JPH0383584A

JPH0383584A - 新規キトサナーゼ、及びそのキトサナーゼの製造方法、並びにそのキトサナーゼを用いたキトサンオリゴ糖の製造方法

Info

Publication number: JPH0383584A
Application number: JP1219555A
Authority: JP
Inventors: Yoshiyuki Torii; 鳥居　義侑; Koji Tsukuda; 好司佃; Haruyoshi Seino; 治良情野
Original assignee: Pias Corp
Current assignee: Pias Corp
Priority date: 1989-08-28
Filing date: 1989-08-28
Publication date: 1991-04-09
Anticipated expiration: 2014-08-16
Also published as: JP2935226B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、新規キトサナーゼ、及びそのキトサナーゼの
製造方法、並びにそのキトサナーゼを用いてキトサンオ
リゴ糖を製造する方法に関するものである。

（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〉周知
のように、キトサナーゼはキトサンを分解する酵素であ
り、現在までにバチルス属微生物その他の微生物由来の
ものが知られている。

ところで、このキトサンは、たとえばカニやエビ等の甲
殻中に含有されるキチンの脱アセチル化物であり、近年
においては有用なバイオマスとして注目されている。

本発明は、このような点に鑑み、キトサンの分解能に優
れた新規なキトサナーゼを提供せんとすることを課題と
するものである。

（問題点を解決するための手段）本発明者等は、このような点に鑑み、上記のようなキト
サンの高い分解能を有するキトサナーゼを得るために、
そのキトサナーゼ生産能を有する微生物を広く自然界に
おいて探索して新規な微生物を見出し、バチルスｓｐ、
ＰＩ−７Ｓと命名し、昭和６３年１月２８日に工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託しく徽工研菌寄第９８４
３号）、その後、昭和６３年３月２８日付けで特許出側
を行った（特開昭６３−７３６２９号）。

本発明者等は、さらにこの微生物から新規キトサナーゼ
を誘導して本発明を完成するに至ったのである。

すなわち、本発明の新規キトサナーゼの特性は次のとお
りである。

（１１作用、基質特異性キトサンの分解能が良好である。

カルボキシメチルセルロースは分解しない。

（２）至適ｐＨ４，８〜６．８（３）安定ｐＨ３，３〜７．４（４）分子量４３０００±３０００　　（ＳＤＳ−ポリアクリルア主
ドゲル電気泳動による測定）２５０００±３０００　（ＨＰＬＣ・ゲル濾過による測
定）（５）阻害物質Ａｇゝ、Ｈｇ＋、ｐ−クロロ安息香酸第２水銀また、本発明のキトサナーゼの製造方法は、キトサナー
ゼ生産能を有する微生物を培養して上記のような特性を
有するキトサナーゼを製造することにある。

このキトサナーゼ生産能を有する微生物としては、主と
して上記バチルスＳρ、ＰＩ−７Ｓが用いられる。

このバチルスｓｐ、Ｐ１−７Ｓの菌学的性質は次のとお
りである。

（Ａ）形態学的性質（ａ）菌の形態桿菌（ｂ）芽胞楕円形、膨出（ｃ）運動性あり（ｄ）ダラム染色性不定（Ｂ）次の各培地における生育状態（ａ）肉汁寒天培地３７℃で２４〜９６時間培養を行ったところ、全周縁が
突内状のコロニーが形成され、時間の経過とともに盛り
上がってきた。

