JPH0365157B2 - - Google Patents
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- JPH0365157B2 JPH0365157B2 JP57129370A JP12937082A JPH0365157B2 JP H0365157 B2 JPH0365157 B2 JP H0365157B2 JP 57129370 A JP57129370 A JP 57129370A JP 12937082 A JP12937082 A JP 12937082A JP H0365157 B2 JPH0365157 B2 JP H0365157B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
- C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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Description
本発明はダウノマイシン（別名ダウノルビシ
ン）と命名された抗癌性抗生物質を製造する新し
い方法に関し、更に詳しくは、ストレプトミセス
属に属するダウノマイシン並びにバウマイシンＡ
又はＢを同時に生産する微生物に由来し、バウマ
イシンＡ又はＢの生産能が欠失したダウノマイシ
ンを生産する能力を有する変異菌株を栄養培地で
培養し、該培養物からダウノマイシンを採取する
ことを特徴とする、ダウノマイシンの製造方法を
提供するものである。 次式 で示されるダウノマイシンは、アントラサイクリ
ン系抗生物質に属し、癌化学療法上、重要な臨床
用制癌剤の１つで、特に急性白血病の治療には不
可欠の薬剤である。 本物質の製造に関しては、ストレプトミセス
ピユセテイウス（Streptomyces peucetius）N.
C.I.B、9475を培養することにより取得する方法
（特公昭44−18913号公報参照）、ストレプトミセ
ス コエルレオルビダス（Streptomyces
coeruleorubidus）NRRL 3045及びNRRL 3046
を培養し、得られる抗生物質コンプレツクスを酸
処理により有効に変換し取得する方法（特公昭45
−24961号公報参照）、ストレプトミセス グリセ
ウス バラエテイ ルビドフアシエンス
（Streptomyces griseus var.rubidofaciens）DS
32041を培養することにより取得する方法（特公
昭50−15880号公報参照）及びストレプトミセス
ビフアルカス（Streptomyces bifurcus）DS
23219を培養する方法（特公昭52−18279号公報参
照）が知られている。 しかしながら、ダウノマイシン生産菌として認
められているストレプトミセス コエルレオルビ
ダス（Streptomyces coeruleorubidus）の一菌
株ME130−A4によるバウマイシン類の生産（特
公昭56−20319号公報及びJ.Antibiotics 30，619
−621，622−624，1977）で明らかにされた様に、
上記特許公報に記載のダウノマイシン生産菌は本
来発酵プロス中に最終生産物としてダウノマイシ
ンを生産蓄積すると同時にダウノマイシンのダウ
ノサミンＣ−4′位に更に中性糖様物質の結合した
次式 式中、Ｒは基
ン）と命名された抗癌性抗生物質を製造する新し
い方法に関し、更に詳しくは、ストレプトミセス
属に属するダウノマイシン並びにバウマイシンＡ
又はＢを同時に生産する微生物に由来し、バウマ
イシンＡ又はＢの生産能が欠失したダウノマイシ
ンを生産する能力を有する変異菌株を栄養培地で
培養し、該培養物からダウノマイシンを採取する
ことを特徴とする、ダウノマイシンの製造方法を
提供するものである。 次式 で示されるダウノマイシンは、アントラサイクリ
ン系抗生物質に属し、癌化学療法上、重要な臨床
用制癌剤の１つで、特に急性白血病の治療には不
可欠の薬剤である。 本物質の製造に関しては、ストレプトミセス
ピユセテイウス（Streptomyces peucetius）N.
C.I.B、9475を培養することにより取得する方法
（特公昭44−18913号公報参照）、ストレプトミセ
ス コエルレオルビダス（Streptomyces
coeruleorubidus）NRRL 3045及びNRRL 3046
を培養し、得られる抗生物質コンプレツクスを酸
処理により有効に変換し取得する方法（特公昭45
−24961号公報参照）、ストレプトミセス グリセ
ウス バラエテイ ルビドフアシエンス
（Streptomyces griseus var.rubidofaciens）DS
32041を培養することにより取得する方法（特公
昭50−15880号公報参照）及びストレプトミセス
ビフアルカス（Streptomyces bifurcus）DS
23219を培養する方法（特公昭52−18279号公報参
照）が知られている。 しかしながら、ダウノマイシン生産菌として認
められているストレプトミセス コエルレオルビ
ダス（Streptomyces coeruleorubidus）の一菌
株ME130−A4によるバウマイシン類の生産（特
公昭56−20319号公報及びJ.Antibiotics 30，619
−621，622−624，1977）で明らかにされた様に、
上記特許公報に記載のダウノマイシン生産菌は本
来発酵プロス中に最終生産物としてダウノマイシ
ンを生産蓄積すると同時にダウノマイシンのダウ
ノサミンＣ−4′位に更に中性糖様物質の結合した
次式 式中、Ｒは基
【式】（バウマイシン
Ａ）又は基
【式】（バウマイシンＢ）
を表わす。
で示されるバウマイシンＡ又はＢを生産蓄積する
性質を有している。従つて、これらの発酵ブロス
