JPH0361676B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新抗生物質RK−1339物質及びその
製造法に関するものである。

更に詳しくは、本発明はストレプトミセス
（Streptomyces）属に属する抗生物質RK−1339
物質生産菌を培養して得られる培養物より新抗生
物質RK−1339物質を分離、採取することを特徴
とする新抗生物質RK−1339物質の製造法及び該
抗生物質RK−1339物質に係るものであり、前記
RK−1339物質は既知文献未載の新規物質であ
る。

本発明者らは、吉田肉腫細胞（Yoshida sarco
−ma cells）に対して細胞変性作用を示す新規
活性物質の探索を目的として多数の土壌中より微
生物を分離し、その産生する二次代謝物質を分
離、探索した結果、ストレプトミセス属に属する
微生物の培養液中に文献未載の新規活性物質が産
生、蓄積されることの新たな知見を得て、ここに
本発明を完成するに至つた。

以下に、本発明の新抗生物質RK−1339物質及
びその製造法について詳述する。

本発明方法において用いる微生物は、新抗生物
質RK−1339物質の生産能を有するストレプトミ
セス属に属する菌種である。

その一例として、ストレプトミセス・エスピ
ー・RK−1339（（Streptomyces sp.RK−1339）
（以下、単に「RK−1339株」という。）と呼称さ
れる微生物が前記の特性を有する新菌株で、本発
明の新抗生物質RK−1339物質を有利に生産する
ものであり、本発明方法に有効に利用し得る微生
物として挙げられる。

また、前記ストレプトミセス・エスピー・RK
−1339の自然的及び人工的変異株は勿論、ストレ
プトミセス属に属する菌種で、後述の新抗生物質
RK−1339物質（以下、単に「RK−1339物質」
という。）の生産能を有する微生物は、すべて本
発明方法において使用することができる。

RK−1339株は本発明者により、岩手県宮古市
で採取した土壌試料中より発見されたストレプト
ミセス属に属する土壌放線菌であり、工業技術院
微生物工業技術研究所に昭和58年２月26日に寄託
され、その微生物受託番号は、微工研菌寄第6934
号（FERM Ｐ−6934）である。RK−1339株の
菌学的性質は次の通りである。

（） 形態的特徴 RK−1339株はストレプトミセス属に属し、ス
ターチ無機寒天培地、チロシン寒天培地、イース
ト麦芽寒天培地、オートミール寒天培地上で豊富
な気中菌糸の生育と共に良好な発育をする。シユ
ークロース硝酸塩寒天培地、グルコースアスパラ
ギン寒天培地、ペプトンイースト鉄寒天培地上で
の気中菌糸の発育は不良か又はないが、基底菌糸
は良好に生育する。グリセロールアスパラギン寒
天培地、栄養寒天培地上の発育はやや不良で気中
菌糸の発育も充分でない。検査対象の炭素源に対
しては全て生育するがＬ−アラビノースで発育が
若干悪い。気中菌糸は全般に灰白色で、可溶性色
素の生成は少ない。気中菌糸の光学顕微鏡観察で
は分枝は不規則に分枝し、その先端に約1μmの胞
子鎖を形成する。胞子は楕円形状で数十個がつら
なる。スターチ無機寒天培地に生育したものは菌
糸先端がカール状である。

（） 各種培地上での生育状態 特許庁産業別審査基準に従い、各種培地を調製
し、接種後３週間後に観察した結果を次に記載す
る。尚色調の記載に於て（ ）内の記号はデイス
クリプテイプ・カラー・ネームズ・デイクシヨナ
リー（Descriptive Color names dictionary）
第４版の色名記号に従つたものである。

１ シユークロース硝酸塩寒天培地 生 育 ：普通 気中菌糸の着性 ：なし 気中菌糸の色 ：不明 基底菌糸の色 ：（6nｇインデイアンレツド） 可溶性色素 ：（6ieレツドウツド）生成は少な
い。

