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン低級
アルキルエステルの製造法。 ２ 反応をPH約４ないし約７で行なう特許請求の
範囲第１項記載の製造法。 ３ 微生物の培養物がその菌体である特許請求の
範囲第２項又は第３項記載の製造法。 ４ 微生物の培養物の処理物がその溶菌生成物で
ある特許請求の範囲第１項又は第２項記載の製造
法。 ５ Ｌ−フエニルアラニン低級アルキルエステル
及びα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニ
ン低級アルキルエステルの低級アルキル基がメチ
ル基である特許請求の範囲第１項ないし第４項の
いずれかの項記載の製造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57136332A JPS5928493A (ja) | 1982-08-06 | 1982-08-06 | アスパルチルフエニルアラニンアルキルエステルの製造法 |
| CA000433525A CA1201402A (en) | 1982-08-06 | 1983-07-29 | Process for preparation of aspartylphenylalanine alkyl esters |
| DE8383107615T DE3379842D1 (en) | 1982-08-06 | 1983-08-02 | Process for preparation of aspartylphenylalanine alkyl esters |
| EP83107615A EP0102529B1 (en) | 1982-08-06 | 1983-08-02 | Process for preparation of aspartylphenylalanine alkyl esters |
| US06/520,129 US4587214A (en) | 1982-08-06 | 1983-08-03 | Process for preparation of aspartylphenylalanine alkyl esters |
| AU17565/83A AU561146B2 (en) | 1982-08-06 | 1983-08-03 | Fermentation process to produce lower alkyl esters of alpha- l-aspartyl-lphenyl-alanine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57136332A JPS5928493A (ja) | 1982-08-06 | 1982-08-06 | アスパルチルフエニルアラニンアルキルエステルの製造法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15524090A Division JPH0315381A (ja) | 1990-06-15 | 1990-06-15 | 新規微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5928493A JPS5928493A (ja) | 1984-02-15 |
| JPH032520B2 true JPH032520B2 (ja) | 1991-01-16 |
Family
ID=15172741
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57136332A Granted JPS5928493A (ja) | 1982-08-06 | 1982-08-06 | アスパルチルフエニルアラニンアルキルエステルの製造法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4587214A (ja) |
| EP (1) | EP0102529B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5928493A (ja) |
| AU (1) | AU561146B2 (ja) |
| CA (1) | CA1201402A (ja) |
| DE (1) | DE3379842D1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0154472B1 (en) * | 1984-03-07 | 1989-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for the production of l-aspartyl-l-phenylalanine ester |
| JPS62205781A (ja) * | 1986-03-03 | 1987-09-10 | Res Assoc Util Of Light Oil | シユ−ドモナス属菌株の培養方法 |
| US7285350B2 (en) * | 2002-09-27 | 2007-10-23 | Questair Technologies Inc. | Enhanced solid oxide fuel cell systems |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3214345A (en) * | 1958-11-20 | 1965-10-26 | Tanabe Seiyaku Co | Process for producing l-aspartic acid |
| GB1004218A (en) * | 1962-05-26 | 1965-09-15 | Ajinomoto Kk | A process for producing l-aspartic acid |
| US3933586A (en) * | 1972-09-07 | 1976-01-20 | Les Produits Organiques Du Santerre Orsam | Method of making l-aspartic acid from fumaric acid |
| US4119493A (en) * | 1975-10-23 | 1978-10-10 | (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center | Process for producing a peptide |
| DE2801238C2 (de) * | 1977-01-27 | 1986-06-05 | (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center, Tokio/Tokyo | Verfahren zur Herstellung von Salzen aus L,L-Dipeptiden und Phenylalaninestern |
| JPS5411293A (en) * | 1977-05-23 | 1979-01-27 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | Recovery of protease |
| JPS6022918B2 (ja) * | 1978-07-27 | 1985-06-04 | 財団法人相模中央研究所 | Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−ｌ−アスパルチル−ｌ−フェニルアラニンメチル−エステルとフェニルアラニンメチルエステルとの付加化合物の製造方法 |
| US4335205A (en) * | 1979-04-06 | 1982-06-15 | Greenwood James R | Low protein degradation product basal medium for identification of non-fermentative gram-negative bacilli and other microorganisms |
| US4506011A (en) * | 1981-09-05 | 1985-03-19 | Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. | Process for preparation of aspartylphenylalanine alkyl esters |
-
1982
- 1982-08-06 JP JP57136332A patent/JPS5928493A/ja active Granted
-
1983
- 1983-07-29 CA CA000433525A patent/CA1201402A/en not_active Expired
- 1983-08-02 DE DE8383107615T patent/DE3379842D1/de not_active Expired
- 1983-08-02 EP EP83107615A patent/EP0102529B1/en not_active Expired
- 1983-08-03 US US06/520,129 patent/US4587214A/en not_active Expired - Fee Related
- 1983-08-03 AU AU17565/83A patent/AU561146B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4587214A (en) | 1986-05-06 |
| AU561146B2 (en) | 1987-04-30 |
| EP0102529A3 (en) | 1986-09-17 |
| EP0102529A2 (en) | 1984-03-14 |
| DE3379842D1 (en) | 1989-06-15 |
| EP0102529B1 (en) | 1989-05-10 |
| JPS5928493A (ja) | 1984-02-15 |
| AU1756583A (en) | 1984-02-09 |
| CA1201402A (en) | 1986-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4774179A (en) | Process for preparing a 7-aminocephalosporanic acid compound | |
| US4506011A (en) | Process for preparation of aspartylphenylalanine alkyl esters | |
| US3871963A (en) | Microbial protease and preparation thereof | |
| US5783428A (en) | Method of producing fumaric acid | |
| JPS6322188A (ja) | 新規なｌ−アミノアシラ−ゼ | |
| JPH032520B2 (ja) | ||
| US5219741A (en) | Method of making L-proline using an N-acyl-L-protine acylase | |
| JPH01187090A (ja) | ε−ポリリシンの製造方法およびε−ポリリシン生産菌 | |
| JPH0445159B2 (ja) | ||
| FR2620731A1 (fr) | Nouveau systeme enzymatique, son procede de preparation et son application notamment dans la preparation de la d-parahydroxyphenylglycine | |
| JPH01320991A (ja) | Ｄ−ホモフエニルアラニン類の製造方法 | |
| EP0455170B1 (en) | Process for culturing microorganisms of the genus Pseudomonas and process for producing L-alanine using said microorganisms | |
| JPS6257317B2 (ja) | ||
| KR950005424B1 (ko) | L-아스파르틸-l-페닐알라닌 및 그의 디케토피페라진의 제조 방법 | |
| JPH0214040B2 (ja) | ||
| EP0310949B1 (en) | Process for producing d-alanine | |
| JPS5829078B2 (ja) | 補酵素ｑ↓１↓０の製造法 | |
| JPS6255839B2 (ja) | ||
| JPS6240298A (ja) | 微生物処理による光学活性なジブロモプロパノ−ルの製法 | |
| JPH04304894A (ja) | 微生物によるピラジン酸の水酸化物の製造方法 | |
| JPH07327690A (ja) | インジゴの製造法 | |
| JPH0362397B2 (ja) | ||
| JPH0191793A (ja) | ジ‐ｄ‐フラクトシルフラノース２，６′：６，２′ジアンハイドライドの製造法 | |
| JPH0158957B2 (ja) | ||
| JPS6328385A (ja) | 微生物菌体の製造方法 |