JP2626663B2 - 新規なβ−マンノシダーゼの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なβ−マンノシダー
ゼ生産能を有するアルカリ側に生育の至適pHを有する好
アルカリ性の新規微生物を用いたβ−マンノシダーゼの
製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】β−マンノシダーゼは分子内にβ−マン
ノシド結合を有する低分子のβ−Ｄ−マンナン（マンナ
ン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラクトグル
コマンナン）に作用し、非還元末端部位から順次マンノ
シド結合を加水分解してマンノースを生成する酵素であ
る。

【０００３】β−Ｄ−マンナンを含むものとしてはアイ
ボリーナッツ（学名：フイテレフアス・マクロカルパ）
やコロゾがよく知られている。β−１，４−マンナン含
有植物としてはヤシ科のフオエニクス・カナリエンシ
ス、オーキス・マキユラタなどが知られている。ガラク
トマンナンはイナゴマメ及びグアーの種子に含まれる各
々の粘質物、ローカストビーンガム及びグアーガムが代
表的なものであり、この二種のガラクトマンナンは、そ
のままあるいは化学的な改質を施した後、工業的に広く
使用されている。また、ガラクトマンナンは大豆、コー
ヒー豆、ムラサキウマゴヤシ、アカツメクサ、コロハな
どマメ科の植物にも多く含まれている。その他のガラク
トマンナン含有植物としてはゲニスタ・スコパリア、グ
レデイツシャ・フエロクス、レウカエナ・グラウカなど
が知られている。グルコマンナン含有物としてはコンニ
ャク（学名：アモルフオフアラス・コンニャク）が最も
有名であるが、サトイモ科のアルム根、マツ属のジャツ
クパイン、ラン科の球根、エゾマツやハリモミなどのト
ウヒ属の植物などが知られている。その他のグルコマン
ナン含有植物としては、アスパラガス・オフィシナリ
ス、エレムラス・フスカス、エレムラス・レゲリー、エ
レムラス・スペクタビリス、フアセオラス・アウレウス
などが知られている。これらは、一般にアルカリ抽出法
などにより得られている。また、これらβ−Ｄ−マンナ
ンは糊料あるいは増粘剤として、食品工業や繊維産業で
工業的に大量に消費されているものである。

【０００４】従来、β−Ｄ−マンナンの非還元末端から
マンノース単位で加水分解する酵素として知られている
β−マンノシダーゼは、動物〔バイオケミストリー(Bio
chemistry), 1972, 11 , 1493〜1501：バイオシミカ
エ バイオフィジカ アクタ(Biochim. Biophys. Act
a), 1973, 268 , 488 〜 496：バイオシミカ エ バイ
オフィジカ アクタ(Biochim. Biophys. Acta), 1973,
315 , 123 〜 127〕、植物〔ジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリー(J. Biol. Chem.),1964,239 ,
990 〜 992〕、微生物〔バイオシミカ エ バイオフィ
ジカ アクタ(Biochim. Biophys. Acta), 1978, 522, 5
21〜530 ：特開昭51− 38486号）〕などの酵素が良く研
究されている。しかし、これらの酵素はいずれも生産性
が低く、培養法・精製法が煩雑なものが多く、該酵素を
工業的に安価に使用する場合に難点を残していた。

【０００５】天然界に再生可能な資源として大量に存在
するβ−Ｄ−マンナンの有効利用、特に該物質の酵素的
加水分解によるマンノオリゴ糖やマンノース、グルコー
ス、ガラクトースなどの糖類を効率良く回収・利用する
ためには、安定性に優れ、酵素の精製が容易であること
が好ましい。しかし、動物、植物、微生物などに起源を
持つ従来提案されていたβ−マンノシダーゼは、上記の
ような理由で工業的に大規模利用するには該酵素の生産
性の点で不十分であり、その製法、精製法も複雑で実用
化するには依然として不満足なものであった。従って、
製造・精製が容易で、しかも高い安定性を有するこの種
の酵素を新たに開発することは、デンプンと共に天然界
に大量に存在する再生利用可能なβ−マンナンを分解
し、あるいは分解生成物（マンノース、ガラクトース、
グルコース、マンノオリゴ糖等）を回収・利用する上で
極めて大きな意義をもつ。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は上記の
各種要件を満足する新規な酵素であるβ−マンノシダー
ゼを高い生産効率で生成する方法を提供することにあ
る。なお、上記の新規な酵素であるβ−マンノシダーゼ
は本出願人による昭和61年７月30日の特願平1-135468号
(特開平2-242678号公報) に記載されている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、工業的に
使用可能なβ−マンナナーゼが具備すべき上記諸性質を
有する酵素を生産する能力を持つ微生物を得るべく、広
く天然界を検索した結果、アルカリ性に生育の至適pHを
有するバチルス属に属するある種の新規微生物が上記要
件を備えた酵素を産生し、またこれを量産性良く産生す
ることを見出して本発明を完成した。本発明の対象は新
規微生物が生産する新規なβ−マンノシダーゼの製造方
法にある。

