JPH0320236B2

JPH0320236B2 -

Info

Publication number: JPH0320236B2
Application number: JP3432184A
Authority: JP
Inventors: Akihiro Yoshimoto; Shizuka Fujii; Katsuro Kubo; Tomoyuki Ishikura; Tsutomu Sawa; Tomio Takeuchi; Hamao Umezawa
Original assignee: MERUSHAN KK
Current assignee: MERUSHAN KK
Priority date: 1984-02-27
Filing date: 1984-02-27
Publication date: 1991-03-18
Also published as: JPS60186298A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はアドリアマイシンの製造法に関し、更
に詳しくは、ストレプトミセスD788 3T−23菌
株を栄養培地に培養し、その培養物から下記式で示されるアドリアマイシンを分離、精製するこ
とを特徴とするアドリアマイシンの製造法であ
る。アドリアマイシンは、強い抗腫瘍活性を有する
アントラサイクリン抗生物質で、抗癌スペクトル
が広く癌治療上重要な科学療法剤である。従来そ
の製造法としては、ダウノマイシン生産菌株とし
て公知ストレプトミセス・ピユーセテイウスから
変異処理により得られた変異株、即ちストレプト
ミセス・ピユーセテイウス・サブスプーシーズ・
カエシウス（Streptomyces peuceticus subsp.
caesius）ATCC27952等の培養による方法（特公
昭45−26713号公報参照）、或はダウノマイシンを
化学的に処理して製造する方法（特公昭47−
46597号公報参照）等が知られている。これらの方法または改良された方法が現実にア
ドリアマイシンの製造に用いられているが、より
有効な微生物発酵による製造法の開発が望まれて
いる。本発明者らは一貫したアントラサイクリン類の
生合成研究により、アドリアマイシンがダウノマ
イシンから、その14位炭素の酵素的酸化により生
合成されることを明らかにし、微生物変換法によ
るダウノマイシンからアドリアマイシンへの変
換、生成法を開発して来た（J.Autibiotics34、
1229−1231、（981））。本研究成果は、加えて、ダ
ウノマイシン生産菌株として公知の菌株から、
種々の菌株改良法により、14位炭素の酸化能に対
し強い活性を有する菌株を育成することにより、
有利なアドリアマイシン発酵生産が可能であるこ
とを示唆するもので、本発明者らはこの考えに沿
つて鋭意検討を重ねた結果、土壌から分離したダ
ウノマイシン（バウマイシン）を生産し得る放線
菌株を変異処理し、アドリアマイシン生産性の菌
株の検索を行ない、アドリアマイシンを多量に生
産する菌株の誘導に成功し本発明を完成した。因みに、特許公昭45−26713号記載のストレプ
トミセス・ピユーセテイウス・サブスピーシス・
カエシウスATCC2759菌株では10μｇ／ml程度の
蓄積生成であるが、本発明の菌株では10〜15倍の
蓄積生成量を示している。本発明に使用される微生物は今回新しく土壌よ
り分離した放線菌ストレプトミセス
（Streptomyces）D788株から変異処理により誘
導されるアドリアマイシン蓄積性変異株で、その
具体的なものとしては、ストレプトミセス
（Streptomyces）D788 3T−23株を挙げることが
出来る。該変異株は、公知の各種の変異手段、例えば、
ニトロソグアニジン、ジエポキシエタン、亜硝酸
塩等の変異誘起剤処理または紫外線、α−線、γ
−線、Ｘ−線等の放射線照射の手段によつて得ら
れる。本発明で用いられる変異株の検索方法を具体例
によりさらに説明すれば次の通りである。ストレプトミセス（Streptomyces）D788株を
YS寒天斜面培地（0.3％酵母エキス、１％可溶性
デンプン、1.5％寒天、PH7.2）に接種、28℃で10
日間培養し、胞子を着生せしめる。１斜面培養よ
り胞子をかき集め、５mlの減菌生理食塩水に懸
濁、これを超音波（Tomy Seiko社製、UR−
200P型）で20秒間処理したのち、脱脂綿を詰め
た殺菌小ガラス管（φ1.5mm×20mm）を通過させ、
液を遠心して胞子を集める。これに１mg／ml濃
度のＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジンを含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH
8.5）の５mlを加え懸濁し、28℃で１時間振盪す
る。再び遠心し、上清を棄て５mlの生理食塩水に
懸濁、同食塩水で適当に希釈し、YS寒天平板
（前述、寒天1.5％）に塗布し、28℃で５日間培養
してコロニーを形成せしめる（殺菌率97.5％）。
該コロニーYS寒天斜面に移植培養したのち、３
mlの下記種母培地を含み試験管に接種し、28℃で
２日間振盪培養する。この全量を以下に示す組成
から成る発酵生産培地20mlを容れた250mlフラス
コに接種し、28℃で６日間回転振盪培養する。種母培地可溶性デンプン 0.5％グルコース 0.5 エスサンミート（味の素社製、大豆粉） 1.0 酵母エキス 0.1 第２リン酸カリ 0.1 食塩 0.1 硫酸マグネシウム、7H₂O 0.1 PH 7.4 発酵生産培地

