JPH0370471B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規なβ−マンノシダーゼと、その製
造法に関するものである。更に詳しくは、新規な
バチルス属に属するアリカリ側に生育の至適PHを
有する好アルカリ性の微生物を培養して得られる
酵素反応の至適PHを中性近傍に有する菌体内β−
マンノシダーゼと、その製造法に関するものであ
る。 従来の技術 β−マンノシダーゼは、分子内にβ−マンノシ
ド結合を有する低分子のβ−Ｄ−マンナン（マン
ナングルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラク
トグルコマンナン）に作用し、非還元末端部位か
ら順次マンノシド結合を加水分解し、マンノース
を生成する酵素である。 上記のβ−Ｄ−マンナンを含むものとしてはア
イボリーナツツ（学名：フイテレフアス・マクロ
カルパ）やコロゾがよく知られている。その他、
β−１，４−マンナン含有植物としては、ヤシ科
のフオエニクス・カナリエシス、オーキス・マキ
ユラタなどが知られている。 ガラクトマンナンとしてはイナゴマメやグアー
の種子に含まれる各粘質物、ローカストビーンガ
ム及びグアーガムが代表的なものであり、この二
種のガラクトマンナンは、工業的にそのままある
いは化学的な改質を施して、広く使用されてい
る。また、ガラクトマンナンは大豆、コーヒー
豆、ムラサキウマゴヤシ、アカツメクサ、コロハ
などマメ科の植物にも多く含まれている。その他
のガラクトマンナン含有植物としては、ゲニス
タ・スコパリア、グレデイツシヤ・フエロクス、
レウカエナ・グラウカなどが知られている。 グルコマンナン含有物としてはコンニヤク（学
名：アモルフオフアラス・コンニヤク）が最も有
名であるが、サトイモ科のアルム根、マツ属のジ
ヤツクパイン、ラン科の球根、エゾマツやハリモ
ミなどのトウヒ属の植物などが知られている。そ
の他のグルコマンナン含有植物としては、アスパ
ラガス・オフイシナリス、エレムラス・フスカ
ス、エレムラス・レゲリー、エレムラス・スペク
タビリス、フアセオラス・アウレウスなどが知ら
れている。グルコマンナンはこれら植物などから
アルカリ抽出法等により得られている。また、こ
れらβ−Ｄ−マンナンは糊料あるいは増粘剤とし
て食品工業や繊維産業で工業的に大量に消費され
ている。 従来、これらβ−Ｄ−マンナンの非還元末端か
らマンノース単位で加水分解する酵素として知ら
れているβ−マンノシダーゼは、動物〔バイオケ
ミストリー（Biochemistry），1972，11，1493〜
1501：バイオシミカ エ バイオフイジカ アク
タ（Biochim.Biophys.Acta），1973，268，488〜
496：バイオシミカ エ バイオフイジカ アク
タ（Biochim.Biophys.Acta），1973，315，123〜
127〕、植物〔ジヤーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（J.Biol.Chem.），1964，239，990
〜992〕、微生物〔バイオシミカ エ バイオフイ
ジカ アクタ（Biochim.Biophys.Acta），1978
522，521〜530：特開昭51−38486号）〕などの酵
素が良く研究されている。 しかしながら、これらの酵素はいずれも生産性
が低く、培養法・精製法が煩雑なものが多く、該
酵素を工業的に安価に使用する場合に難点を残し
ていた。 発明が解決しようとする問題点 天然界に再生可能な資源として大量に存在する
β−Ｄ−マンナンの有効利用、特に該物質の酵素
的加水分解によるマンノオリゴ糖やマンノース、
グルコース、ガラクトースなどの糖類を効率良く
回収・利用するためには、安定性に優れ、酵素の
精製が容易であることが好ましい。 しかしながら、動物、植物、微生物などの各種
の起源を持つ従来提案されていたβ−マンノシダ
ーゼは、既に述べたように、該酵素の生産性の点
で不十分であり、その製法、精製法も複雑で実用
化するには依然として不満足なものであつた。 従つて、上記の如き製造・精製の容易な、しか
も高い安定性を有するこの種の酵素を新たに開発
することは、デンプンと共に天然界に大量に存在
