JPH0325440B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規生理活性物質OF4949及びその製
造法に関するものである。 本発明者らは微生物の生産する新規生理活性物
質の検索を行い、土壌から新たに分離したペニシ
リウム（Penicillium）属に属する微生物中に、
アミノペプチターゼ（aminopeptidase）Ｂの活
性を強力に阻害する生理活性物質、すなわち、本
発明者により、OF4949と命名された水溶性両性
のペプチド系物質が蓄積されることを見出した。 更に詳細な研究の結果、本発明者らは、
OF4949より性状類似の二物質OF4949−及び
OF4949−を単離精製することに成功した。理
化学的及び生物学的性質よりOF4949−及び
OF4949−は１箇所に異なる置換基が存在する
ことを除けば同一の構造を有する新規生理活性物
質であることを確かめた。本発明はこのうち、
OF4949−に係るものである。 本明細書ではOF4949−及び／又はOF4949−
をOF4949と称する。 OF4949は抗アミノペプチダーゼＢ活性を有す
ることよりブラジキニンの生成を阻害して抗炎症
作用を示し、種々の疾患に対する治療剤として使
用され得る。 またOF4949は羊赤血球を抗原としてマウス足
蹠に接種して得られる遅延型過敏症を指標として
得られる細胞性免疫の増強作用を示し、生体の免
疫能を高めることにより、免疫制癌剤として用い
うる。 OF4949を生産する代表菌株は本発明者らによ
り京都府の土壌から分離されたもので、その菌学
的性質は次の通りである。 (1) 各種培地における発育状態（24℃、２週間） 麦芽エキス寒天培地 生育は遅く集落の径は２週間で2.0〜2.5cm。集
落の表面は暗緑色ないし青緑色となり、集落中心
部はやや隆起する。集落周辺部は平坦でビロード
状の菌糸体を形成する。集落の縁は、巾１〜２mm
で白い。裏面は一部黄色となるが寒天中への色素
分泌はない。 バレイシヨ、ブドウ糖培地 生育は遅く、集落の径は２週間で2.5〜3.0cm。
集落の中心部は白色ないし灰緑色。周辺部は黄色
ないし黄緑色でビロード状の菌糸体を形成する。
集落表面には放射状の溝が認められる。裏面は淡
黄色ないし黄橙色でわずかにひだがあり寒天中へ
の色素分泌はない。 ツアペツク寒天 生育は極めて遅く、分生胞子の着生も悪い。集
落の径は２週間で1.5〜2.0cm。表面は淡黄色ない
し黄橙色のビロード状の菌糸体を形成する。部分
的に白色ないし灰色となることもある。裏面は着
色せず、寒天中への色素の分泌もない。 コンステイープリカ添加ツアペツク寒天 生育は遅く集落の径は２週間で2.0〜2.5cm。表
面は黄緑色ないし暗緑色のビロード状菌糸体を形
成し、集落中心部はひだを形成することもある。
集落の縁は巾１〜２mmで白い。裏面は着色せず寒
天中への色素の分泌はない。 麦芽汁寒天 生育良好で集落の径は２週間で3.0〜4.0cmに達
する。集落中心部はやや隆起し、暗緑色ないし青
緑色ビロード状で周辺は黄色ないし黄緑色を帯び
る。表面、裏面とも多くのひだを形成し、裏面は
黄橙色ないし黄褐色となるが寒天中への色素の分
泌はない。 (2) 形態 菌糸は無色で隔壁があり、ペニシラスは大部分
整斉双輪生状であるが、たまに単輪状のものもあ
る。分生胞子は楕円形をなし、長さ3.0μｍないし
4.0μｍ、巾2.5μｍないし3.0μｍであり、分生胞子
連鎖の大きさは50μｍから80μｍに及ぶ。梗子は
とつくり状ないし槍鋒状で、並行状様に４個ない
し８個群生し、長さ10.0μｍないし13.0μｍ、巾
2.0μｍないし2.5μｍである。基底梗子は緻密状態
に、また幾分散開状態に２個ないし８個群生し、
長さ10μｍないし13μｍ、巾2.5μｍないし3.0μｍで