よりダウノマイシンを有効に取得するためには、
発酵ブロスを強い酸性下（PH2.0以下）で抽出乃
至は更に熱処理（例えば特公昭45−24961号公報
参照）することにより、Ｃ−4′位に結合している
中性糖を離脱させダウノマイシンに変換せしめる
必要がある。本操作は上記のいずれの特許公報等
にも明記されている基本的操作である。なお、バ
ウマイシン類に結合しているのと全く同一の中性
糖によるダウノサミンＣ−4′位の修飾は、カルミ
ノマイシン生産菌株（J.Antibiotics 27，254，
34，774）でも明らかにされており、ダウノマイ
シン、カルミノマイシンなど同一群に属するアン
トラサイクリン抗生物質生産菌株に共通した特徴
といえる。 本発明者らは、バウマイシン類がダウノマイシ
ンより生合成されることを明らかにしており、
（例えばJ.Antibiotics，33，1158）これらの知見
に従い生合成経路上の一点、即ちダウノマイシン
に中性糖を結合せしめる酵素反応を欠失した変異
菌株を選別単離することにより、ダウノマイシン
類縁化合物を生産することなくダウノマイシンを
直接最終生産物として蓄積、取得することが可能
であるとの考えに基いて鋭意研究した結果、ダウ
ノマイシン及びバウマイシンの生産菌ストレプト
ミセス コエルレオルビダス（Streptomyces
coeruleorubidus）ME130−A4（微工研菌寄第
3540号及びATCC 31276）の変異処理により、バ
ウマイシン類を全く生産せずに、それらの前駆体
であるダウノマイシンを生産するように変化した
目的の変異菌株の単離に成功した。 本菌株の如き性質を有する変異株の単離につい
ては、今までまだ報告されておらず、本発明者ら
により初めて取得されたものである。 しかして、本発明によれば、ダウノマイシン並
びにバウマイシンＡ又はＢを同時に生産する微生
物としては、前記ストレプトミセス8899、ストレ
プトミセス ピユセテイウス、ストレプトミセス
グリセウス バライエテイ ルビドフアシエン
スDS 32041、ストレプトミセス ビフアーカス
DS 23219若しくはストレプトミセス コエル
レオルビダスME130−A4又はそれらの変異菌株
を挙げることができるが、これらの菌株以外でも
ダウノマイシン並びにバウマイシンＡ又はＢを同
時に生産するストレプトミセス属に属する微生物
であれば、いずれも本発明に用いられるバウマイ
シンＡ又はＢの生産能が欠失したダウノマイシン
を生産する能力を有する変異菌株の親菌株として
用いることができる。これらのうち、本発明にお
いて好適に用いられるものとしては、ストレプト
ミセス コエルレオルビダスME130−A4（微工研
菌寄第3540号及びATCC 31276）及びこれに近似
するストレプトミセス8899（NRRL 3046）が挙
げられる。 また、バウマイシンＡ又はＢの生産能が欠失し
たダウノマイシンを生産する変異菌株としては上
記ストレプトミセス属に属する微生物に由来する
もので、ダウノマイシン並びにバウマイシンＡ又
はＢを同時に生産する菌株の変異によつて得られ
るバウマイシンＡ又はＢの生産能が欠失したダウ
ノマイシンを生産する菌株が全て含まれるが、好
適なものとしては、前記ME130−A4菌株を変異
処理することによつて得られるストレプトミセス
コエルレオルビダス3T−373菌株を挙げること
ができる。 本発明の目的に適する変異菌株を単離するに
は、ダウノマイシン並びにバウマイシンＡ又はＢ
を同時に生産することが知られている前述の菌株
をそれ自体公知である通常の変異処理により取得
することが出来る。その一例を示せば、ストレプ
トミセス コエルレオルビダスME130−A4菌株
をYS寒天（0.3％酵母エキス、１％可溶性デンプ
ン、1.5％寒天、PH7.2）斜面に接種し、一週間28
℃で培養する。着生する胞子をエーゼにてかき集
め、５mlの無菌0.1Mトリスー１ｍＭ EDTA緩
衝液（PH8.5）に採り、超音波処理（Tomy
Seiko，Ultrasonic Disruptor，model UR−
200Pで15秒間）を行い、次いで無菌脱脂綿をパ
ツクした小ガラス管（φ1.2×2.0cm）を通過させ、
ほぼ純粋な均一胞子液4.5mlを得る。これに10
mg／ml濃度のＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン（NTG）水溶液を0.5ml添加
し、ゆるやかに振盪しながら28℃で60分間変異処
理を行う。この時点での殺菌率は92.6％であつ
た。処理後、無菌生理食塩水で適当に希釈し、そ
の0.1mlをYS寒天（前出）をプレートし固化させ
たシヤレー平板上に塗布し、28℃で５日間培養す
る。生じるコロニーをYS寒天斜面（前出）に単
離し、培養して以下の方法によりダウノマイシン
生産性を検する。 まず以下に示す種母用培地４mlを分注滅菌した
試験管に、上記単離菌株を一白金耳接種し、28℃
で２日間、往復振盪培養する。 種母用培地 可溶性デンプン 0.5％ グルコース 0.5％ エスサンミート（味の素社製、大豆粉） 1.0％ 酵母エキス 0.1％ NaCl 0.1％ K2HPO4 0.1％ MgSO4・7H2O 0.1％ 水道水 PH7.4 次いで下記の本培養培地20mlを分注滅菌した
250−ml容三角フラスコに全量接種し、28℃で７
日間、ロータリーシエカー上で振盪培養する。 本培養培地 台湾酵母 ５％ 酵母エキス 0.3％ 可溶性デンプン 7.5％ NaCl 0.2％ CaCO3 0.3％ ミネラル＊ 0.125％ 水道水 PH8.0 ＊CuSO4・5H2O 2.8ｇ，FeSO4・7H2O 0.4ｇ，
MnCl2・4H2O 3.2ｇ，ZnSO4・7H2O 0.8ｇを
蒸溜水500mlに溶解したもの。 各培養フラスコより、ブロス１mlをサンプリン
グし、これにアセトン２mlを加え、サーモミキサ
