JPH03502645A - 『〔Ｌｙｓ４６、Ａｓｐ９７、Ａｓｐ１１３〕および〔Ｌｙｓ４６、Ａｓｐ１１３、Ａｓｐ１３７〕タウマチン１ポリペプチドをコードするＤＮＡ』 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ’　（Ｌｙｓ”、　　Ａｓｐ”、＾ｓ　ｐ　ｌ　ｌ　２　）および（１，，４６ ，＾ｓ　ｐ　ｌ　ｌ　２、＾ｓ　ｐ　ｌ　３　′）タウマチンｌポリペプチドを コードするＤＮＡＪボ願出願は、１９８８年１１月８日出願の米国特許出願番号 筒０７／２６８．７０２号の一部継続出願であり、該特許出願の開示内容は参照 により本明細書中に組み込まれている。 ■−見 本発明は、一般的に遺伝物質の操作、そして特に天然タウマチンＩとして同定さ れるポリペプチドの改良変異体の生産をもたらす＆ｌＩ換え工程において有用な 特定のＤＮＡ配列の製造に関する。 タウマチンは、アフリカ産低木Ｔｈａｕｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄａｎｉｅｌｌ ｉｉＢｅｎ　ｔｈの果実の仮種皮中に産生される極めて甘味の強いタンパク質で ある。この果実は西アフリカにおいて伝統的にヤシ酒、トウモロコシパン、およ びサワーフルーツの甘味料として使用されてきた。タウマチンは、重量ベースで シラ糖より約ｓ　、　ｏｏｏ倍甘く、少なくとも、タウマチン１、■、ａ、ｂお よびＣの５つの形態て産生される。イオン交換カラムからの溶出順に命名された これらタンパク質〔ヒギンボザム（旧ｇｇｉｎｂｏｔｈａｍ）ら、　ｔ３ｏ」冨 ５シｈ【ｊ５Ｌｔ１゜（バーチ（Ｂｉｒｃｈ）ら、編集）ロンドン：＾ｐｐｌｉ ｅｄ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　ｐｐ。 タウマチンは、深い甘味反応を誘発する無毒性、低カロリー、および非う食原性 のタンパク質である。これら特性は、該タンパク質とヒト味覚受容体との間の安 定な相互作用を示唆する。従って、タウマチンは、砂糖代用品、食品添加物、甘 味受容体プローブ、および味覚反応のさらなる誘発の手段として用いられる可能 イを持つ。 該タンパク質を食品添加物および研究手段として利用するには、純粋なタウマチ ンの豊富な供給が必要である。タウマチン植物は、果実の繁殖を成功させるため には熱帯の気候と昆虫授粉を必要とするので、果実の温室栽培にはかなりの困難 が伴う。 イエンガ−（Ｉｙｅｎｇａｒ）は、下記第１表に示されたタウマチンＩのアミノ 酸配列を開示した〔イエンガーら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ■、。 銭、１９３−２０４　（１９７９））　。 タウマチン■のアミノ酸配列はそのヌクレオチド配列から推定され〔エデンズ（ Ｅｄｅｎｓ）ら、　Ｇｅｎｅ、　ＩＪｌ、　１−１２（１９８２））　、タウマ チンＨの遺伝子はメツセンジャーＲＮＡ−誘導ｃＤＮＡからクローン化された。 上記のタウマチン■配列と異なる、タウマチン１配列中の５つのアミノ酸は次の 通りである８４６位残基のアスパラギンの代わりにリジン；６３位残基のセリン の代わりにアルギニン；６７位残基のリジンの代わりにアルギニン；７６位残基 のアルギニンの代わりにグルタミン；および１１３位残基のアスパラギンの代わ りにアスパラギン酸、配列分析はまた、タウマチン■が最初に２２位残基のアミ ノ末端延長と酸性の６アミノ酸カルボキシ末端の両方により、前駆体のプレプロ タウマチンとして翻訳されることを示した。アミノ末端ペプチドは、その疎水特 性に基づき分泌シグナルと仮定され、カルボキシ末端延長の区画役割という仮説 が設けられた。 上記に引用したエデンズ（Ｅｄｅｎｓ）らの参考文献は、プレプロタウマチン■ の天然配列を持つポリペプチドが微生物学的に産生されたことを記している。よ り詳細には、該参考文献およびベリフ第１表 特表平３−５０２６４５　（４） ブス（Ｖｅｒｒｉｐｓ）　ら、米国特許第４，７７１，０００号が、天然成熟タ ウマチン■ならびにプレプロタウマチン■をコードするｃＤＮＡ配列を開示し、 同時に微生物での形質転換に使用するための該ＤＮＡ配列を含むクローニング媒 体を開示している。 その開示内容が参照により本明細書中に組み込まれている共同出願で、係属中の １９８３年１０月１１日出願の米国特許出願番号第５４０，６３４号において、 イエンガーらによって同定されたタウマチンＩのアミノ酸配列をコードする製造 遺伝子の合成方法、すなわち、ＤＮＡ微生物形質転換ベクター、融合遺伝子、形 質転換された微生物、および製造遺伝子を発現し、それによって産生されるポリ ペプチド産物を獲得する工程が開示された。該出願のある製造遺伝子は、酵母宿 主細胞における発現のために「好ましいＪ数多くのコドンを含んでいた。 その開示内容が参照により本明細書中に組み込まれている共同出願で、係属中の １９８５年１１月１３日出願の出願番号第７９７，４７４号のｍ続出願である米 国特許出願番号第１８９．２５０号において、（Ａｓ２１１３）タウマチンｌお よび（Ｌｙｓ’″、ＡｓｐＩ目）タウマチンＩのアミノ酸配列、すなわち、咳ポ リペプチドのアミノ末端から１１３位にあるアスパラギンにＩｔｆｉしたアスパ ラギン酸アミノ酸残基および任意に４６位のアスパラギンに置換したリジンアミ ノ酸残基を除いて、イエンガーらによって報告されたような天然タウマチン１の アミノ酸残基の連続配列を含んだ配列の合成のためのポリペプチドおよび遺伝子 が開示された。これらのポリペプチドは組換え産生じた（Ａｓ２１１３）および （Ｌｙ　ｓ　ａ　ｈ　、　Ａｓ　ｐ　ｌ　＋　′）タウマチンＩポリペプチドは 従来技術に改良を加えてはいるが、それらは一部の食品における使用を制限する 可能性がある植物由来のタウマチンと味覚特性を共をしている。それら味覚特性 のうちで最も重要なのは、砂糖（シ＝ｌ糖）には見られない後味の滞溜である。 本発明にとって興味深いのは、ファン・デル・ヴエル（ｖａｎ　ｄｅｒＷｅｌ） ら、　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｅｎｓｅｓ　ａｎｄ　Ｆｌａｖｏｒ、　２．２１） −２１８（１９７６）の開示である。この文献は、タウマチン！中のりジン残基 を無水酢酸によるアセチル化、および還元メチル化により化学的に修飾した実験 を開示している。■、２．３または４個のいずれかのアセチル化アミノ基を持っ た少なくとも４つのアセチル化タウマチンが得られた。さらに、６個のジメチル リジン残基および１個のモノメチルリジン残基を持つメチル化タウマチンが生成 された。７個の修飾されたりジン残基を有するメチル化タウマチンは、最初のタ ウマチンと実際上回等の甘味度を持っていたが、アセチル化タウマチンの甘味度 はアセチル化アミノ基の数の増加と共に低下した。 ４個のアセチル化リジン残基を分子内に導入した時、甘味感覚は完全に消失した 。該文献は、総荷電と分子の甘味度の間に相関関係が存在する可能性を示唆した 。 本発明の他の態様として興味があるのは、ポリペプチド分泌シグナル配列に関す る文献である。フォノ・ハイネ（ｖｏｎ　ｌ１ｅｉｊｎｅ）。 Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１３３．１７−２１　（１９Ｂ ３）は、様々な真核性シグナル配列を開示し、２つの異なる独立したシグナルを 含む典型的なシグナル配列を記している。