【０００８】上記新規微生物（ＡＭ−００１株）はβ−
マンナナーゼとβ−マンノシダーゼの生産能を有し、生
育の至適pHをアルカリ側に有するバチルス属に属する新
規微生物であり、微工研菌寄第8856号（ＦＥＲＭ Ｐ−
8856）で寄託されている。この新規菌株は本発明者が天
然界から新たに検索・単離されたものである。この菌株
をバージェーズ マニュアル オブ デターミナティブ
バクテリオロジー (Bergey's Mannual of Determinat
ive Bacteriology), 第８版およびザ・ジーナス・バチ
ルス〔The Genus Bacillus：米国、デパートメント オ
ブ アグリカルチャー (Dept. of Agricalture) 版〕に
従って同定すると、好気性有胞子桿菌であり、運動性が
あり、周べん毛を有し、グラム染色バリアブルであるこ
とからバチルス属(Bacillus sp.)に属することは明らか
であったが、pH 7.5〜11.5のアルカリ性で良く生育する
ことから、既知のバチルス属菌とは分類学上異る新菌株
と考えた。以下の表１に単離したβ−マンナナーゼ／β
−マンノシダーゼ生産菌（ＡＭ−００１株）の菌学的諸
性質を示す。

【０００９】

【表１】 β−マンナナーゼおよびβ−マンノシダーゼ生産菌株 （ＡＭ−００１）の菌学的性質 (1) 形態学的性質 形 状 桿 菌 サイズ 0.6 〜0.8 ×３〜５μｍ 運動性 有り（周べん毛） グラム染色 バリアブル 胞子のう わずかにふくらんでいる 胞子の形および寸法 楕円型で1.2 ×２μｍ 末端 (2) 各種培地での生育 肉汁液体培地 もろい菌環をつくり白濁 肉汁寒天平板 周辺全縁、凸円状、色は白濁 肉汁ゼラチン穿刺培養 ＋ グルコース・肉汁液体培地 による嫌気的生育 − 硝酸塩からの嫌気的ガスの生成 − 5.0 ％食塩肉汁液体培地 ＋ 7.5 ％食塩肉汁液体培地 − (3) 生化学的性質 ゼラチンとカゼインの加水分解 ＋ デンプンの加水分解 ＋ クエン酸の利用 ＋ (4) 生化学的性質 硝酸塩の還元 − ＶＰ−テスト − インドールの生成 − 硫化水素 − 無機窒素源の利用 − 色素の生成 − ウレアーゼ − オキシダーゼ − カタラーゼ ＋ 酸素に対する態度 − （嫌気） (4) 生育のpHと温度 生育pH 7.5〜11.5 生育温度 〜50℃ (5) 糖の資化 Ｌ−アラビノース、Ｌ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、 Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、マルトース、 ショ糖、 乳糖、トレ ハロース、ラフィノース、デンプン、グリセリン、Ｄ−ソルビット、Ｄ− マンニット、イヌリン、セルロースを資化する。 また、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、トレハロ ースにより酸を生成し、ガスは生成しない。 (注) ＋： 生育する又は陽性 −： 生育しない又は陰性

