JPH02288890A - 新規生理活性物質ｏｆ４９４９及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規生理活性物質ＯＦ４９４９及びその製造法
に関するものである。

本発明者らは微生物の生産する新規生理活性物質の検索
を行い、土壌から新たに分離したペニシリウム（Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ　）属に属する微生物中に、アミノペ
プチターゼ（ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）　Ｂの活
性を強力に阻害する生理活性物質、すなわち、本発明者
により、ＯＦ４９４９と命名された水溶性両性のペプチ
ド系物質が蓄積されることを見出した。

更に詳細な研究の結果、本発明者らはＯＦ４９４９より
性状類似の二物質口１７４９４９−　Ｉ及びＯＦ４９４
９−ＩＩを単離精製することに成功した。理化学的及び
生物学的性質よりＯＩ’＋４９４９−　Ｉ及び［ｌＩ’
４９４９−ＩＩは１箇所に異なる置換基が存在すること
を除けば同一の構造を有する新規生理活性物質であるこ
とを確かめた。本発明はこのうち、ＯＦ４９４９−ｍに
係るものである。

本明細書ではＯＦ４９４９−　Ｉ及び／又はＯＦ４９４
９−　ＩＩをＯＦ４９４９と称する。

ＯＦ４９４９は抗アミノペプチダーゼＢ活性を有するこ
とよりブラジキニンの生成を阻害して抗炎症作用を示し
、種々の疾患に対する治療剤として使用され得る。

またＯＦ４９４９は羊赤血球を抗原としてマウス足随に
接種して得られる遅延型過敏症を指標として得られる細
胞性免疫の増強作用を示し、生体の免疫能を高めること
により、免疫制癌剤として用いうる。

ＯＦ４９４９を生産する代表菌株は本発明者らにより京
都府の土壌から分離されたもので、その菌学的性質は次
の通りである。

（１）各種培地における発育状態（２４℃、２週間）■
麦芽エキス寒天培地 生育は遅く集落の径は２週間で２．０〜２．５ｃｍ０集
落の表面は暗緑色ないし青緑色となり、集落中心部はや
や隆起する。集落周辺部は平坦でビロード状の菌糸体を
形成する。集落の縁は、巾１〜２ｍｍ　で白い。裏面は
一部黄色となるが寒天中への色素分泌はない。

■　ハレイショ、ブドウ糖培地 生育は遅く、集落の径は２週間で２．５〜３．０ｃｍ０
集落の中心部は白色ないし灰緑色。周辺部は黄色ないし
黄緑色でビロード状の菌糸体を形成する。集落表面には
放射状の溝が認杓られる。裏面は淡黄色ないし黄橙色で
わずかにひだがあり寒天中への色素分泌はない。

■ツアペック寒天 生育は極めて遅く、分生胞子の着生も悪い。集落の径は
２週間で１．５〜２．０ｃｍ０表面は淡黄色ないし黄橙
色のビロード状の菌糸体を形成する。部分的に白色ない
し灰色となることもある。裏面は着色せず、寒天中への
色素の分泌もない。

■コンステイープリカ添加ツアペック寒天生育は遅く集
落の径は２週間で２．０〜２．５ｃｍｏ表面は黄緑色な
いし暗緑色のビロード状菌糸体を形成し、集落中心部は
ひだを形成することもある。集落の縁は巾１〜２ｍｍで
白い。裏面は着色せず寒天中への色素の分泌はない。

■麦芽汁寒天 生育良好で集落の径は２週間で３．０〜４．０ｃｍに達
する。集落中心部はやや隆起し、暗緑色ないし青緑色ビ
ロード状で周辺は黄色ないし黄緑色を帯びる。

表面、裏面とも多くのひだを形成し、裏面は黄橙色ない
し黄褐色となるが寒天中への色素の分泌はない。

（２）形態 菌糸は無色で隔壁があり、ベニシラスは大部分整斉双輪
生状であるが、たまに単輪生状のものもある。

分生胞子は楕円形をなし、長さ３０μｍないし４０μｍ
、巾２５μｍないし３．０μｍであり、分生胞子連鎖の
大きさは５０μｍから８０μｍに及ぶ。神子はとっくり
状ないし槍鋒状で、並行状様に４個ないし８個群生し、
長さ１０．０　Ｊ、Ｌｍないし１３０μｍ５巾２４０μ
ｍないし２．５μｍである。基底神子は緻密状態に、ま
た幾分散開状態に２個ないし８個群生し、長さ１０μｍ
ないし１３μｍ、　ｒｌ］２．５μｍないし３．０μｍ
である。分生子柄は、長さ５０μｍないし８０μｍ１巾
２．５μｍないし３０μｍで多くは気菌糸又は栄養菌糸
より分岐せずに突出するが、分岐したものも見られる。