ある。分生子柄は、長さ50μｍないし80μｍ、巾
2.5μｍないし3.0μｍは多くは気菌糸又は栄養菌糸
より分岐せずに突出するが、分岐したものも見ら
れる。 (3) 生育条件 PH：２〜12の範囲で生育し、最適生育PHは、３
〜６。 温度：６℃〜33℃の範囲で生育可能で最適範囲
は、18℃〜28℃である。 以上の観察の結果、本菌は、ペニシリウム・ル
グロサム（Penicillium rugulosum）と同定され
た。 ペニシリウム・ルグロサム、についての菌学的
性質は、レイパー及びトム（Raper＆Thom）共
著、 1968年、ハフナー（Hafner）出版社の“ア・
マニユアル・オブ・ザ・ペニシリア（Ａ
Manual of the Penicillia）”、ドムシユ及びガム
ス（Domsh＆Gams）共著、1972年、ロングマン
（Longman）社の“フアンジー・イン・アグリカ
ルチユラル・ソイルズ（Fungi in Agricultural
Soils）”並びに阿部著の“ジヤーナル・オブ・ジ
エネラル・アンド・アプライド・マイクロバイオ
ロジー（Journal of General and Applied
Microbiology）”２巻１頁1956年に、詳しく記載
されている。 本発明者らはOF4949生産性により本菌を“ペ
ニシリウム・ルグロサムOF4949（Penicillium
rugulosumOF4949）”と命令した。なお、本菌は
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研条寄第203号（FERM BP−203）なる受託
番号のもとに寄託されている。 本発明における使用菌としては、上記寄託菌は
代表菌株であり、これ以外にペニシリウム属に属
する菌株であつてOF4949を生産する菌はすべて
用いることができる。また、これらの菌株は紫外
線を照射し、或いはニトロソグアニジンなどの微
生物の変異のために用いられている変異誘起剤に
よる処理によつて得られた人工的突然変異株及び
自然発生した変異株中にもOF4949を生産するも
のが見いだされ、これらの変異株も本発明に用い
ることができる。 本発明に使用される培養にあたつては、培地は
液体でも固体でもよいが、通常は液体培地による
振盪培養、又は通気撹拌培養が用いられる。培地
はカビの生育に適し、OF4949を生産し得るもの
であればどのようなものでも良い。即ち、炭素源
としては、グルコース、フラクトース、マルトー
ス、シユークロース、ラクトース、デキストリ
ン、澱粉、グリセリン、ソルビトール等の糖類、
及び大豆油等の植物性油脂類が用いられる。窒素
源としては、例えば、ペプトン、酵母エキス、肉
エキス、大豆粉、綿実粉、コーンステイープリ
カ、麦芽エキス、グルタミン酸、アスパラギン
酸、チロシン、フエニルアラニン等のアミノ酸、
及びその塩類、尿素アンモニウム塩類、硝酸塩等
が用いられる。その他、燐酸マグネシウム、カル
シウム、ナトリウム、カリウム、鉄、マンガン等
の無機塩類、ビタミンB₁、パントテン酸カルシ
ウムなどのビタミン類等の微量栄養素を適宜加え
ることができる。 大量培養には液体培養が好ましい。 培地のPH、培養温度などの培養条件は、
OF4949を生産する範囲内で適宜変更し得るが、
液体の振盪又は通気撹拌培養の場合は、PH４〜
７、培養温度25℃〜30℃、培養期間２〜10日間の
培養が適当である。このようにして得られる培養
液中には、OF4949が蓄積される。 本発明に係る物質は、培養濾液、及び菌体のい
ずれにも存在し、いずれからも採取することがで
きる。培養濾液及び菌体から目的物を取り出すに
は、本発明に係る物質の性状に基づいて、例え
ば、活性炭、非イオン性吸着樹脂による吸着クロ
マトグラフイー、イオン交換樹脂によるイオン交