【表】

【表】培養液１mlを採り、これにアセトン３mlを加
え、ミキサーにて激しく振盪撹拌する。遠心した
赤色の抽出上清を得る。これを下記の高速液体ク
ラマトグラフイー用移動相で10倍に希釈し、10μ
をインジエクトしてアドリアマイシンの検出を
行なう。高速液体クロマトグラフイー条件：本体：日立製作所社製Model655 カラム：YMC−Pack Ａ−312 移動相：36％CH₃CN−0.01M Ｄ−10−カンフア
ースルホン酸（PH4.2）流速：1.0ml／min 検出：254nｍ保持時間：5.45min 如くして、アドリアマイシンの生産が認めら
れ、且つ蓄積量の多い菌株を選択する。蓄積量の
高い菌株の一例としては本発明者らが3T−23菌
株の番号を付した菌株が挙げられる。この菌株3T−23は親株であるストレプトミセ
ス（Streptomyces）D788株とアントラサイクリ
ン抗生物生産に関してはバウマイシン類を生産し
ない点、及びアドリアマイシンを蓄積生産する点
において異なるが、菌学的諸性質に関してはほと
んど変らない。以下にストレプトミセス（Streptomyces）
D788、3T−23菌株の菌学的性状を記載する。ストレプトミセス（Streptomyces）D788 3T−
23株の菌学的性状 () 形態分枝した基中菌糸より、直線状の気中菌糸を
伸長し、輪生枝はみとめられない。成熟した胞
子鎖は10ケ以上の胞子の連鎖が認められ胞子の
大きさは0.6〜0.8×0.9〜2.5ミクロン位で、胞
子の表面は平滑である。子のう胞子、鞭毛胞子
などはみとめらない。 () 各種培地における生育状態色の記載について（）内に示す標準なH.
D.Tresner＆E.J.Backus著System of color
wheels for Streptomycete taxonomy（J.
Appl.Microbiol.11巻335〜338頁、1963年）を
用い、補足的に日本色彩研究所出版の「色の標
準」も用いた。