２ グルコース・アスパラギン寒天培地 生 育 ：やや不良 気中菌糸の着生 ：不良、わずかに着生がみら
れる。

気中菌糸の色 ：（3cbサンド） 基底菌糸の色 ：（3neトパーズ） 可溶性色素 ：（３ｇｃライトタン）生成は少
ない。

３ グリセロール・アスパラギン寒天培地 生 育 ：やや不良 気中菌糸の着生：やや不良 気中菌糸の色 ：（4ecベイジユ） 基底菌糸の色 ：（3ieキヤメル） 可溶性色素 ：なし ４ スターチ無機塩寒天培地 生 育 ：良好 気中菌糸の着性：豊富 気中菌糸の色 ：（3cbサンド） 基底菌糸の色 ：（3eaライナメロンイエロー） 可溶性色素 ：なし ５ チロシン寒天培地 生 育 ：良好 気中菌糸の着生：豊富 気中菌糸の色 ：（ｃライトグレー） 基底菌糸の色 ：（3caシエル） 可溶性色素 ：なし ６ 栄養寒天培地 生 育 ：やや不良 気中菌糸の着生 ：なし 気中菌糸の色 ：不明 基底菌糸の色 ：（3caシエル） 可溶性色素 ：なし ７ イースト麦芽寒天培地 生 育 ：良好 気中菌糸の着生 ：豊富 気中菌糸の色 ：（ｄグレー） 基底菌糸の色 ：（3ieキヤメル） 可溶性色素 ：（3icライトアンバー）生成は少
ない。

８ オートミール寒天培地 生 育 ：良好 気中菌糸の着生：豊富 気中菌糸の色 ：（ｂオイスターホワイト） 基底菌糸の色 ：（3ieキヤメル） 可溶性色素 ：なし ９ ペプトン・イースト鉄寒天培地 生 育 ：普通 気中菌糸の着生 ：なし 気中菌糸の色 ：不明 基底菌糸の色 ：（2eaライトメイズ） 可溶性色素 ：なし （） 炭素源の資化性（プリドハム・ゴツトリ
ーブ寒天培地） １ Ｌ−アラビノース ＋ ２ Ｄ−キシロース ＋＋＋ ３ Ｄ−グルコース ＋＋＋ ４ Ｄ−フラクトース ＋＋＋ ５ シユークロス ＋＋＋ ６ イノシトール ＋＋ ７ Ｌ−ラムノース ＋＋＋ ８ ラフイノース ＋＋＋ ９ Ｄ−マンニツト ＋＋＋ ＋ ： 利用する。

＋＋： よく利用する。

＋＋＋：非常によく利用する。

（） 生理的性質 １ 至適生育温度 27−30℃ ２ ゼラチンの液化（グルコース・ペプトンゼラ
チン培地上） なし ３ スターチの加水分解（スターチ寒天培地上）
分解する。

４ 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化 なし ５ メラニン様色素の生成（チロシン寒天培地及
びペプトンイースト鉄寒天培地上） なし 上記の諸性質を有するRK−1339株を野々村氏
によるジヤーナル・オブ・フアーメンテイシヨ
ン・テクノロジー52巻２号記載の放線菌l.S.P.458
菌種の分類法の記載（キイ・フオア・クラシイフ
イケイシヨン・アンド・アイデンテイフイケイシ
ヨン・オブ・458スペシス・オブ・ザ・ストレプ
トミセス・インクル−デツド・インl.S.P）（Key
for classification and identification of
458species of streptomyces included in l.S.P.）
により探索すると、気中菌糸が、白から灰色を
呈する点、メラノイド色素を生成しない点、
菌の裏が特徴的な色を呈さない点、可溶性色素
を生成しない点、胞子がスムースである点及び
糖をすべて利用する点、等の特徴を有すること
から、RK−1339株は、ストレプトミセス・スク
レロテイアラス（Streptomyces sclerotialus）、
ストレプトミセス・カルブス（Streptomyces
calvus）、ストレプトミセス・グラミノフアシエ
ンス（Streptomyces graminofaciens）に近緑の
一菌種と考えられる。

次に、本発明を実施するに当つては、ストレプ
トミセス属に属する抗生物質RK−1339物質生産
菌を、抗生物質を生産する通常の方法で培養する
ことができる。培養の形態は、液体培養でも固体
培養でもよく、工業的に有利に培養するために
は、前記生産菌の胞子懸濁液又は培養液を培地に
接種し、通気撹拌培養を行えばよい。

