JPH0357748B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は高温性糸状菌を用いて結晶度の高いセ
ルロースにも極めて強い分解活性を有する耐熱性
セルラーゼの製造法に関するものである。

セルラーゼは植物体など世の中に広く分布する
セルロースを分解する酵素であり、飼料製造や食
品加工、セルロースを多く含む廃液の処理などに
従来から広く利用されてきた。特に近年において
は新資源、新エネルギーとしてこの多量に存する
セルロースが注目されるようになり、それにとも
なつてセルロースを分解して有用物質を生産する
ためのセルラーゼの需要が急速に高まりつつあ
る。

本発明者らはこのようなセルラーゼの開発を目
的として種々検討の結果、フミコーラ属に属する
新規な微生物が、耐熱性であつてセルロース分解
活性が高く結晶度の高いセルロースをも強力に分
解するセルラーゼを生産することを見出し、これ
に基いて本発明を完成するに至つた。

すなわち本発明は、新菌種であるフミコーラ・
サーモセルロリチカを培養し、培養物からセルラ
ーゼを採取することを特徴とするセルラーゼの製
造法に関するものである。

本発明の方法に用いるフミコーラ・サーモセル
ロリチカAJ117115の菌学的性質を以下に示す。
なお、本菌は微工研寄託受理番号第7036号として
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。

(1) 各種培地における生育状態（50℃） 麦芽エキス寒天培地 生育は速かであり、３日目には直径30mmに達
する。コロニーは綿毛状で灰黒色となり、裏面
も同様の色調を呈した。

バレイシヨ・ブドウ糖寒天培地 生育は速かであり、３日目には直径40mmに達
する。コロニーは綿毛状で灰黒色となり、裏面
も同様の色調を呈した。

サブロー寒天培地 生育は速かであり、３日目には直径25mmに達
する。コロニーは綿毛状で暗緑色ないし灰黒色
を呈し、裏面は中心部が黒色そして周辺部が灰
色ないし灰白色となる。

(2) 顕微鏡観察による特徴 菌糸は無色であり、幅は２〜4μmで隔壁を有
し、滑面である。

胞子はアレウロ型であり、胞子柄の頂端に単生
する。最初は透明で次第に茶灰色ないし暗い茶色
又は暗オリーブ色になる。一般に球形ないしやや
亜球形で直径は８〜12μm。表面は平滑。介在性
の胞子及び厚膜胞子は認められない。

アレウロ型胞子柄には通常分枝はない。隔壁あ
り。初期には無色又はうす茶色を呈し、成熟とと
もに暗オリーブ色になる。

(3) 生理的性質（麦芽エキス培地） 最適生育条件 pH5.5〜6.5、温度45〜50℃ 生育の範囲 pH3.0〜7.0、温度30〜55℃ 本発明者らは、以上の菌学的性質のうち特に本
菌がアレウロ型の胞子を形成する等の性質を、
「イラストレイテツド・ジエネラ・オブ・インパ
ーフエクト・フアンジ（Illustrated Genera of
Imperfect Fungi）」及びコンペデイウム・オ
ブ・ソイル・フアンジ（Compendium of Soil
Fungi）第１巻」の記載と比較検討し、本菌がフ
ミコーラ属に属するものと認定した。さらに、オ
ルガ・フアサチオバ（OlgaFassatiova）がセス
カ・マイコロギー（Ceska Myko−logie）、第21
巻、第78〜89頁（1976年）の中で示したキー
（key）により本菌の分類学的位置の検索を試み
た。菌糸が無色であること、アレウロ型胞子が
12μm以下であること等の性質が本菌と一致する
ものには、フミコーラ・フスコアトラ・バル・フ
スコアトラ（Humicol fuscoatra var.
fuscoatra）、同ロンギスポラ（H.longispora）及
び同インソレンス（H.insolens）の３種がある。
しかしながら、フスコアトラ・バル・フスコアト
ラは至適生育温度が室温である点及び楕円形のア
レウロ型胞子が存在する点等において本菌と異な
り、ロンギスポラはやはり生育至適温度が室温で
ある点及び厚膜胞子を形成する点で本菌と異な
る。また、インソレンスはアレウロ型胞子のうち
長くのびたものが存在する点、胞子の色が比較的
うす茶色である点及び介在性の胞子が存在する点
で本菌と明らかに異なる。そこで、本発明者ら
は、本菌をフミコーラ属に属する新菌と認定し、
フミコーラ・サーモセルロリチカ（Humicola
thermocellulolytica）と命名した。

このフミコーラ・サーモセルロリチカを培養す
る培地の炭素源にはセルロースを含有する物質を
用いる。セルロースを含有する物質であれば特に
制限されるものではないが、例えばセルロースパ
ウダー、紙片、アルカリ処理バガス等を炭素源
として用いうる。窒素源としては、無機物、有機
物のいずれであつてもよいが、ペプトン、蛋白加
水分解物等が特に好ましい。炭素源及び窒素源以
外の培地成分としては無機塩類を適宜添加する。
このような培地は加熱殺菌等によつて殺菌してか
ら使用する。

