JPH036793B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、多孔性ゲル状担体及びその用途に
関する。さらに詳しくは、酵素固定化用として好
適な活性の優れた多孔性ゲル状担体及びそれを用
いた固定化酵素に関する。 最近、酵素等のペプチド含有化合物をガラス担
体に固定化した固定化酵素が診断用や合成用のバ
イオリアクターとして用いられるようになつてき
た。これらの固定化酵素の製造法としては、溶融
法によつて予め得られたSiO₂系ガラスの表面を
アルカリ処理して水酸基を生成させ、これに例え
ばアミノアルキル基を導入しこれに酵素を付加し
て固定させる方法が知られており実用化されてい
る。 しかし上記従来の方法においてはガラス表面に
水酸基を生成させる工程が必要であり、それによ
つて生成しうる水酸基の単位面積当りの量は限度
があつて酵素等の固定量を増大し活性の高い固定
化酵素を得ることが困難であつた。 この点に関し、この発明の発明者は先に、アル
コキシシラン等の金属アルコキシドを原料としこ
れを加水分解した際に得られる多孔性のガラス様
ゲル状化合物を担体とすることにより水酸基を導
入する工程を行なうことなく活性の高い固定化酵
素が得られる事実を見出した。これは、上記ガラ
ス様ゲル状化合物は対応する水酸化金属化合物や
その低縮合物からなるためそれ自身非常に多数の
水酸基を有しておりその結果酵素の固定化能が増
加するものと考えられる。 この発明は、上記知見を更に発展させることに
よりなされたものである。すなわち金属アルコキ
シドからのガラス様ゲル状化合物製造の際に、フ
ツ化水素を接触させることにより、水酸化金属化
合物及び／又はその縮合物にフツ素原子が置換導
入された一種のフツ化ガラス様ゲル状化合物が得
られ、その導入割合を少量とした際に得られるフ
ツ化ガラス様ゲル状化合物が、フツ素化していな
いものに比して水酸基の反応性が優れており酵素
等の固定化能がさらに増加する事実を見い出すこ
とによりなされたものである。 かくしてこの発明によれば、アルコキシシラン
を加水分解して生成するガラス様ゲル状の水酸化
金属化合物及び／又はその縮合物における一部の
水酸基がフツ素原子で置換されてなる活性の優れ
た多孔性ゲル状担体が提供される。さらに上記多
孔性ゲル状担体を用いてなる活性の優れた固定化
酵素が提供される。 この発明における金属アルコキシドとしては、
ガラス製造分野やセラミツクス製造分野における
原料として知られたアルコキシシランが種々適用
でき、具体的にはSi（OCH₃）₄、Si（OC₂H₅）₄等の
低級アルコキシシランを用いるのが通常好適であ
る。なお、これら二種以上の混合物を用いてもさ
しつかえはない。 この発明の多孔性ゲル状担体は、アルコキシシ
ランを加水分解してゲル状化合物とする際に、フ
ツ化水素を反応に関与させることにより得られ
る。より具体的には加水分解触媒を任意に有する
水性溶媒中に、アルコキシシランを混合して加水
分解させつつ少量のフツ化水素酸を添加混合した
後、徐々に溶媒や触媒を除去させることにより得
られる。また、ゲル状化合物とした後にフツ化水
素酸を接触させて表面のシラノール基の一部をフ
ツ素置換することも可能である。 例えば低級アルコキシシランを用いる場合に
は、水を含む揮発性の親水性溶媒（例えば含水メ
タノールや含水エタノール）中でかつ酸性下（例
えば、加水分解触媒としての塩酸等の無機酸を添
加してPH１〜３程度とするのが好ましい）の緩和
な条件下（例えば室温下）でアルコキシドの加水
分解を開始すると同時に少量のフツ化水素酸を添
加し80℃程度に加温しつつ徐々に生成アルコー
ル、溶媒、無機酸及び未反応のフツ化水素を蒸発
しかつ充分に乾燥させることにより得られる。な
お、場合によつては水分は空気中から供給される
ため水を含ませなくてもよい。水のみで加水分解
を行なうことも可能であるが、この場合は加水分
解が不均一になる惧れがありさらに、ゲル状物の
乾燥上不利であり好ましくない。 他のアルコキシシランにおいても基本的に同様
にして意図する多孔性ゲル状担体を得ることがで