換クロマトグラフイー、セルロース等による分配
クロマトグラフイー、アルキル基結合シリカゲ
ル、による逆相分配クロマトグラフイー、ゲル濾
過担体、によるゲル濾過等通常微生物の培養物か
ら有機物質を分離精製する手段が適宜組み合わせ
て使用される。より具体的には、活性炭（和光純
薬社製）、ダイヤイオンHP−20（三菱化成社製）、
などの吸着剤を詰めたカラムに培養濾液、菌体含
水アセトン抽出液、又は本物質を含有する液を通
して吸着させた後、酸、アルカリ、水、メタノー
ル、エタノール、アセトンなどを単独で、或いは
組み合わせた混合溶媒を用いて溶出する。更にこ
の溶出液をダウエツクス50W（H⁺型）（ダウ・ケ
ミカル社製）などの強酸性陽イオン交換樹脂、或
いは、ダウエツクス１×２（OH^-型）（ダウ・ケ
ミカル社製）などの強塩基性陰イオン交換樹脂を
詰めたカラムに吸着させ、酸、アルカリ、若しく
は塩類溶液を用いて溶出させる。 また、ダウエツクス１×２（Cl型）を通過させ
て不純物を除去することもできる。このようにし
て得た溶液から前述の如く、ダイヤイオンHP−
20等を用いて吸着し、次いで溶媒で溶出すること
により脱塩した後、減圧下濃縮すると目的物は黄
褐色を帯びた粗物質として得られる。次にこの粗
物質を結晶セルロース・アビセル（フナコシ社
製）、アルキル基結合シリカゲルのリクロプレツ
プRP−８（メルク社製）、カートリツジカラムC₁₈
（ウオーターズ社製）などのカラムにかけ、酸、
アルカリ、水、緩衝液、メタノール、アセトニト
リル、プロパノール、ｎ−ブタノール、などを単
独で或いはそれらを組み合わせた混合溶媒で展開
すると、目的物を単品として得ることができる。 次に本発明に係るOF4949−の性質を、性状
類似のOF4949−の性質と比較しながら詳述す
る。 〔理化学的性質〕 分子式 OF4949−：C₂₃H₂₆O₈N₄ OF4949−：C₂₂H₂₄O₈N₄ 元素分析値 OF4949−： 実測値 炭素52.30％，水素5.46％，窒素10.64％ 理論値 炭素52.87％，水素5.79％，窒素10.72％ （C₂₃H₂₆O₈N₄・2H₂Oとして） OF4949−： 実測値 炭素51.60％，水素5.48％，窒素11.06％ 理論値 炭素51.97％，水素5.55％，窒素11.02％ （C₂₂H₂₄O₈N₄・2H₂Oとして） 分子量 SIMS（Secondary Ion Mass
Spectrometry）法により測定したOF4949−
及びOF4949−の分子量は次の通りである。 OF4949−：486 OF4949−：472 融点 OF4949−，OF4949−共に280℃付近で
分解する。 比旋光度 OF4949−：［α］²⁵ _D＝−64.8゜ （Ｃ＝1.0，H₂O） OF4949−：［α］²⁵ _D＝−42.6゜ （Ｃ＝1.0，H₂O） 紫外線吸収スペクトル OF4949−及びOF4949−の下記の溶剤に
溶解した場合の極大吸収を示す波長及びＥ１％ １cm
値は次の通りである。

【表】

【表】 赤外線吸収スペクトル OF4949−及びOF4949−の臭化カリウム
錠により測定した極大吸収は次の通りである。

【表】 溶解性 OF4949−，OF4949−共に水、アルカリ
水、ジメチルスルフオキサイド、に可溶。メタ
ノール、エタノールに難溶。ｎ−プロパノー
ル、ｎ−ブタノール、アセトン、酢酸エチル、
クロロホルム、エーテル、ベンゼン、ヘキサン
に不溶。 呈色反応 OF4949−，OF4949−共にニンヒドリ
ン、過マンガン酸カリ、ライドンスミス 沃素
反応陽性、坂口 プロカツカ ハーネス、アン
スロン反応陰性。OF4949−は塩化第二鉄反
応陰性。OF4949−は塩化第二鉄反応陽性。 中性、酸性、塩基性の区別 OF4949−、OF4949−共に両性物質であ