培養方法は常法によればよく、例えば40〜50
℃、pH5.5〜6.5に保ちながら好気的条件下で培養
を続ける。培養時間はセルラーゼが充分に蓄積さ
れるまでであり、通常３〜７日間程度である。

培養終了後は、培養液から菌体を分離して上清
をそのまま酵素液として用いてもよく、硫安塩析
等の酵素を精製する常法によつて更に精製してか
ら用いてもよい。

実施例で得られたセルラーゼの作用pH特性は
第１図に示す通りであり、作用温度特性は第２図
に示す通りである。図から明らかなように、本酵
素の作用至適pHは5.5であり、至適温度は60℃で
ある。また、各pHで５℃24時間後残存活性を測
定して求めたpH安定性は第３図に示す通りであ
り、各温度でpH6のリン酸緩衝液中で10分間処理
後の残存活性を測定して求めた温度安定性は第４
図に示す通りである。

第４図から明らかなように、本酵素は、60℃で
10分間加熱処理しても全く失活せず、また、70℃
で10分間加熱処理した場合にも95％の活性が残存
するといういわゆる耐熱性酵素である。本酵素を
例えば従来フミコーラ属の産生するセルラーゼの
うちで最も熱に安定であるといわれているフミコ
ーラ・インソレンスのセルラーゼと比較しても熱
安定性で10℃以上、そして至適作用温度で10℃本
酵素のほうが高い。

本酵素は、結晶度の高いセルロース、例えばセ
ルロースパウダー（ワツトマン社製、CC−41）
やアビセルをも分解してグルコースを効率よく生
成することができ、この点においても従来のフミ
コーラ・グリセア等の産生するセルラーゼと異な
り、すぐれている。

セルロースパウダーに対する分解活性（棒グラ
フ斜線入）及びグルコースの生成活性（棒グラフ
点入）をトリコデルマ属の産生したセルラーゼ
（メイセラーゼ）及びアスペルヂルス属の産生し
たセルラーゼのそれらと比較した結果を第５図に
示す。

なお、測定方法は次の通りである。

セルロースパウダの分解活性 0.5％のセルロースパウダーを含み各酵素の至
適pHに調整した0.1M酢酸緩衝液５mlに、各酵素
をその蛋白濃度が0.5％になるように添加し、各
酵素の至適温度下で振盪しながら反応させた。１
時間後に反応液の比濁を610nmの波長で測定し、
反応開始時の比濁からの減少量（ΔOD₆₁₀）をも
つて活性とした。

グルコース生成活性 上記の分解活性の測定方法と同様にして反応さ
せた反応液100mlのグルコース含量（ｇ）をグル
コースオキシダーゼを用いて常法により測定し、
グルコース生成活性とした。

以下、実施例を示す。

実施例 セルロースパウダー（CC−41） 40g／ KH₂PO₄ 2g／ 硫 安 3g／ ペプトン 10g／ MgSO₄・7H₂O 0.9g／ CaCl₂・2H₂O 0.9g／ 尿 素 0.3g／ Tween80 2g／ ZnSO₄・7H₂O 15mg／ FeSO₄・7H₂O ５mg／ CoCl₂・6H₂O 200μg／ MnSO₄・4H₂O 100μg／ pH6.0 上記の組成の培地50mlを500ml（容肩付コルベ
ンに入れ、120℃で15分間加熱殺菌を行なつた。
室温まで放冷後、バレイシヨ・ブドウ糖寒天培地
のスラント上で生育させたフミコーラ・サーモセ
ルロリチカAJ117115FERM−P7036の胞子を無
菌水５mlに懸濁させ、全量を前述の培地に植菌し
た。45℃にて４日間振盪培養（振幅７cm、振盪数
120回／分）した後、培養液の菌体を遠心分離し
て37mlの上清液を酵素液として得た。

本酵素液には0.6％の酵素蛋白が含まれており、
この酵素液を用いて上質紙、紙片（亜洋紙No.
２）及びセルロースパウダーCC−41を48時間糖
化したところ下表に示すような結果が得られた。

基質 基質濃度 生成糖濃度 上質紙 20g／ 14g／ 紙片 20g／ 12g／ セルロースパウダー 20g／ 10g／

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の活性とpHとの関係を示す図
であり、第２図は温度との関係を示す図である。
第３図はpH安定性を、そして、第４図は温度安
定性をそれぞれ示す図である。また、第５図は本
酵素及び市販の酵素についてセルロースパウダー
分解活性及びグルコース生成活性を測定した結果
を示すものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ フミコーラ・サーモセルロリチカを培養し、
   培養物からセルラーゼを採取することを特徴とす
   るセルラーゼの製造法。