【表】

【表】 () 生理的性質 (1) 生育温度範囲：（イースト・麦芽・寒天培
地）を使用、PH6.0で、20℃、28℃、30℃、
37℃、42℃の各温度で実験） 20℃から37℃までの各温度では生育がみと
められた。42℃では生育しない。 (2) ゼラチンの液化：陽性（グルコース・ペプ
トン・ゲラチン培地を使用し、20℃で培養） (3) スターチの加水分解：陽性（スターチ・無
機塩寒天培地） (4) スキム・ミルクの凝固・ペプトン化：始め
はすべて陰性、培養15日間過ぎる頃ペプトン
化をはじめる。 (5) メラニン様色素の生成：（トリプトン・イ
ースト・ブロス、ペプトン・イースト・鉄・
寒天、及びチロシン寒天培地使用）いずれの培地でも陽性 () 各種炭素源の利用性：（フリドハム・ゴド
リーブ寒天培地上）１Ｌ−アラビノース陽性２Ｄ−キシロース〃３Ｄ−グルコース〃４Ｄ−フラクトース〃５シユクロース〃６イノシトール〃７Ｌ−ラムノース陰性８ラフイノース〃９Ｄ−マンニツト陽性本発明の菌株ストレプトミセス
（Streptomyces）D788、3T−23菌株はアドリア
マイシン生産菌株として公知のストレプトミセ
ス・ピユーセテイウス・サブスピーシス・カエシ
ウス（Streptomyces peusetius sub.sp.caesius）
（Streptomyces peucetiusから誘導した変異株）
とは、特公昭45−26713記載の菌学的性状を比較
することにより、以下の点で大きな菌学的相違が
認められる。即ち、 (1) 形態ストレプトミセス・ピユーセテイウス・サブ
スピーシス・カエシウス（Streptomyces
peucetius sub.sp.caesius）（及びその親株
Streptomyces peucetius）の気中菌糸の先端
は鉤形又は環状であり、分生子は球形で、大き
さ1.1〜3.3μである。一方、本発明の菌株スト
レプトミセス（Streptomyces）D788 3T−23
菌株（及びその親株Streptomyces D788）は
気中菌糸の先端は直線形であり、分生市は桿形
である。 (2) 生理的性質ストレプトミセス・ピユーセテイウス・サブ
スピーシス・カエシウス（Streptomyces
peucetius sub.sp.caesius）はメラニン色素の
生成はないと思われ、またミルクのペプトン化
も陰性である。一方、3T−23菌株はメラニン
の生成は被検した３種類の培地でいずれも陽性
であり、またミルクのペプトン化も陽性であ
る。 (3) 炭水化物の利用性ストレプトミセス・ピユーセテイウス・サブ
スピーシス・カエシウス（Streptomyces
peucetius sub.sp.caesius）はラフイノーズを
利用し、Ｌ−アラビノーズ、イノシトールを利
用しないが、3T−23株はＬ−アラビノーズ、
イノシトールを利用し、ラフイノースを利用出
来ない。以上の如く、多くの菌学的性質で相違し、従つ
て、本発明の菌株、ストレプトミセス
（Streptomyces）D788 3T−23菌株はアドリアマ
イシン生産性公知菌ストレプトミセス・ピユーセ
テイウス・サブスピーシス・カエシウス