第１シグナルは疎水性コアの形態であ ると言われ、第２シグナルはプロセシング特異性を与えるグナルを開示している ：（動圧荷電アミン末端、（ｂ）疎水性コア、および（Ｃｌプロセシング部位近 傍の高度に保存された配列。 ケンダル（にｅｎｄａｌｌ）ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２１．７０６−７０８　 （１９８６）は、疎水性コア部分に９個の連続するロイシン残基を含む突然変位 シグナル配列を生成するための、特定部位の突然変異誘発の使用を開示している 。ショーストレム（Ｓｉｏｓｔｒｏ＊）　　ら、　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎ ａｌ＋６．８２３〜８３１　（１９８７）は、大腸菌分泌シグナル配列の分析に 関連して、大腸菌シグナル配列の多くの配列のアミノ末端におけるリジン残基の 存在を開示している。ンヨーストレムらは、しかしながら、真核生物のシグナル ペプチドはほとんど配列相同性を持たないと記している。 又皿生叉竹 本発明は、イエンガーが報告した天然タウマチン１のアミノ酸残基の内、ポリペ プチドのアミン末端から４６位にあるアスパラギンを置換したリジンアミノ酸残 基、　１１３位のアスパラギンを置換したアスパラギン酸残基、ならびに９７位 のリジンを１換したアスパラギン酸または１３７位のリジンを置換したアスパラ ギン酸を除いた連続配列を含む（Ｌｙｓ”＋　Ａｓｐ”＋　Ａｓｐ””Ｊタウマ チン１および（１ｙｓ４ｈ、Ａｓ　ｐ　Ｉ目　６．ｐＩ３４　）タウマチンＩの 、選択した宿主微生物における合成を指示することができる精製、準則されたＤ ＮＡ配列を提供する。遺伝子の好ましい形態では、塩基配列は予定した宿主微生 物、たとえば大腸菌、ビール酵母閉（Ｓａｃｃｈａｒｏ−同じアミノ酸を特定す る！またはそれ以上のコドンを含む、他の好ましい形態の製造遺伝子は下記のも のを含む：（１）大腸菌微生物および／もしくは酵母微生物における直接発現を 促進する合成ポリペプチド（たとえば先頭のメチオニン残基）中の付加アミノ酸 を１キ定するコドン；あるいは（２）ポリペプチドの適切な終止を確寞にするた めの、製造遺伝子の末端における少なくとも１つの終止コドン。 ポリペプチド産生物を生成するための本発明の実施においては、製造遺伝子を含 んだＤＮＡ配列をウィルスまたは環状プラスミドＤＮＡベクター中に挿入してハ イブリッドベクターを形成し、該ハイブリッドベクターを使用して細菌（たとえ ば大腸菌）あるいは酵母細胞（たとえばＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような 宿主微生物を形質転換する。ベクターはまた、宿主微生物における制ｊＴｊされ た発現を可能にする、適切なプロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列によって も供給されうる。形質転換した微生物をその後適当な栄養条件下で増殖させ、本 発明のポリペプチド産生物を発現する。 本発明はまた、タウマチンのような＆ｌｌ換え産生ポリペプチドの形質転換体が 出現するのに必要な遅滞時間を低下する改良した酵母分泌シグナル配列をコード する新規ＤＮＡ配列を提供する。加えて、本発明はさらに、本発明のタウマチン タンパクの発現及び分泌のための好ましい突然変異誘発した宿主細胞を提供する 。 新規（Ｌｙｓ’−＾Ｓｐ雫）　４ｓ、ＩＩコ〕および（Ｌｙｓ’−＾、ｐＩｌｌ 、Ａ、ｐ１３？）タウマチン１ポリペプチドは、特に甘味の後味の寿命短縮に関 して、新しい味覚特性を与える。この発明は、タウマチ７１分子の味覚特性のよ うな生物学的特性に対する９７位および１３７位のアミノ酸残基の重要性を示す ものである。改良した味覚特性を持つ付加的タウ７チンｌポリペプチドは、９７ 位または１３７位のいずれかのリジンをアスパラギン酸以外のアミノ酸で置換す ることにより生成されうると考えられる０本発明の他の態様および利点は、下記 の本発明の詳細な説明を考慮すれば明白であろう。 塵ｍソ１乙【吸 第１図は、（Ｌｙｓ”、　Ａｓｐ”ツ、＾ｓ、ｌ　Ｉ　３　）および（１，、ｓ Ｊ＆、＾ｓ　ｐ　Ｉ＋　１゜＾ｓ　ｐ　ｌ　ｆｆ　１　）タウマチンｉポリペプ チドと植物由来タウマチンの相対的味覚特性の描写である。 第２図は、〔Ｌ、、４も、Ａ、ｐ９１．　Ａ、、＋１３１および（Ｌｙｓ”＋　 ＡｓｐＩＩり。 Ａｓｐ＋３’？）タウ７チンｌポリペプチドと植物由来タウマチンの相対的味覚 特性の描写である。 又里生用豊星豆里 １隻■上 本実施例において、（ｌ　ｙ　ｓ　Ｊ　＆　、　Ａ　３　Ｐ　Ｉ　Ｉ　３．＾ｓ 　ｐ　ｌ　３　？　）タウマチン１をコードするプラスミドｐｌＮＧ１５２Ｔお よび（Ｌｙ、４６．　Ａ、、？’ｆ、　Ａ、、ＩＩ″〕タウマチン！をコードす るプラスミドｐｌＮＧ３２３Ｔを、開示内容が参照により本明細書中に組み込ま れている、共同出願で、係属中の１９８８年５月２日出願の米国特許出願番号第 １８９．２５０号に構築法が述べられているプラスミドｐＫＳ６およびＭ１３閣 ｐｌｏ−タウマチン、ならびに開示内容が参照により本明細書中に組み込まれて いる、係属中の１９８５年１１月１３日出願の米国特許出願番号第７９７．４７ ７号に対応する国際公開番号第ＵＳ／ＰＣＴ８６１０２４４３号に構築法が記述 されているＰＩＮＧ５８Ｔから構築した。。 ２１８ｂｐのＰＧＫプロモーターを含み（Ｌｙｓ４ｈ、　Ａｓｐ””　）　タウ ７チンｌポリペプチドをコードするプラスミドｐＫＳ６をＢａｅ＋ＨＩおよびＸ ｈｏｌで切断し、８５０塩基対のＰＩＪプロモーター−タウマチン断片を、Ｂａ ｗｌ上およびＴｏｏｌで切断したＭ１３ＭＰ１０−タウマチンに連結して、プラ スミドＭ１３−ＫＳ５を形成した。　Ｍ１３−ＫＳ６から一重鎖ファージＤＮＡ を作製し、特定部位突然変異誘発のための鋳型として使用した。 ｌｙ、１３ｆｆをＡｓｐに変更するための５’−ＧＡＧＣＣＴＴＡＡＧＧＴＣＡ ＧＣＴＧＧＡＣＡＴ　−３’、および１．ｙ、９？を＾ｓｐに変更するための５ ゛−Ｃ＾丁ＧＴＡＧＴＣＧＴＣＡＣＣＧＴＡＴＴＧ　　−３’の２つのオリゴヌ クレオチドを別々にＭ１３−ＫＳ５にアニールし、ミャダ（Ｍｉｙａｄａ）ら、 　Ｇｅｎｅ　（１９８２）、　　１７：　１６７−１７７の記述に従い特定部位 突然変異誘発を実施した。突然変異誘発に用いたのと同じオリゴヌクレオチドを 陽性プラークをスクリーニングするためのプローブとして用いた。陽性プラーク を連鎖終止反応（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　　（１９７７）、　７４：　５４６３−５４６７ ）によって配列決定し、所望の変更を確認した。各々の突然変異誘発から一つの 陽性プラークを採取した。二本鎖複製形態ＤＮＡを調製し、ｈ畦上および狂虱で 切断し、Ｂａ５ＨＩおよびハ虹で切断したｐｌＮＧ５８Ｔに連結し、ｐｌＮＧ１ ５２丁（Ｌ、、１！？からＡｓｐ’！７〕およびｐｌＮＧ３２３Ｔ　（Ｌｙｓ” からＡｓｐ９？　）を形成した。これら２つの構築物を酵母菌株ＢＢ２９−ＩＣ に形質転換した時、各細胞内で（Ｌｙｓ”＋７４　ｓ　ｐ　ｌ　＋コ　Ａ　ｓ　 ｐ　＋　３７〕タウマチンＩおよび（１，，４に、　Ａｓｐ”、　Ａｓｐ”’） タウマチン１をそれぞれ産生じた。開示内容が参照により本明細書中に組み込ま れている、共同出願で、係属中の中の米国特許第４．７６６．２０５号の記述に 従い、タウマチンポリペプチドを酵母細胞抽出物から精製し、各々を甘味構造に 再び折り重ねた。 １隻１ 本実施例において、プラスミドｐｌＮＧ１５２ｃＶｓおよびｐｌＮＧ３２３ｃＶ ｓが溝築され、別々に酵母菌株を形質転換した。　２２０ｂｐＰＧにプロモータ ー、５ＵＣ２酵母転化酵素シグナル配列、１３８塩基対欠失が生じた（ＬｙｓＪ ＆、　ＡＳ、１１！　）タウマチン１の構造配列、および培地コピー酵母ベクタ ーＣＶ２Ｏ（ＹＥＰ２０．　ＡＴＣＣ３７０５９、Ｂｒｏａｃｈ、　Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｓｏｌｏｇｙ、　皿３Ｇ？−３２５）上にＩ’ＧＫターミネ ータ−を含む、酵母分泌ベクターであるプラスミドｐｌＮＧ８０４ｃＶｓを基礎 ベクターとして用いて、ＹＴ１５２およびＹＴ３２３分泌ベクターを構築した。 ｐｌＮＧ８０４ｃＶｓを基礎ベクターとして選択した理由は、このプラスミドが 小さなシｕ−」−−Ｘ　ｈ　ｏ　Ｉ断片を生成し、ＹＴ１５２およびＹ↑３２３ 遺伝子の完全な大きさのＩＬＬニーＸｈｏｌ断片と容易に識別できるからである 。プラスミドｐｌＮＧ１５２ＴおよびｐｌＮＧ３２３Ｔをハ辷１および…１で切 断し、ｐｌＮＧ１５２ｃＶｓおよびｐｌＮＧ３２３ｃＶｓ各々を生成するために ４８５ｂｐの部分的タウマチン遺伝子を１０−」−およびＸｈｏｌで切断したｐ ｌＮＧ８０４ＣＶＳニ連結シタ。 プラスミドｐｌＮＧ１５２ｃＶｓおよびｐｌＮＧ３２３ｃＶｓ各々は、酵母菌株 ＡＩ？（ＭＡＴ　　　ｃｒ　　　　Ｉｅｕ　　２−　３　　）　　、　（ｆｌｈ ｉｔｅｈｅａｄ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　　ｏｆ　　Ｃａｎｃｅｒ@　Ｒｅ５ｅ ｒｃｂ。 Ｇｅｒａｌｄ　Ｆｉｎｋの研究室より入手）で形質転換された。Ｌｅｕ”形質転 換体を５０−１ｅｕ中で４日間増殖させ、放射免疫検定法のサンプルとした。　 ＹＴ１５２あるいはＹＴ３２３の分泌レベルは約０．４μｇ／ｍｌと決定された 。 ２隻貫主 本発明のタウマチンポリペプチドをコードするベクター作製の代替手段として、 市販の装置を使用して、適当なプロモーター、分泌シグナルおよびターミネータ −配列と共に本発明のタウマチンポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌク レオチド配列全体を合成することは、十分に当該技術の範囲内である。該配列を 含むカセットは、適当なプラスミドに容易に押入できるように、その５°および ３゛末端に制限部位を複製しうるヌクレオチドを生じうる。 たとえば、下記の第２表及び第３表に示すのは、ＰＧＫプロモーター−凹シグナ ル配列−［Ｌｙｓ’″　７１．ρ＋１３．　ＡＳｐ１！？　）タウマチ７ｌ−Ｐ ＧＫターミネータ−を含むｐｌＮＧ１５２ｃＶｓ配列（第２表）、ならびにＰＧ Ｋブロモ−クー４距ｑシグナル配列−（Ｌｙｓ４４．＾ｓ　ｐ　＊　１゜＾ｓｐ Ｈｆｆ）タウマチン１−ＰＧＫターミネータ−を含むｐｌＮＧ３２３ｃＶｓ配列 （第３表）をコードするＤＮＡカセットのヌクレオチド配列である。これら配列 は同時に、５°末端のｈ１上部位および３゛末端のＳａｔ　　ｎ部位への「接着 末端」を含み、Ｂａｍ１ｌ　Ｉおよび独制限酵素で開裂した一船ニ入手しうるプ ラスミドＣＶ２Ｏ（ＹＥｐ２０．　ＡＴＣＣ３７０５９）内に挿入した時、選択 的ニｐＩＮＧ　１５２ｃＶｓおよびＰＩＮＧ３２３ＣＶＳを生成する。 第２表 ｐｌＮＧ１５２ｃＶｓ　配列 １０　　　　　　　　２０　　　　　　　　　：１０　　　　　　　　４０　　 　　　　　　　Ｓ。 ６０　　　　　　　’７０　　　　　　　　８０　　　　　　　　９０　　　　 　　　１００１１０　　　　　　　１２０　　　　　　　１ｊＯ１４０１５０Ｔ ＧＣＡＡＧＡＡＡＴ　　ＡＧＡＴＡＴＴＴＧＧ　　ＴＣＴＴＴＴＣＴＡＡ　　Ｔ ＴＣＧＴＡＧＴＴＴ　　ＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＧＴＴＣＴＴＴＡ　　ＴＣＴ ＡＴＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＴＴ　　ＡＡＧＣＡＴＣＡＡＡ　　ＡＡＧＴＴ ＣＡＡＧＡ３１０　　　　　　　　３２０　　　　　　　３］０　　　　　　　 ３４０　　　　　　　３５０ＡＴＣＧＴＴＡＡＣＡ　　ＧＡＴＧＴＴＣＴＴＡ　 　ＣＡＣＴＧＴＴＴＧＧ　　ＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴ　　ＣＣＭＧＧＧＴＧＡＴＡ ＧＣＡＡＴＴＧＴ　　ＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴ　　ＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＣＧＡＣ ＧＡＣＧＡＡ　ＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴ第３表 ｐｌＮＧ３２３ｃＶｓ配列 スｍ先 声１か°の 本実施例において、形質転換した細胞によって生成され、増殖培地中に分泌され るタウマチンの精製方法を記述する。震盪フラスコ（０８２〜２リツトル）ある いは小規模発酵装置（１０〜７５リツトル）内で増殖させた培′＃物からのタウ マチン精製方法に従って、酵母細胞をベレット状にするために連続フロー遠心分 離（ｆｌｅｓｔｆａｌｉａ　５Ａ−１）により培地を浄化する。 次に１０，０００ダルトンの分子量分離らせん形カートリッジを備えたＡｍ１ｃ ｏｎ　ＤＣ−１０Ｌ　４１１機を用いて細胞不含増殖培地を１０〜２０倍にｍ　 縮し、１５倍量の水で洗浄する。濃縮物を浄化するために（大容量用中空繊維カ ートリッジを用いて）　１７．０００　ｘ　ｇで２０分間遠心分離する０次に上 清を孔サイズ０．４５μ−の膜に通して濾過し、微粒子および残存する細胞破片 を除去する。リン酸ナトリウム緩衝液を１膜Ｍの濃度まで添加して、ｐＨを７〜 ８にｌ！整する。 浄化した増殖培地濃縮物をＺｅｔａ　Ｃｈｒｏｍ−６０ＳＰデイスク（Ｎｅｓ　 ｔｅｒ口Ａａａｌｙｔｉｃａｌ、スルホプロピル腸イオン交換体）上に置く、デ ィスクを１０ｍ１ｌリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム緩衝液ｐ）１７〜Ｂ で洗浄し、放射免疫検定法によりタウマチンの存在に関して試験した後、流動物 を廃棄する。　５ｐＦＩＡ脂上で濃縮したタウマチンは、先に使用した緩衝液中 で２５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液２００ｍ１でディスクから溶出する０次に希釈 タウマチン溶液は、Ｙ？ｌ−５膜を備えたＡｍ１ｃｏｎ攪拌細胞の加圧限外濾過 により濃縮され、水で２回洗浄され、実質的に精製（すなわち、９５％以上）さ れた産生物を生成した。 大規模発酵（すなわち、４００〜６００リツトル）での増殖培地かに発酵培地を 、リン酸でＰＨ４，０にする処理、０．４％安息香酸ナトリウム（重量／容量） の添加、および３０’Ｃ１３０分間の通気無しでのインキエベーシッンを含む不 活性化工程に適用する。細胞を遠心分離によってベレット化し、５％漂白剤で死 滅させた。 次に６個の１０．０００ダルトン分子量分離らせん形カートリツジを備えたＡ■ １ｃｏｎ　ＤＣ−３０Ｐ　ｆＡＩＩ機を使用して細胞不含増殖培地を１０〜２０ 倍に濃縮し、５倍量の水で洗浄した。培地を０．