する再生利用可能なβ−マンナンを分解し、ある
いは分解生成物（マンノース等）を回収・利用す
る上で極めて大きな意義をもつ。 そこで、本発明の第１の目的は上記の各種要件
を満足する新規な酵素、β−マンノシダーゼを提
供することにある。 本発明の他の目的は、簡単かつ高い収率で該酵
素を得ることのできる新規な微生物を用いたβ−
マンノシダーゼの製造方法を提供することにあ
る。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、工的に使用するためのβ−マン
ノシダーゼが具備すべき上記諸性質を有する酵素
を生産する能力を持つ微生物を得るべく広く天然
界を検索した結果、アルカリ性に生育の至適PHを
有し、バチルス属に属するいくつかの細菌が上記
要件を備えたβ−マンノシダーゼ産生能を有し、
うかも、これを生産性良く生成することを見出
し、本発明を完成したものである。 本発明の第１の観点によつて提供される新規β
−マンノシダーゼは、下記のような理化学的諸特
性を有している： (イ) 作用： 非還元末端から順次β−マンノシド結合を加
水分解し、マンノースを生成する。 (ロ) 基質特異性： β−メチル（メチル）−Ｄ−マンノシドを完
全に分解し、又β−結合のマンノースを含むオ
リゴ糖に作用しマンノースを遊離する。ｐ−ニ
トロ−フエニル−グリコシドのβ−Ｄ−マンノ
シドを基質となしうるが、α−Ｄ−マンノシ
ド，α−Ｄ−グルコシド，α−Ｄ−グルコシ
ド，α−Ｄ−ガラクトシド，β−Ｄ−ガラクト
シド，β−Ｄ−キシロシド，α−Ｌ−フコシ
ド，β−Ｄ−グルクロニドを基質となし得な
い。 (ハ) 至適PHおよび安定PH範囲： 至適PHは６〜７であり、40℃、30分間の加熱
条件下ではPH６〜９の範囲内で安定である。 (ニ) 温度に対する安定性： PH6.5、30分間の加熱条件下では45℃まで安
定である。 (ホ) 作用適温の範囲： 40℃の近傍に至適作用温度を有する。 (ヘ) 失活条件： 40℃、30分間の処理条件下ではPH5.0および
10で完全に失活する。また、PH6.5、30分間の
処理では、55℃で完全に失活する。 (ト) ゲルろ過法による分子量： 68000±3000。 上記の新規β−マンノシダーゼは、本発明の第
２の観点によつて提供されるその製造方法によつ
て得ることができる。すなわち、上記β−マンノ
シダーゼは、バチルス属に属する上記β−マンノ
シダーゼを菌体内生産する微生物を培養後、集菌
して、これを分離・精製することを特徴とする方
法によつて得ることができる。 本発明の方法において使用する新規菌体内β−
マンノシダーゼ生産菌株は本発明者等により新た
に天然界から検索・単離されたものである。この
菌株をバージエーズ マニユアル オブ デター
ミナテイブ バクテリオロジー（Bergey′S
Mannual of Determinative Bacteriology）、第
８版およびザ・ジ−ナス・バチルス〔The
Genus Bacillus］米国、デパートメント オブ
アグリカルチヤー（Dept.of Agricultuer）版
に従つて同定すると、好気性有胞子桿菌であり、
運動性があり、周べん毛を有し、グラム染色陽性
もしくはバリアブル、カタラーゼテスト陽性であ
ることから、バチルス（Bacillus）属する属する
ことは明らかであつたが、PH7.5〜11.5のアルカ
リ性で良く生育することから、既知のバチルス属
菌とは分類上異なる新菌株と考えられた。 以下の第１表に、単離した菌体内β−マンノシ
ダーゼ生産菌の菌学的諸性質を示す。 【表】 【表】 (注) ＋：生育する又は陽性
−：生育しない又は陰性
尚、上記菌は工業技術院微生物工業技術研究所
にFERMP−8859（AS−420）として寄託してい
る。 次に、本発明の新規な菌体内β−マンノシダー
ゼの製造法につき更に詳しく説明する。 本発明では、上記のような菌体内β−マンノシ
ダーゼ生産菌を適当な培地に接種し、該菌体の生
育温度の観点から30〜40℃にて、48〜72時間、好
気的に培養する。 ここで、培地は炭素源、窒素源の他、必要に応
じて無機塩、微量栄養素を含むものである。 まず、炭素源としては従来公知の各種材料を使
用することができ、例えばコンニヤク粉、ローカ
ストビーンガム、キヤロブガム、グアーガムある