（Streptomyces peucetius sub.sp.caesius）及び
その親株であるストレプトミセス・ピユーセテイ
ウス（Streptomyces peucetius）と全く別種の
菌株と考えられる。なお、3T−23菌株は、昭和59年２月20日付で
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
7457号（FERMP7457）として寄託されている。本発明によるアドリアマイシン生産菌株の培養
は、放線菌の栄養源として通常使用さるそれ自体
公知の培地組成物中で行うことができる。例え
ば、炭素源としては、グルコース、グリセリン、
蔗糖、澱粉、マルトーズ、動植物油などが使用で
き、窒素源としては、例えば大豆粉、肉エキス、
酵母エキス、ペプトン、コーンステープリカー、
綿実粕、魚粉などの有機物並びに硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、リン酸
アンモニウムなどの無機体窒素が使用できる。又
必要に応じて食塩、塩化カリウム、リン酸塩その
他Mg⁺⁺、Ca⁺⁺、Zn⁺⁺、Fe⁺⁺、Cu⁺⁺、Mn⁺⁺ある
いはNi⁺⁺などの２価金属塩類及びアミノ酸やビ
タミン類を添加する他発酵中の発泡を抑制するた
め、例えばシリコーン（信越化学KK製、−
KM75；商標）などの消泡剤を適宜添加すること
もできる。温度、PH、通気撹拌および発酵時間等の発酵条
件は、用いられる菌株が最大量の該化合物を蓄積
する様に選択する。例えば温度20〜40℃、好まし
くは28℃、PH５〜９、好ましくは６〜７におい
て、発酵時間は４〜10日間、好ましくは６日間で
発酵を行うのが有利である。該培養物からアドリアマイシンを単離、採取す
るには、発酵終了後の培養物を遠心分離による
か、ケイ藻土の如き適当な濾過助剤の存在下で濾
過することにより、菌体と上澄または濾液に分離
する。菌体からは必要により、アセトン、メタノー
ル、エタノールもしくはブタノール等の水と混和
する有機溶媒を用いて抽出し、この濃縮液を濾液
と混合する。この混合液を、吸着担体、例えば、
合成吸着樹脂、シリカゲルを用いたクロマトグラ
フイーにより処理するか、陰イオン交換樹脂、陽
イオン交換樹脂を用いる処理等を単独にあるいは
適宜組合せて使用することにより、アドリアマイ
シンは純粋な形で採取できる。以上の本発明方法によつて得られる標品のアド
リアマイシンとして同定は、0.1N塩酸水、80℃
30分間の加水分解により得られるアグリコンの数
種類の溶媒系を用いてのシリカゲル薄層（F₂₅₄メ
ルク社製）上でのRf値、紫外部、可視部吸収ス
ペクトル、赤外線吸収スペクトル等が標準アドリ
アマイシンと一致すること、酸加水分解物中の糖
成分をJ.Antibiotics32、801−819記載の方法で定
性分析した結果ダウノサミンが検出されたことか
ら証明された。下記に示した本標品の物理化学的性状及び機器
分析値を文献値と比較した結果、アドリアマイシ
ンと一致した。 (1) 外観赤色粉末 (2) 融点 199−201℃（dec）（塩酸塩として） (3) 紫外線部、視部吸収スペクトル