ーにて攪拌し生成物を液層に抽出する。遠心処理
により上澄と菌体に分ち、上澄区分の20μをシ
リカゲル薄層（メルク社製、F254）の下端より２
cmの位置に１cm間隔でスポツトし、クロロホル
ム／メタノール／水／酢酸（80／20／２／0.2）
で展開し、ダウノマイシン標準品と比較する。親
菌株及び変異処理の大部分はバウマイシン類
（A1，A2，B1，B2等）及びアグリコン類から成
る、多数の赤橙色のスポツトを与えるが、本発明
のダウノマイシン生産性変異株では僅かにジヒド
ロダウノマイシンの微少スポツトを認めるが、ダ
ウノマイシン以外のアントラサイクリングリコシ
ドのスポツトは検出されない。 以上の方法により、本発明の目的に適する変異
菌株はおよそ変異処理コロニー5000菌株中、１個
の割合で取得された。 かくして得られる菌株の一つであるストレプト
ミセス コエルレオルビダス3T−373株の菌学的
性状を下記に示す。 １ 形態 3T−373株は分枝した基中菌糸より直線状あ
るいは鉤状の気菌糸を形成し、輪生枝は見られ
ない。成熟胞子鎖は10ケ以上で、胞子の大きさ
は0.4〜0.8×1.2〜2.0ミクロン位で、胞子の表
面は殆んど平滑である。時に一部の胞子の表面
に刺状突起の痕跡様の突起が僅かに認められる
事がある。 ２ 各種培地における成育状態 (1) シユークローズ・硝酸塩寒天培地（28℃培
養） うすだいだい或はにぶだいだい、ないしは
明るい茶（4ea〜4gc）の発育上に、灰黄味
ピンク（5cd）の気菌糸を着生し、溶解性色
素の生成は殆んど認められない。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地（28℃
培養） 灰黄或は明るいオレンジ黄、ないしはうす
だいだい（3ee〜3ea〜4ea）の発育をなす。 気菌糸は殆んど形成されず、溶解性色素も
殆んど生成されない。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP
−培地５、28℃） うすだいだい（4ea）或はだいだい、ない
しは暗いだいだいの発育上に灰黄味ピンク
（5cb）の気菌糸を着生し、溶解性色素は僅
かにだいだい色を帯びる。 (4) 無機塩・スターチ寒天培地（ISP−培地
４、28℃） 明るい橙黄或はうすだいだい（3ea〜
4ea）、ないしは赤味だいだいの発育上に、
灰黄味ピンク（5cb）の気菌糸を着生し、溶
解性色素はピンクを、或は僅かにピンク色を
帯びる。 (5) チロジン寒天培地（ISP−培地７、28℃） うすだいだい（4ea）或は黄茶、ないしは
赤味だいだいの発育上に、紫を帯びた白
（13ba）ないし灰黄味ピンク（5cb）の気菌
糸を着生し、溶解性色素は殆んど認められな
い。培養長期（約20日）に及ぶとだいだい色
を帯びる。 (6) 栄養寒天培地（28℃培養） 赤ないし暗い赤の発育上に、灰黄味ピンク
（5cb）ないし極うすい紫（11ca）の気菌糸
を着生し、溶解性色素はピンク色を帯びる。 (7) イースト・麦芽寒天培地（ISP−培地２、
28℃） にぶだいだい（4gc）或は黄茶、ないしは
赤味茶の発育上に灰黄味ピンク（5cb）の気
菌糸をはじめはうつすらと、培養後14日目頃
より豊富に着生し、溶解性色素はだいだい色
を僅かに帯びる。 (8) オートミル寒天培地（ISP−培地、28℃） 明るい赤茶（5gc）或は赤茶、ないしは茶
の発育上に灰黄味ピンク（5cb）の気菌糸を
着生し、溶解性色素は極く僅かにピンク色を
帯びる。 (9) グルコース・ペプトン・ゼラチン培地（20
℃培養） 黄茶ないし暗い茶の発育上に、うすく白色
の気菌糸を僅かに着生し、溶解性色素は僅か
に茶色を呈する。 (10) 脱脂牛乳培地（28℃） 表面に発育し、カゼインは凝固しないが、
ペプトン化を生ずる。溶解性色素は茶色味を
呈する。 ３ 生理的性質 (1) 生育温度範囲20℃、25℃、30℃、37℃、46
℃、50℃の各温度で試験の結果、46℃及び50
℃を除いていずれの温度でも生育したが、最
適温度は30℃〜37℃付近と思われる。 (2) ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・
ゼラチン培地、20℃培養、20日間） 液化する。 (3) スターチの加水分解（無機塩・スターチ寒
天培地、28℃培養） スターチを水解する。 (4) 脱脂乳の凝固、ペプトン化（脱脂牛乳培
地、28℃培養） 凝固は殆んどしないが、ペプトン化する。 (5) メラニン様色素の生成（トリプトン・イー
スト・ブロス、ISP−培地１；ペプトン・イ
ースト・鉄寒天、ISP−培地６；チロシン寒
天、ISP−培地７、何れも28℃培養） チロシン寒天培地に於けるメラニン様色素
の生成は始んどないか或は生成しても痕跡程
度認められた。しかし他の２種類の培地には
明らかにメラニン様色素の生成が認められ
る。 (6) 炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ
寒天培地、ISP−培地９、28℃培養） Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−
グリコース、Ｄ−フラクトース、シユクロー
ス、イノシトール、Ｄ−マンニツトを利用し
てよく発育する。Ｌ−ラムノース、ラフイノ
ースの利用は僅かで疑わしい。 本菌株は、昭和57年７月13日付にて、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研条寄第165号
（FERM BP−165）として国際寄託されている。 本発明によるダウノマイシンの製造は、ストレ
プトミセス属に属するダウノマイシン及びその類
縁化合物を同時に生産する微生物に由来し、ダウ
ノマイシン類縁化合物の生産能が欠失したダウノ
マイシンを生産する能力を有する変異菌株、例え