いはこれらを含有する植物などを典型例として例
示できる。 また、窒素源としても特に制限はなく、酵母エ
キス、ペプトン、肉エキス、コーンステイープリ
カー、アミノ酸液、大豆粕などの有機態窒素、あ
るいは硫安、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ムなどの無機窒素などが安価かつ入手容易なもの
として例示できる。 尚、有機態窒素源は炭素源となることはいうま
でもない。更に、このような炭素源、窒素源の他
に一般に使用されている各種の塩、例えばマグネ
シウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩等の無機
塩、ビタミンなどを添加することも可能である。 本発明の方法において使用するのに適した培地
は、例えば１％のコンニヤク粉、２％のポリペプ
トン、0.2％の酵母エキス、0.1％のK₂HPO₄およ
び0.2％のMgSO₄・7H₂Oを含有する液体培地で
あり得る。 また、本発明の方法で使用する微生物の生育PH
は塩基性の範囲内であるので、適当なアルカリを
用いて上記培地のPH値を調整する必要がある。そ
のために0.5％炭酸水素ナトリウムを典型例とし
て上げることができるが、これに限定されず水酸
化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウ
ム、リン酸ナトリウム、水酸化カリウムなどのア
ルカリ試薬も使用できる。 本発明の方法において使用する菌はいずれもβ
−マンノシダーゼを菌体内に生産し、そこに蓄積
する。これら菌の培養はバツチ式、連続式のいず
れによつても実施することができ、生成する酵素
の分離・精製は例えば以下のようにして実施する
ことができる。 即ち、まず培養液中の菌体を遠心分離、濾過な
どの公知の手段で集菌した後、得られた菌体をそ
のままマンノオリゴ糖の加水分解反応に使用する
ことも可能であり、これは経済的に有利である。 また、勿論これを更に精製して使用することも
できる。そのために、例えば菌体破砕抽出後、硫
安による塩析、エタノール、アセトン、イソプロ
パノール等による溶媒沈澱法、限外濾過法、ゲル
濾過法、イオン交換樹脂等による一般的な酵素精
製法により精製することができる。 以下に、本発明のβ−マンノシダーゼの好まし
い精製法の１例を説明する。 好アルカリ性バチルス属に属する上記のAS−
420菌株を、例えば、上記のような培地に植菌し、
37℃にて48時間好気的に培養して得られる培養液
を、12000r.p.m、０℃にて30分間遠心分離して菌
体を集め、湿重量10ｇの菌体を得る。次いで該菌
体を永水中で冷却しながら10mM燐酸緩衝液（PH
7.0）に懸濁して超音波破砕を数回に分け、計３
分間程度行う。次いで、12000r.p.m、０℃にて30
分間遠心分離して残渣を除き、上澄液50mlを得
る。次いで、該上澄液に酸アンモニウムを加えて
75％飽和とし、４℃で一夜放置する。生じた沈澱
を濾別し、10mM燐酸緩衝液（PH7.0）に溶解さ
せ、一夜４℃で同緩衝液に対して透析する。 生じた沈澱を遠心分離して除き、得られた上澄
液を同上緩衝液で平衡化したDEAD−トヨパー
ル650Mに吸着させ、0.1〜0.5MのNaClを含む同
上緩衝液の濃度勾法によつて酵素を溶出する。溶
出した活性画分を集め、同緩衝液に対して一夜、
４℃で透析した後、同上緩衝液で平衡化したハイ
ドロオキシアパタイトに吸着させる。次いで、
0.4Mリン酸緩衝液（PH8.0）で酵素を溶出させ、
活性画分を集めて、平均分画分子量10000の限外
濾過膜を用いて濃縮する。濃縮酵素は、高速液体
クロマトグラフ用蛋白質分取精製用カラムシヨデ
ツクス プロテイン（SHODEX protein）WS−
2003に充填し、10mMリン酸緩衝液（PH7.0）を
用いて溶出する。かくして得られた活性画分を濃
縮した後、同上カラムを用いて同一条件で再度ク
ロマトグラフイーにかけ、得られた活性画分を濃
縮し、ポリアクリルアミドゲルデイスク電気泳動
法〔アナルズ ニユーヨーク アカデミツク サ
イエンス（ANN.N.Y.Acad.Sci.），121，404
（1964）〕によつて均一な酵素標品15mgが得られ
る。活性収率は18％であつた。 なお、β−マンノシダーゼ活性の測定法とその