培地の栄養源としては特に限定されることはな
く、微生物の培養に通常用いられる炭素源、窒素
源その他を培地中に含有させることができる。炭
素源としては、殿粉、デキストリン、グリセリ
ン、グルコース、シユークロース、ガラクトー
ス、イノシトール、マンニトールなどが、また窒
素源としてはペプトン、大豆粉、肉エキス、米ぬ
か、〓、尿素、コーンステイープリカー、アンモ
ニウメム塩、硝酸塩、その他の有機または無機の
窒素化合物が用いられる。その他、無機塩類、た
とえば、食塩、燐酸塩類、カリウム、カルシウ
ム、亜鉛、マンガン、鉄等の金属塩類等を適宜に
添加してもよく、必要に応じて消泡剤として、
動・植・鉱物油等を添加してもよい。培養温度、
培養時間等の培養条件は使用菌の発育に適し、し
かもRK−1339物質の生産が最高となるような条
件が選ばれる。たとえば培地のPHは４〜９、特に
中性付近がよく、培養の適温は25°〜35℃程度が
よい。

しかし、これらの培養組成物、培地の水素イオ
ン濃度、培養温度、撹拌条件などの培養条件は使
用する菌株の種類や、外部の条件などに応じて好
ましい結果が得られるように適宜調節されるべき
であることはいうまでもない。このようにして得
られる培養物からRK−1339物質を得るには、代
謝産物を採取するのに通常用いられる手段を適宜
に利用し得る。たとえば、RK−1339物質と不純
物との溶解度差を利用する手段、吸着親和力の差
を利用する手段のいずれも、それぞれ単独で、ま
たは組合わせて、あるいは反復して使用される。
具体的には、培養液を遠心分離により上清及び菌
体に分ける。上清は酢酸エチル等により抽出す
る。一方菌体は、含水アセトン等で撹拌抽出し、
次いで過、減圧濃縮して得た水溶液を酢酸エチ
ル等で抽出する。両抽出液を合わせ、水洗、乾燥
後、減圧乾固してシロツプ状物質を得る。得られ
た粗物質は、更にシリカゲル、セルロース等への
吸着性を利用して、これらの吸着剤を用いたカラ
ムクロマトグラフイーに付し、活性区分を集めて
減圧濃縮してシロツプ状物質を得る。最終的な精
製は、Nucleosil5C18等を用いた高速液体クロマ
トグラフイーにより行い、活性ピーク部分を集
め、濃縮、抽出、粉末化して純粋なRK−1339物
質を得ることができる。

かくして得られたRK−1339物質の理化学的及
び生物学的性状は通の通りである。

〔RK−1339物質の理化学的性質及び生物学的性
状〕 (1) 元素分析値 炭素：66.38％，水素：9.68％ 窒素：1.52％ (2) 分子量（FDマススペクトルによる） 907 (3) 融点 88〜91℃ (4) 比旋光度 〔α〕²³ _D−28.6゜（ｃ＝0.5，メタノール） (5) 紫外線吸収スペクトル 第１図に示す通り、メタノール中、256mμに
ε12510の吸収を示す。

(6) 赤外線吸収スペクトル 第２図に示すとおり、臭化カリ錠剤中で次の主
な極大値を示す。

3400，2920，1714，1670，1558，1460，1380，
1260，1148，1130，1090，1078，1055，1003，
975cm^-1 (7) ¹³C−核磁気共鳴スペクトル CD₂Cl₂中で、第３図のスペクトルを示す。

(8) 溶解性 メタノール、クロロホルム、ベンゼン、酢酸エ
チルに可溶、水、ヘキサンに難溶 (9) 呈色反応 過マンガン酸カリ、沃素、アニスアルデヒド−
硫酸反応陽性、ニンヒドリン、アンスロン反応陰
性である。

(10) 塩基性、中性、酸性の区別 塩基性物質である。

物質の色、 無色粉末 生物活性 吉田肉腫細胞（Yoshida sarcoma cells）に対
し0.01〜10mcｇ／mlの濃度で細胞変性作用を示
す。クロレラ・ブルガリス（Chlorella
Vulgaris）に対し0.1〜3.12mcｇ／ml濃度で生育
の部分阻害を示し、6.25〜100mcｇ／mlで完全阻
害する。