【００１０】この新規菌株は以下のようにしてスクリー
ニングした。この新規菌株の採取場所は国立市谷保の圃
場内における古ダタミの腐朽堆肥である。該堆肥カスを
水に懸濁し、上澄の一滴を以下組成の寒天培地に塗抹し
た。使用した寒天培地は寒天２％、 0.5％のNaＨＣ
Ｏ₃ 、ヤシ油抽出残渣１％、 0.5％のポリペプトン、
0.5％の酵母エキス、0.1 ％のＫ₂ＨＰＯ₄および0.02％
のMgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを含有する。この寒天平板培地で37
℃にて好気的に培養し、平板上に現われた各コロニーを
得、夫々のコロニーを更に寒天を除いた他は上記と同じ
組成の液体培地中で30〜40℃で48〜72時間好気的に培養
した。次いで、各培養液を12,000Ｇで10分間、４℃で遠
心分離し、菌体と上澄とに分離した。かくして得た上澄
液と、 0.1Ｍリン酸緩衝液（pH7.0)に菌体を懸濁させて
得られる懸濁液とから以下に述べるような活性測定法に
よりβ−マンナナーゼ活性を示すものを選んだ。その結
果、上記のような菌学的諸特性を有する菌株が分離でき
た。

【００１１】本発明の上記新菌株はβ−マンナナーゼを
菌体外に生産し且つβ−マンノシダーゼを菌体内に生産
する能力を有している。従って、この性質を利用してこ
れら酵素を有利に生産することができる。すなわち、本
発明のβ−マンナナーゼの製造方法は、上記新規菌株を
培養し、β−マンナナーゼを培養液中に生成・蓄積させ
且つβ−マンノシダーゼを菌体内に生成・蓄積させ、菌
体からβ−マンノシダーゼを採取することを特徴として
いる。

【００１２】この方法で得られるβ−マンノシダーゼは
以下のような理化学的特性を有している： （イ）作用：非還元末端から順次β−マンノシド結合を
加水分解し、マンノースを生成する （ロ）基質特異性：β−メチル（エチル）−Ｄ−マンノ
シドを完全に分解し、またβ−結合のマンノースを含む
オリゴ糖に作用しマンノースを遊離し、ｐ−ニトロフェ
ニル−グリコシドのβ−Ｄ−マンノシドを基質となし得
るが、α−Ｄ−マンノシド、α−Ｄ−グルコシド、β−
Ｄ−グルコシド、α−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｄ−ガラ
クトシド、β−Ｄ−キシロシド、α−Ｌ−フコシド、β
−Ｄ−グルクロニドを基質となし得ない （ハ）至適pHおよび安定pH範囲：至適pHは６〜７であ
り、40℃、30分間の加熱条件下ではpH６〜９の範囲内で
安定である （ニ）温度に対する安定性：pH 6.5、30分間の加熱条件
下では45℃まで安定である （ホ）作用適温の範囲： 50℃近傍に至適作用温度を有
する （ヘ）失活条件：40℃、30分間の処理条件下ではpH 5.0
および10で完全に失活し、また、pH6.5 、30分の処理で
は、55℃で完全に失活する （ト）ゲル濾過法による分子量： 63,000 ±3,000 。

【００１３】次に、本発明のβ−マンノシダーゼの新規
製造方法についてさらに詳しく説明する。上記のβ−マ
ンナナーゼ／β−マンノシダーゼ生産菌を適当な培地に
接種し、該菌体の生育温度の観点から30〜40℃で48〜72
時間、好気的に培養する。ここで培地は炭素源、窒素源
の他、必要に応じて無機塩、微量栄養素を含むものであ
る。炭素源としては従来公知の各種材料を使用すること
ができ、例えばコンニャク粉、ローカストビーンガム、
キャロブガム、グアーガムあるいはこれらを含有する植
物などを典型例として例示できる。窒素源としても特に
制限はなく、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
スティープリカー、アミノ酸液、大豆粕などの有機態窒
素、あるいは硫安、尿素、硝酸アンモニウム、塩化アン
モニウムなどの無機態窒素などが安価かつ入手容易なも
のとして例示できる。なお、有機態窒素源は炭素源とな
ることはいうまでもない。更に、これら炭素源、窒素源
の他に、一般に使用されている各種の塩、例えばマグネ
シウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩等の無機塩、ビ
タミンなどを添加することも可能である。本発明方法で
使用するのに適した培地は、例えば１％のコンニャク
粉、２％のポリペプトン、 0.2％の酵母エキス、 0.1％
のK₂HPO₄および 0.2％のMgSO₄ ・７Ｈ₂Ｏを含有する液
体培地にすることができる。また、上記微生物の生育pH
は塩基性の範囲内であるので、適当なアルカリを用いて
上記培地のpH値を調整する必要がある。そのためにpH調
整剤としては 0.5％炭酸水素ナトリウムを典型例として
拳げることができるが、これに限定されず、水酸化ナト
リウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、リン酸ナト
リウム、水酸化カルシウムなどのアルカリ試薬も使用で
きる。本発明方法で用いられる菌の培養はバッチ式、連
続式のいずれによっても実施することができる。