（３）生育条件 ｐＨ２〜１２の範囲で生育し、最適生育ｐ）（は、３〜
６゜ 温度：６℃〜３３℃の範囲で生育可能で最適範囲は、１
８℃〜２８℃である。

以上の観察の結果、本面は、ペニシリウム、ルグロザム
（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｒｕｇｕｌｏｓｕｍ　）と
同定された。

ペニシリウム・ルグロ勺ム　についての菌学的性質は、
レイパー及びトム（Ｒａｐｅｒ　＆　　Ｔｈｏｍ）共著
、１９６８年、ハフナー（Ｈａｆｎｅｒ）出版社のパア
ーｖ＝ユアル・オブ・ザ・ベニシリア（Ａ　Ｍａｎｕａ
ｌ　ｏｆ　ｔｈｅＰｅｎｉｃｉｌｌｉａ）　”　、トム
シュ及びガムス（Ｄｏｍｓｈ　＆Ｇａｍ５　）共著　１
９７２年、ロングマン（１，ｏｎｇｍａｎ　）社の゛フ
ァンジー・イン・アグリカルチュラル・ソイルズ（Ｆｕ
ｎ已ｉ　ｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　５ｏｉｌｓ
　）”並びに阿部著の゛ジャーナル・オブ・ジェネラル
・アンド・アプライド・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆＧｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅ
ｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　）　１１２巻１頁１９
５６年　に詳しく記載されている。

本発明者らはＯＦ４９４９生産性により本面を“ぺ一シ
リウム・ルグロサムＯＦ４９４９　　（Ｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍｒｕｇｕｌｏｓｕｍ　　ＯＦ４９４９）　”と
命名した。なお、本面は通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研条寄第２０３号（Ｆ［！ＲＭ、Ｂ
Ｐ−２０３）なる受託番号のもとに寄託されている。

本発明における使用菌としては、上記寄託菌は代表菌株
であり、これ以外にペニシリウム属に属する菌株であっ
てＯＦ４９４９を生産する菌はすべて用いることができ
る。また、これらの菌株に紫外線を照射し、或いはニト
ロソグアニジンなどの微生物の変異のために用いられて
いる変異誘起剤による処理によって得られた人工的突然
変異株及び自然発生した変異株中にもＯＦ４９４９を生
産するものが見いだされ、これらの変異株も本発明に用
いることができる。

本発明に使用される培養にあたっては、培地は液体でも
固体でもよいが、通常は液体培地による振盪培養、又は
通気撹拌培養が用いられる。培地はカビの生育に適し、
ＯＦ４９４９を生産し得るものであればどのようなもの
でも良い。即ち、炭素源としては、グルコース、フラク
トース、マルトース、シュークロース、ラクトース、デ
キストリン、澱粉、グリセリン、ソルビトール等の糖類
、及び大豆油等の植物性油脂類が用いられる。窒素源と
しては、例えば、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大
豆粉、綿実粉、コーンステイープリカ、麦芽エキス、グ
ルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、フェニルアラ
ニン等のアミノ酸、及びその塩類、尿素アンモニウム塩
類、硝酸塩等が用いられる。その他、燐酸マグネシウム
、カルシウム、ナトリウム、カリウム、鉄、マンガン等
の無機塩類、ビタミンＢｌ、パントテン酸カルシウムな
どのビタミン類等の微量栄養素を適宜加えることができ
る。

大量培養には液体培養が好ましい。

培地のｐＨ，培養温度などの培養条件は、ＯＦ４９４９
を生産する範囲内で適宜変更し得るが、液体の振盪又は
通気撹拌培養の場合は、ｐＨ４〜？、培養温度２５℃〜
３０℃、培養期間２〜１０日間の培養が適当である。

このようにして得られる培養液中には、ＯＦ４９４９が
蓄積される。

本発明に係る物質は、培養濾液、及び菌体のいずれにも
存在し、いずれからも採取することができる。

培養濾液及び菌体から目的物を取り出すには、本発明に
係る物質の性状に基づいて、例えば、活性炭、非イオン
性吸着樹脂による吸着クロマトグラフィーイオン交換樹
脂によるイオン交換クロマトグラフィ、セルロース等に
よる分配クロマトグラフィーアルキル基結合シリカゲル
、による逆相分配クロマトグラフィー、ゲル濾過担体　
によるゲル濾過等通常微生物の培養物から有機物質を分
離精製する手段が適宜組み合わせて使用される。より具
体的には、活性炭（和光純薬社製）、ダイヤイオン）Ｉ
Ｐ−２０（三菱化成社製）、などの吸着剤を詰めたカラ
ムに培養濾液、菌体含水アセトン抽出液、又は本物質を
含有する液を通して吸着させた後、酸、アルカリ、水、
メタノール、エタノール、アセトンなどを単独で、或い
は組み合わせた混合溶媒を用いて溶出する。更にこの溶
出液をダウエックス５０Ｗ（Ｈ＋型）（ダウ・ケミカル
社製）などの強酸性陽イオン交換樹脂、或いは、ダウエ
ックスｌＸ２（ＯＨ−型）　（ダウ・ケミカル社製）な
どの強塩基性陰イオン交換樹脂を詰めたカラムに吸着さ
せ、酸、アルカリ、若しくは塩類溶液を用いて溶出させ
る。