きる。 かようなフツ化水素の接触処理により、アルコ
キシシランの加水分解物である水酸化金属化合物
及び／又はその縮合物（ガラス様ゲル状化合物）
における一部の水酸基（エーテル結合も含む）が
フツ素原子で置換され、フツ素原子を化学的に結
合したこの発明の多孔性ゲル状担体が得られる。
この際置換導入するフツ素原子は少量であること
が必要である。この少量としては、原料のアルコ
キシシラン（１モル）に対するモル比として表わ
せば0.05〜1.0モル程度が適切であり、0.2モル前
後が最も好ましい。0.05モル以下ではフツ素原子
導入による効果が不充分で好ましくなく、1.0モ
ルを越えると水酸化金属化合物及び／又はその縮
合物における水酸基の置換度が過剰となり以後の
反応に関与しうる水酸基の量が実質的に減少する
ため好ましくない。 このようにして得られたこの発明の多孔性ゲル
状担体は、基本的に多数の水酸基を有するゲル状
化合物からなるため、従来のガラスを担体とする
ものに比して反応性が良好である。さらに、その
水酸基やエーテル結合の一部はフツ素原子で置換
されているため、単なるゲル状化合物に比して活
性はより優れている。なお、フツ素原子の導入に
よる効果は、アルコキシシランで説明すれば下式
（）に示されるように、 水酸化金属化合物やその縮合物に少量置換導入さ
れたフツ素原子の誘起効果（効果）によつて隣
接するシラノールの水酸基の分極の程度が大きく
なつて水素原子が活性となり、反応性がより上昇
するものと信じられる。さらに、前述のごとくフ
ツ化水素を合成反応に関与させて得たゲル状化合
物の多孔度は、フツ化水素の反応モル比によつて
若干変化させることができるが、いずれにおいて
も単なるゲル状化合物のものよりも多孔であるこ
とからそれによる表面積の増加による効果も加わ
つているものと考えられる。 このようにして得られたこの発明の多孔性ゲル
状担体は、そのまま用いてもよく、微粒子状に粉
砕して用いてもよく、液体クロマトグラフイーや
その他の各種のクロマトグラフイーのカラム充填
材の基材として有用であり、また、酵素、抗原、
抗体等の固定化用担体としても有用である。こと
に酵素等を用いたアルコール、アミノ酸、水素等
有用化学物質生産用の固定化担体として低コスト
で高活性を有するものを提供できる。 このゲル状担体にシランカツプリング剤を反応
させ、その反応物に酵素を固定化することにより
この発明の固定化酵素が得られる。 上記ゲル状担体に反応させるシランカツプリン
グ剤としては、アミノ基、チオール基、エポキシ
基などの管能性基を有する当該分野で公知のシラ
ン誘導体が適用でき、具体的にはγ−アミノプロ
ピルトリエトキシシラン、γ−クロロプロピルト
リメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、
γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、
Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルト
リメトキシシラン等が使用される。かようなシラ
ンカツプリング剤との反応は、当該分野で公知の
条件下で行なわれる。例えばγ−アミノプロピル
トリメトキシシランを用いた場合、このカツプリ
ング剤を水に溶解して約10％水溶液としかつPHを
３〜５に調整した後、この溶液に充分に乾燥され
た前記ゲル状担体又はその粉砕物を加え加温下混
合して数時間処理した後水洗して未反応のカツプ
リング剤を除去することにより得られる。 上記、シランカツプリング剤を導入したゲル状
担体は、それ自身従来のガラスに導入したものに
比して担体として多くのカツプリング基を有して
おり、酵素等との反応活性が高く固定化酵素用担
体やカラム充填材として有用なものである。 このようにして処理されたゲル状担体に公知の
方法で酵素が固定化される。例えば、カツプリン
グ剤としてγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ンを用いてアミノアルキル基を水酸基にエステル