色は、２４時間培養時においてほぼ白濁色であるが、４
８時間培養時以降から薄黄色又は黄色を帯びてきた。

生育状態は陽性と認められた。

（ｂ）肉汁液体撹拌培地好気性であり、３７℃で２４時間培養を行ったところ、
白濁色となった。

生育状態は陽性と認められた。

（Ｃ）嫌気下での発育発育せず（Ｄ）生理学的性質（ａ）カタラーゼの生成　　　　　　十（ｂ）　ＶＰ反
応　　　　　　　　　　　十Ｗ（ｃ）　ＶＰブロスでの
ｐＨ４，８（ｄ）グルコースからのガスの産生（ｅ）酸の産性 ■　グルコース　　　　　　　＋ ■　アラビノース ■　キシロース ■　マンニット　　　　　　　＋（ｆ）ゼラチンの液化　　　　　　　＋（ｇ）デンプン
の分解　　　　　　　＋（ｈ）チロシンの分解（ｉ）クエン酸の利用性（ｊ）卵黄反応（ｋ）硝酸塩の還元（１）インドール産生（ｍ）　ｐＨ５，７での生育　　　　　　　＋（ｎ）５
％ＮａＣ１存在下での生育（ｏ）７％ＮａＣｌ存在下での生育（ρ）　５０℃での生育尚、上記において＋は陽性、−は陰性、＋Ｗは間隔性を
それぞれ意味する。

（実施例）以下、本発明の実施例について説明する。

〔キトサナーゼの製造方法の実施例〕

夫施狙工先ず、特願昭６３−７３６２９号に係るバチルスｓｐ、
Ｐ１−７Ｓ　（微工研菌寄第９８４３号〉を、ＩＮ（７
）ＫＯＨにてｐＨ６，８に調整された下記の＆１１或か
らなる培地で培養した。

コロイダルキトサン　　　　　０．５　Ｗ／Ｖ％ペプト
ン　　　　　　　　０．１　Ｗ／Ｖ％Ｋ　ＨＩＰ　０４
　　　　　　　　０．ＩＷ／Ｖ％Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏｓ　・
７　Ｈ２００，Ｉ　Ｗ／Ｖ％ＣａＣ１ｇ’２ＨｔＯＯ，
０３Ｗ／Ｖ％その培養を、３７℃で４日間行うと、キト
サナーゼ生産が最高であった（タンパク量０．２６■／
−）。

また、キチナーゼはほとんど生産されなかった。

次に、この培養濾液を硫安分画し、５５〜１００％飽和
画分を透析した後、ＤＥＡＥ−トヨ−バールイオン交換
クロマトグラフィー（０，２Ｍ塩化カリウムを含む１０
ｍＭのリン酸カリウム（ｐ　Ｈ６，８）で洗浄後、０．
２−０゜５Ｍ塩化カリウムクラジエント）で精製した。

次に、この精製液を限外濾過で濃縮し、５ｅｐｈａｄｅ
ｘＧ−７５ゲル濾過クロマトグラフイー（５０ｍＭリン
酸カリウム、ｐＨ６，８で平衡化）の操作を行うことに
より、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で単一の活性バンドを示す
キトサナーゼが得られた。

尚、上記のようなキトサナーゼの精製経過を皮表１に示
す。

表１尚、上記表１中において、イオン交換とは、ＥＡＥ−）ヨーバールイオン交換クロマトグラフィーに
よる精製操作を意味し、ゲル濾過とは、５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　Ｇ　−７５ゲル濾過クロマトグラフイーによる操作
を意味する。

また、キトサナーゼの活性の測定は次のようにして行っ
た。

すなわち、先ず脱アセチル化度９９％のキトサンを０．
２　Ｍ酢酸に溶解し、０．１ＮのＮａＯＨでｐＨ５，５
に調整した１％キトサン溶液を準備し、次にこの１％キ
トサン溶液１ｍｌと、酵素液ｌｌ１ｌＩとを３７℃で１
０分間反応させ、５ｃｈａ　ｌｅｓ法にて遊離還元糖を
定量した。

この条件下で毎分１μＭのグルコサミンに相当する還元
糖を遊離させる酵素量をＩＵ（ユニット）とした。

〔キトサナーゼの実施例〕

次に、上記のようにして得られたキトサナーゼの特性に
ついて以下に説明する。

（１１作用、基質特異性本実施例のキトサナーゼは、水溶液キトサンを最も効率
よく分解し、グリコールキトサン。

コロイダルキトサンも分解する傾向にあった。

しかし、キチン、カルボキシメチルセルロース、うもナ
リンには、はとんど分解作用を示さなかった。

尚、上記キトサナーゼの各基質に対する相対活性を次表
２に示す。

次表２において、水溶性キトサンについては、キトサン
（脱アセチル化度９９％）を０．２　Ｍ酢酸で溶解しＮ
ａＯＨでｐＨ５，５に調整した１％キトサン溶液ｌ−と
酵素液ｌ−を反応して活性を測定した。