１μｍ分離Ａｍ１ｃｏｎ中空フ ィルターカートリッジで浄化し、１０＋ｗＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７〜８中の ２５０■阿塩化ナトリウム１５リツトルで洗浄した。 この時、小規模発酵について述べたのと同様の方法で、培地を八ｗｉｃｏｎ　Ｄ Ｃ−１０Ｌ　４縮機を用いて濃縮し、１７，０００　ｘ　ｇで遠心分離し、０． ４５μ諷ミリボア膜に通して濾過し、緩衝液で処理してｐＨ１〜８とした。 浄化した増殖培地濃縮物を、最大流量２０ｍ１／分でＺｅｔａ　Ｃｈｒｏｍ（賀 ｅｓｔｅｒｎ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）　１００ｃｃＳＰカプセル上に置き、１ ０ｍＭリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７〜８で洗浄する０次 に＄１街液中の２５０ＩＩＭ塩化ナトリウム１リットルを用いて、濃縮したタン パク貿を溶出する。溶出液を、Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａｙを 用いてタンパク質溶出に関して観察する。タンパク質陽性画分はプールされ、門 、５膜を備えたＡｍ１ｃｏｎ撹拌細胞を用いて限外濾過により脱塩／ｆＡ１１Ｌ 、て、実質的に精製された産生物を生成した。 災旌貫立 本実施例において、各種の改良された酵母分泌シグナル配列が構築された。並匹 野生型酵母転化酵素シグナル配列の５゛末端に配列変更（主として正に電荷した アミノ酸をコードするために）を導入するために、プラスミドｐＫｓ４８が構築 された。３゛末端の展−５ｓｔｌ−Ｘｈｏｌリンカ−と共に２１８ｂｐ　ＰＧＫ プロモーターを含むプラスミドｐＳ）１４を匣で分解し、丁４ＤＮＡポリメラー ゼで充填して、次にハ１上で分解した。　Ｈｉｎｄｍで分解し、Ｔ４ポリメラー ゼでプラント末端化して、Ｂａｗｌ（土で切断したｐＫＫ１０８に、Ｂａｗｌ上 −プラント末端２１８ｂｐ　ＰＧＫプロモーター断片を連結し、ｐＸＳ４８を生 成した。 プラスミドｐＸ５４８は、２１８ｂｐ　ＰＧＩＩプロモーター、部分的転化酵素 シグナル配列、および部分的タウマチン遺伝子を含む。 ｐＸＳ４８をｎ…およびＨｉｎｄｌ［Ｉ−で分解すると転化酵素シグナル配列の ５゛末端を変化させるための合成オリゴヌクレオチドの押入が可能となる。５つ のオリゴヌクレオチドが合成された。これらオリゴヌクレオチドがコードするア ミノ酸配列の変化を下記第４表に示した。 各オリゴヌクレオチドを、匣およびＨｉｎｄｌ［Ｉ−で切断しておいたプラスミ ドｐＫ３４８に連結した。大腸菌株ＭＣ１０６１への形質転換後、−木鎖ギャッ プをｉｎ　ｖｉｖｏで修復しくフアツジ（Ｈｕａｎｇ）　ら、　Ｂｉｏ−ｃｈｅ ｍｉｓけｙ、（１９８７）、　２６：　８２４２−８２４６）、プラスミドｐＫ ５４８−１（Ｌｅｕ（１）−＋Ａｒｇ　）、ｐｌｆｓ４８−２　［Ｌｅｕ（２） →Ａｒｇ　）　、ｐＸＳ４８−３ＣＧＩｎ（３）→Ｌｙｓ　）、ｐＸＳ５５　［ Ｌｅｕ（２）−＊ＬｙｓＬｙｓｔ、ｙｓ　）およびｐＸＳ５６［Ｌｅｕ（２）→ ＬｙｓＡｒｇＬｙｓＡｒｇ）を形成した。　２１８ｂｐ　ＰＧＫプロモーターユ 突然変異シグナル配列一部分的タウマチン遺伝子を含むハ１土−匡吐±断片が、 ５つのすべてのプラスミドそれぞれから精製された。（ｌｙｓ４＆、　ＡＳｐ１ １３　）タウマチンｌをコードするＹＴ４０６と称する遺伝子の３°側半分を含 む匡」上−秤旦断片もまた、ｐｌＮＧ９５ｃＶｓあるいはｐｌＮＧ４３８ｃＶｓ から精製された（ただし、ＹＴ４０６遺伝子は、ｐＸＳ６のような他のプラスミ ドから入手することができた）。 ｐＸＳ４８−１　、　ｐＫ５４８−２　、およびｐＫ３４Ｂ−３からのハ畦土− Ｒ皿上断片を、ｐｌＮＧ９５ｃＶｓからの影＝３」−一匣断片およびｌす咀」− 一…旦分解日出願の米国特許出願番号第１８９，２５０号に記されているＰＧに ターミネータ−配列を含むプラスミド）に連結し、ｐｌＮＧ４４７　、ｐｌＮＧ ４４８およびｐｌＮＧ４４９それぞれを形成した。　ｐＸＳ５５およびｐＸＳ５ ６からのハ畦±−ＥｃｏＲ工断片を、プラスミドｐｌＮＧ４５４およびｐｌＮＧ ４５６それぞれを形成するために、ｐｌＮＧ４３８ｃＶｓからのＥｃｏＲ上−■ 旦断片およリボヌクレオチド（５°ＧＣＴＴＴＣＴＴＧＡＴＣＴＴＧＴＴＧＩＴ ＴＴＴＧＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＣＴＧＣＡ　３’）をｉｎ 　ｖｉｖｏギヤ”／ブ充填技術によってｐＸＳ４６の小さなＨｉｎｄｌｌｌ−Ｐ ｓｔｌ断片と置き換え、ｐＸＳ４９を生成するために用いられた。　ｐｌＮＧ１ ７４からのタウマチン遺伝子を、２段階クローニングによりｐＸＳ、＋９の新し いシグナル配列と内相融合して接合し、ｐＫｓ５４を形成した。　２１８ｂｐ　 ＰＧにプロモーター−シグナル配列−タウマチン遺伝子を、ｐｌＮＧ４５１を生 成するためにＢａｗｌ土−…旦断片としてｐｌＮＧ５８にクローニングした。プ ラスミドｐｌＮＧ４５１において、５ＵＣ２分泌シグナル配列内で下記置換を行 った：　　（Ｐｈｅ’→Ｔｉｅ　％Ａｌａ”　→Ｉｌｅ　、　Ｇｌｙ”　−＋Ｌ ｅｕ　、　Ａｌａ′３−＊Ｐｒｏ　％およびＡｌａ”　−＊Ｇｌｙ）。 ｐＸＳ５５およびｐＸＳ５６における変更とｐＸＳ５４における変更との結合を 下記のようにして実施した。　ｐＸＳ５５およびｐＸＳ５６からの小さな堕畦上 −１細Ａ１−断片を、ｐにＳ５４からの小さな…ｎｄｌ［Ｉ　　ｊｉ…断片と共 に、Ｂａｗｌ上−紅旦切断したｐＸＳ６内に連結し、ｐＸＳ５７およびｐＫｓ５ ８それぞれを形成した０次にｐＸＳ５７およびｐＸＳ５８からの（約９２０ｂｐ 　、プロモーター−シグナル−タウマチン融合物を含む）Ｂ　ａ　ｍ　Ｈ土−■ 旦断片を、Ｂａｗｌ上および皿切断したｐｌＮＧ５８にクローニングし、ｐｌＮ Ｇ４６０およびｐｌＮＧ４６２それぞれを生成した。これらプラスミドは、配列 のアミノ末端にどちらも正に帯電したアミ７？酸残基を持つ分泌シグナル配列を コードし、分子の中心部の疎水性を上昇した。 酵母菌株ＢＢ３１−１ｃ　　（ＭＡＴａ、民４」、ｋユＵ−１ｕｒａ３−５２　 ）をプラスミドｐｌＮＧ１５６　、ｐｌＮＧ４４７　、ｐｌＮＧ４４８　、ｐｌ ＮＧ４４９　、ｐｌＮＧ４５１、ρｌＮＧ４５４　、ｐｌＮＧ４５６　、ｐｌＮ Ｇ４６０およびｐｌＮＧ４６２で形質転換した。 Ｌｅｕ”形質転換体がＳＤ−１ｅｕプレート上で選択され、単独コロニーを５Ｄ −ｌｅｕブイヨン中に採取し、４日間増殖させた。そして放射免疫検定法のため のサンプルが採取された。形質転換遅滞時間と比較した（Ｌ　ｙ　Ｓａ　ｈ　、 Ａ　３　ｐ　Ｉ　１３　）タウマチンＩ産生最大収量を下記第５表に記録した。 里！ タウマチン分泌に対する修正シグナル配列の影響スＩＬ団 本実施例において、大量の好適なタウマチンを分泌する好ましい酵母菌株を単離 した。菌株ＢＢ３３−１ｃ（ＭＡＴａ　　Ｉｅｕ２−３．２４１２ｕｒａ３−５ ２）を、Ｌｅｕ”形質転換体を選択することによりｐｌＮＧ１５６（（Ｌｙｓ” 、ＡｓｐＩｌりタウマチン■をコードし、野生型分泌シグナル配列を含む高コピ ー数発現プラスミド）で形質転換した。形質転換体の小さな百分は０．３〜０． ６　ｐｇ／ｍｌのタウマチンを分泌した。これら高分泌形質転換体の１つは、後 に、もはや半数体ではないことが認められ、ＰＳＩＩと称した。　ｐｌＮＧ１５ ６を含むＰＳＩＩをＮ−メチル−Ｎ゛−ニトロ−ニトロソグアニジンで突然変異 誘発し、コロニーは分泌促進のためにスクリーニングされた　。 