また、ダウエックスｌＸ２（ＣＩ型）を通過させて不純
物を除去することもできる。このようにして得た溶液か
ら前述の如く、ダイヤイオン１（Ｐ−２０等を用いて吸
着し、次いで溶媒で溶出することにより脱塩した後、減
圧下濃縮すると目的物は黄褐色を帯びた組物質として得
られる。次にこの組物質を結晶セルロース・アビセル（
フナコシ社製）、アルキル基結合シリカゲルのりクロブ
レツブＲＰ＝８　（メルク社製）、カートリッジカラム
Ｃ１６（ウォーターズ社製）などのカラムにかけ、酸、
アルカリ、水、緩衝液、メタノール、アセトニトリル、
プロパツール、ｎ−ブタノール、などを単独で或いはそ
れらを組み合わせた混合溶媒で展開すると、目的物を単
品として得ることができる。

（以下次頁） 次に本発明に係るＯＦ４９４９−ＩＩの性質を、性状類
似のＯＦ４９４９−　Ｉの性質と比較しながら詳述する
。

〔理化学的性質〕

■　分子式　１］Ｆ４９４９−１　：　Ｃ２，Ｈ２６０
，Ｎ。

０１１４９４９−ｎ　：　Ｃ，２Ｈ２，Ｏ、Ｎ　。

■　元素分析値 叶４９４９−　Ｉ・ 実測値　炭素５２．３０％、水素５．４６％、窒素１０
．６４％理論値　炭素５２．８７％、水素５．７９％、
窒素１０．７２％（Ｃ２３Ｈ２６０６Ｎ　、　　・２Ｈ
２０として）０１’４９４９−ｎ 実測値　炭素５１６０％、水素５．４８％、窒素１１．
０６％理論値　炭素５１．９７％、水素５．５５％、窒
素１１．０２％（Ｃ２２Ｈ２，０８Ｎ　、　　・２Ｈ２
０として）■分子量 Ｓ　Ｉ　ＭＳ　（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ｉｏｎ法により
測定したＯＦ４９４９ 予歪は次の通りである。

ＯＦ４９４９−Ｉ　：　４８６ ０１’４９４９−■＋　４７２ Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）■及びＯＦ４９
４９−Ｈの分 ■　融点 ＯＦ４９４９−　Ｉ、ＯＦ４９４９−ＩＩ共に２８０℃
付近で分解する。

■　比旋光度 ＯＦ４９４９−Ｉ　：　［α］♂　＝−６４，８゜（Ｃ
＝１．０．　　Ｈ２Ｏ） ＯＦ４９４９−■　：　　［ａ　　ｌｆ　　　　＝　　
　　４２．６゜（Ｃ＝１．０．　　Ｈ２Ｏ） ■　紫外線吸収スペクトル ＯＦ４９４９−１及び０１’４９４９−１１の下記の溶
剤に溶解した場合の極大吸収を示す波長及びＥ　ｔ、２
値は次の通りである。

ＯＦ４９４９−１ ＯＦ４９４９−ＩＩ ■　赤外線吸収スペクトル ＯＦ４９４９−　Ｉ及びＯＦ４９４９−ｎの臭化カリウ
ム錠により測定した極大吸収は次の通りである。

ＯＦ４９４９−　Ｉ ＯＦ４９４９−ｎ メチルスルフォキサイド、に可溶。メタノール、エタノ
ールに難溶。ｎ−プロパツール、ｎ−ブタノール、アセ
トン、酢酸エチル、クロロホルム、エーテル、ベンゼン
、ヘキサンに不溶。

■　呈色反応 ＯＦ４９４９−　Ｉ、［１Ｆ４９４９４共にニンヒドリ
ン、過マンガン酸カリ、ライドンスミス　沃素反応陽性
、板目　プロ力ッカ　ハーネス、アンスロン反応陰性。

ＯＦ４９４９−　Ｉは塩化第二鉄反応陰性。叶４９４９
−Ｉｔは塩化第二鉄反応陽性。

■　中性、酸性、塩基性の区別 ＯＦ４９４９−　Ｉ、ＯＦ４９４９−　ＩＩ共に両性物
質である。

０　薄層クロマトグラフィー シリカゲルプレート（メルク社製）上でのＲｆ値は次の
通りである。

（以下次頁） ■　溶解性 ＯＦ４９４９−Ｌ　　ＯＦ４９４９−ＩＴ共に水、アル
カリ水、ジ■　高速液体クロマトグラフィー ヌクレオシル５Ｃ，、（エム・ナーゲル社製）を用いた
ＯＦ４９４９−　Ｉ及びＯＦ４９４９−　ＩＩの保持容
量、保持時間は次の通りである。

