JPS6336779A - β−マンノシダ−ゼおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規なβ−マンノシダーゼ並びにその製造法に
関する。更に詳しくは、新規なバチルス属に属し、アル
カリ側に生育の至適ｐＨを有する好アルカリ性の微生物
を培養して得られ、酵素反応の至適ｐＨを中性近傍に有
する菌体内β−マンノシダーゼおよびその製造法に関す
る。

従来の技術 β−マンノシダーゼは、分子内にβ−マンノシド結合を
有する低分子のβ−Ｄ−マンナン（マンナン、グルコマ
ンナン、ガラクトマンナン、ガラクトグルコマンナン）
に作用し、非還元末端部位から順次マンノシド結合を加
水分解し、マンノースを生成する酵素である。

まず、β−Ｄ−マンナンを含むものとして、アイポリ−
ナツツ（学名：フイテレファス・マクロカルバ）やコロ
ゾがよく知られている。その他β−１，４−マンナン含
有植物としてはヤシ利のフオエニクス・カナリエンシス
、オーキス・マキュラタなどが知られている。

ガラクトマンナンはイナゴマメおよび、グアーの種子に
含まれる各粘質物、ローカストビーンガム及びグアーガ
ムが代表的なものであり、この二種のガラクトマンナン
は、工業的にそのままあるいは化学的な改質をほどこし
、広く使用されている。また、ガラクトマンナンは大豆
、コーヒー豆、ムラサキウマゴヤシ、アカツメフサ、コ
ロハなどマメ科の植物にも多く含まれている。その他の
ガラクトマンナン含有植物としては、ゲニスタ・スコパ
リア、ダレデイラシャ・フエロラス、レウカエナ・グラ
ウカなどが知られている。

グルコマンナン含有物としてはコンニャク（学名ニアモ
ルフオファラス・コンニャク）が最も有名であるが、サ
イトモ科のアルム根、マツ属のジャックパイン、ラン科
の球根、ニジマツやハリモミなどのトウヒ属の植物など
が知られている。その他のグルコマンナン含有植物とし
ては、アスパラガス・オフィシナリス、エレムラス・フ
スカス、エレムラス・レゲリー、エレムラス・スペクク
ビリス、ファセオラス・アウレウスなどが知られている
。グルコマンナンはこれら植物などからアルカリ抽出法
等により得られている。また、これらβ−Ｄ−マンナン
は糊料あるいは増粘剤として食品工業や繊維産業で工業
的に大量に消費されている。

従来、これらβ−Ｄ−マンナンの非還元末端からマンノ
ース単位で加水分解する酵素として知られているβ−マ
ンノシダーゼは、動物〔バイオケミストリー（Ｂｉｏ’
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　１９７２．１１　、１４９３
〜１５０１：バイオシミカ　エ　バイオフィジカ　アク
タ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）、　
１９７３．２６８　、４８８〜４９６：バイオシミカ　
エ　バイオフィジカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、１９７３，３１５．１２：
３〜１２７）、植物〔ジャーナル　オブ　バイオロジカ
ルケミスト　リ　−（Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ
、）、１９６４．　２３９　．９９０−９９２１　　、
微生物〔バイオシミカエバイオフィジカアクタ　（Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　）、１９７８
，５２２．５２１〜５３０；特開昭５１−３８４８６号
）〕などの酵素が良く研究されている。

、しかしながら、これらの酵素はいずれも生産性が低く
、培養法・精製法が煩雑なものが多く、該酵素を工業的
に安価に使用する場合に難点を残していた。

発明が解決しようとする問題点 天然界に再生可能な資源として大量に存在するβ−Ｄ−
マンナンの有効利用、特に該物質の酵素的加水分解によ
るマンノオリゴ糖やマンノース、グルコース、ガラクト
ースなどの糖類を効率良く回収・利用するためには、安
定性に侵れ、酵素の精製が容易であることが好ましい。