結合で多数導入したゲル状担体を用いる場合、上
記アミノアルキル基にグルタルアルデビドを用い
てアルデビド基を有するシツフベースを導入し、
これに酵素等を接触させてアルデビド基と酵素等
のアミノ基間でさらにシツフベースを形成させて
結合することにより固定化を行なうことができ、
これ以外にもアミノアルキル基をジアゾ化して芳
香族アミノ基を導入しこれに酵素等を固定化して
もよく、またカルボジイミドを用いてアミノアル
キル基と酵素等との間に直接ペプチド結合を行な
い固定化を行なつてもよく酵素等の種類に応じて
適宜選択すればよい。他のカツプリング剤使用時
にも同様に直接又は適宜変換したカツプリング基
によつて酵素等を固定化することができる。 固定化用の酵素としては具体的にはグルコース
オキシダーゼ、ウリカーゼ、ウレアーゼ、クレア
チニナーゼ、CoA−シンテターゼ、CoA−オキ
シダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレス
テロールヒドロラーゼ等が挙げられるが限定され
ることはなく、抗原や抗体を固定化することもで
きる。 このようにして得られた固定化酵素（固定化ガ
ラス）は従来の固定化酵素と同様に、種々の形態
で診断用や合成用のバイオリアクターとして有用
であり、さらに従来の固定化酵素に比して担体当
りの酵素等の固定量は多くバイオリアクターとし
ての能力が増大されたものである。 以上述べたように、この発明の多孔性ゲル状担
体及び固定化酵素は従来に比していずれも反応性
や活性に優れたものであり、またその安定性も優
れておりさらに簡便に製造できるため極めて有用
である。ことに担体としては従来のガラス担体に
比して製造コストは1/10以下と極めて安価であ
る。 以下、この発明を実施例により説明する。 実施例 １ （多孔性ゲル状担体の製造） テトラエトキシシランSi（OC₂H₅）₄0.52モル、
エタノール1.72モル、水1.82モル、塩酸0.028モル
及びフツ化水素酸0.058〜0.115モルの混合物（PH
約１）を室温下で均一になるまで数十分混合撹拌
した。 次いで80℃のウオーターバス中で３昼夜加熱し
て加水分解反応で生じたエチルアルコール、水及
び残存する塩酸や未反応の微量のフツ化水素酸を
蒸発することにより約30ｇのこの発明のガラス様
多孔性ゲル状担体を得た。 （アミノアルキル化） 上記で得られたゲル状担体を粉砕して120／200
メツシユのビーズを得た。 5wt％のγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ン水溶液を5N塩酸でPH3.5に調整し、この溶液45
mlに対し上記ビーズ状ゲル状物を各々５ｇ投入
し、さらにPH3.5になるように調整した。この混
合物を、撹拌機、温度計、ジムロートを付設した
四ツ口フラスコに入れウオーターバスで温度を75
℃に保ち、撹拌させながら３時間反応を行なつ
た。反応終了後、ビーズを吸引メンブランフイル
ターに移し、１の蒸留水で未反応のγ−アミノ
プロピルトリエトキシシランを除去した後、デシ
ケーターで乾燥させてアミノアルキル化ゲル状担
体を得た。このアミノアルキル化ゲル状物はデシ
ケーター内で保存する。 （酵素の固定化） 上記アミノアルキル化ゲル状担体（ビーズ状）
を二管能性のグルタルアルデヒド（2.5wt％）の
リン酸塩緩衝溶液（PH7.0）に浸漬し、アスピレ
ータで減圧させつつ約30分撹拌下反応させた。続
いてさらに約30分常圧で撹拌下反応させた。反応
温度は30℃であつた。これをPH7.0のリン酸塩緩
衝液で充分に洗浄し、乾燥させた。この処理によ
りゲル状物にアルデヒド基を有するシツフベース
が導入される。 得られたゲル状物を１mg／ml（グルコースオキ
シダーゼ／PH7.0リン酸塩緩衝液）中に浸漬し、
25℃下まず30分減圧下で緩やかに撹拌して反応を
行ない、続いて60分常圧下で緩かに撹拌して固定
化反応を行なつた。この処理によりグルコールオ
キシダーゼのアミノ基が反応に関与し、担体（ゲ
ル状物）のアルデヒド基とさらにシツフベースを