スクリーニングは、ＳＤ−１ｅｕプレート上でのコロニーの増殖、マスタープレ ートからコロニーをニトロセルロースフィルター上への移動、コロニー側を上に したフィルターを新鮮５Ｄ−１ｅｕプレート上への移動を含んでいた。６〜２４ 時間の増殖後、コロニーをフィルターから洗い流し、フィルターをタンパク賞免 疫プロッティング（ウェスタン法）によりタウマチンについて調べた。高分泌コ ロニーをマスタープレートから採取し、ウェスタン法およびＲＩＡ法によって再 び調べた。高分泌コロニーを連続的に単離することによるこの方法を反復し、Ｐ Ｓｌｌ（ｐ夏ＮＧ１５６　）→ＰＳ６　　（ｐｌＮＧ１５６〕→ＰＳＩＯ（ｐｌ ＮＧ１５６　）→ＰＳ１４　（ｐｌＮＧ１５６　）という系統を作製した。プラ スミドＰＳ１４は、非選択性培地（ＹＰＤ）で増殖させて処理され、ｐｌＮＧ４ ６０で再形質転換された。　ＰＳ１４　（ｐｌＮＧ４６０　）の突然変異誘発は ＰＳ１６　（ｐｌＮＧ４６０　）を生じた。酵母菌株ＰＳ１６は、Ａ、Ｔ、Ｃ， Ｃ，寄託番号第２０９０９号として、ｔｈｅ＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ＋　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖ ｅｎ　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２−１７７６との契 約下に寄託されている。一連の各突然変異体のタウマチン分泌を下記第６表に示 す。 １１表 なるジグ　ル　　　　っベク　−　　・″然゛　　による　Ｌｓ　４　ｈ　　Ａ ｓ　ｌ　＋　２　　　ウマチンＩ　°°・ＲＩＡによって分析した（μｇ／鴎１ ）ｐｌＮＧ　　　ｐｌ）ＩＧ　　　ｐｌＮＧ　　　ｐｌＮＧ　　　ｐｌＮＧＨ匹 鉦且坐盪簗 Ｋｌｕ　ｖｅｒｏｍ　ａｓｓ　Ｉａｃｔｉｓ菌株ＫＧ５１−５Ａ　（ＡＴＣＣ１ ４８７９２）がらのゲノムＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａで部分分解した。１Ｏ− １２）［ｂの大きさの断片を分別し、シ！ｌ￥ｐ！！勾配で回収した。このＤＮ Ａを、あらかじめＤａｍ）Ｉ土（ｈ畦上末端はと一虹末端と適合する）で切断し ておいたｐＩＮＧ１００１ＲＫｎＢ内に連結し、酵母ゲノムプラスミドライブラ リーを作製した。　ｐｌＮＧｌｏｏｌＲＫｎＢは、ビール酵母菌（Ｓ、ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ）　３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターに連 結したＴｎ９０３アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含むＳ、 ｑｅｒｅｖｉｓｉａｅ−大腸菌シャトルベクターである。これは、アミノイブラ リ−の形質転換を可能にする。プラスミドｐｌＮＧ１００］ＲＫｎＢはこの工程 に不可欠のものではなく、宿主の欠失を相補するｌまたはそれ以上のマーカを持 つ他のプラスミドで置き換えてもよい。 該ライブラリーを酵母菌株８８３３−１ｃ　　（ＭＡＴａ　　Ｉｅｕ２−３　２ −１１２、ｕｒａ３−５２）に形質転換した時に、ｕｒａ　’形質転換体が単離 された。 プラスミドＤＮＡをこの形質転換体から単離し、大腸菌に形質転換して、プラス ミド調製品から採取した。　ｐｌＮＧｌｏｏｌＲＫｎＢのハ１±部位は、５ａｕ ３Ａ末端に連結する時（この場合のように）しばしば破壊されるが、２つのＥｃ ｏＲ１部位によって（ｐｌＮＧｌｏｏｌＲＫｎＢにおける唯一のＥｃｏＲ土部位 ）によって側面から作用して、ＢＢ３１−１ｃにＵｒａ”を与えるＤＮＡを２． ８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片として除去することト末端化し、先に述べた、Ａｓｔ　 ＩＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼでプラント末端化したｐｌＮＧ４６０　 　（（Ｌｙｓ”　、Ａｓｐ”’）タウマチンｌ）に連結した。　ｐｌＮＧ４６０ の細菌配列中のＡｍｐ”遺伝子のム且した。　ｐｌＮＧ８１６Ａはハ旦部位から 約１ｋｂのところに田旦部位を持つのに対し、ｐｌＮＧ８１６Ｂはハ旦部位から 約３ｋｂのところにハ１部位を持つ。 叶ａ゛に関して選択した、酵母菌株ＰＳ１６　（ＢＢ３３−１ｃの突然変異誘導 体）のプラスミドｐｌＮＧ８１６Ａ形質転換体は、３〜４日後に発現した。それ らは、液体培地中Ｕｒａ”分泌下で約１０μｇ／■Ｉのタウマチンを分泌した。 このタウマチン分泌レベルは再現性があり、かなり安定であった。　　ｐｌＮ［ ；８１６＾を有するＬｅｕ’あるいはＬｅｕ’Ｕｒａ　’表現型の選択は、低い レベルのタウマチン分泌（２〜３μｇ／ｍｌ）を生した。非選択性ＹＰＤ培地に おける約２０世代後、細胞の約３７％が依然としてＩＪｒａ’であった。 １１貫］一 本実施例において、プラスミドｐｌＮＧ１５２Ｔ、およびｐｌＮＧ３２３Ｔ　（ 各々、酵母タウマチン１５２（ＹＴ１５２）　［Ｌｙｓ”、　Ａｓｐ””、　Ａ ｓｐ１３’　）タウマチン！および酵母タウマチン３２３　（Ｙ↑３２３）　（ Ｌｙｓ”、　Ａｓｐ”。 Ａｓｐ１１３〕タウマチンＩ）で形質転換した細胞から生成したタウマチンタン パクを、味覚パネルによって検査し、植物由来のタウマチンと比較した。植物タ ウマチンは甘味が強いが、甘味が遅延して発現し、その後甘味度が急速に上昇し 、長く続く甘味と「せ草探」と呼ばれる長く残る滞溜する後味がある。ヒギンボ ザムら、タリン甘味料（タウマチン）の香味増強特性、　Ｔｈｅ　Ｑｕａｌｉｔ ｙ　ｏｆｒ’ｏｏｄｓ　ａｎｄ　Ｂｅｖｅｒａｇｅｓ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ ｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　９ｌ−１１１（１９８１）。 １５名の被験候補者を、甘味、酸味、塩味および苦味（２％シ町糖、０．０７％ クエン酸、０．２％塩化ナトリウム、０．０７％カフェイン）の基本的味覚を識 別する能力に関してスクリーニングした。１３名の被験者（女性１０名、男性３ 名）がスクリーニングプログラムを成功裡に修了した。 スクリーニング後、被験者は記述分析に関する５つの各３０分間のトレーニング に参加した。トレーニングは、円卓会議、および仕切をした官能試験室内での評 価する甘味料を表わす感覚特性と強度を含むように選択したサンプルに関する試 験の両方を含んだ。 被験者が、定義を伴った記述的感覚言語、各特性の強度を測定するスコアシート 、製品を検査し、評価するための標準方法を開発し、及び１８の香味および後味 特性に関するスコアシートを用いて製品を評価する能力を示した時に、トレーニ ングを一旦終了した。（下記第７表参照）。 試験サンプルは、１リツトルのマスターバッチ内で等甘味（１０％シｇｔＩ！当 量）に調製し、試験のため１〜３日間、華氏３８度に保持した。 すべての試験は、制御された試験環境を提供するように設計された官能室内で実 施した。サンプル（１０ｍｌ）は、１オンスの無臭プラス千ツクコツプで供した 。各被験者は１回に１サンプルを評価し、サンプルとサンプルの間に３分間の休 止時間を与えられた。 被験者は、サンプルを吐き出し、サンプルとサンプルの間に純水と無塩クラッカ ーで洗浄するよう指示された。