また、その他の基質については、１．０％基質を含む５
０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６，０）１−と酵素液１耐
を反応させ、水溶性キトサンの場合を１００として相対
活性を示した。

表２尚、キトサナーゼの脱アセチル化度と相対活性との相関
関係のグラフを第１図に示す。

第１図からも明らかなように、上記キトサナーゼの最適
脱アセチル化度は９９％であった。以後、アセチル化度
が進むごとに酵素作用度は弱まり、アセチル化度７９％
以上になると、はとんど作用されなくなった。

（２）　　温度安定性水溶性キトサンを基質とした場合の温度安定性は４５℃
以下では、１５分の処理での失活はほとんど見られなか
ったが、６０℃になるとすべての活性が失活した。

尚、温度安定性の測定には、２０ｍＭの酢酸−酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐ　Ｈ５，０）を用いた。

温度安定性のグラフを第２図に示す。

この温度安定性の測定においては、先ず２０ｍＭ酢酸−
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ　Ｈ５，０）を含む酵素液を
各々の温度で１５分処理した後、残存活性を示した。

（３）至適ｐＨ，安定ｐＨｐＨ４〜６での水溶性キトサンに対する至適ｐＨは４．
８〜５．５であった。また、ｐＨ４〜１０でのグリコー
ルキトサンに対する至適ｐＨは５゜５〜６．８であった
。３０℃、６０分の処理での安定ｐ　Ｈ’域は３．３〜
７．４であった。

尚、至適ｐＨ１安定ｐＨの測定には、次の緩衝液を用い
た。

（ａ）ｐＨ４〜５．５２０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム（ｂ）　　ｐＨ５，５〜８．２２０−リン酸カリウム（ｃ）　　ｐ　Ｈ８，４〜１０２０＋ａＭ炭酸水素ナトリウムー炭酸ナトリウム尚、水
溶性キトサンを基質とした場合の至適ｐＨと、グリコー
ルキトサンを基質とした場合の至適ｐＨとを第３図にそ
れぞれグラフで示した。

また、安定ｐＨについては第４図に示した。

これら至適ｐＨや安定ｐＨの測定については次のような
操作により行った。

（イ）安定ｐＨ各々のｐＨの２０ｍＭ緩衝液ｌ−に酵素液０．１ｍｌを
加え、３０℃、　６０分処理する。その後、０．５％キ
トサン溶液（０，３Ｍ＃酸で溶解しＮａＯＨでｐＨ５に
調整）１−を加えて反応させ、残存活性を示した。

（口〉至適ｐＨ（ａ）　　水溶性キトサンを基質にした場合キトサンを
１％になるように２００−酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液
に溶解し、ｐＨを４〜６に調整する。この溶液１ＩＲ１
に対して酵素液０．０２ｄを添加して３７℃、　６０分
反応させて遊離してくる還元糖を５ｃｈａｌｅｓ法で求
め、活性測定を行った。

（ｂ）　　グリコールキトサンの場合１％グリコールキトサン液０．５−に、各々のｐＨの緩
衝液２１ｄｌを加えて基質溶液とし、これに酵素液０．
０５−を加え、３７℃、６０分反応させ、上記（ａ）と
同様にして活性測定を行った。

（４）　　酵素作用型上記キトサナーゼによる水溶性キトサンから生成するキ
トサンオリゴ糖は、ｌ糖を除く一連の２〜５糖であり、
ｅｎｄｏ型に作用することが推定された。

（５）分子量５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動から求めた分
子量は４３０００　±３０００、ＨＰＬＣ（ＴＳ　Ｋ　
−Ｇｅｔ　Ｇ３０００ＳＷ）から求めた分子量は２５０
００±３０００であった。

ＨＰ　Ｌ　Ｃ（Ｔ　Ｓ　Ｋ　−Ｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ
）によるキトサナーゼの分子量決定を第５図のグラフに
示す。