しかしながら、動物、植物、微生物などの各種の起源を
持つ従来提案されていたβ−マンノシダーゼは、既に述
べたように、該酵素の生産性の点で不十分であり、その
製法、精製法も複雑で実用化するには依然として不満足
なものであった。

従って、上記の如き製造・精製の容易な、しかも高い安
定性を有するこの種の酵素を新たに開発することは、デ
ンプンと共に天然界に大量に存在する再生利用可能なβ
−マンナンを分解し、あるいは分解生成物（マンノース
等）を回収・利用する上で極めて大きな意義をもつ。

そこで、本発明の第１の目的は上記の各種要件を満足す
る新規な酵素、β−マンノシダーゼ、を提供することに
ある。また、簡単かつ高い収率で該酵素を得ることので
きる、新規な微生物を用いたβ−マンノシダーゼの製造
方法は本発明のもう一つの目的を構成する。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、工業的に使用するためのβ−マンノシダ
ーゼが具備すべき上記諸性質を有する酵素を生産する能
力を持つ微生物を得るべく広く天然界を検索した結果、
アルカリ性に生育の至適ｐＨを有し、バチルス属に属す
るいくつかの細菌が上記要件を備えたβ−マンノシダー
ゼ産生を有し、かつこれを生産性良く生成することを見
出し、本発明を完成したものである。

即ち、本発明は、まず新規β−マンノシダーゼを提供す
るものであり、これは以下のような理化学的緒特性を有
している。

（イ）作用： 非還元末端から順次β−マンノシド結合を加水分解し、
マンノースを生成する。

（ロ）基質特異性： β−メチル（エチル）−Ｄ−マンノシドヲ完全に分解し
、又β−結合のマンノースを含むオリゴ糖に作用しマン
ノースを遊離する。ｐ−ニトロ−フェニル−グリコシド
のβ−Ｄ−マンノシドを基質となしうるが、α−Ｄ−マ
ンノシド、α−Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルコシド、
α−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｄ
−キシロシド、α−Ｌニフコシド、β−Ｄ−グルクロニ
ドを基質となし得ない。

（ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは６〜７てあり、４０℃、３０分間の加熱条件
下ではｐＨ６〜９の範囲内で安定である。

（ニ）温度に対する安定性： ｐＨ６，５，３０分間の加熱条件下では４５℃まで安定
である。

（ホ）作用適温の範囲： ５０℃近傍に至適作用温度を有する。

（へ）失活条件： ４０℃、３０分間の処理条件下ではｐＨ５，０および１
０で完全に失活する。また、ｐＨ６，５，３０分の処理
では、５５℃で完全に失活する。

（ト）ゲルろ過法による分子潰： ６３、０００〜６８．０００ また、本発明は上記の新規β−マンノシダーゼの製法に
も関り、該β−マンノシダーゼはバチルス属に属し、上
記β−マンノシダーゼを菌体内生産する微生物を培養後
、集菌して、これを分離・精製することを特徴とする方
法によって得Ｚことができる。

本発明の方法において使用する新規菌体内β−マンノシ
ダーゼ生産菌株は本発明者等により新たに天然界から検
索・単離されたものである。これらの菌株をバージニー
ズ　マニュアル　オブ　デターミナティブ　バクテリオ
ロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’　ｓＭａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
）、第８版およびザ・ジーナス・バチルス［：Ｔｈｅ　
ＧｅｎｕｓＢａｃｉｌｌｕｓ　　米国、デパートメント
　オブ　アグリカルチャー　（Ｄｅｐｔ、　ｏｆ　Ａｇ
ｒｉｃａｌｔｕｒｅ）版〕に従って同定すると、いずれ
も好気性有胞子桿菌であり、運動性があり、周べん毛を
有し、ダラム染色陽性もしくはバリアプル、カタラーゼ
テスト陽性であることから、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属に属することは明らかであったが、ｐＨ７，５〜
１１．５のアルカリ性で良く生育することから、既知の
バチルス属菌どは分類学上異なる新菌株と考えられた。