ば、上記ストレプトミセス コエルレオルビダス
3T−373の胞子または菌糸を栄養源含有培地に接
種して、好気的に増殖させることによつて生産さ
れる。 その栄養源としては、放線菌の栄養源として通
常使用されるもの、例えば炭素源としてはグルコ
ース、グリセリン、蔗糖、殿粉、マルトース、動
植物油などが使用でき、窒素源としては例えば大
豆粉、肉エキス、酵母エキス、ペプトン、コーン
ステイーブ・リカー、綿実粕などの有機物並びに
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アン
モニウム、リン酸アンモニウムなどの無機体窒素
が使用できる。又必要に応じて食塩、塩化カリウ
ム、リン酸塩、その他重金属塩などの無機塩類及
びビタミン類を添加する他、発酵中の発泡を抑制
するため、例えばシリコーン（信越化学K.K.製
−KM75；商標）などの消泡剤を適宜添加するこ
とができる。 温度、PH、通気攪拌および発酵時間のような発
酵条件は用いられる菌株が最大量の該化合物を蓄
積するように選択する。例えば、発酵条件として
は20〜40℃、好ましくは28℃の温度でPH５〜９、
好ましくは7.4において１〜５日間、好ましくは
３日間行うのが有利である。 発酵培養物よりダウノマイシンを単離するに
は、アントラサイクリン系抗生物質の製造の技術
分野に於ける通常の手段、例えば遠心操作による
か、あるいは適当なケイ藻土の如き過助剤の存
在下に培養液を過し、菌体と液に分離した
後、菌体からはアセトン、メタノール、エタノー
ルもしくはブタノール等の水と混和する有機溶媒
を用いて抽出し、また液からは、クロロホル
ム、酢酸エチル等の有機溶媒を用いて抽出するこ
とができるが、これらの溶媒を適宜選択すること
により、菌体を予め分別することなく培養物から
直接抽出することも可能である。 抽出物は、一般に数種の類縁化合物を包含する
ため、目的物を単離するには、更に、シリカゲル
等を用いるクロマトグラフイー、セフアデツクス
LH−20（フアルマシヤ社製）、バイオ・ゲルＰ−
２（バイオ・ラツド社製）等によるゲル過メタ
クリル又はアクリル系弱酸性陽イオン交換樹脂等
による吸着及び溶出等をそれぞれ単独で或いは適
宜組合せて、さらに場合によつては反復して使用
される。 なお、前述したとおり、従来はダウノマイシン
含有培養物からダウノマイシンを回収するに際し
て、ダウノマイシンの類縁化合物をダウノマイシ
ンに変換せしめる処理を施した後、前記回収手段
を講ずることが高収率下にダウノマイシンを得る
ために必要であるが、本発明の方法によれば、か
かる処理を特別には要しないだけでなく、上記の
クロマトグラフイー処理等も簡便に実施できるた
めダウノマイシンを高収率で回収単離し得る。 以下に、本発明を実施例によりさらに詳しく説
明する。 実施例 ストレプトミセス コエルレオルビダス
（Streptomyces coeruleorubidus）3T−373菌株
のYS斜面培養より一白金耳を採り、下記する種
母培地100mlを分注殺菌した500−ml容三角フラス
コに接種し、28℃、ロータリーシエーカー
（220rpm）にて２日間振盪培養して種母を作成し
た。 種母培地 可溶性デンプン 0.5％ グルコース 0.5％ エスサンミート（大豆粉、味の素社製） 1.0％ 酵母エキス 0.1％ NaCl 0.1％ K2HPO4 0.1％ MgSO4・7H2O 0.1％ 水道水 PH7.4（殺菌前） 次いで、下記組成の生産培地15リツトルを入
れ、殺菌した30リツトル容ジヤーフアーメンター
２基に上記の種母培養液を、一基当り750ml（５
％に相当）ずつ添加接種した。 生産培地 台湾酵母 ５％ 可溶性デンプン 7.5％ 酵母エキス 0.3％ NaCl 0.2％ CaCO3 0.3％ ミネラル混液＊ 0.125％ 水道水 PH80（加熱殺菌前） ＊CuSO4・5H2O 2.8ｇ、FeSO4・7H2O 0.4ｇ、
MnCl2・4H2O 3.2ｇ、ZnSO4・7H2O 0.8ｇを
蒸溜水500mlに溶解したもの。 通気量５リツトル／分、攪拌450回転／分で、
28℃、120時間培養すると培養液は濃赤褐色を呈
し、培養液１ml中およそ380μｇのダウノマイシ
ンを蓄積した。なお、ダウノマイシンの定量はダ
ウノマイシン抽出液を適当に希釈し、その10〜
20μを薄層シリカゲルプレート（F254、メルク
社製）の下端より２cm位置にスポツトし、クロロ
ホルム／メタノール／水／酢酸（80／20／２／
0.2）で展開し、ダウノマイシンスポツトを薄層
用クロマトスキヤンナー（島津製作所製CS−910
型）で測定し、標準曲線より算定して定量した。 培養120時間後、発酵を中止し、ジヤーフアー
メンター２基より培養液を集め（総量27リツト
ル）、遠心操作により菌体と液に分離する。
液中のダウノマイシンは総量10リツトルのクロロ
ホルムで抽出した。一方、菌体区分のダウノマイ
シンは総量８リツトルのアセトンで抽出し、その
抽出上清をおよそ1/3量まで減圧濃縮する。次い
でクロロホルム２リツトルで２回抽出した。前記
液からのクロロホルム抽出液と合せ、濃縮乾涸
すると、純度およそ50％の粗ダウノマイシン標品
8.47ｇが得られた。 実施例 実施例で得た粗標品全量を３リツトルの
0.1M酢酸（PH3.0）に懸濁、溶解させ、不溶物を
過にて除去した。上清を4N苛性ソーダー溶液
で中和し、PHを8.0に調節したのち、再びクロロ
ホルムで抽出した。クロロホルム抽出層を水洗、
芒硝で乾燥させたのち、少量まで濃縮し、過剰の
ｎ−ヘキサンを添加して沈殿させ、過にて集積
せしめ、真空乾燥すると、赤褐色の純度およそ85
％のダウノマイシン粉末4.57ｇが得られた。 次いで、このダウノマイシン粉末全量をクロロ
ホルム300mlに溶解し、これにシリカゲル
（Art.7734メルク社製）20ｇを加え、混合吸着せ