る。 薄層クロマトグラフイー シリカゲルプレート（メルク社製）上での
Rf値は次の通りである。

【表】

〔生物学的性質〕

OF4949はエールリツヒ癌細胞のアミノペプチ
ダーゼＢ活性を著しく阻害する生理活性を有す
る。 本発明に係るOF4949−の生物学的性質を、
性状類似のOF4949−と比較しながら詳述する。 アミノペプチダーゼＢの測定方法は、ホプスら
〔V.K.Hops，K.K.Makinen，G.G.Glenner，
Archives of Biochemistry abd Biphisics144
557（1966）〕の方法を改良して行つた。即ち、ハ
ンクス液（ニツスイ製薬社製）に溶解した3mM
アルギニン−β−ナフチルアミド（シグマ社製）
0.1mlに検体を含むハンクス液0.7mlを加えた混合
液を37℃、３分間加熱した後、ハンクス液に、
2.5×10⁷個／mlの濃度となるように調整したエー
ルリツヒ癌細胞懸濁液0.2mlを加え、37℃、30分
間反応した後0.3mg／c.c.の濃度にガーネツトGBC
（オルトアミノアゾトルエン・ジアゾニウム塩）
（シグマ社製）を含み、３％の濃度にツウイーン
20（Tween20）（和光純薬社製）を含む1.0M酢酸
緩衝液（PH4.2）3mlを加え、室温に15分間放置し
た後、その上清525nmにおける吸光度ａ測定し
た。 同時に検体を含まないハンクス液のみを用いた
対照の吸光度ｂを測定し、アミノペプチダーゼＢ
の阻害率を ｂ−ａ／ｂ×100 により計算した。上記に用いたエールリツヒ癌細
胞は、ddY系、４−６週令（雄）マウスの腹腔内
で継代維持されているもので、２×10⁶個の細胞
をマウス腹腔内に移植後７日〜10日目の腹水液よ
り採取した。細胞懸濁液は、エールリツヒ癌細胞
を含む腹水液をトリス−塩化アンモニウム溶液
（PH7.2）で処理し、赤血球を除去後、ハンクス液
で３回洗浄し、所定の細胞数にハンクス液で調整
したものである。このものは、エールリツヒ癌細
胞の生細胞数として96％以上の均一な細胞集団で
ある。上記試験法によるOF4949−及びOF4949
−のいくつかの濃度における阻害率を求め、そ
れぞれに50％阻害濃度を帰納した。その結果を第
１表に示した。

【表】 また本物質は羊赤血球を抗原としてマウスの足
蹠に接種して得られる遅延型過敏症（Delayed
TypeHypersensitivity：DTHと略記）を指標と
した細胞性免疫の増強作用を示した。即ち、羊赤
血球を抗原として１×10⁵個をCDF₁系10個令雌マ
ウス１群８匹に静脈注射して感作し、感作直後に
OF4949−又はOF4949−を滅菌水に溶解した
ものを、５、50、500μg／Kgの濃度となるように
腹腔内注射し、４日後に左後足の足蹠に羊赤血
球、10⁸個を皮下注射して、24時間後にその足蹠
に見られる腫張の程度（足蹠の厚さ）をノギスで
測定することにより判定した。その結果を第２表
に示した。 OF4949−又はOF4949−を投与したマウス
ではその腫張の程度が対照に比して著しく増強さ
れていた。このことは、0F4949−及びOF4949
−が細胞性免疫の成立に増強作用のあることを
示している。

【表】 なお、OF4949−及びOF4949−は、ICR系
マウスの腹腔内投与300mg／Kgでの急性毒性試験
の結果、毒性が認められなかつた。 医薬として投与する場合、本発明化合物はその
まま又は医薬的に許容される無毒性かつ不活性の
担体中に、例えば0.1％〜99.5％、好ましくは0.5
％〜90％含有する医薬組生物として、人を含む動
物に投与される。 担体としては、固形、半固形、又は液状の希釈
剤、充填剤、及びその他の処方用の助剤一種以上
が用いられる。医薬組成物は、投与単位形態で投
与することが望ましい。本発明医薬組成物は、経