活性表示法は以下の通りである。 即ち、0.2Mの燐酸緩衝液（PH7.0）0.2mlと
8mMのｐ−ニトロフエニル−β−Ｄ−マンノピ
ラノシド水溶液0.2mlに酵素液0.1mlを混合し、40
℃で10分間反応させた後、0.5Mの炭酸ナトリウ
ム水溶液1.0mlを添加して酵素を失活させた後、
水を加えて3mlにする。着色度を紫外光（波長
420nm）で1μmol／mlのｐ−ニトロフエノールを
標準として測定する。 酵素活性の単位は、前述の条件下で１分間に
1μmolのｐ−ニトロフエノールを遊離させる酵素
量を１単位として表示する。 本発明の方法によつて得られるβ−マンノシダ
ーゼの分子量は68000±3000である。尚、この分
子量はゲル濾過法で求めたものである。 本発明のβ−マンノシダーゼおよび従来公知の
微生物由来のβ−マンノシダーゼの理化学的性質
および酵素化学的性質を比較して第２表に示す。 【表】 作 用 β−Ｄ−マンナンは様々な植物中に比較的多量
に含まれており、種々の分野においてそのまま、
または化学的改質処理を施した後、糊料、増粘
剤、食品材料として工業的に利用されている。 このβ−Ｄ−マンナンを例えば繊維産業におい
て糊料などとして使用した場合には、所定の加工
処理の終了後に除去されるが、その場合、一般に
その分解酵素、β−マンノシダーゼ等が使用され
る。また、β−Ｄ−マンナンを加水分解し、得ら
れる分解生成物を利用する場合にもこの種の酵素
が利用される。 しかしながら、従来知られているβ−マンノシ
ダーゼはいずれも生産性が低く、培養法・精製法
の煩雑なものが多かつた。そのため高価であり、
上記のような工業的な大規模利用は困難であつ
た。 更に、β−Ｄ−マンナンの抽出工程は一般にア
ルカリ側で実施されるが、このような場合にはア
ルカリ性で既知の酵素よりも安定であり、至適PH
も高い酵素を使用することが有利である。即ち、
酸性側に至適PHをもつ従来の酵素では、分解反応
を行う前に中和剤で抽出液のPH調節を行う必要が
あり、これは工程を複雑化するばかりか、コスト
高なものとしてしまう。 従つて、量産可能な方法の開発が必要であり、
また既知の酵素よりも高い至適PHをもつ酵素の開
発が必要である。 本発明者等の見出した特定の微生物によれば上
記のβ−Ｄ−マンナンの分解に係る要件をいずれ
も満足する酵素を多量に得ることが可能であり、
従来の諸問題点を一挙に解決できる。 即ち、量産性とコストの問題は、本発明により
新たに見出された親菌株を用いることにより簡単
な方法で大量に、しかも、安価に得ることができ
るので、克服できる。従つて、大規模な工業的利
用が可能となる。 また、得られる酵素のマンナン分解反応におけ
る至適PHが中性近傍にあるので、マンナンの抽出
処理後、わずかなPH調節を施した後に即座に次の
分解反応に移行することができる。従つて、分解
操作が簡略化されると共に経済的にも有利にな
る。 以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明
する。 実施例 １ 工業技術院微生物工業技術研究所にFERMP−
8859として寄託された好アルカリ性細菌バチルス
AS−420株を500ml容の三角フラスコ中の、グア
ーガム0.5％、コーンステイープリカー５％、硫
安0.1％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄・7H₂O0.02％
および炭酸ソーダ0.25％を含む培養液100ml（PH
9.5）に植菌し、37℃で48時間、200r.p.m.で振と
う培養した。ついで、該培養液を12000rpmで、
０℃にて30分間遠心分離して菌体を回収し、5ml
の10mM燐酸緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機
で菌体を破砕した。次いで、この菌体破砕液を
12000rpmにて０℃で30分間遠心分離し、得られ
た上澄液のβ−マンノシダーゼ活性を測定した結
果、16単位／mlであつた。 発明の効果 以上詳しく述べたように、本発明によればアル
カリ側に酵素反応の至適PHを有するβ−Ｄ−マン
ナンの加水分解酵素の１つ、即ちβ−マンノシダ
ーゼが提供され、このものを使用することにより