しめ減圧濃縮乾涸した。これを同シリカゲル150
ｇをクロロホルムに懸濁し充填したカラム（φ5.2
×16cm）上にのせ、クロロホルム／メタノール／
水（15／２／0.2）の５リツトルで展開溶出した。
ダウノマイシン溶出区分を集め、水洗したのち、
芒硝を加えて乾燥させ、濃縮乾涸して純度98.5％
のダウノマイシンの赤褐色粉末3.31ｇを取得し
た。
性質を有している。従つて、これらの発酵ブロス
よりダウノマイシンを有効に取得するためには、
発酵ブロスを強い酸性下（PH2.0以下）で抽出乃
至は更に熱処理（例えば特公昭45−24961号公報
参照）することにより、Ｃ−4′位に結合している
中性糖を離脱させダウノマイシンに変換せしめる
必要がある。本操作は上記のいずれの特許公報等
にも明記されている基本的操作である。なお、バ
ウマイシン類に結合しているのと全く同一の中性
糖によるダウノサミンＣ−4′位の修飾は、カルミ
ノマイシン生産菌株（J.Antibiotics 27，254，
34，774）でも明らかにされており、ダウノマイ
シン、カルミノマイシンなど同一群に属するアン
トラサイクリン抗生物質生産菌株に共通した特徴
といえる。 本発明者らは、バウマイシン類がダウノマイシ
ンより生合成されることを明らかにしており、
（例えばJ.Antibiotics，33，1158）これらの知見
に従い生合成経路上の一点、即ちダウノマイシン
に中性糖を結合せしめる酵素反応を欠失した変異
菌株を選別単離することにより、ダウノマイシン
類縁化合物を生産することなくダウノマイシンを
直接最終生産物として蓄積、取得することが可能
であるとの考えに基いて鋭意研究した結果、ダウ
ノマイシン及びバウマイシンの生産菌ストレプト
ミセス コエルレオルビダス（Streptomyces
coeruleorubidus）ME130−A4（微工研菌寄第
3540号及びATCC 31276）の変異処理により、バ
ウマイシン類を全く生産せずに、それらの前駆体
であるダウノマイシンを生産するように変化した
目的の変異菌株の単離に成功した。 本菌株の如き性質を有する変異株の単離につい
ては、今までまだ報告されておらず、本発明者ら
により初めて取得されたものである。 しかして、本発明によれば、ダウノマイシン並
びにバウマイシンＡ又はＢを同時に生産する微生
物としては、前記ストレプトミセス8899、ストレ
プトミセス ピユセテイウス、ストレプトミセス
グリセウス バライエテイ ルビドフアシエン
スDS 32041、ストレプトミセス ビフアーカス
DS 23219若しくはストレプトミセス コエル
レオルビダスME130−A4又はそれらの変異菌株
を挙げることができるが、これらの菌株以外でも
ダウノマイシン並びにバウマイシンＡ又はＢを同
時に生産するストレプトミセス属に属する微生物
であれば、いずれも本発明に用いられるバウマイ
シンＡ又はＢの生産能が欠失したダウノマイシン
を生産する能力を有する変異菌株の親菌株として
用いることができる。これらのうち、本発明にお
いて好適に用いられるものとしては、ストレプト
ミセス コエルレオルビダスME130−A4（微工研
菌寄第3540号及びATCC 31276）及びこれに近似
するストレプトミセス8899（NRRL 3046）が挙
げられる。 また、バウマイシンＡ又はＢの生産能が欠失し
たダウノマイシンを生産する変異菌株としては上
記ストレプトミセス属に属する微生物に由来する
もので、ダウノマイシン並びにバウマイシンＡ又
はＢを同時に生産する菌株の変異によつて得られ
るバウマイシンＡ又はＢの生産能が欠失したダウ
ノマイシンを生産する菌株が全て含まれるが、好
適なものとしては、前記ME130−A4菌株を変異
処理することによつて得られるストレプトミセス
コエルレオルビダス3T−373菌株を挙げること
ができる。 本発明の目的に適する変異菌株を単離するに
は、ダウノマイシン並びにバウマイシンＡ又はＢ
を同時に生産することが知られている前述の菌株
をそれ自体公知である通常の変異処理により取得
することが出来る。その一例を示せば、ストレプ
トミセス コエルレオルビダスME130−A4菌株
をYS寒天（0.3％酵母エキス、１％可溶性デンプ
ン、1.5％寒天、PH7.2）斜面に接種し、一週間28
℃で培養する。着生する胞子をエーゼにてかき集
め、５mlの無菌0.1Mトリスー１ｍＭ EDTA緩
衝液（PH8.5）に採り、超音波処理（Tomy
Seiko，Ultrasonic Disruptor，model UR−
200Pで15秒間）を行い、次いで無菌脱脂綿をパ
ツクした小ガラス管（φ1.2×2.0cm）を通過させ、
ほぼ純粋な均一胞子液4.5mlを得る。これに10
mg／ml濃度のＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン（NTG）水溶液を0.5ml添加
し、ゆるやかに振盪しながら28℃で60分間変異処
理を行う。この時点での殺菌率は92.6％であつ
た。処理後、無菌生理食塩水で適当に希釈し、そ
の0.1mlをYS寒天（前出）をプレートし固化させ
たシヤレー平板上に塗布し、28℃で５日間培養す
る。生じるコロニーをYS寒天斜面（前出）に単
離し、培養して以下の方法によりダウノマイシン
生産性を検する。 まず以下に示す種母用培地４mlを分注滅菌した
試験管に、上記単離菌株を一白金耳接種し、28℃
で２日間、往復振盪培養する。 種母用培地 可溶性デンプン 0.5％ グルコース 0.5％ エスサンミート（味の素社製、大豆粉） 1.0％ 酵母エキス 0.1％ NaCl 0.1％ K2HPO4 0.1％ MgSO4・7H2O 0.1％ 水道水 PH7.4 次いで下記の本培養培地20mlを分注滅菌した
250−ml容三角フラスコに全量接種し、28℃で７