口投与、組織内投与、局所投与（経皮投与等）又
は経直腸的に投与することができる。これらの投
与方法に適した剤型で投与されるのはもちろんで
ある。例えば、注射剤が特に好ましい。 用量は、年齢、体重、等の患者の状態、投与径
路、病気の性質と程度等を考慮した上で調整する
ことが望ましいが、通常は、成人に対して本発明
の有効成分量として、１日あたり、0.1〜1000mg
の範囲が一般的である。場合によつては、これ以
下で足りるしまた逆にこれ以上の用量を必要とす
ることもある。多量に投与するときは、１日数回
に分割して投与することが望ましい。 経口投与は固形または液状の用量単位、例えば
末剤、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、顆粒
剤、懸濁剤、液剤、シロツプ剤、ドロツプ剤、舌
下錠その他の剤型によつて行うことができる。 末剤は活性物質を適当な細かさにすることによ
り製造される。散剤は活性物質を適当な細かさと
成し、次いで同様に細かくした医薬用担体、例え
ば澱粉、マンニトールの如き可食性炭水化物その
他と混合することにより製造される。必要に応じ
風味剤、保存剤、分散剤、着色剤、香料その他の
ものを混じても良い。 カプセル剤は、まず上述のようにして粉末状と
なつた末剤や散剤あるいは錠剤の項で述べるよう
に顆粒化したものを、例えばゼラチンカプセルの
ようなカプセル外皮の中へ充填することにより製
造される。滑沢剤や流動化剤、例えばコロイド状
のシリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、
ステアリン酸カルシウム、固形のポリエチレング
リコールの如きものを粉末状態のものに混合し、
然るのちに充填操作を行うこともできる。崩壊剤
や可溶化剤、例えばカルボキシメチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低
置換度ヒドロキシプロピルセルロース、炭酸カル
シウム、炭酸ナトリウムを添加すれば、カプセル
剤が摂取されたときの医薬の有効性を改善するこ
とができる。 また、本品の微粉末を植物油、ポリエチレング
リコール、グリセリン、界面活性剤中に懸濁分散
し、これをゼラチンシートで包んで軟カプセル剤
とすることができる。錠剤は粉末混合物を作り、
顆粒化もしくはスラグ化し、次いで崩壊剤又は滑
沢剤を加えたのち打錠することにより製造され
る。 粉末混合物は、適当に粉末化された物質を上述
の希釈剤やベースと混合し、必要に応じ結合剤
（たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウ
ム、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリ
ドン、ポリビニルアルコールなど）、溶解遅延化
剤（たとえばパラフインなど）、再吸収剤（たと
えば四級塩）及び／又は吸着剤（たとえばベント
ナイト、カオリン、リン酸ジカルシウムなど）を
も併用しても良い。粉末混合物は、まず結合剤た
とえばシロツプ、でんぷん糊、アラビアゴム、セ
ルロース溶液又は高分子物質溶液で湿らせ、次い
で篩を強勢通過させて顆粒とすることできる。こ
のように粉末を顆粒化するかわりに、まず打錠機
にかけたのち、得られる不完全な形態のスラグを
破砕して顆粒にすることも可能である。 このようにして作られる顆粒は、滑沢剤として
ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、ミネラ
ルオイルその他を添加することにより、互いに付
着することを防ぐことができる。このように滑沢
化された混合物を、次いで打錠する。また薬物
は、上述のように顆粒化やスラグ化の工程を経る