【表】 (4) 赤外線吸収スペクトル（KBr錠） ν^max _cn-1：3350、2950、1720、1620、1580、
1530、1420、1280、1230、1210、1110、1080、
980、910、870 (5) PMRスペクトル（100メガヘルツ、クロロホ
ルム中）Ｈ−１（8.00）Ｈ−２（7.75）Ｈ−３（7.35）Ｈ−1′（5.50）Ｈ−７（5.25）Ｈ−3′、Ｈ−
5′（4.15）４−ＯCH₃ （4.05）Ｈ−4′（3.45） COCH₂
OH（4.70）Ｈ−10（3.05）Ｈ−８（2.20）Ｈ−2′（1.70）Ｈ−6′（1.35）アドリアマイシンの物理化学的性状及び機器分
析データーに関しては、以下の文献を参考にし
た。文献 (1) Tetrahedron Letters、13、1007（1969） (2) Biotechnol.Bioeng、11、1101（1969） (3) Recent Results in Cancer Res.p.9 Berlior−Heidelberg−New York、
Springer Verlag、1972 実施例１ (1) ストレプトミセスD788（Streptomyces
D788）3T−23菌株（微工研条寄第7457号）の
YS（0.3％酵母エキス、１％可溶性デンプン、
1.5％寒天、PH7.2）斜面培養より一白金耳を採
り、下記する種母培地100mlを分注殺菌した500
ml容三角フラスコに接種し、28℃、ロータリー
シエカー（220rpm）にて２日間振盪培養して
種母を作成した。種母培地可溶性デンプン 0.5％グルコース 0.5％エスサンミート（大豆粉、味の素社製） 1.0％酵母エキス 0.1％ NaCl 0.1％ K₂HPO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.1％水道水 PH7.4（殺菌前）次いで、下記組成の生産培地15を入れ、殺
菌した30容ジヤーフアーメンター２基に上記
の種母培養液を、１基当り750ml（５％に相当）
ずつ添加接種した。生産培地台湾酵母５％可溶性デンプン 7.5％酵母エキス 0.3％ NaCl 0.2％ CaCO₃ 0.3％ミネラル混液※ 0.06％水道水 PH8.2（加熱殺菌前） ※CuSo₄・5H₂O2.8ｇ、FeSo₄・7H₂O0.4ｇ MnCl₂・4H₂O3.2ｇ、ZnSO₄・7H₂O0.8ｇを蒸留水500mlに溶解したもの。通気量５／分、撹拌450回転／分で、28℃、
140時間培養すると培養液は濃赤褐色を呈し、
培養液１ml中およそ120μｇのアドリアマイシ
ンを蓄積した。なお、培養液中のアドリアマイシンの定量
は、培養液１mlに1Mクエン酸緩衝液（PH3.5）
１mlを加え、これにアセトン２mlを加えて撹
拌、室温で１時間放置、遠心操作により上清を
分取し、36％CH₃CN₃−0.01M Ｄ−10−カン
フアースルホン酸（PH4.2）で５〜10倍に希釈
し、その10μを高速液体クロマトグラフイー
（前出）にかけて、標準アドリアマイシン量
（0.1〜0.3γ）より算定し、測定した。実施例２発酵終了後、培養液14を約２倍に水で希釈
し、濃硫酸でPHを1.7に調整した後、過助剤
（パーライト）を添加し、過した。液12
を4N水酸化ナトリウムでPH2.3に調整して、合
成吸着樹脂HP−20 400mlのカラムに通し、水
洗後、50％アセトン水で吸着物を溶出した。溶
出液850mlから減圧下でアセトンを留去し、得
られた濃縮液のPHを4N水酸化ナトリウムで8.5
に調整して、クロロホルム300mlで２回、赤色
物質を抽出した。抽出液を集め300mlまで濃縮
し同容量の0.1M酢酸緩衝液PH3.0で酸転し、ア
グリコンをのぞいた。次いで酸転水のPHを4N
水酸化ナトリウムで6.0とし、クロロホルム100
mlで２回洗浄抽出を行つた後、水層のPHを8.5
とし、クロロホルム150mlで２回抽出した。得
られた抽出液を水洗し無水硫酸ナトリウムで乾
燥後、減圧下濃縮乾固して2.66ｇの赤色粗粉末
を得た。実施例３実施例２で得た粗粉末全量を、クロロホルム
で懸濁充填作成したシリカゲルカラム（ワコー
ゲルＣ−200、80ｇ）にかけ、クロロホルム−
メタノール−水（50：10：１）溶媒混液で展開
した。溶出分画は高速液体クロマトグラフイー
（前出）で追跡し、アドリアマイシンを含む溶
出分画を集め、濃縮乾固して、純度57％のアド
リアマイシン粗標品を得た。この粗標品全量を、再度上記と同様に作成し
たシリカゲルカラム（ワコーゲルＣ−200、10
ｇ）にかけ、クロロホルム−メタノール−水
（60：10：0.5）で展開し、溶出分画を高速液体
クロマトグラフイーで分析し、アドリアマイシ
ンのみを含む分画を集めた。次いで溶出区分を
水洗し、0.1M酢酸緩衝液（PH3.0）50mlで酸転
抽出したのち、抽出水層を4N水酸化ナトリウ
ムでPHを8.5となし、クロロホルム30mlで２回
抽出した。抽出液を水洗し、さらに飽和食塩水
で洗浄、芒硝で乾燥したのち、少量まで濃縮
し、過剰のｎ−ヘキサンを加ええて沈殿させ、
過、集積せしめ、真空デシケーターで乾燥し
て精製アドリアマイシン124mgを取得した。

Claims

【特許請求の範囲】１ストレプトミセスD788 3T−23（微工研菌寄
第7457号）菌株を栄養培地に培養し、その培養物
から下記式で示されるアドリアマイシンを分離、精製するこ
とを特徴とするアドリアマイシンの製造法。