カラムの大きさ：φ４．０印Ｘ　１５０．０証充填剤 溶媒 ：ヌクレオシル５Ｃ１６ ：　０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，７）　ニアセト
ニトリル−９０：　１０ ：　　０．５’ｍ！／分 ：　ＵＶ　２７５ｎｍ 保持時間　　９．９分 保持容量　　５．０ｄ ＯＦ４９４９−ＩＩ　　　保持時間　　４．２分保持容
量　　２．１ｄ 流速 検出 ＯＦ４９４９−　Ｉ ■　物質の色 ０１１４９４９−Ｉ、　　ＯＦ４９４９−ｎ共に白色粉
末。

■　プロトン核磁気共鳴スペクトル ＯＦ４９４９−　Ｉ及びＯＦ４９４９−Ｈの０．０６Ｎ
重アンモニア水中で測定した化学シフト、プロトン数、
多重度は次の通りである。

単位：化学シフト　ｐｐｍ 内部標準：ＤＳＳ ７．２６（ＬＨ，ｄｄ）、　　７．４６（１）１．　　
ｄｄ）■Ｃ−１３核磁気共鳴スペクトル ＯＦ４９４９−１及びＯＦ４９４９−ＩＩの０．０６Ｎ
重アンモニア水中で測定した化学シフトは次の通りであ
る。

単位：化学シフト　ｐｐｍ 内部標準：　　ｐ−ｄｉｏｘａｎｅ　（６７，４ｐｐｍ
）上記の如く、ＯＦ４９４９−　Ｉ及びＯＦ４９４９−
ＩＩは性状類似の近縁物質であり、ＯＦ４９４９−　Ｉ
Ｉは１個のフェノール性水酸基を有するが、ＯＦ４９４
９−　Ｉではこれが１個のメトキシ基に置換されている
ことを除けば、両者は同一の構造を有する新規な物質で
ある。

本発明には、ＯＦ４９４９−ＩＩのカルボン酸金属塩並
びに鉱酸又は有機酸との塩が含まれるのは当然である。

〔生物学的性質〕

ＯＦ４９４９はエールリッヒ癌細胞のアミノペプチダー
ゼＢ活性を著しく阻害する生理活性を有する。

本発明に係るＯＦ４９４９−ＩＩの生物学的性質を、性
状類似の（］ｆ’４９４９−　Ｉと比較しながら詳述す
る。

アミノペプチダーゼＢの測定方法は、ホブスら［Ｖ、　
　Ｋ、　１（ｏｐｓ、　Ｋ、に、Ｍａｋｉｎｅｎ、　Ｇ
、Ｇ、　Ｇｌｅｎｎｅｒ。

Ａｒｃｈｉｖｅｓ　　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｉｓｉｃｓ　１４４５５７　　（
１９６６）、：］の方法を改良して行った。即ち、ハン
クス液にッスイ製薬社製）に溶解した３ｍＭアルギニン
−β−ナフチルアミド（シグマａ［）　　０．１ｄに検
体を含むハンクス液０．７ｍｌを加えた混合液を３７℃
、３分間加熱した後、ハンクス液に２．５Ｘ１０’個／
ｍｆの濃度となるように調製したエールリッヒ癌細胞懸
濁液０．２ｍｌを加え、３７℃、３０分間反応した後０
．３ｍｇ／ｃｃの濃度にガーネットＱＢＣ（オルトアミ
ノγゾトルエン・ジアゾニウム塩）（シグマ社製）を含
み、３％の濃度にツウィーン２０　（Ｔｗａｅ口２０）
（和光紬薬社製）を含む１．０Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，
２）３ｍｌを加え、室温に１５分間放置した後、その上
清の５２５ｎｍにおける吸光度（ａ）を測定した。

同時に検体を含まないハンクス液のみを用いた対照の吸
光度（ｂ）を測定し、アミノペプチダーゼＢの阻害率を −ａ ×１００ により計算した。上記に用いたエールリ・ｙヒ癌細胞は
、ｄｄＹ系　４−６週令（雄）マウスの腹腔内で継代維
持されているもので、２×１０６個の細胞をマウス腹腔
内に移植後７日〜１０日目の腹水液より採取した。細胞
懸濁液は、エールリッヒ癌細胞を含む腹水液をトリス−
塩化アンモニウム溶液（ｐＨ７，２）で処理し、赤血球
を除去後、ハンクス液で３回洗浄し、所定の細胞数にハ
ンクス液で調整したものである。

このものは、エールリッヒ癌細胞の生細胞数として９６
％以上の均一な細胞集団である。上記試験法によるＤＰ
４９４９−１及びＯＦ４９４９−　ｆｆのいくつかの濃
度における阻害率を求め、それぞれに５０％阻害濃度を
帰納した。その結果を第１表に示した。