午前１０時から１１時３０分の間にすべての試験 を実施した。サンプルは、３つの数字からなる無作為番号のみを付けて各被験者 に供された。数字は各試験ごとに各被験者および各サンプルについて異なってい た。 サンプルは、試験全体を通じてサンプル供出順序、被験者および日時の平均を保 つために単位計画に沿って供された。各サンプルが３日間にわたって１日１回、 １３名の被験者各々によって評価され、１８の特性の各々に関して製品あたり約 ３９の観察が得られた。 データは、各特性に関する被験者個々の成績の評価には分散の一方向分析、各特 性に関する全体的なパネル成績の評価には分散の二方向分析、そしてサンプル平 均値間の統計的有意差を同定するためにダンカン・マルチプルレンジ検定により 分析した。 タウマチンタンパクの経時的甘味強度に関しても試験を実施した。被験候補者を 募り、シ！Ｉｗおよび植物タウマチンの５つの上限濃度を検出する能力に関して スクリーニングした。この初期スクリーニングを通過した者を、次にスワルツ（ Ｓｗａｒｔｚ）ら＋　ＦｏｏｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　３ｔ１．５１−６７　 （１９７７）の方法に従って、種々の濃度のンａｔＡ溶液を最低濃度から最高濃 度の順に（水分中５．７．５．１０．１２．５、及び１５％）等級づけする能力 に関して試験した。１３〜１５名の最も正確で信幀しうる鑑定者を選択して、時 間−強度試験に参加させた。 ３つの実習授業を実施して、被験者に試験の手法およびラーラン°パワーズとバ ングボーン（Ｌａｒｓｏｎ−Ｐｏｗｅｒｓ　ａｎｄ　Ｐａｎｇｂｏｒｎ）。 Ｊ、　Ｆｏｏｄ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　４３（＋）、　４１−４６　（１９７Ｂ ）が記しているようなストリップ−チャート記録装置の操作方法に関する基本的 知識を与旧畦ＩＪ濃度は１０％（ｆｆｉｆｆｉ／容量）ショ糖溶液とほぼ等しい 甘さであった。これら濃度は、信幀しうる時間−強度データを確保するために実 施した等甘味試験の結果を通して導き出した。被験者は、一連の平均が保たれた 順序で、無作為に番号（３つの数字）を付した各甘味料の１Ｏ−１サンプルを与 えられた。被験者は、サンプル全部を口の中に入れ、足踏みペダルで移動チャー ト記録装置を始動させて、「サンプルの相対的甘味強度を最もよく反映している ラインに沿ってマークをつける」ように指示された。ラインが紙上に記録された 時点で、被験者はサンプルを吐き出すように指示され（１０秒）、すべての甘味 が消え去るまで甘味強度の採点をＩｌ！続するように指示された。被験者は、サ ンプル評価の間の数分間に水と無塩クラッカーを使用して口を洗浄した。検査し た各甘味料についてこの方法を反復した。一貫性を保証し、統計的有効性を高め 、試験結果に基づいて信鯨できる結論に到達できるよプな質の高い、十分な量の データを従供するために、各々の試験を３回反復した。 各個人の記録から下記４つの感覚特性を測定した：１、曵上が■鬼皮：ｌＯ秒時 の１００単位スケールでの強度絶対値２、量大鬼皮：１００単位スケールで採点 された最高甘味強度値３、量大値１工皇片別：ゼロの時点から最大甘味に達した 時点までに経過した秒数 ４、ζ社皿：ゼロの時点からすべての甘味が消失し、記録を停止するまでの秒数 。 これらのデータを、個々のパネリストの成績の評価には分散の一方向分析、各測 定に関する全体的なパネル試験の評価には分散の二方向分析、そして甘味料間の 統計的有意差の同定にダンカン・マルチプルレンジ検定を用いて分析した。すべ ての統計分析は９５％信転レベルで実施された。 また、各甘味料について各−走者が作成したチャートに沿って各２．５秒間隔で 平均値も計算した。 二の試験により、塩味、酸味、メントール涼感、薬物性、薬物的後味およびメン トール後味に関しては、ＹＴ１５２およびＹＴ３２３は植物産生タウマチンと存 意の差がないという結果を得た。しかしながら、測定した１８の特性のうち１１ に関して有意の差があった。 ９０７ｚｇ／ｍｌのＹＴ１５２および１４５　μＨ／ｍｌのＹＴ３２３は、４９ μｇ／＋ａｌの植物タウマチンと同等の甘さであった。　ＹＴ３２３は最もタウ マチンに近かったが、酸味と苦味の後味は少なかった。　ＹＴ］５２はタウマチ ンとかなり異なっていた。甘草の香味と後味、酸味及び甘味の後味が小さいＹＴ Ｉ５２は、唾液分泌、口腔被覆、及び全体的に滞溜する甘味のいずれについても 小さかった。（第１図及び第２図、第７表〜第９表）。 別の試験において、１０４　μｇ／曽１のＹＴ１５２および７０μｇｌ園１のＹ Ｔ３２３は、４９μｇ／■１の植物タウマチンと同等の甘さで、最大甘味強度に 達するのに要する時間がより短く、植物タウマチンよりも滞溜する甘味がより少 なかった（第１２表）。 これらデータは、植物タウマチンの潜伏性甘味の発現および滞溜する後味が、Ｙ Ｔ１５２およびＹＴ３２３の両方について有意に低下していることを明らかに示 している。　ＹＴ１５２はまた、その適用範囲を広げうる「甘草様」の香味およ び後味が有意に低下している。 工旦盈 １平均は、０．５の確率レベルで有意差がない。 ゝ平均は、０，５の確率レベルで有意差がない。 １刊盈 ：　＋３：士二　８：詔■ヒ叱七；ｌ諾り：り；：：ＹＴ１５２　６４．３１” 　　３．６３　　　　タウマチン　６７．６”　　３．８６タウマチン６３．１ ８”　　３．９８　　　　　　ＴＹ３２３　６４．９”　　４．０３タウマチン ７３．２３”　　３．８５　　　　タウマチン　７２．８”　　３．９２ＹＴ１ ５２　７０．７２”　　３．８２　　　　　　ＹＴ３２３　７０．５”　　４． ０９ＹＴ１５２　１２．５４　　０．８３　　　　　　ＹＴ３２３　１０．６ゝ 　０．５６タウマチン４０．７２　　４．０１　　　　タウマチン　３６．５　 　２．５６ＹＴ１５２　３３．１０　　２．７１　　　　　　ＹＴ３２３　３１ ．４　　２．３６スｍ影 本実施例において、ＰＳ１６から誘導される好ましい酵母菌株、ＫＩ（にｌを単 離した。　ＰＳ１６　（ｐｌＮＧ８１６Ａ）形質転換体を単独集落分離のために ＳＤ−ｕｒａ寒天培地で画線培養した。液体ＳＤ−ｕｒａ　３ｇ＋１中での４日 間の増殖により、１６のコロニーをタウマチン分泌に関して試験した。これらの うちの１つで、１２．９ｐｇ／−１のタウマチンを分泌した８８２と呼ばれるも のを５０−　ｕｒａ寒天培地上で再び画線培養してサブクローニングした。４つ のコロニーを採取してＳ「液体中で増殖させた。これのうちの１つ、ＫＨＫＩ　 Ｃ元のＢＢ２ａ　）は１４〜１７μｇ／ｍｌを分泌した。酵母菌株Ｋ）ｌにｌは 、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，寄託番号２０９５４　として、ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　 Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１Ｌｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ＋　１２３０１　Ｐａｒｋｌ ａｗｎＤｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｃ、門ａｒｙｌａｎｄ　２０８５２−１ ７７６との契約下に寄託されている。 