β−Ｄ−マンナンを高い効率で、しかも簡単かつ
経済的な工程で分解し、不用となつたマンナンを
迅速に除去でき、あるいは目的とする分解生成物
を量産することができる。 また、本発明のβ−マンノシダーゼの製造方法
によれば、該酵素を高い生産性で簡単に得ること
ができる。従つて、該酵素を安価に工業的規模で
利用することが可能となる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有する新規β−マンノ
   シダーゼ： (イ) 作用： 非還元末端から順次β−マンノシド結合を加
   水分解し、マンノースを生成する。 (ロ) 基質特異性： β−メチル（エチル）−Ｄ−マンノシドを完
   全に分解し、又β−結合のマンノースを含むオ
   リゴ糖に作用しマンノースを遊離する。ｐ−ニ
   トロ−フエニル−グリコシドのβ−Ｄ−マンノ
   シドを基質となしうるが、α−Ｄ−マンノシ
   ド，α−Ｄ−グルコシド，β−Ｄ−グルコシ
   ド，α−Ｄ−ガラクトシド，β−Ｄ−ガラクト
   シド，β−Ｄ−キシロシド，α−Ｌ−フコシ
   ド，β−Ｄ−グルクロニドを基質となし得な
   い。 (ハ) 至適PHおよび安定PH範囲： 至適PHは６〜７であり、40℃、30分間の加熱
   条件下ではPH６〜９の範囲内で安定である。 (ニ) 温度に対する安定性： PH6.5、30分間の加熱条件下では45℃まで安
   定である。 (ホ) 作用適温の範囲： 40℃の近傍に至適作用温度を有する。 (ヘ) 失活条件： 40℃、30分間の処理条件下ではPH5.0および
   10で完全に失活する。また、PH6.5、30分間の
   処理では、55℃で完全に失活する。 (ト) ゲルろ過法による分子量： 68000±3000 ２ 工業技術院微生物工業技術研究所にFERMP
   −8859（AS−420）として寄託された菌が生産し
   たものであることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項に記載のβ−マンノシダーゼ。 ３ 下記の理化学的性質： (イ) 作用： 非還元末端から順次β−マンノシド結合を加
   水分解し、マンノースを生成する。 (ロ) 基質特異性： β−メチル（エチル）−Ｄ−マンノシドを完
   全に分解し、又β−結合のマンノースを含むオ
   リゴ糖に作用しマンノースを遊離する。ｐ−ニ
   トロ−フエニル−グリコシドのβ−Ｄ−マンノ
   シドを基質となしうるが、α−Ｄ−マンノシ
   ド，α−Ｄ−グルコシド，β−Ｄ−グルコシ
   ド，α−Ｄ−ガラクトシド，β−Ｄ−ガラクト
   シド，β−Ｄ−キシロシド，α−Ｌ−フコシ
   ド，β−Ｄ−グルクロニドを基質となし得な
   い。 (ハ) 至適PHおよび安定PH範囲： 至適PHは６〜７であり、40℃、30分間の加熱
   条件下ではPH６〜９の範囲内で安定である。 (ニ) 温度に対する安定性： PH6.5、30分間の加熱条件下では45℃まで安
   定である。 (ホ) 作用適温の範囲： 40℃の近傍に至適作用温度を有する。 (ヘ) 失活条件： 40℃、30分間の処理条件下ではPH5.0および
   10で完全に失活する。また、PH6.5、30分間の
   処理では、55℃で完全に失活する。 (ト) ゲルろ過法による分子量： 68000±3000 を有するβ−マンノシダーゼ生産能を有し、アル
   カリ側に生育の至適PHを有するバチルス属に属す
   る微生物を培養し、該β−マンノシダーゼを菌体
   内に生成・蓄積させ、これを採取することを特徴
   とする新規菌体内β−マンノシダーゼの製造方
   法。 ４ 上記培養を30〜45℃の範囲内の温度下で好気
   的に行うことを特徴とする特許請求の範囲第３項
   記載の菌体内β−マンノシダーゼの製造方法。 ５ 上記培養液のPHが7.5〜11.5の範囲内にある
   ことを特徴とする特許請求の範囲第３項または第
   ４項記載の菌体内β−マンノシダーゼの製造方
   法。 ６ 上記微生物が工業技術院生物工業技術研究所
   にFERMP−8859（AS−420）として寄託された
   菌がであることを特徴とする特許請求の範囲第３
   項から５項のいずれか一項に記載のβ−マンノシ
   ダーゼの製造方法。