第１表 また本物質は羊赤血球を抗原としてマウスの足部に接種
して得られる遅延型過敏症（Ｄｅｌａｙｅｄ　Ｔｙｐｅ
Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　　：　ＤＴＨと略
記）を指標とした細胞性免疫の増強作用を示した。即ち
、羊赤血球を抗原として１×１０５個をＣＤＦ、系１０
週令雌マウス１群８匹に静脈注射して感作し、感作直後
にＯＦ４９４９Ｉ又はＯＦ４９４９−　ｎを滅菌水に溶
解したものを、５．５０．５００μｇ／ｋｇの濃度とな
るように腹腔内注射し、４日後に左後足の足部に羊赤血
球　１０８個を皮下注射して、２４時間後にその足部に
見られる腫張の程度（足部の厚さ）をノギスで測定する
ことにより判定した。その結果を第２表に示した。

ＯＦ４９４９−　Ｉ又は０１’４９４９−１１を投与し
たマウスではその腫張の程度が対照に比して著しく増強
されていた。このことは、ＯＦ４９４９−１及びＯＦ４
９４９−ＩＩが細胞性免疫の成立に増強作用のあること
を示している。

なお、ＯＦ４９４９−　Ｉ及びＯＦ４９４９−　ＩＩは
、　ＩｃＲ系マウスの腹腔的投与３００ｍｇ／　ｋｇで
の急性毒性試験の結果、毒性が認められなかった。

（以下次頁） 医薬として投与する場合、本発明化合物はそのまま又は
医薬的に許容される無毒性かつ不活性の担体中に、例え
ば０．１％〜９９．５％、好ましくは０．５％〜９０％
含有する医薬組成物として、人を含む動物に投与される
。

担体としては、固形、半固形、又は液状の希釈剤、充填
剤、及びその他の処方用の助剤一種以上が用いられる。

医薬組成物は、投与単位形態で投与することが望ましい
。本発朋医薬組成物は、経口投与、組織内投与、局所投
与（経皮投与等）又は経直腸的に投与することができる
。これらの投与方法に適した剤型で投与されるのはもち
ろんである。例えば、注射剤が特に好ましい。

用量は、年齢、体重、等の患者の状態、投与径路、病気
の性質と程度等を考慮した上で調整することが望ましい
が、通常は、成人に対して本発明の有効成分量として、
１日あたり、０．１〜１０００ｍｇの範囲が一般的であ
る。場合によっては、これ以下で足りるしまた逆にこれ
以上の用量を必要とすることもある。

多量に投与するときは、１日数回に分割して投与するこ
とか望ましい。

経口投与は固形または液状の用量単位、例えば末剤、散
剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、液剤
、シロップ剤、ドロップ剤、舌下錠その他の剤型によっ
て行うことができる。

末剤は活性物質を適当な細かさにすることにより製造さ
れる。散剤は活性物質を適当な細かさと成し、次いで同
様に細かくした医薬用担体、例えば澱粉、マンニトール
の如き可食性炭水化物その他と混合することにより製造
される。必要に応じ風味剤、保存剤、分散剤、着色剤、
香料その他のものを混じても良い。

カプセル剤は、まず上述のようにして粉末状となった末
剤や散剤あるいは錠剤の項で述べるように顆粒化したも
のを、例えばゼラチンカプセルのようなカプセル外皮の
中へ充填することにより製造される。

滑沢剤や流動化剤、例えばコロイド状のシリカ、タルク
、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム
、固形のポリエチレングリコールの如きものを粉末状態
のものに混合し、然るのちに充填操作を行うこともでき
る。崩壊剤や可溶化剤、例えばカルボキシメチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換
度ヒドロキシプロピルセルロース、炭酸カルシウム、炭
酸ナトリウムを添加すれば、カプセル剤が摂取されたと
きの医薬の有効性を改善することができる。

また、水晶の微粉末を植物油、ポリエチレングリコール
、グリセリン、界面活性剤中に懸濁分散し、これをゼラ
チンシートで包んで軟カプセル剤とすることができる。

　錠剤は粉末混合物を作り、顆粒化もしくはスラグ化し
、次いで崩壊剤又は滑沢剤を加えたのち打錠することに
より製造される。

粉末混合物は、適当に粉末化された物質を上述の希釈剤
やベースと混合し、必要に応じ結合剤（たとえばカルボ
キシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸塩、ゼラ
チン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールな
ど）、溶解遅延化剤（たとえばパラフィンなど）、再吸
収剤（たとえば四級塩）及び／又は吸着剤（たとえばベ
ントナイト、カオリン、リン酸シカルシウムなど）をも
併用しても良い。粉末混合物は、まず結合剤たとえばシ
ロップ、でんぷん糊、アラビアゴム、セルロース溶液又
は高分子物質溶液で湿らせ、次いで篩を強勢通過させて
顆粒とすることできる。このように粉末を顆粒化するか
わりに、まず打錠機にかけたのち、得られる不完全な形
態のスラグを破砕して顆粒にすることも可能である。