ことなく、流動性の不活性担体と混合したのちに
直接打錠しても良い。シエラツクの密閉被膜から
成る透明または半透明の保護被覆、糖や高分子材
料の被覆、及びワツクスより成る磨上被覆の如き
も用いうる。 他の経口投与剤型、たとえば溶液、シロツプ、
エリキシルなどもまたその一定量が薬物の一定量
を含有するように用量単位形態にすることができ
る。シロツプは、化合物を適当な香味化水溶液に
溶解して製造され、またエリキシルは非毒性のア
ルコール性担体を用いることにより製造される。
懸濁剤は化合物を非毒性担体中に分散させること
により処方される。可溶化剤や乳化剤（たとえば
エトキシ化されたイソステアリルアルコール類、
ポリオキシエチレンソルビトールエステル類）、
保存剤、風味賦与剤（たとえばペパミント油、サ
ツカリン）その他もまた必要に応じ添加できる。 必要とあれば、経口投与のための用量単位処方
はマイクロカプセル化しても良い。該処方はまた
被覆をしたり、高分子・ワツクス等中にうめ込ん
だりすることにより作用時間の延長や持続放出を
もたらすこともできる。 非経口的投与は、皮下・筋肉内又は静脈内注射
用としたところの液状用量単位形態たとえば溶液
や懸濁剤の形態を用いることによつて行いうる。
これらのものは、化合物の一定量を、注射の目的
に適合する非毒性の液状担体たとえば水性や油性
の媒体に懸濁し又は溶解し、次いで該懸濁液又は
溶液を滅菌することにより製造される。あるいは
化合物の一定量をバイアルにとり、然るのち該バ
イアスとその内容物を滅菌し密閉しても良い。投
与直前に溶解又は混合するために、粉末又は凍結
乾燥した有効成分に添えて、予備的のバイアルや
担体を準備しても良い。注射液を等張にするため
に非毒性の塩や塩溶液を添加しても良い。さらに
安定剤、保存剤、乳化剤の如きものを併用するこ
ともできる。 直腸投与は、化合物を低融点の水に可溶又は不
溶の固体たとえばポリエチレングリコール、カカ
オ脂、高級エステル類（たとえばパルミチン酸ミ
リスチルエステル）及びそれらの混合物を混じた
坐剤を用いることによつて行いうる。 本発明化合物の製剤には、本発明に係る有効成
分に加えて他の薬物例えば、シトシンアラビノサ
イド、アドリアマイシン又はマイトマイシンなど
を配合してもよく、又は併用しても良い。 以下に本発明に係る製造方法の実施例を具体的
に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。 実施例 １ ペニシリウム・ルグロサムOF4949（通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所、受託番号微工
研条寄第203号）を麦芽エキス寒天の斜面培地に
７日間培養した。この斜面培養から、一白金耳を
グルコース２％、ポリペプトン0.5％、酵母エキ
ス0.1％、リン酸第一カリウム0.05％、硫酸マグ
ネシウム0.05％を含む培地500mlづつを２容量
の三角フラスコに分注し、120℃、20分間滅菌し
たものに接種し、27℃で毎分190回転の振盪で６
日間培養した。この培養物を予め滅菌しておいた
グルコース２％、ポリペプトン0.5％、酵母エキ
ス0.1％、リン酸第一カリウム0.05％、硫酸マグ
ネシウム0.05％、を含む培地20を入れた20の
ステンレス醗酵槽15基に１基あたり１ずつ植菌
して培養を開始した。培養は、毎分通気量20、
毎分回転数300回転、27℃で行い、必要に応じて
消泡剤を添加した。４日間培養して培養物を取り
出し、菌体を濾過して培養濾液を分離し、圧縮容
量6.5の菌体及び300の培養濾液が得られた。 実施例 ２ 実施例１で得られた菌体は50％アセトン水24
にて３回抽出し、抽出液72を30まで減圧濃縮
することによりアセトンを除去した。濃縮液30