ｕｒａＡ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ断片中のハ旦部位のため、ｐｌＮＧ８１６Ａプ ラスミドパンタグラウンドはＰＧＫターミネータ−の前のＢａｗｌ　Ｉ　−Ｘｈ ｏｌ断片の常法クローニングには不都合であった。そのため、この…旦部位を破 壊して同様のプラスミドバックグラウンドが構築された。　ｐｌＮＧ８１６Ａを ｌす引」−およびハｙ土で開裂し、丁４ＤＮＡポリメラーゼでプラント末端化し 、そして連結した。これは約２，９００ｂｐを除去し、Ｘｂａ１１部位を破壊し て則り」」一部位を再生した０次にこの中間プラスミドｐＫＫ１３５を、皿で開 裂し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼでプラント末端化し、再連結することで、Ｘｈｏ １部位を破壊し、回部値を造った。この第２の中間体ｐＫＫ１３６をＢａｍＨ上 および九…で切断し、ｐｌＮＧ５８の約２．］５０ｂρのシ１１土：」■ｌ−断 片と連結した。 生したプラスミドρｌＮＧ３２７は、アンピシリン選択のためのβ−ラクタマー ゼ遺伝子および大腸菌における複製のためのｃｏｌＥＩ　レブじてＳ、ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅにＵＲＡ３および部分的星機能を与えることができるＩｕｅ２」マ ーカーＢ　Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるｐｌＮＧ８２７の複製のための複 製源および内生的２ミクロンプラスミドの５ＴＢ（ＲＥＰ３）機能；ならびに単 −Ｘｈｏ１部位の後のＰＧＫターミネータ−を含む。 プラスミドｐｌＮＧ８２７は、プロモーター（この場合、ＰＧＫプロモーター） およびＰｆ、にターミネータ−の前のプロモーターに続く機能遺伝子（この場合 、分泌シグナルを持つタウマチン遺伝子）を含むＢａｍＨＩ　　ＸｈｏＴ断片を クローニングするのに適している。 ｐｌＮＧ８２７の約１９０ｂｐ　ＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌ断片をＰＩＮＧ４６０の 約１，２８０　ｂｐＢａｓＨＩ−Ｘｈｏｌ断片で置換することにより、プラスミ ドｐｌＮＧ８３４が構築された。これは、ｕｒａＡ中の回部値が破壊されたｐｌ ＮＧ８１６Ａの翻訳を効果的に行った。ｐｌＮＧ８１６＾と同様に、ｐｌＮＧ８ ３４は（Ｌｙｓ”＋Ａ、ｐ１１３）タウマチンｌコード配列を持つ。 （Ｌｙｓ”＋　Ａｓｐ””＋　Ａｓｐ”マ〕タウマチンＩコード配列を含む類縁 プラスミドｐｌＮＧ８３５は、３つの制限断片の連結によって構築することがで きる：　ｐＩＮＧ８２７の大きなりａｗｌ　Ｉ−Ｘｈｏｌ断片、　ＰＧＫプロモ ーター、シグナル配列、および（Ｌ、ｓ４ｈ、　Ａ、、＋１３　）タウマチンｌ コード配列の５゛側部分を含む、ｐｌＮＧ４６０の約５４０ｂｐ　Ｂａｗｌ　Ｉ 　−ＥｃｏＲ工断片；ならびに（Ｌｙｓ”＋　Ａｓｐ”’＋＾ｓｐ＋Ｓ？　）タ ウマチンｌコード配列の３゛側部分を含む約２６７ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏｌ 断片、二のＥｃｏＲＩ−χｈｏｌ断片はｐｌＮＧ１５２ｃＶｓから供給されうる が、実際には池のプラスミドｐｌＮＧ１５２ＫＲ５から供給した。 ＫＨＫＩ　（ｐｌＮＧ８１６Ａ）を浄化した培養培地中に存在する分泌タウマチ ンのレベルが一貫して１００　ｍｌ／　ｌ　＠超えている小規模発酵槽中で増殖 した。特に、プラスミドｐｌＮＧ８１６Ａ、　ｐｌＮＧ８３４あるいはｐｌＮＧ ８３５を有するＰＳ−１６あるいはＫＨＫＩの種子培養物を、標準量の６倍量、 すなわち０．１８１／Ｌロイシンを含む５Ｄ−ｕｒａ中で３０°Ｃで増殖させた 。　０Ｄｂｏｅ　＞　２の種子培養物５〜５０１ｍ１を、フィエスコ（Ｆｉｅｓ −ｃｈｋｏ）　　ら＋　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　ｌ　Ｂｉｏｅｎｇ、＋　ＸＸＩＸ巻 、　１１１３−１１２１　頁、　Ｊｏｈｎｌｌｉｌｅｙ　ｌ　５ｏｎｓ　（１９ ８７）に基づき、２３．０　ｇルカザミノ酸、４．０ｇ／Ｌ硫酸アンモニウムお よび１３．０ｇ／Ｌ　リン酸カリウム（−塩基）を含む９０容量部の溶液と、第 １部（２，０ｇ／Ｌグルコース、１゜Ｏｇ／Ｌ硫酸マグネシウムおよび０．１　 ｇ／Ｌイノシトール）および第２部（３，０−１ルビタミン溶液、３、Ｏｗｌル 微量金属溶液及び３．０　ｍｌ／Ｌ　１％チアミン溶液）を含む、加圧滅菌した 添加物１０容量部と配合することによって生成した回分培地約１リツトル中に無 菌的に接種した。 種子の成長の間選択を維持するが、種子成長の正確な方法は必須ではないと考え られる１発酵槽の培養物を、４０％水酸化アンモニウムを添加してｐＨを５．５ に維持し、空気および酸素の強制通気により溶存酸素を３５％以上に保ちながら 、３０℃で増殖させた。ＯＤ、。。 が発酵槽中で約１に達した時、５３ｋｌの第１部（１００ｇ／Ｌカザミノ酸、３ ．０ｇ／Ｌリン酸カリウム（−塩基Ｌ５．Ｏｇル硫酸アンモニウム、０．５鵬１ ／Ｌポリエチレングリコール、および４６５．０ｓ＋Ｉ／Ｌ　ＲＯ（逆浸透）　 −Ｈ２Ｏ）　、ならびに、加熱してグルコースを溶解した後、７．０１ビタミン 溶液、７．０１微量金Ｎ溶液および′２．Ｏｍｌの１％チアミン溶液をあらかじ め添加しておいた、４５５ｍ１の第２部（５００，０、／Ｌグルコース、１５． ０ｍｌ／Ｌ　　１１１硫酸マグネシウム、０．１　ｇ／Ｌイノシトール、および １２０　ｍｌ／Ｌ　ＲＯ−ＨＩ３）を含み、そしてフィエスコらに基づいた飼料 を培地に添加した。飼料溶液は、約１−１／時の割合で添加を開始した。ＯＤ、 。。に比例して飼料を増加した（発酵槽からサンプルを回収して測定することに より決定した）が、より重要な点として、（酵母代謝からの）エタノール濃度を ０．１　ｇ／Ｌ以下に維持した。飼料が尽きた後２〜８時間、発酵を継続させた 。 典型的な最終ＯＤ＆ｔｈｅは２００以上２５０未満であった。 分泌されたタウマチンについての数値は、タウマチン特異性モノクローナルおよ びポリクローナル抗体を用いて２ＬＩＳＡにより決定した０発酵培地中に分泌さ れたタウマチンの量を、２つの付加的方法の少なくとも１つによって測定した： すなわち、（１）クーマシーブルー染色したＳＯＳポリアクリルアミドゲル上に 生じた脱塩培地の帯の強度；および（２）陽イオン交換クロマトグラフィーＣＩ ＩＩ”ＬＣまたはＦＰＬＣ）を用いて溶出した培地サンプルのタンパク質ピーク ｆｉｌ域、　ＩＩＰＬｃについては、旧ｏＲａｄ　１（ＲＬＣＭＡ７Ｃカラム（ カルボキシメチル基）での１０ｍＭ　Ｎａ−ＰＯ４、ｐＨ６，９中の０〜５００ ＩＩＭ塩化ナトリウムの１０分間勾配を使用した。　ＦＰＬＣに関しては、Ｒａ １ｎｉｎＨｙｄｒｏｐｏｒｅ−５ＣＸカラムでの、２０＋ａＭ　Ｍ［’Ｓ　（２ −Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸）、ｐ）１６．０中の同じ勾配を使用し た。陽イオン交換クロマトグラフィーのこの方法に従えば、他の培地タンパク質 はこのクロマトグラフィー法においてカラムに結合することができないが、タウ マチンは単一ピークとして溶出する。 本発明の実施においては、前記の好ましい実施！！様の記述を考慮すれば、当業 者には数多くの修正および変更が可能であると考えられる。特に、出願人による 、タウマチ７１分子の味覚特性に関する９７位および１３７位のアミノ酸残基の 重要性の発見に照らして、９７位および１３７位のリジンをアスパラギン酸以外 のアミノ酸の置換することにより、改良された味覚特性を持つ付加的タウマチ７ １分子が生成できると考えられる。 Ｆｉｇｔ＋ｒｅ　ｉ。 滞留 唾液分泌　　　　　　　　　　　甘味の後味Ｆｉｇｕｒｅ　２゜ 甘草 ラクトースの後味 国際調査報告 一６１１＋□Ｉ■−蟲□＾”””６”’ｐＭｎ’ＱＲＧＭぺｒ）ｓ；