形成し固定化される。このようにしてこの発明の
グルコースオキシダーゼ固定化ゲル状物（固定化
酵素）が得られた。 このようにして得られた固定化酵素の活性の経
時変化をポーラログラフイーで測定した結果を第
１図に示す。なお測定条件は以下の通りである。 試験液：β−Ｄ（＋）−グルコース300mg 測定温度：28℃ 保存温度：４℃ なお、測定は固定化酵素１ｇを試験液11mlと共
に５分間撹拌混合し、その10mlをメンブランフイ
ルターで別した後滴下水銀電極によるポーラロ
グラフイーで行なつた。酸素反応で発生した
H₂O₂の半波電位は0.85（vs）Ag／AgCl電極とし
た。 このように２ケ月半を経過してもその活性に変
化は見られなかつた。 一方、同様にして、フツ素原子を導入しないゲ
ル状担体を用いた固定化酵素との比較を行なつた
結果を第２図に示す（１は実施例、２は比較例）。
このように、フツ素原子を導入しない同様な固定
化酵素に比してこの発明の固定化酵素は約2.5倍
の活性を有することが判る。 実施例 ２ 実施例１と同様にしてHF／Si（CO₂H₅）₄がモル
比で0.1〜0.5の条件下で反応を行ないこの発明の
多孔性ゲル状担体をそれぞれ得た。これらの担体
について前記と同様にしてグルコースオキシダー
ゼを固定化して固定化酵素を得た。これらの固定
化酵素の活性と前記モル比との関係を第３図に示
す。なお活性の測定も前記に準じた。 このように、酵素活性が担体製造時のフツ化水
素酸の量に影響を受けており、ことにモル比が
0.2近傍で最大活性（ブランクに比して約７倍程
度）が示されていることが判る。また、担体製造
時に塩酸等の無機酸を添加することが好ましいこ
とが判る。 なお、モル比0.1及び0.5の際に得られる多孔性
ゲル状担体のSEM像（20000倍）を第４図及び第
５図に示した。また、第６図はフツ素原子を導入
していない多孔性ゲル状担体のSEM像（20000
倍）である。このように、この発明の担体はその
表面多孔度もフツ素原子を導入していないものに
比してより多孔であることが判る。 実施例 ３ 実施例２で得られた多孔性ゲル状担体（ガラス
ビーズ状）のESCA（Ｘ線光電子スペクトル）に
よる分析チヤートを第７図に示す。（Ａは走査速
度2eV／secであり、Ｂは走査速度1eV／secであ
る）。なお、ESCAの測定条件は以下の通りであ
る。 ターゲツト：Ｍｇ 加速電圧：8kV フイラメント：30ｍＡ Arエツチング条件： 加速電圧 2kV エミツシヨン 30ｍＡ 時間 15分 このように、結合エネルギーが700eV近傍にフ
ツ素原子によるピークが観察されることから、フ
ツ素原子が化学的に結合していることが判る。ま
た、表１は、ESCAのスペクトルのF_1SとSi_2Sピー
クの強度比をバルクステートとパウダーステート
で比較したもので、両者の強度比の値が近接して
いることから、この発明の多孔性ゲル状担体は、
表面のみならず全体がフツ素化合物になつている
ことが判る。 【表】

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の固定化酵素の活性の経時変
化を示すグラフ、第２図は同じくグルコースの濃
度に対する活性の変化を比較例と共に示すグラ
フ、第３図はこの発明の固定化酵素におけるフツ
素原子導入による影響を示すグラフ、第４図及び
第５図はこの発明の多孔性ゲル状担体の多孔性表
面をそれぞれ例示する走査型電子顕微鏡（SEM）
による拡大写真、第６図は比較例のゲル状担体の
多孔性表面を例示するSEMによ拡大写真、第７
図はこの発明の多孔性ゲル状担体のESCAスペク
トルを例示するグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アルコキシシランを加水分解して生成するガ
   ラス様ゲル状の水酸化金属化合物及び／又はその
   縮合物における一部の水酸基がフツ素原子で置換
   されてなる活性の優れた多孔性ゲル状酵素固定化
   用担体。 ２ シランカツプリング剤を介して固定化された
   酵素を有する特許請求の範囲第１項記載の酵素固
   定化用担体。