以上のRK−1339物質の理化学的性質及び生物
学的性質を、既知の抗生物質と比較すると、吉田
肉腫細胞及びクロレラに対して特異的活性を示す
点において、更に上述の理化学的性状において一
致する物質を見出せないので、RK−1339物質
は、新規物質であると結論された。RK−1339物
質は、吉田肉腫細胞に対して細胞変性作用を示す
ところから、抗腫瘍剤としての利用が期待され
る。

以下に、本発明を実施例によつて詳述するが、
本発明は、何らこれに限定されるものではない。

実施例 グルコース２％、可溶性殿粉１％、肉エキス１
％、乾燥酵母0.4％、食塩0.2％、、第二燐酸カリ
0.005％、大豆粉2.5％よりなる培地に前記RK−
1339株〔微生物受託番号微工研菌寄6934号
（FERM Ｐ−6934）を接種して96時間28℃で振
盪培養する。

培養終了後、培養液２を遠心分離により菌体
と上清に分ける。上清は酢酸エチル２で一回抽
出する。菌体は２の80％アセトンで撹拌抽出
し、過後、減圧濃縮して得た水溶液を１の酢
酸エチルで抽出する。両醋酸エチル層を合し、水
洗後、芒硝で脱水し、減圧乾固して粗シラツプを
得る。これをベンゼン−酢酸エチル（７：１）の
溶剤系を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフ
イーを行う（カラムサイズ：２×70cm）。溶出液
を分取し、クロレラに対する活性区分を集めて減
圧濃縮してシラツプを得る。最終的な精製は
Nucleosil5C₁₈（２×30cm）のカラムを用いて高速
液体クロマトグラフイーによる分取を行つた。１
％ジエチルアミン−ギ酸緩衝液（PH6.0）−60％ア
セトニトリル−メタノール（１：６：３）よりな
る溶剤系を用いて溶出を行い、保持時間50分のと
ころに溶出する活性ピークを分取した。この区分
を濃縮して得た無色の油状物質を熱ヘキサンで抽
出し、これを濃縮するとRK−1339物質30mgが白
色粉末として得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、RK−1339物質のメタノール中の紫
外線吸収スペクトルを示す図面であり、第２図
は、RK−1339物質のKBr錠剤中の赤外線吸収ス
ペクトルを示す図面であり、第３図は、RK−
1339物質のCD₂Cl₂中の¹³C−核磁気共鳴スペクト
ルを示す図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質及び生物学的性質を有す
   ることを特徴とする新抗生物質RK−1339物質。 (1) 元素分析値 炭素：66.38％、水素：9.68％、 窒素：1.52％ (2) 分子量（FDマススペクトルによる）907 (3) 融点 88〜91℃ (4) 比旋光度 〔α〕²³ _D−28.6゜（ｃ＝0.5、メタノール） (5) 紫外線吸収スペクトル メタノール中256mμにε12510の吸収を示す。 (6) 赤外線吸収スペクトル （臭化カリ錠剤中の主な極大値） 3400、2920、1714、1670、1558、1460、1380、
   1260、1148、1130、1090、1078、1055、1003、
   975（cm^-1） (7) 溶解性 メタノール、酢酸エチル、クロロホルム、ベン
   ゼンに可溶、水、ヘキサンに難溶 (8) 呈色反応 過マンガン酸カリ、沃素、アニスアルデヒド−
   硫酸反応は陽性、ニンヒドリン、アンスロン反応
   は陰性である。 (9) 塩基性、酸性、中性の区別 塩基性物質 (10) 物質の色 無色粉末 (11) 生物活性 吉田肉腫細胞に対し、細胞変性作用を示し、ク
   ロレラ・ブルガリスに対し、生育阻害作用を示
   す。 ２ ストレプトミセス（Streptomyces）属に属
   する抗生物質RK−1339物質生産菌を培養し、そ
   の培養物から新抗生物質RK−1339物質を分離、
   採取することを特徴とする新抗生物質RK−1339
   物質の製造法。 ３ ストレプトミセス（Streptomyces）属に属
   する抗生物質RK−1339物質生産菌がストレプト
   ミセス・エスピー・RK−1339 （Streptomyces sp.RK−1339）である特許請求
   の範囲第２項記載の製造法。