と実施例１で得られた培養濾液300とともに活
性炭カラムに吸着させ、80の水で充分洗浄後、
50％アセトンをふくむPH２塩酸水溶液150にて
溶出した。アミノペプチダーゼ阻害活性画分80
を減圧下で30まで濃縮し、アセトンを除去後、
濃縮液30を強塩基性陰イオン交換樹脂ダウエツ
クス１×２（C1−型）の1.2カラムにかけ、水に
て溶出した。次に溶出液80をPH３に補正し、強
酸性陽イオン交換樹脂ダウエツクス50W（H⁺型）
の2.0カラムに吸着させた10の水にて洗浄後、
1.0Nのアンモニア水100にて溶出した。活性区
60を2N塩酸にて中和後非イオン性吸着樹脂ダ
イヤイオンHP−20の２に吸着させた。20の
水で洗浄後、50％メタノール水20にて溶出し
た。得られた活性区を減圧下濃縮し粗物質28.8g
を得た。 実施例 ３ 実施例２において得られた粗物質28.8gを結晶
セルロースアビセル30gにまぶし、減圧下充分乾
燥後アビセルカラム１の上部に充填した。展開
溶媒（1Nアンモニア水：ｎ−ブタノール＝15：
85）12で展開するとOF4949−を主に含む活
性区が、次いでOF4949−を主に含む活性区が
分離して得られた。それぞれの活性区を1NHC１
で中和し、減圧濃縮後、水に再溶解し、ダイヤイ
オンHP−20の500mlに吸着させた。水洗後２
の50％メタノール水で溶出し、活性区を減圧濃縮
することにより、OF4949−の粗粉末3.1g及び
OF4949−の粗粉末4.1gを得た。 実施例 ４ 実施例３において得られたOF4949−粗粉末
3.1gを15mlの水に溶解し、大量分取専用高速液体
クロマトグラフイー（システム500、ウオーター
ズ社）を用い、カラム：カートリツジカラム
（C₁₈、ウオーターズ社）、展開溶媒：0.1Mクエン
酸緩衝液：アセトニトリル＝90：10の条件下で逆
相分配クロマトグラフイーを行い、アミノペプチ
ダーゼＢ阻害活性を検定した。その活性区をダヤ
イオンHP−20の200mlに吸着させ、水洗浄、１
の50％メタノール水で溶出した。活性区を集め
た減圧下濃縮後、凍結乾燥することにより、
OF4949− 455mgを得た。 実施例３にて得られたOF4949−の粗粉末、
4.1gについても同様に展開溶媒0.1Mクエン酸緩
衝液：アセトニトリル＝95：５を用い、C₁₈逆相
分配クロマトグラフイーを行つた後、ダイヤイオ
ンHP−20のカラムクロマトグラフイーを行い、
OF4949−671mgを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はOF4949−の紫外部吸収スペクトル
を示す。―は溶媒がH₂Oの場合を、……は溶媒
が0.05N HCの場合を、………は溶媒が0.05N NaOHの
場合をそれぞれ示す。第２図はOF4949−の臭
化カリウム中で測定した赤外線吸収スペクトルを
示す。第３図はOF4949−の0.06N重アンモニ
ア水中で測定したプロトン核磁気共鳴スペクトル
を示す（内部標準：DSS）。第４図は、OF4949−
の0.06N重アンモニア水中で測定したＣ−13核
磁気共鳴スペクトルを示す（内部標準：ｐ−
dioxane67.4ppm）。第５図はOF4949−の紫外
部吸収スペクトルを示す。―は溶媒がH₂Oの場
合を、……は溶媒が0.05N、HC１の場合を、…
…は溶媒が0.05N、NaOHの場合をそれぞれ示
す。第６図はOF4949−の臭化カリウム中で測
定した赤外線吸収スペクトルを示す。第７図は
OF4949−の0.06N重アンモニア水中で測定し
たプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す（内部標
準：DSS）。第８図はOF4949−の0.06N重アン
モニア水中で測定したＣ−13核磁気共鳴スペクト