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．選択された宿主微生物において〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ９７，Ａｓｐ１１３〕 タウマチンＩの合成を指示する能力がある、精製、単離されたＤＮＡ配列。 ２．前記ＤＮＡ配列が、製造遺伝子である請求項１に記載の精製、単離されたＤ ＮＡ配列。 ３．前記塩基配列が、大腸菌におけるコドンの選択的発現特性に基づき同じアミ ノ酸を特定する代替コドンの中から選択された１またはそれ以上のコドンを含む 請求項２に記載の精製、単離されたＤＮＡ配列。 ４．前記塩基配列が、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）におけるコドンの選択的発現特性に基づき同じアミノ酸を特定する 代替コドンの中から選択された１またはそれ以上のコドンを含む請求項２に記載 の精製、単離されたＤＮＡ配列。 ５．コードするストランド中に下記ヌクレオチド塩基配列を含む請求項１に記載 の精製、単離されたＤＮＡ配列：【配列があります】 ６．選択された宿主微生物において〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ１１３，Ａｓｐ１３７ 〕タウマチソＩの合成を指示する能力がある、精製、単離されたＤＮＡ配列。 ７．前記ＤＮＡ配列が、製造遺伝子である請求項６に記載の精製、単離されたＤ ＮＡ配列。 ８．前記塩基配列が、大腸菌におけるコドンの選択的発現特性に基づき同じアミ ノ酸を特定する代替コドンの中から選択された１またはそれ以上のコドンを含む 請求項７に記載の精製、単離されたＤＮＡ配列。 ９．前記塩基配列が、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）の選択的発現特性に基づき同じアミノ酸を特定する代替コドンの中 から選択された１またはそれ以上のコドンを含む請求項７に記載の精製、単離さ れたＤＮＡ配列。 １０．コードするストランド中に下記ヌクレオチド塩基配列を含む請求項６に記 載の精製、単離されたＤＮＡ配列：【配列があります】 １１．選択された宿主微生物において〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ９７，Ａｓｐ１１３ 〕タウマチンＩの合成を指示する能力がある遺伝子を含む、生物学的に機能しう るＤＮＡ微生物形質転換ベクター。 １２．選択された宿主微生物において〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ１１３，Ａｓｐ１３ ７〕タウマチンＩの合成を指示する能力がある遺伝子を含む、生物学的に機能し うるＤＮＡ微生物形質転換ベクター。 １３．〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ９７，Ａｓｐ１１３〕タウマチンＩの合成を指示す る能力がある遺伝子を含むベクターで形質転換した微生物。 １４．〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ１１３，Ａｓｐ１３７〕タウマチンＩの合成を指示 する能力がある遺伝子を含むベクターで形質転換した微生物。 １５．前記微生物が、大腸菌微生物である請求項１３もしくは１４に記載の微生 物。 １６．前記微生物が、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）微生物である請求項１３もしくは１４に記載の微生物。 １７．適当な栄養条件下で、〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ９７，Ａｓｐ１１３〕タウマ チンＩの合成を指示する遺伝子を含む生物学的に機能しうるＤＮＡで形質転換し た微生物を増殖させ、それにより前記微生物が前記遺伝子を発現し、〔Ｌｙｓ４ ６，Ａｓｐ９７，Ａｓｐ１１３〕タウマチンＩを産生することを含む、〔Ｌｙｓ ４６，Ａｓｐ９７，Ａｓｐ１１３〕タウマチＩの生産方法。 １８．適当な栄養条件下で、〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ１１３，Ａｓｐ１３７〕タウ マチンＩの合成を指示する遺伝子を含む生物学的に機能しうるＤＮＡで形質転換 した微生物を増殖させ、それにより前記微生物が前記遺伝子を発現し、〔Ｌｙｓ ４６，Ａｓｐ１１３，Ａｓｐ１３７〕タウマチンＩを産生することを含む〔Ｌｙ ｓ４６，Ａｓｐ１１３，Ａｓｐ１３７〕タウマチンＩの生産方法。 １９．前記微生物が、大腸菌微生物である請求項１７もしくは１８に記載の方法 。 ２０．前記微生物がビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ）微生物てある請求項１７もしくは１８に記載の方法。 ２１．〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ９７，Ａｓｐ１１３〕タウマチンＩをコードする遺 伝子が微生物において発現したポリペブチド産生物。 ２２．〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ１１３，Ａｓｐ１３７〕タウマチンＩをコードする 遺伝子が微生物において発現したポリペブチド産生物。 ２３．選択された宿主微生物において、下記アミノ酸配列を含む酵母分泌シグナ ルを直接合成する能力がある精製、単離されたＤＮＡ配列： 【配列があります】２４．選択された宿主微生物において、下記アミノ酸配列を 含む酵母分泌シグナルを直接合成する能力がある精製、単離されたＤＮＡ配列： 【配列があります】 ２５．選択された宿主微生物において、下記アミノ酸配列を含む酵母分泌シグナ ルを直接合成する能力がある精製、単離されたＤＮＡ配列： 【配列があります】 ２６．選択された宿主微生物において、下記アミノ酸配列を含む酵母分泌シグナ ルを直接合成する能力がある精製、単離されたＤＮＡ配列： 【配列があります】 ２７．選択された宿主微生物において、下記アミノ酸配列を含む酵母分泌シグナ ルを直接合成する能力がある精製、単離されたＤＮＡ配列： 【配列があります】 ２８．適当な栄養条件下で、前記非酵母ポリペブチドの合成を指示する遺伝子を 含む生物学的に機能しうるＤＮＡで形質転換した酵母微生物を増殖し、さらに前 記ＤＮＡが請求項２３、２４、２５、２６、もしくは２７に記載の酵母分泌シグ ナル配列から選択されたアミノ酸配列をコードすることを含む、非酵母ポリペブ チドの生産方法。 ２９．Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号第２０９０９号として寄託した酵母菌株。 ３０．Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号第２０９５４号として寄託した酵母菌株。