日間、ロータリーシエカー上で振盪培養する。 本培養培地 台湾酵母 ５％ 酵母エキス 0.3％ 可溶性デンプン 7.5％ NaCl 0.2％ CaCO3 0.3％ ミネラル＊ 0.125％ 水道水 PH8.0 ＊CuSO4・5H2O 2.8ｇ，FeSO4・7H2O 0.4ｇ，
MnCl2・4H2O 3.2ｇ，ZnSO4・7H2O 0.8ｇを
蒸溜水500mlに溶解したもの。 各培養フラスコより、ブロス１mlをサンプリン
グし、これにアセトン２mlを加え、サーモミキサ
ーにて攪拌し生成物を液層に抽出する。遠心処理
により上澄と菌体に分ち、上澄区分の20μをシ
リカゲル薄層（メルク社製、F254）の下端より２
cmの位置に１cm間隔でスポツトし、クロロホル
ム／メタノール／水／酢酸（80／20／２／0.2）
で展開し、ダウノマイシン標準品と比較する。親
菌株及び変異処理の大部分はバウマイシン類
（A1，A2，B1，B2等）及びアグリコン類から成
る、多数の赤橙色のスポツトを与えるが、本発明
のダウノマイシン生産性変異株では僅かにジヒド
ロダウノマイシンの微少スポツトを認めるが、ダ
ウノマイシン以外のアントラサイクリングリコシ
ドのスポツトは検出されない。 以上の方法により、本発明の目的に適する変異
菌株はおよそ変異処理コロニー5000菌株中、１個
の割合で取得された。 かくして得られる菌株の一つであるストレプト
ミセス コエルレオルビダス3T−373株の菌学的
性状を下記に示す。 １ 形態 3T−373株は分枝した基中菌糸より直線状あ
るいは鉤状の気菌糸を形成し、輪生枝は見られ
ない。成熟胞子鎖は10ケ以上で、胞子の大きさ
は0.4〜0.8×1.2〜2.0ミクロン位で、胞子の表
面は殆んど平滑である。時に一部の胞子の表面
に刺状突起の痕跡様の突起が僅かに認められる
事がある。 ２ 各種培地における成育状態 (1) シユークローズ・硝酸塩寒天培地（28℃培
養） うすだいだい或はにぶだいだい、ないしは
明るい茶（4ea〜4gc）の発育上に、灰黄味
ピンク（5cd）の気菌糸を着生し、溶解性色
素の生成は殆んど認められない。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地（28℃
培養） 灰黄或は明るいオレンジ黄、ないしはうす
だいだい（3ee〜3ea〜4ea）の発育をなす。 気菌糸は殆んど形成されず、溶解性色素も
殆んど生成されない。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP
−培地５、28℃） うすだいだい（4ea）或はだいだい、ない
しは暗いだいだいの発育上に灰黄味ピンク
（5cb）の気菌糸を着生し、溶解性色素は僅
かにだいだい色を帯びる。 (4) 無機塩・スターチ寒天培地（ISP−培地
４、28℃） 明るい橙黄或はうすだいだい（3ea〜
4ea）、ないしは赤味だいだいの発育上に、
灰黄味ピンク（5cb）の気菌糸を着生し、溶
解性色素はピンクを、或は僅かにピンク色を
帯びる。 (5) チロジン寒天培地（ISP−培地７、28℃） うすだいだい（4ea）或は黄茶、ないしは
赤味だいだいの発育上に、紫を帯びた白
（13ba）ないし灰黄味ピンク（5cb）の気菌
糸を着生し、溶解性色素は殆んど認められな
い。培養長期（約20日）に及ぶとだいだい色
を帯びる。 (6) 栄養寒天培地（28℃培養） 赤ないし暗い赤の発育上に、灰黄味ピンク
（5cb）ないし極うすい紫（11ca）の気菌糸
を着生し、溶解性色素はピンク色を帯びる。 (7) イースト・麦芽寒天培地（ISP−培地２、
28℃） にぶだいだい（4gc）或は黄茶、ないしは
赤味茶の発育上に灰黄味ピンク（5cb）の気
菌糸をはじめはうつすらと、培養後14日目頃
より豊富に着生し、溶解性色素はだいだい色
を僅かに帯びる。 (8) オートミル寒天培地（ISP−培地、28℃） 明るい赤茶（5gc）或は赤茶、ないしは茶
の発育上に灰黄味ピンク（5cb）の気菌糸を
着生し、溶解性色素は極く僅かにピンク色を
帯びる。 (9) グルコース・ペプトン・ゼラチン培地（20
℃培養） 黄茶ないし暗い茶の発育上に、うすく白色
の気菌糸を僅かに着生し、溶解性色素は僅か
に茶色を呈する。 (10) 脱脂牛乳培地（28℃） 表面に発育し、カゼインは凝固しないが、
ペプトン化を生ずる。溶解性色素は茶色味を
呈する。 ３ 生理的性質 (1) 生育温度範囲20℃、25℃、30℃、37℃、46
℃、50℃の各温度で試験の結果、46℃及び50
℃を除いていずれの温度でも生育したが、最
適温度は30℃〜37℃付近と思われる。 (2) ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・
ゼラチン培地、20℃培養、20日間） 液化する。 (3) スターチの加水分解（無機塩・スターチ寒
天培地、28℃培養） スターチを水解する。 (4) 脱脂乳の凝固、ペプトン化（脱脂牛乳培
地、28℃培養） 凝固は殆んどしないが、ペプトン化する。 (5) メラニン様色素の生成（トリプトン・イー
スト・ブロス、ISP−培地１；ペプトン・イ
ースト・鉄寒天、ISP−培地６；チロシン寒
天、ISP−培地７、何れも28℃培養） チロシン寒天培地に於けるメラニン様色素
の生成は始んどないか或は生成しても痕跡程
度認められた。しかし他の２種類の培地には
明らかにメラニン様色素の生成が認められ
る。 (6) 炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ
寒天培地、ISP−培地９、28℃培養） Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−
グリコース、Ｄ−フラクトース、シユクロー
ス、イノシトール、Ｄ−マンニツトを利用し
てよく発育する。Ｌ−ラムノース、ラフイノ