ルを示す（内部標準：ｐ−dioxane67.4ppm）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有することを特徴とす
   る生理活性物質OF4949−。 分子式 OF4949−：C₂₂H₂₄O₈N₄ 元素分析値 実測値 炭素51.60％，水素5.48％，窒素11.06％ 理論値 炭素51.97％，水素5.55％，窒素11.02％ （C₂₂H₂₄O₈N₄・2H₂Oとして） 分子量 SIMS（Secondary Ion Mass
   Spectrometry）法により測定した分子量は次
   の通りである。 ：472 融点 280℃付近で分解する。 比旋光度 ：［α］²⁵ _D＝−42.6゜ （Ｃ＝1.0，H₂O） 紫外線吸収スペクトル 下記の溶剤に溶解した場合の極大吸収を示す
   波長及びＥ１％ １cm値は次の通りである。 【表】 赤外線吸収スペクトル 臭化カリウム錠により測定した極大吸収を示
   す波数は次の通りである。 【表】 溶解性 水、アルカリ水、ジメチルスルフオキサイ
   ド、に可溶。メタノール、エタノールに難溶。
   ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、アセト
   ン、酢酸エチル、クロロホルム、エーテル、ベ
   ンゼン、ヘキサンに不溶。 呈色反応 ニンヒドリン、過マンガン酸カリ、ライドン
   スミス、沃素反応陽性、坂口、プロカツカ、ハ
   ーネス、アンスロン反応陰性。 塩化第二鉄反応陽性。 中性、酸性、塩基性の区別 両性物質である。 薄層クロマトグラフイー シリカゲルプレート（メルク社製）上での
   Rf値は次の通りである。 【表】 高速液体クロマトグラフイー ヌクレオシル5C₁₈（エム・ナーゲル社製）を
   用いた保持容量、保持時間は次の通りである。 カラムの大きさ：φ4.0mm×150.0mm 充填剤：ヌクレオシル5C₁₈ 溶媒 ：0.1Mクエン酸緩衝液（PH5.7）：ア
   セトニトリル＝90：10 流速 ：0.5ml／分 検出 ：UV275nm 保持時間 4.2分 保持容量 2.1ml 物質の色 白色粉末。 プロトン核磁気共鳴スペクトル 0.06N重アンモニア水中で測定した化学シフ
   ト、プロトン数、多重度は次の通りである。 単位：化学シフト、ppm 内部標準：DSS ：2.65（1H，ｔ），2.70〜2.95（2H，ｍ） 3.36（1H，dd），3.67（1H，dd） 4.40（1H，ｄ），4.46（1H，dd） 5.78（1H，ｄ），6.67（1H，dd） 6.74（1H，ｄ），6.85（1H，dd） 7.05（1H，dd），7.22（1H，dd） 7.41（1H，dd） Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル 0.06N重アンモニア水中で測定した化学シフ
   トは次の通りである。 単位：化学シフト、ppm 内部標準：ｐ−dioxane（67.4ppm） ：178.8，176.0，175.8，168.3 154.1，149.0，145.6，136.1 132.8，131.4，127.4，125.2 123.1，122.0，117.0，116.8 73.0，57.9，55.1，54.0 39.7，39.1 ２ ベニシリウム（Penicillium）属に属する OF4949生産菌を培地に培養し、その培養物か
   らOF4949−を採取することを特徴とする生理
   活性物質OF4949−の製造法。 ３ ペニシリウム（Penicillium）属に属する OF4949生産菌が、ペニシリウム・ルグロサム
   OF4949（Penicillium rugulosum OF4949）であ
   る特許請求の範囲第２項記載の製造法。