以下の第１表に、単離した二種の菌体内β−マンノシダ
ーゼ生産菌の菌学的諸性質を示す。

尚、上記菌は工業技術院微生物工業技術研究所に、夫々
、Ｆ　Ｅ　ＲＭ　Ｐ　−８８５９（Ａ　Ｓ−４２０）お
よびＦ　Ｅ　ＲＭ　Ｐ　−８８６０（Ａ　Ｓ−４４０）
として寄託している。

本発明の新規な菌体内β−マンノシダーゼの製造法につ
き更に詳しく説明する。上記のような菌体内β−マンノ
シダーゼ生産菌を適当な培地に接種し、該菌体の生育温
度の観点から３０〜４０℃にて、４８〜７２時間、好気
的に培養する。ここで、培地は炭素源、窒素源の他、必
要に応じて無機塩、微量栄養素を含むものである。

まず、炭素源としては従来公知の各種材料を使用するこ
とができ、例えばコンニャク粉、ローカストビーンガム
、キャロブガム、グアーガムあるいはこれらを含有する
植物などを典型例として例示できる。

また、窒素源としても特に制限はなく、酵母エキス、ペ
プトン、肉エキス、コーンステイープリカー、アミノ酸
液、大豆粕などの有機態窒素、あるいは硫安、尿素、硝
酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機態窒素な
どが安価かつ人手容易なものとして例示できる。

尚、有機態窒素源は炭素源となることはいうまでもない
。更に、このような炭素源、窒素源の他、一般に使用さ
れている各種の塩、例えばマグネシウム塩、カリウム塩
、リン酸塩、鉄塩等の無機塩、ビタミンなどを添加する
ことも可能である。

本発明の方法において使用するのに適した培地は、例え
ば１％のコンニャク粉、２％のポリペプトン、０．２％
の酵母エキス、０．１％のに２８Ｐ０４および０．２％
のＭｇ５Ｏ＜・７Ｈ２０を含有する液体培地でありｉ尋
る。

また、本発明の方法で使用する微生物の生育ｐＨは塩基
性の範囲内であるので、適当なアルカリを用いて上記培
地のｐＨ値を調整する必要がある。そのために０．５％
炭酸水素ナトリウムを典型例として上げることができる
が、これに限定されず水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化カルシ
ウムなどのアルカリ試薬も使用できる。

本発明の方法において使用する菌はいずれもβ−マンノ
シダーゼを菌体内に生産し、そこに蓄積する。これら菌
の培養はバッチ式、連続式のいずれによっても実施する
ことができ、生成する酵素の分離・精製は例えば以下の
ようにして実施することができる。

即ち、まず培養液中の菌体を遠心分離、濾過などの公知
の手段で集菌した後、得られた菌体をそのままマンノオ
リゴ糖の加水分解反応に使用することも可能であり、こ
れは経済的に有利である。

また、勿論これを更に精製して使用することもできる。

そのために、例えば菌体破砕抽出後、硫安による塩析、
エタノール、アセトン、イソプロパツール等による溶媒
沈殿法、限外濾過法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂等に
よる一般的な酵素精製法により精製することができる。

以下に、本発明のβマンノシダーゼの好ましい精製法の
１例につき説明する。好アルカリ性バチルス属に属する
例えばＡＳ−４４０菌株を、例えば上記のような培地に
植菌し、３７℃にて４８時間好気的に培養して得られる
培養液を、１２．００Ｏｒ、ｐ、ｍ　、　０℃にて３０
分間遠心分離して菌体を集め、湿重量１０ｇの菌体を得
る。次いで該菌体を氷水中で冷却しなからｌ　Ｑ　ｍ　
ＩＡ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁して超音波破砕を
数回に分け、計３分間程度行う。次いて、１２．００Ｏ
ｒ、ｐ、ｍ、　０℃にて３０分間遠心分離して残渣を除
き、上澄液５０ｍ１を得る。次いで該上澄液に硫酸アン
モニウムを加えて７５％飽和とし、４℃で一夜放置する
。生じた沈澱をろ別し、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，
０）に溶解させ、−夜４℃で同緩衝液に対して透析する
。