このようにして作られる顆粒は、滑沢剤としてステアリ
ン酸、ステアリン酸塩、タルク、ミネラルオイルその他
を添加することにより、互いに付着することを防ぐこと
ができる。このように滑沢化された混合物を、次いで打
錠する。また薬物は、上述のように顆粒化やスラグ化の
工程を経ることなく、流動性の不活性担体と混合したの
ちに直接打錠しても良い。シェラツクの密閉被膜から成
る透明または半透明の保護被覆、糖や高分子材料の被覆
、及びワックスより成る層上被覆の如きも用いうる。

他の経口投与剤型、たとえば溶液、シロップ、エリキシ
ルなどもまたその一定量が薬物の一定量を含有するよう
に用量単位形態にすることができる。シロップは、化合
物を適当な香味化水溶液に溶解して製造され、またエリ
キシルは非毒性のアルコール性担体を用いることにより
製造される。懸濁剤は化合物を非毒性担体中に分散させ
ることにより処方される。可溶化剤や乳化剤（たとえば
エトキシ化されたイソステアリルアルコール類、ポリオ
キシエチレンソルビトールエステル類）、保存剤、風味
賦与剤（たとえばペパミント油、サッカリン）その他も
また必要に応じ添加できる。

必要とあれば、経口投与のための用量単位処方はマイク
ロカプセル化しても良い。該処方はまた被覆をしたり、
高分子・ワックス等中にうめ込んだりすることにより作
用時間の延長や持続放出をもたらすこともできる。

非経口的投与は、皮下・筋肉内又は静脈内注射用とした
ところの液状用量単位形態たとえば溶液や懸濁剤の形態
を用いることによって行いうる。これらのものは、化合
物の一定量を、注射の目的に適合する非毒性の液状担体
たとえば水性や油性の媒体に懸濁し又は溶解し、次いで
該懸濁液又は溶液を滅菌することにより製造される。あ
るいは化合物の一定量をバイアルにとり、然るのち該バ
イアルとその内容物を滅菌し密閉しても良い。投与直前
に溶解又は混合するために、粉末又は凍結乾燥した有効
成分に添えて、予備的のバイアルや担体を準備しても良
い。

注射液を等張にするために非毒性の塩や塩溶液を添加し
ても良い。さらに安定剤、保存剤、乳化剤の如きものを
併用することもできる。

直腸投与は、化合物を低融点の水に可溶又は不溶の固体
たとえばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級エス
テル類（たとえばパルミチン酸ミリスチルエステル）及
びそれらの混合物を混じた坐剤を用いることによって行
いうる。

本発明化合物の製剤には、本発明に係る有効成分に加え
て他の薬物例えば、シトシンアラビノサイド、アドリア
マイシン又はマイトマイシンなどを配合してもよく、又
は併用しても良い。

以下に本発明に係る製造方法の実施例を具体的に説肋す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ ペニシリウム・ルグロサムＯＦ４９４９　　（通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所　受託番号微工研条
寄第２０３号）を麦芽エキス寒天の斜面培地に７日間培
養した。この斜面培養から、−白金耳をグルコース２％
、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．１％、リン酸
第−カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム００５％を
含む培地５００誦づつを２１容量の三角フラスコに分注
し、１２０℃、２０分間滅菌したものに接種し、２７℃
で毎分１９０回転の振盪で６日間培養した。この培養物
を予め滅菌しておいたグルコース２％、ポリペプトン０
．５％、酵母エキス０，１％、リン酸第−カリウム０．
０５％、硫酸マグネシウム０．０５％、を含む培地２０
Ｉ！、を入れた２０βのステンレス醗酵槽１５基に１基
あたりｌｌずつ植菌して培養を開始した。培養は、毎分
通気量２０ｊ２、毎分回転数３００回転、２７℃で行い
、必要に応じて消泡剤を添加した。４日間培養して培養
物を取り出し、菌体を濾過して培養濾液を分離し、圧縮
容量６．５ｊ２の菌体及び３００１の培養濾液が得られ
た。