尚、第５図において、ａ”−ｅ点に示す標準蛋白質は次
のものである。

標準蛋白質　　　　　　　　　　分子量ａ　、　Ｇｌｕ
ｔａｍａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　　　　　
２９００００ｂ、　Ｌａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇ
ｅｎａｓｅ　　　　　　１４２０００ｃ、　Ｅｎｏｌａ
ｓｅ　　　　　　　　　　　　　　６７０００ｄ、＾ｄ
ｅｎｙｌａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ　　　　　　　　　３２
０００ｅ　、　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｃ　　　　　　
　　　　　１２４００次に、５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動による分子量決定を第２図に示す。

第６図において、Ｂ−ｇ点に示す標準蛋白質は次のもの
である。

標準蛋白質　　　　　　　　　　分子量ａ　、　Ａｌｂ
ｕｍｉｎ、Ｂｏｖｔｎｅ　　　　　　　　　　６６００
０ｂ、Ａｌｂｕｍｉｎ、　Ｅｇｇ　　　　　　　　　　
　　４５０００ｃ　、　Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ
　−３＝ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａ
ｓｅ　　　　　　３６０００ｄ　、　Ｃａｒｂｏｎｉｃ
　ａｎｈｙｄｒａｓｅ　　　　　　　　２９０００ｅ、
Ｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎ　　　　　　　　　　　　２４
０００ｆ　、　Ｔｒｙｐｓｉｎ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ、
５ｏｙｂｅａｎ　　　　　２０１００ｇ、ａ　−Ｌａｃ
ｔａｌｂｕｍｉｎ　　　　　　　　　　１４２００（６
）等電点等電点電気泳動から求めた等電点はｐＨ８，４〜９．６
であった。

Ｋｍ値水溶性キトサンを基質とした場合のＫｍ値は２．２　ｔ
ｇキトサン／−で、Ｖｍａｘは０．９１　ｐ　Ｍグルコ
サミン／＋ｍｉｎ／−であっ、た。

（８）金属と酵素阻害剤の影響キトサナーゼ活性を阻害する物質について、各種物質の
阻害作用を相対活性との対比から考察した。

（７）すなわち、２〜４ｍＭの試薬０．５１Ｒ１と酵素液（１
，５Ｕ／ｄ）　０．０２−と、　１００　ｍＭ酢酸−酢
酸ナトリウム緩衝液（ｐ　Ｈ５＞を含む混合液を４０℃
。

２０分放置した後、０．５％キトサン溶液１ｍｌを力り
え残した無添加を１００とした相対活性を測定した。そ
の結果を皮表３に示す。

表３尚、上記表３において、ｐ−ＣＭＢはｐ−クロロ安息香
酸第２水銀、ＰＭＳＦはフッ化フェニルメチルスルホニ
ルを意味する。

２ＩＩＭのＡｇ＋、Ｈｇ”°、ｐ−ＣＭＢはキトサナー
ゼ活性をほとんど阻害したがＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、Ｎａ
ｚＳＯ＝は全く阻害作用を示さなかった。

このことから、上記実施例のキトサナーゼの活性にＳＨ
基が関係していることが示唆される。

Ａｇ“＋Ｈｇ”！以外の金属には全く阻害されず、比較
的金属に安定な酵素であった。

ちなみに、バチルスｓｐ、Ｎ０−７Ｍ由来のキトサナー
ゼの場合には、Ａｇ”　、Ｆｅ＋、Ｃｕ＋、Ｈｇ＋、Ｐ
ｂ”＋、ｐ−ＣＭＢに阻害され、また、バチルスサーキ
ュランスＭＨ−Ｋｌ由来のキトサナーゼの場合には、Ｃ
ｕ＋、Ｈｇ＋、Ｎ　ｉ＋、Ｚｎ”＋　　ｐ−ＣＭＢに阻
害される。

従って、本実施例のキトサナーゼは、これら他のバチル
ス属微生物由来のキトサナーゼに比べると、阻害物質が
少ないという利点がある。

〔キトサンオリゴ糖の製造方法の実施例３次に、上記の
ようなキトサナーゼを用いてキトサンオリゴ糖を製造す
る方法の実施例について説明する。

Ｘ搬器１キトサン５６■を添加したキトサナーゼ０．６　ＬＪを
含む０．２　Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６゜
０）６ｄを３７℃で４時間反応させ、生成するキトサン
オリゴ糖の組成を調べた。