【００１４】上記菌株はβ−マンナナーゼを菌体外生産
するので、生産されたβ−マンナナーゼは培養液中に放
出され、そこに蓄積される。こうして生成した酵素をそ
のまま利用することもできる。例えば、培養液中の菌体
を遠心分離、濾過などで除去した後、得られる上澄液
（粗酵素液）をそのままβ−マンナンの加水分解反応に
適用することも可能である。これは経済的に有利な方法
である。

【００１５】また、生成した酵素を分離・精製して用い
ることもできる。この場合には、例えば菌体破砕・抽出
後、硫安による塩析、エタノール、アセトン、イソプロ
パノール等による溶媒沈澱法、限外濾過法、ゲル濾過
法、イオン交換樹脂等による一般的な酵素精製法により
精製することができる。以下に、β−マンノシダーゼの
好ましい精製法の１例を説明する。好アルカリ性バチル
ス属に属するＡＭ−００１菌株を、例えば上記のような
培地に植菌し、37℃で48時間好気的に培養して得られる
培養液を、０℃で30分間12,000r.p.m で遠心分離して菌
体を集め、湿重量10ｇの菌体を得る。次いで、該菌体を
氷水中で冷却しながら10mM燐酸緩衝液（pH7.0)に懸濁
し、超音波破砕を数回に分け、計３分間程度行う。次い
で、０℃で30分間 12,000 r.p.m で遠心分離して残渣を
除き、上澄液50mlを得る。この上澄液に硫酸アンモニウ
ムを加えて75％飽和とし、４℃で一夜放置する。生じた
沈澱を濾別した後、10ｍＭ燐酸緩衝液 (pH7.0)に溶解さ
せ、一夜４℃で同緩衝液に対して透析する。生じた沈澱
を遠心分離して除き、得られた上澄液を同上緩衝液で平
衡化したＤＥＡＥ−トヨパール 650Ｍに吸着させ、 0.1
〜0.5 ＭのNaClを含む同上緩衝液の濃度勾配法によって
酵素を溶出する。溶出した活性画分を集め、同上緩衝液
に対して一夜、４℃で透析した後、同上緩衝液で平衡化
したハイドロオキシアパタイトに吸着させる。次いで、
0.4Ｍリン酸緩衝液（pH8.0)で酵素を溶出させ、活性画
分を集めて、平均分画分子量10,000の限外濾過膜を用い
て濃縮する。濃縮酵素は、高速液体クロマトグラフ用蛋
白質分取精製用カラム、ショデックス プロテイン(SHO
DEX protein)WS-2003 で分離し、10ｍＭリン酸緩衝液
（pH7.0)を用いて溶出する。かくして得られた活性画分
を濃縮した後、同上カラムを用いて同一条件で再度クロ
マトグラフィーにかけ、得られた活性画分を濃縮し、ポ
リアクリルアミドゲルディスク電気泳動法〔アナルズ
ニューヨーク アカデミック サイエンス (ANN. N.Y.
Acad. Sci.),121, 404 (1964) 〕で均一な酵素標品11mg
が得られる。活性収率は17％である。このβ−マンノシ
ダーゼ活性の測定法と活性表示法は以下の通りである。
即ち、 0.2Ｍの燐酸緩衝液(pH7.0)0.2mlと、８mMのｐ−
ニトロフェニル−β−Ｄ−マンノピラノシド水溶液 0.2
mlとに酵素液 0.1mlを混合し、40℃で10分間反応させた
後、 0.5Ｍの炭酸ナトリウム水溶液 1.0mlを添加して酵
素を失活させ、その後、水を加えて３mlにする。着色度
を紫外光（波長 420nm) で１μmol/mlのｐ−ニトロフェ
ノールを標準として測定する。酵素活性の単位は上記の
条件下で１分間に１μmol のｐ−ニトロフェノールを遊
離させる酵素量を１単位として表示する。本発明のβ−
マンノシダーゼと従来公知の微生物由来のβ−マンノシ
ダーゼの理化学的性質と酵素化学的性質との比較表を表
２に示す。