ースの利用は僅かで疑わしい。 本菌株は、昭和57年７月13日付にて、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研条寄第165号
（FERM BP−165）として国際寄託されている。 本発明によるダウノマイシンの製造は、ストレ
プトミセス属に属するダウノマイシン及びその類
縁化合物を同時に生産する微生物に由来し、ダウ
ノマイシン類縁化合物の生産能が欠失したダウノ
マイシンを生産する能力を有する変異菌株、例え
ば、上記ストレプトミセス コエルレオルビダス
3T−373の胞子または菌糸を栄養源含有培地に接
種して、好気的に増殖させることによつて生産さ
れる。 その栄養源としては、放線菌の栄養源として通
常使用されるもの、例えば炭素源としてはグルコ
ース、グリセリン、蔗糖、殿粉、マルトース、動
植物油などが使用でき、窒素源としては例えば大
豆粉、肉エキス、酵母エキス、ペプトン、コーン
ステイーブ・リカー、綿実粕などの有機物並びに
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アン
モニウム、リン酸アンモニウムなどの無機体窒素
が使用できる。又必要に応じて食塩、塩化カリウ
ム、リン酸塩、その他重金属塩などの無機塩類及
びビタミン類を添加する他、発酵中の発泡を抑制
するため、例えばシリコーン（信越化学K.K.製
−KM75；商標）などの消泡剤を適宜添加するこ
とができる。 温度、PH、通気攪拌および発酵時間のような発
酵条件は用いられる菌株が最大量の該化合物を蓄
積するように選択する。例えば、発酵条件として
は20〜40℃、好ましくは28℃の温度でPH５〜９、
好ましくは7.4において１〜５日間、好ましくは
３日間行うのが有利である。 発酵培養物よりダウノマイシンを単離するに
は、アントラサイクリン系抗生物質の製造の技術
分野に於ける通常の手段、例えば遠心操作による
か、あるいは適当なケイ藻土の如き過助剤の存
在下に培養液を過し、菌体と液に分離した
後、菌体からはアセトン、メタノール、エタノー
ルもしくはブタノール等の水と混和する有機溶媒
を用いて抽出し、また液からは、クロロホル
ム、酢酸エチル等の有機溶媒を用いて抽出するこ
とができるが、これらの溶媒を適宜選択すること
により、菌体を予め分別することなく培養物から
直接抽出することも可能である。 抽出物は、一般に数種の類縁化合物を包含する
ため、目的物を単離するには、更に、シリカゲル
等を用いるクロマトグラフイー、セフアデツクス
LH−20（フアルマシヤ社製）、バイオ・ゲルＰ−
２（バイオ・ラツド社製）等によるゲル過メタ
クリル又はアクリル系弱酸性陽イオン交換樹脂等
による吸着及び溶出等をそれぞれ単独で或いは適
宜組合せて、さらに場合によつては反復して使用
される。 なお、前述したとおり、従来はダウノマイシン
含有培養物からダウノマイシンを回収するに際し
て、ダウノマイシンの類縁化合物をダウノマイシ
ンに変換せしめる処理を施した後、前記回収手段
を講ずることが高収率下にダウノマイシンを得る
ために必要であるが、本発明の方法によれば、か
かる処理を特別には要しないだけでなく、上記の
クロマトグラフイー処理等も簡便に実施できるた
めダウノマイシンを高収率で回収単離し得る。 以下に、本発明を実施例によりさらに詳しく説
明する。 実施例 ストレプトミセス コエルレオルビダス
（Streptomyces coeruleorubidus）3T−373菌株
のYS斜面培養より一白金耳を採り、下記する種
母培地100mlを分注殺菌した500−ml容三角フラス
コに接種し、28℃、ロータリーシエーカー
（220rpm）にて２日間振盪培養して種母を作成し
た。 種母培地 可溶性デンプン 0.5％ グルコース 0.5％ エスサンミート（大豆粉、味の素社製） 1.0％ 酵母エキス 0.1％ NaCl 0.1％ K2HPO4 0.1％ MgSO4・7H2O 0.1％ 水道水 PH7.4（殺菌前） 次いで、下記組成の生産培地15リツトルを入
れ、殺菌した30リツトル容ジヤーフアーメンター
２基に上記の種母培養液を、一基当り750ml（５
％に相当）ずつ添加接種した。 生産培地 台湾酵母 ５％ 可溶性デンプン 7.5％ 酵母エキス 0.3％ NaCl 0.2％ CaCO3 0.3％ ミネラル混液＊ 0.125％ 水道水 PH80（加熱殺菌前） ＊CuSO4・5H2O 2.8ｇ、FeSO4・7H2O 0.4ｇ、
MnCl2・4H2O 3.2ｇ、ZnSO4・7H2O 0.8ｇを
蒸溜水500mlに溶解したもの。 通気量５リツトル／分、攪拌450回転／分で、
28℃、120時間培養すると培養液は濃赤褐色を呈
し、培養液１ml中およそ380μｇのダウノマイシ
ンを蓄積した。なお、ダウノマイシンの定量はダ
ウノマイシン抽出液を適当に希釈し、その10〜
20μを薄層シリカゲルプレート（F254、メルク
社製）の下端より２cm位置にスポツトし、クロロ
ホルム／メタノール／水／酢酸（80／20／２／
0.2）で展開し、ダウノマイシンスポツトを薄層
用クロマトスキヤンナー（島津製作所製CS−910
型）で測定し、標準曲線より算定して定量した。 培養120時間後、発酵を中止し、ジヤーフアー
メンター２基より培養液を集め（総量27リツト
ル）、遠心操作により菌体と液に分離する。
液中のダウノマイシンは総量10リツトルのクロロ
ホルムで抽出した。一方、菌体区分のダウノマイ
シンは総量８リツトルのアセトンで抽出し、その
抽出上清をおよそ1/3量まで減圧濃縮する。次い
でクロロホルム２リツトルで２回抽出した。前記
液からのクロロホルム抽出液と合せ、濃縮乾涸
すると、純度およそ50％の粗ダウノマイシン標品
8.47ｇが得られた。 実施例 実施例で得た粗標品全量を３リツトルの
0.1M酢酸（PH3.0）に懸濁、溶解させ、不溶物を