オリゴ糖の種別　　　重量２糖　　　　　　　　　１．２　■ ３ｔＪ！　　　　　　　　　　８．１５ｒ！ｇ４＃Ｍ　
　　　　　　　　　８．３４■５糖　　　　　　　　　
１．６５■ ６糖　　　　　　　生成せずこのように、キトサンにキトサナーゼを作用させるだけ
で、容易にキトサンオリゴ糖の調製が可能である。

大旌舛主キトサン１１．２■を添加したキトサナーゼを０．１８
ユニット含む０．２Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
　Ｈ６，０）　１．８−を２０℃にし、限外濾過にまり
生成オリゴ糖を除去しながら５時間酵素反応を行い、生
成したオリゴ糖の組成を調べた。

オリゴ糖の種別　　　重量２Ｉ！　　　　　　　　０．１１■ ３糖　　　　　　　１．２４■ ４糖　　　　　　　１．８８■ ５＄Ｊｉ　　　　　　　　１．６３■ ６１１１．０１■ 本実施例では、上記実施例１のようないわゆるバッチ法
では得られない６糖も調製することができる。

上記実施例２及び実施例３により調製したオリゴ糖は、
それぞれ従来のイオン交換カラム法等により単離するこ
とができる。

また、従来では、キトサンオリゴ塘は、塩酸分解法等に
より行われていたが、５１Ｌ６糖等の調製には塩酸分解
等の条件等、かなり困難な点があった。

この点、上記実施例、特に実施例３では５糖６１Ｊ！の
調製が容易に行える。

（発明の効果）叙上のように、本発明によって、上記のような特性を有
する全く新規なキトサナーゼが得られるに至った。

そして、このキトサナーゼは、他のキトサナーゼに比べ
ると阻害物質が少なく、金属等に対する安定性が非常に
高いものである。

従って、このキトサナーゼを用いる場合に、たとえば反
応液中に金属成分が含有されていても、酵素が阻害され
て影響を受けることもない。

さらに、このようなキトサナーゼを用いれば、細胞壁に
キトサンを含む微生物のプロトプラストの調製も容易に
行え、そのプロトプラスト調製の効率が向上するという
利点がある。

【図面の簡単な説明】

第１図はキトサナーゼのアセチル化度と相対活性との相
関関係を示すグラフ。第２図は温度安定性と相対活性との相関関係を示すグラ
フ。第３図は至ＪｐＨと相対活性との相関関係を示すグラフ
。第４図は安定ｐＨと相対活性との相関関係を示すグラフ
。第５図はＨＰ　Ｌ　Ｃ（Ｔ　Ｓ　Ｋ　−Ｇｅｌ　Ｇ３０
００ＳＷ）によるキトサナーゼの分子量測定結果のグラ
フを示す。第６図は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
るキトサナーゼの分子量測定結果のグラフを示す。

Claims

【特許請求の範囲】１、次に示す特性を有することを特徴とする新規キトサ
ナーゼ。（１）作用、基質特異性キトサンの分解能が良好である。カルボキシメチルセルロースは分解しない。（２）至適ｐＨ４．８〜６．８（３）安定ｐＨ３．３〜７．４（４）分子量４３０００±３０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定）２５０００±３０００（ＨＰＬＣ・ゲル濾過による測定）（５）阻害物質Ａｇ＾＋、Ｈｇ＾＋、ｐ−クロロ安息香酸第２水銀２、請求項１記載のキトサナーゼ生産能を有する微生物
を培養してキトサナーゼを製造することを特徴とするキ
トサナーゼの製造方法。３、前記キトサナーゼ生産能を有する微生物がバチルス
ｓｐ．ＰＩ−７Ｓ（微工研菌寄第９８４３号）である請
求項２記載のキトサナーゼの製造方法。４、請求項１記載のキトサナーゼと、キトサン又はキト
サンの部分分解物とを反応させてキトサンオリゴ糖を製
造することを特徴とするキトサンオリゴ糖の製造方法。