実施例２ 実施例１で得られた菌体は５０％アセトン水２４１にて
３回抽出し、抽出液７２１を３０　ｎまで減圧濃縮する
ことによりアセトンを除去した。濃縮液３０１と実施例
１で得られた培養濾液３００βとともに活性炭カラムに
吸着させ、８０ｆｌの水で充分洗浄後、５０％アセトン
をふくむｐＨ２塩酸水溶液１５０１にて溶出した。アミ
ノペプチダーゼ阻害活性画分８０１を減圧下で３０　Ａ
まで濃縮し、アセトンを除去後、濃縮液３０１を強塩基
性陰イオン交換樹脂ダウエックス１ｘ２（Ｃ１−型）の
　１．２ｆ！、カラムにかけ、水にて溶出した。次に溶
出液８０ｊ２をｐＨ３に補正し、強酸性陽イオン交換樹
脂ダウエックス５０Ｗ　（Ｈ＋型）の２．Ｏｌカラムに
吸着させた１０ｊ２の水にて洗浄後、１．ＯＮのアンモ
ニア水　ＩＱＯＡにて溶出した。

活性区６０１を２Ｎ塩酸にて中和後非イオン性吸着樹脂
ダイヤイオンＨＰ−２０の２１に吸着させた。

２ＯＡの水で洗浄後、５０％メタノール水２ＯＡにて溶
出した。得られた活性区を減圧下濃縮し粗物質　２８．
８ｇを得た。

実施例３ 実施例２において得られた粗物質２８．８ｇを結晶セル
ロースアビセル３０ｇにまぶし、減圧下充分乾燥後アビ
セルカラム１１の上部に充填した。展開溶媒（ＩＮアン
モニア水：ｎ−ブタノール−１５：　８５）　１２ｊ！
で展開するとＤＦ４９４９−　Ｉを主に含む活性区が、
次いでＯｆ”４９４９−ＩＩを主に含む活性区が分離し
て得られた。

それぞれの活性区をｌＮＨＣｌで中和し、減圧濃縮後、
水に再溶解し、ダイヤイオンＩＩＰ−２０の５００ｍ１
に吸着させた。水洗後２βの５０％メタノール水で溶出
し、活性区を減圧濃縮することにより、ＤＰ４９４９−
１　　の粗粉末３．１ｇ及びＯＦ４９４９−　ＩＩ　　
の粗粉末４．１ｇを得た。

実施例４ 実施例３において得られた０１’４９４９−　Ｉ粗粉末
３．１ｇを１５ｍ１の水に溶解し、大量分取専用高速液
体クロマトグラフィー（システム５００、ウォーターズ
社）を用い、カラム：カートリッジカラム（Ｃ１８、ウ
ォーターズ社）、展開溶媒：［１，１Ｍクエン酸緩衝液
ニアセトニトリル−９０：　１０の条件下で逆相分配ク
ロマトゲラフイーを行い、アミノペプチダーゼＢ阻害活
性を検定した。その活性区をダイヤイオンＨＰ−２０の
２００ｍ１に吸着させ、水洗浄、１βの５０％メタノー
ル水で溶出した。活性区を集め減圧下濃縮後、凍結乾燥
することにより、ＯＦ４９４９−Ｉ　　４５５　ｍｇを
得た。