過にて除去した。上清を4N苛性ソーダー溶液
で中和し、PHを8.0に調節したのち、再びクロロ
ホルムで抽出した。クロロホルム抽出層を水洗、
芒硝で乾燥させたのち、少量まで濃縮し、過剰の
ｎ−ヘキサンを添加して沈殿させ、過にて集積
せしめ、真空乾燥すると、赤褐色の純度およそ85
％のダウノマイシン粉末4.57ｇが得られた。 次いで、このダウノマイシン粉末全量をクロロ
ホルム300mlに溶解し、これにシリカゲル
（Art.7734メルク社製）20ｇを加え、混合吸着せ
しめ減圧濃縮乾涸した。これを同シリカゲル150
ｇをクロロホルムに懸濁し充填したカラム（φ5.2
×16cm）上にのせ、クロロホルム／メタノール／
水（15／２／0.2）の５リツトルで展開溶出した。
ダウノマイシン溶出区分を集め、水洗したのち、
芒硝を加えて乾燥させ、濃縮乾涸して純度98.5％
のダウノマイシンの赤褐色粉末3.31ｇを取得し
た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ストレプトミセス属に属するダウノマイシン
並びにバウマイシンＡ又はＢを同時に生産する微
生物に由来し、バウマイシンＡ又はＢの生産能が
欠失したダウノマイシンを生産する能力を有する
変異菌株を栄養培地で培養し、該培養物からダウ
ノマイシンを採取することを特徴とするダウノマ
イシンの製造方法。 ２ ストレプトミセス属に属するダウノマイシン
並びにバウマイシンＡ又はＢを同時に生産する微
生物が、ストレプトミセス（Streptomyces）
8899（NRRL 3046）、ストレプトミセス
（Streptomyces）31723（NRRL 3045）、ストレプ
トミセス ピユセテイウス（Streptomyces
peucetius）（N.C.I.B.9475）、ストレプトミセス
グリセウス、バラエテイ ルビドフアシエンス
（Streptomyces grisseus，var.rubidofaciens）
DS 32041、ストレプトミセス ビフアーカス
（Streptomyces bifurcus）DS 23219（NRRL
3539）若しくはストレプトミセス コエルレオル
ビダス（Streptomyces coeruleoubidus）ME
130−A4（微工研菌寄第3540号及びATCC 31276）
又はそれらの変異菌株である特許請求の範囲第１
項記載のダウノマイシンの製造方法。 ３ バウマイシンＡ又はＢの生産能が欠失したダ
ウノマイシンを生産する変異菌株がストレプトミ
セス コエルレオルビダス3T−373である特許請
求の範囲第１項又は第２項記載のダウノマイシン
の製造方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57129370A JPS5921394A (ja) | 1982-07-24 | 1982-07-24 | ダウノマイシンの製造法 |
| US06/514,678 US4592999A (en) | 1982-07-24 | 1983-07-18 | Process for producing daunomycin |
| EP83107221A EP0100075A3 (en) | 1982-07-24 | 1983-07-22 | Process for producing daunomycin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57129370A JPS5921394A (ja) | 1982-07-24 | 1982-07-24 | ダウノマイシンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5921394A JPS5921394A (ja) | 1984-02-03 |
| JPH0365157B2 true JPH0365157B2 (ja) | 1991-10-09 |
Family
ID=15007897
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57129370A Granted JPS5921394A (ja) | 1982-07-24 | 1982-07-24 | ダウノマイシンの製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4592999A (ja) |
| EP (1) | EP0100075A3 (ja) |
| JP (1) | JPS5921394A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK356087A (da) * | 1987-07-09 | 1989-01-10 | Biogal Gyogyszergyar | Fremgangsmaade til isolering af et antibiotikum |
| GB2330144B (en) * | 1997-03-06 | 2001-05-02 | Pharmacia & Upjohn Spa | Process for preparing doxorubicin |
| ES2356284T3 (es) * | 1997-12-05 | 2011-04-06 | Mercian Corporation | Antibiótico de antraciclina cristalino y procedimiento para su producción. |
| KR20020008297A (ko) * | 2000-07-21 | 2002-01-30 | 채문식 | 안스라사이클린계 항생물질 도노마이신을 이용한식물병방제용 살균제 |
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