生じた沈殿を遠心分離して除き、得られた上澄液を同上
緩衝液で平衡化したＤＥＡＤ−）ヨパール６５０Ｍに吸
着させ、０．１〜０．５ＭのＮａＣｌを含む同上緩衝液
の濃度勾配法によって酵素を溶出する。

溶出した活性画分を集め、同上緩衝液に対して一夜、４
℃で透析した後、同上緩衝液で平衡化したハイドロオキ
シアパタイトに吸着させる。ついで、０．４Ｍ’Ｊン酸
緩衝波緩衝液１８．０）で酵素を溶出させ、活性画分を
集めて、平均分画分子量１０．０００の限外濾過膜を用
いて濃縮する。濃縮酵素は、高速液体クロマトグラフ用
蛋白質分取精製用力うムジョデックス　プロティン（Ｓ
ｔｌＯＤ［ＥＸ　　ｐｒｏｔｅｉｎ）ＷＳ　−２００３
に充填し、１０ｍＭ’ｌン酸緩衝液（ｐＨ７，Ｏ）を用
いて溶出する。かくして得られた活性画分は濃縮した後
、同上刃ラムを用いて同一条件で再度クロマトグラフィ
ーにかけ、得られる活性画分を濃縮し、ポリアクリルア
ミドゲルディスク電気泳動法〔アナルズ　ニューヨーク
　アカデミツク　サイエンス（ＡＮＮ、　　Ｎ、　　Ｙ
、　　　Ａｃａｄ、　　　Ｓｃｉ、）、１２１．　　４
０４　　（１９６４）　　　：ｌ　　ｆごおいて均一な
酵素標品１５ｍｇが得られ活性収率は１８％であった。

なお、本発明の方法において有用なＡ　Ｓ−４２０菌株
についても上記方法と同様にして精製することができる
。

なお、β−マンノシダーゼ活性の測定法並びに活性表示
法は以下の通りである。

即ち、０．２Ｍの燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）　０．２ｍ
ｌと３ｍ！、１のｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マンノ
ピラノシド水溶液０．２ｍｌに酵素液０．１ｍｌを混合
し、４０℃で１０分間反応させた後、０．５Ｍの炭酸ナ
トリウム水溶液１．Ｏｍｌを添加して酵素を失活させた
後、水を加えて３ｍｌにする。着色度を紫外光（波長４
２０ｎｍ）で１μｍｏｌ　／ｍｌのｐ−ニトロフェノー
ルを標準として測定する。

酵素活性のｍ位は前述の条件下で１分間に１μｍｏｌの
ｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１単位とし
て表示する。

本発明の方法によって得られるβ−マンノシダーゼの理
化学的、酵素化学的性質は上記の他、各菌株Ａ　Ｓ−４
２０およびＡ　Ｓ−４４０から得られる酵素の分子量は
夫々６８．０００±３．０００、および６３．０００±
３．０００である。尚、これらの分子量はゲル濾過法で
求めたものである。

本発明のβ−マンノシダーゼおよび従来公知の微生物由
来のβ−マンノシダーゼの理化学的性質および酵素化学
的性質を比較して第２表に示す。

第２表　β−マンノシダーゼ 作用 β−Ｄ−マンナンは様々な植物中に比較的多量に含まれ
ており、種々の分野においてそのまま、または化学的改
質処理を施した後、糊料、増粘剤、食品材料として工業
的に利用されている。ところで、このβ−Ｄ−マンナン
を例えば繊維産業において糊料などとして使用した場合
、所定の加工処理の終了後除去されるが、その場合一般
にその分解酵素、β−マンノシダーゼ等が使用される。