【００１６】

【表２】 各種β−マンノシダーゼの比較表 起 源 Aspergillus Tremella AM−001 niger Fuciformis 至適pH 3.5 5 7.0 至適温度 55℃ ── 55℃ pH安定性 2.5 〜7.5 4.5〜6.5 6.0〜7.0 （37℃、２hr) ── (50℃、30mim) 温度安定性 ─ ── 45℃ 分子量 130,000 160,000〜200,000 63,000±3,000 ( ゲル濾過法） ｐＩ 4.7 ── 以下、本発明の実施例を説明する。

【００１７】

【実施例】実施例１ 500ml 容の三角フラスコ中にグアーガムを 0.5％、コー
ンスティープリカーを５％、硫安を 0.1％、Ｋ₂ＨＰＯ₄
を 0,1％、MgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを0.02％および炭酸ソーダ
を0.25％含む培養液100ml(pH9.5)に、本発明による好ア
ルカリ性細菌バチルスＡＭ−００１菌株(FERM P-8856)
を植菌し、37度で48時間、200 r.p.m.で振とう培養し
た。次いで、該培養液を０℃で30分間、12,000r.p.m.で
遠心分離して菌体と培養上澄とを回収した。回収した菌
体を５mlの10ｍＭ燐酸緩衝液に懸濁後、超音波破砕機に
て菌体を破砕した。ついで、この菌体破砕液を０℃で30
分間 12,000 r.p.m.で遠心分離して得られた上澄み液の
β−マンノシダーゼ活性を測定した。結果は14単位／ml
であった。

【００１８】

【発明の効果】天然界に比較的多量に存在するβ−Ｄ−
マンナンは、デンプンと同様にそのまま、または化学的
改質処理を施した後に糊料、増粘剤、食品材料等として
繊維、化粧品、食品、農薬等の各種分野において広く利
用されているが、このβ−Ｄ−マンナンを有効利用する
ためには、これを効率良く加水分解する酵素（βマンナ
ナーゼ、β−マンノシダーゼなど）を得る必要がある。
即ち、β−Ｄ−マンナンを高効率で加水分解し得る酵素
を得ることは、これを分解して有用なマンノオリゴ糖、
マンノース、グルコース、ガラクトースなどの糖類とし
て、これを回収、利用したり、あるいはβ−Ｄ−マンナ
ン自体として使用した後にこれを分解・除去するなどの
目的のために極めて重要である。このような用途におい
て、β−マンノシダーゼは高温安定性を有し、しかも中
性〜アルカリ性領域に酵素反応の至適pHを有するもので
あることが、工業的応用という観点から極めて望まし
い。しかし、このような目的で従来から種々起源のマン
ナン分解酵素が見出され、利用されてきたが、例えばβ
−マンナナーゼでは高温安定性に劣るものであったり、
酵素産生微生物の培養時間が著しく長いものであり、経
済性の観点すなわちβ−Ｄ−マンナンの分解効率の観点
から望ましいものとはいえなかった。本発明者等は種々
検索し、好アルカリ性バチルス属に属するある種の微生
物が有用なβ−マンナナーゼおよびβ−マンノシダーゼ
を高い生産率で同時に生産することを見出した。この酵
素は上記β−Ｄ−マンナンの加水分解反応における諸要
件を満足するものであり、従来知られていた各酵素の諸
問題点をいずれも解決するものであることが分かった。
即ち、先ず、本発明の新規微生物はβ−マンナナーゼを
菌体外生産するので、酵素の分離・精製は極めて容易で
あり、労力、製造コストの点で大巾な改善が期待でき
る。更に、この酵素は高温安定性に優れ、しかもアルカ
リ側（pH８〜10）に酵素反応の至適pHを有しているの
で、アルカリ条件下で行われる各種植物からのβ−マン
ナンの抽出操作後、従来のように酸性条件とするための
操作を施すことなくそのまま酵素分解反応に移行するこ
とが可能であり、作業性、経済性の点で大巾な改善が望
める。更に、本発明の上記微生物はβ−マンノシダーゼ
を菌体内生産し、このβ−マンノシダーゼははほぼ中性
領域に酵素反応の至適pHを有するので、上記のような抽
出操作後わずかなpH調節を施した後、次の分解反応に移
行することができる。また、この酵素はβ−マンナナー
ゼを含む培養上澄の分離の際に得られる菌体をそのまま
あるいは簡単な分離・精製操作を施した後使用でき、労
力、量産性、経済性の点で有利である。従って、本発明
方法では、β−Ｄ−マンナンを加水分解して分解生成物
を有効利用したり、β−Ｄ−マンナン自体を糊料等とし
て使用した後に分解・除去するのに有用なβ−マンナナ
ーゼおよびβ−マンノシダーゼを効率良く生産すること
ができ、しかもこの酵素はpH安定性、高温安定性等にお
いて優れているので、酵素の工業的な大規模利用が可能
となる。要約すれば、本発明方法は、β−Ｄ−マンナン
を効率良く加水分解するβ−マンナナーゼとβ−マンノ
シダーゼを同時に生産する好アルカリ性バチルス属に属
する新規な微生物を用いて、β−Ｄ−マンナンの加水分
解反応に要求される諸条件をいずれも満足し、高い効率
でこれを分解し、使用後の分解・除去および分解生成物
の有効利用を著しく容易にする酵素を製造する方法を提
供し、それによって経済的に大巾な改善を保証し得るも
のである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中村 信之 東京都国立市中１−４−23 (72)発明者 掘越 弘毅 東京都練馬区桜台４−39−８