実施例３にて得られたＯＦ４９４９−　ｎの粗粉末　４
．１ｇについても同様に展開溶媒０．１Ｍクエン酸緩衝
液ニアセトニトリル＝９５：５を用い、ＣＩ８逆相分配
クロマトグラフィーを行った後、ダイヤイオン）ＩＰ−
２００カラムクロマトグラフイーを行い、ＯＦ４９４９
−ｎ　６７１ｍｇを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はＯＦ４９４９−１の紫外部吸収スペクトルを示
す。□は溶媒がＨ，Ｏの場合を、　　　　は溶媒が０．
０５Ｎ　ＨＣＩの場合を、−・−・−ミー一は溶媒が０
．０５ＮＮａＯ）１の場合をそれぞれ示す。第２図はＤ
Ｉ’４９４９−１の臭化カリウム中で測定した赤外線吸
収スペクトルを示す。第３図はＯＦ４９４９−　Ｉの０
．０６Ｎ重アンモニア水中で測定したプロトン核磁気共
鳴スペクトルを示す（内部標準：ＤＳＳ）。第４図は、
ＯＦ４９４９−　Ｉの０．０６Ｎ重アンモニア水中で測
定したＣ−１３核磁気共鳴スペクトルを示す（内部標１
　：　ｐ−ｄｉｏｘａｎｅ６７、４　ｐｐｍ　）。 第５図はＯＦ４９４９−　Ｈの紫外部吸収スペクトルを
示す。□は溶媒がＨ２Ｏの場合を、　　　　は溶媒が０
．０５Ｎ　）ＩｃＩの場合を、−・−・−・−は溶媒が
０．０５ＮＮａｉｌ（の場合をそれぞれ示す。第６図は
ＯＦ４９４９＝ＩＩの臭化カリウム中で測定した赤外線
吸収スペクトルを示す。第７図はＯＦ４９４９−　Ｉｆ
の０．０６Ｎ重アンモニア水中で測定したプロトン核磁
気共鳴スペクトルを示す（内部標準：ＤＳＳ＞。　第８
図はＯＦ４９４９−　Ｉ［の０、０６Ｎ重アンモニア水
中で測定したＣ−１３核磁気共鳴スペクトルを示す（内
部標準：　ｐ−ｄｉｏｘａｎｅ　６７、４ｐｐｍ）　。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の理化学的性質を有することを特徴とする生
   理活性物質ＯＦ４９４９−II。 ［１］分子式　ＯＦ４９４９−II：Ｃ＿２＿２、Ｈ＿２
   ＿４、Ｏ＿８Ｎ＿４ ［２］元素分析値 実測値　炭素５１．６０％、水素５．４８％、窒素１１
   ．０６％ 理論値　炭素５１．９７％、水素５．５５％、窒素１１
   ．０２％ （Ｃ＿２＿２Ｈ＿２＿４Ｏ＿８Ｎ＿４・２Ｈ＿２Ｏとし
   て） ［３］分子量 ＳＩＭＳ（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓ
   ｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）法により測定した分子量は次
   の通りである。 ：４７２ ［４］融点 ２８０℃付近で分解する。 ［５］比旋光度 ：［ａ］＾２＾５＿Ｄ＝−４２．６° （Ｃ＝１．０、Ｈ＿２Ｏ） ［６］紫外線吸収スペクトル 下記の溶剤に溶解した場合の極大吸収を示す波長及びＥ
   ＾１＾％＿１＿ｃ＿ｍ値は次の通りである。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［７］赤外線吸収スペクトル 臭化カリウム錠により測定した極大吸収を示す波数は次
   の通りである。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［８］溶解性 水、アルカリ水、ジメチルスルフォキサイド、に可溶。 メタノール、エタノールに難溶。ｎ−プロパノール、ｎ
   −ブタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、
   エーテル、ベンゼン、ヘキサンに不溶。 ［９］呈色反応 ニンヒドリン、過マンガン酸カリ、ライドンスミス　沃
   素反応陽性、坂口　プロカッカ　ハーネス、アンスロン
   反応陰性。 塩化第二鉄反応陽性。 ［１０］中性、酸性、塩基性の区別 両性物質である。 ［１１］薄層クロマトグラフィーシリカゲルプレート（
   メルク社製）上でのＲｆ値は次の通りである。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［１２］高速液体クロマトグラフィーヌクレオシル５Ｃ
   ＿１＿８、（エム・ナーゲル社製）を用いた保持容量、
   保持時間は次の通りである。 カラムの大きさ：φ　４．０ｍｍ×１５０．０ｍｍ 充填剤：ヌクレオシル５Ｃ＿１＿８ 溶媒：０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．７）： アセトニトリル＝９０：１０ 流速：０．５ｍｌ／分 検出：ＵＶ２７５ｎｍ 保持時間　４．２分 保持容量　２．１ｍｌ ［１３］物質の色 白色粉末。 ［１４］プロトン核磁気共鳴スペクトル ０．０６Ｎ重アンモニア水中で測定した化学シフト、プ
   ロトン数、多重度は次の通りである。 単位：化学シフト　ｐｐｍ 内部標準：ＤＳＳ ：２．６５（１Ｈ、ｔ）、２．７０〜２．９５（２Ｈ、
   ｍ） ３．３６（１Ｈ、ｄｄ）、３．６７（１Ｈ、ｄｄ） ４．４０（１Ｈ、ｄ）、４．４６（１Ｈ、ｄｄ） ５．７８（１Ｈ、ｄ）、６．６７（１Ｈ、ｄｄ） ６．７４（１Ｈ、ｄ）、６．８５（１Ｈ、ｄｄ） ７．０５（１Ｈ、ｄｄ）、７．２２（１Ｈ、ｄｄ） ７．４１（１Ｈ、ｄｄ） ［１５］Ｃ−１３核磁気共鳴スペクトル ０．０６Ｎ重アンモニア水中で測定した化学シフトは次
   の通りである。 単位：化学シフト　ｐｐｍ 内部標準：ｐ−ｄｉｏｘａｎｅ（６７．４ｐｐｍ） ：１７８．８、１７６．０、１７５．８、１６８．３ １５４．１、１４９．０、１４５．６、１３６．１ １３２．８、１３１．４、１２７．４、１２５．２ １２３．１、１２２．０、１１７．０、１１６．８ ７３．０、５７．９、５５．１、５４．０ ３９．７、３９．１ （２）ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属
   するＯＦ４９４９生産菌を培地に培養し、その培養物か
   らＯＦ４９４９−IIを採取することを特徴とする生理活
   性物質ＯＦ４９４９−IIの製造法。 （３）ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属
   するＯＦ４９４９生産菌が、ペニシリウム・ルグロサム
   ＯＦ４９４９（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ　ｒｕｇｕｌｏｓ
   ｕｍ　ＯＦ４９４９）である特許請求の範囲第２項記載
   の製造法。