また、β−Ｄ−マンナンを加水分解し、得られる分解生
成物を利用する場合にもこの種の酵素が利用される。

しかしながら、従来知られているβ−マンノシダーゼは
いずれも生産性が低く、培養法・精製法の煩雑なものが
多かった。そのため高価であり、上記のような工業的な
大規模利用は困難であった。

更に、β−Ｄ−マンナンの抽出工程は一般にアルカリ側
で実施されるが、このような場合にはアルカリ性で既知
の酵素よりも安定であり、至適ｐＨも高い酵素を使用す
ることが有利である。即ち、酸性側に至適ｐＨをもつ従
来の酵素では、分解反応を行う前に中和剤で抽出液のｐ
Ｈ調節を行う必要があり、これは工程を複雑化するばか
りか、コスト高なものとしてしまう。

従って、遺産可能な方法の開発が必要であり、また既知
の酵素よりも高い至適ｐＨをもつ酵素の開発が必要であ
る。

本発明者等の見出した特定の微生物によれば上記のβ−
Ｄ−マンナンの分解に係る要件をいずれも満足する酵素
を多量に得ることが可能であり、従来の諸問題点を一挙
に解決できる。

即ち、量産性並びにコストの問題は本発明により新たに
見出された親菌株を用いることにより克服でき、簡単な
方法で大量に得ることができ、しかも安価である。従っ
て、大規模な工業的利用が可能となる。

また、得られる酵素のマンナン分解反応における至適ｐ
Ｈが中性近傍にあるので、マンナンの抽出処理後わずか
なｐＨ調節を施した後即座に次の分解反応に移行するこ
とができる。従って、分解操作が簡略化されると共に経
済的にも有利になる。

実施例 以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。

実施例１ 好アルカリ性細菌バチルスＡＳ−４２０株（Ｆ［ＥＲＭ
　Ｐ−８８５９）を５００ｍ１容の三角フラスコ中の、
グアーガム０．５％、コーンステイープリカー５％、硫
安０．１％、Ｋ２ＨＰ０，０．１％、んＩｇｓＯ＜・７
８２００．０２％および炭酸ソーダ肌２５％を含む培養
液１００ｍ１　（ｐＨ９，５）に植菌し、３７℃で４８
時間、２０Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、　で振とう培養した。つ
いで、該培養液を１２．　ｏｏｏｒ、　ｐ、ｍｌ、０℃
にて３０分間遠心分離して菌体を回収し、５ｍｌの１０
＋ｔ＋Ｍ燐酸緩衝液に懸濁後、超音波破砕機にて菌体を
破砕した。づいで、この菌体破砕液を１２．０ＯＯｒ、
　ｐ、　ｍ。

にて０℃で３０分間遠心分離し、得られた上澄液のβ−
マンノシダーゼ活性を測定した結果、１６単位／ｍｌで
あった。

実施例２ 好アルカリ性細菌バチルスへＳ−０４４株（旺ＲＩＪ　
Ｐ−８８６０）を５００ｍ１容の三角フラスコ中の、や
し搾油カス２％、大豆カス１％、ＫＮＯ３０，２％、Ｎ
ａ２　ＨＰ　０４０．１％、ＭｇＳＯ３・７Ｈ２００，
０２％および炭酸ソーダ０．５％を含む培養液１００ｍ
１　（ｐＨ１０，０）に植菌し、４０℃で５０時間２５
０ｒ、　ｐｏｍ、で振とう培養した。ついで、この菌体
破砕液を１２．０ＯＯｒ、　ｐ、　ｍ、にて０℃で３０
分間遠心分離し、得られた上澄液のβ−マンノシダーゼ
活性を測定した結果、３８単位／ｍｌであった。