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 工業技術院微生物工業技術研究所に微工
   研菌寄第8856号で寄託された下記理化学的性質： （イ）作用：非還元末端から順次β−マンノシド結合を
   加水分解し、マンノースを生成する （ロ）基質特異性：β−メチル（エチル）−Ｄ−マンノ
   シドを完全に分解し、またβ−結合のマンノースを含む
   オリゴ糖に作用しマンノースを遊離し、ｐ−ニトロフェ
   ニル−グリコシドのβ−Ｄ−マンノシドを基質となし得
   るが、α−Ｄ−マンノシド、α−Ｄ−グルコシド、β−
   Ｄ−グルコシド、α−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｄ−ガラ
   クトシド、β−Ｄ−キシロシド、α−Ｌ−フコシド、β
   −Ｄ−グルクロニドを基質となし得ない （ハ）至適pHおよび安定pH範囲：至適pHは６〜７であ
   り、40℃、30分間の加熱条件下ではpH６〜９の範囲内で
   安定である （ニ）温度に対する安定性：pH 6.5、30分間の加熱条件
   下では45℃まで安定である （ホ）作用適温の範囲： 50℃近傍に至適作用温度を有
   する （ヘ）失活条件：40℃、30分間の処理条件下ではpH 5.0
   および10で完全に失活し、また、pH6.5 、30分の処理で
   は、55℃で完全に失活する （ト）ゲル濾過法による分子量： 63,000 ±3,000 を有するβ−マンノシダーゼ生産能を有し且つ生育の至
   適pHをアルカリ性に有するバチルス属に属する微生物を
   培養して菌体内にβ−マンノシダーゼを生成・蓄積さ
   せ、それを採取することを特徴とするβ−マンノシダー
   ゼの製造方法。
2. 【請求項２】 培養を30〜45℃の範囲内の温度下で好気
   的に行う請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 培養液のpHを 7.5〜11.5の範囲にする請
   求項１または２に記載の方法。
4. 【請求項４】 上記微生物の培養後、培養液から菌体を
   分離し、そのままβ−マンノシダーゼの粗酵素とする請
   求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 【請求項５】 微生物の培養後、培養液から菌体を分離
   し、更に精製して精製β−マンノシダーゼとする請求項
   １〜４項のいずれか一項に記載の方法。