発明の効果 以上詳しく述べたように、本発明によればアルカリ側に
酵素反応の至適ｐＨを有するβ−Ｄ−マンナンの加水分
解酵素の１つ、即ちβ−マンノシダーゼが提供され、こ
のものを使用することによりβ−Ｄ−マンナンを高い効
率で、しかも簡単かつ経済的な工程で分解し、不用とな
ったマンナンを迅速に除去でき、あるいは目的とする分
解生成物を量産することができる。

また、本発明のβ−マンノシダーゼの製造方法によれば
、該酵素を高い生産性で簡単に得ることができる。従っ
て、該酵素を安価に工業的規模で利用することが可能と
なる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下の理化学的性質を有する新規β−マンノシダ
   ーゼ。 （イ）作用： 非還元末端から順次β−マンノシド結合を加水分解し、
   マンノースを生成する。 （ロ）基質特異性： β−メチル（エチル）−Ｄ−マンノシドを完全に分解し
   、又β−結合のマンノースを含むオリゴ糖に作用しマン
   ノースを遊離する。ｐ−ニトロ−フェニル−グリコシド
   のβ−Ｄ−マンノシドを基質となしうるが、α−Ｄ−マ
   ンノシド、α−Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルコシド、
   α−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｄ
   −キシロシド、α−Ｌ−フコシド、β−Ｄ−グルクロニ
   ドを基質となし得ない。 （ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは６〜７であり、４０℃、３０分間の加熱条件
   下ではｐＨ６〜９の範囲内で安定である。 （ニ）温度に対する安定性： ｐＨ６．５、３０分間の加熱条件下では４５℃まで安定
   である。 （ホ）作用適温の範囲： ５０℃近傍に至適作用温度を有する。 （ヘ）失活条件： ４０℃、３０分間の処理条件下ではｐＨ５．０および１
   ０で完全に失活する。また、ｐＨ６．５、３０分間の処
   理では、５５℃で完全に失活する。 （ト）ゲルろ過法による分子量： ６３，０００〜６８，０００
2. （２）以下の理化学的性質： （イ）作用： 非還元末端から順次β−マンノシド結合を加水分解し、
   マンノースを生成する。 （ロ）基質特異性： β−メチル（エチル）−Ｄ−マンノシドを完全に分解し
   、又β−結合のマンノースを含むオリゴ糖に作用しマン
   ノースを遊離する。ｐ−ニトロ−フェニル−グリコシド
   のβ−Ｄ−マンノシドを基質となしうるが、α−Ｄ−マ
   ンノシド、α−Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルコシド、
   α−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｄ
   −キシロシド、α−Ｌ−フコシド、β−Ｄ−グルクロニ
   ドを基質となし得ない。 （ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは６〜７であり、４０℃、３０分間の加熱条件
   下ではｐＨ６〜９の範囲内で安定である。 （ニ）温度に対する安定性： ｐＨ６．５、３０分間の加熱条件下では４５℃まで安定
   である。 （ホ）作用適温の範囲： ５０℃近傍に至適作用温度を有する。 （ヘ）失活条件： ４０℃、３０分間の処理条件下ではｐＨ５．０および１
   ０で完全に失活する。また、ｐＨ６．５、３０分間の処
   理では、５５℃で完全に失活する。 （ト）ゲルろ過法による分子量： ６３，０００〜６８，０００ を有するβ−マンノシダーゼ生産能を有し、アルカリ側
   に生育の至適ｐＨを有するバチルス属に属する微生物を
   培養し、該β−マンノシダーゼを菌体内に生成・蓄積さ
   せ、これを採取することを特徴とする上記新規菌体内β
   −マンノシダーゼの製造方法。
3. （３）上記培養を３０〜４５℃の範囲内の温度下で好気
   的に行うことを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の
   菌体内β−マンノシダーゼの製造方法。
4. （４）上記培養液のｐＨが７．５〜１１．５の範囲内に
   あることを特徴とする特許請求の範囲第２項または第３
   項記載の菌体内β−マンノシダーゼの製造方法。