JPS6283877A - 細菌の生育および増殖の抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細菌の生育および増殖抑制剤に関し、詳しくは
、キトサンまたはその軽度分解物からなる細菌の生育お
よび増殖抑制剤に関する。本発明の細菌の生育および増
殖抑制剤は、細菌だけでなく、カビの生育および増殖を
抑制することができるから＜食品、化粧品および医療材
料の分野におけるカビおよび細菌の双方の生育または増
殖の抑制に利用することができる。

〔技術の背景および発明の要約〕

食品または化粧品などの防腐、殺菌剤として、安息香酸
、安息香酸塩、ソルビン酸、ソルビン酸塩、デヒドロ酢
酸、デヒドロ酢酸塩、バラオキシ安息香酸エステル、プ
ロピオン酸、プロピオン酸塩、サリチル酸、サリチル酸
塩、フェノール、パラクロルメタクレゾール、ヘキサク
ロロフェン、トリクロロカルバニリドおよび塩化ベンザ
ルコニウムなどの多数の合成品があるが、これらの防腐
殺菌剤は、人工の合成品であるがゆえに、食品または化
粧品の添加剤として使用する場合に、人体に対する安全
性に問題を生じることがあり、最近は合成品の防腐殺菌
剤の使用を制限する傾向が強くなっている。

一方、キトサンは、エビやカニなどの甲＠項の政に含ま
れるキチンを脱アセチル化して得られる寥糖類であって
、Ｄ−グルコサミンがβ−１，４桔りによって直鎖駄に
結合した多Ｕ類であり、キトサンを分解して得られる低
重合度のキトサンも知られているっキトサンを分解する
方法には、塩酸による加水分解法、亜硝酸による酸化分
解法および塩累による酸化分解法などの化学的な方法、
および酵素（キトサナーゼ）による方法がある。キトサ
ナーゼを生産する微生物として、バチルス（ｌｌａｃｉ
ｌｌｕｓ　Ｓｐ、　）　　Ｒ−４（ｈミナガ他：ビオヒ
ミ力・工・ビオフイジ力・アクタ　（ｙ、　Ｔｏｍｉｎ
ａｇａｅｔ　ａｌ　　：　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ
　Ｂｌｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　）　Ｍ１１１０蓚
第１４５−１５５百（１９５７年）〕、ペニシリウム・
イスランデイクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｉｓｌａｎ
ｄｉｃｕｍ　）　　（ディー・エム・フェントン他：ジ
ャーナル・オブ・ジェネラル・ミクロバイオロジー（肌
Ｍ−Ｆｅｎｔｏｎ　ｅｔ　ａｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　にｅｎｅｒａ１Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　）第１２
６巻ｍ　１５１−　＋６５百（１９８１年）〕、バチル
ス（［１ａｅｉｌｌｕｓ　５ｐ、　）　　９９−５　（
屈内：日本農芸化学会、昭和５９年度大会講演要旨集第
５５０自）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｅ
ｅｓ　）　Ｎｏ、　６　Ｃジエイ・ニス・プライス他：
ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｓ、　Ｐｒ
１ｃｅ　ｅｔ　ａｌ　：　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆＢａｃｔ
ｃｒｉｏｌｏｇＹ　）第１２４巻第１５７４−１５８４
　Ｎ（１９７５年）〕、ストレプトミセス・グリセウス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　）　　
（オオタカラ他：キチン拳キトサン・アンド・リレイテ
ツド会エンザイムス（Ａ、０ｈｔａｋａｒａ　ｅｔ　ａ
ｌ　：　Ｃｈｌｔｉｎ＋　Ｃｈｉｔｏｓａｎａｎｄ　Ｒ
ｅ１ａｔｅｄ　　Ｅｎｚｙｍｅｓ　）　第１４７−１６
０頁（１９８５年）アカデミツク・プレス〕およびバチ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　）　Ｎａ　７−　Ｍ
’　（特願昭６ｏ　−１２０６７３号）があり、キトサ
ンが植物病原性のカビの生育に影響を及ぼすこと〔ビー
・ニス・ストエヅセル他：フイトバソロギッシエ・ツア
イトシュリフト（Ｐ、　５ｔｏｅｓｓｅｌ　ｅｔ　ａｌ
　：Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｃｈｅ　Ｚｅｔｔ
ｓｅｈｒｉｆｔ　）　第１ＩＩ巻第８２−８９頁（１９
８４年）、シー・アール・アラン他：エクスベリメンタ
ル・マイコロジー（Ｃ，Ｒ，Ａ１１ａｎ　　ｅｔ　ａｔ
　　：　ＥｘｐｅｒｆｍｅｎｔａｌＭＹｃｏｌｏｇｙ　
）　第３　ｙ第２８５−２８７　Ｆ！　（１９７９年）
〕およびキトサンの分解物かえんヴのカビの生育の抑制
に影響を及ぼすこと〔ディー・エフ・ケンドラ＋＋！１
：エクスペリメンタル・マイコロジー（肌Ｆ、　Ｋｅｎ
ｄｒａ　ｅｔ　ａｔ　ＥｘｐｅｒｉＩＩＩｅｎｔａｌ　
Ｍｙｃｏｌｏｇｙ）ｍ８Ｑ　１２７６−２８１　ｆｆｌ
　４１９８４年）〕カ知ラうテいるが、キトサンおよび
キトサンの分解産物の細菌の生育の抑制については、未
だ何も知られていないつ 本発明音らは、キトサンについて永年研究を続けている
が、その研究においてキトサンはカビの生育および増殖
の抑制に効果があるだけでなく、ＩＨ閑の生育および増
殖の抑制にも効果があること、およびバチルスＮｏ、　
７−　Ｈに上り生産され″：料トサナーゼによって分解
されたキトクン降ｊσ′Ｔ）　’ｔＪ　ｎ　：よりビの
生育および増殖の抑制に幼東ｊ＋Ｅ　７＋うで、すでな
く、＠Ｂ閑の生育および１曽７＋Ｔのｕｌ　ｉ１＝およ
び羽１刃；こち顕Ｈｔ工効果があることをす出し、これ
らの用姑にハづいて木兄１！［Ｉにヱヮ辛した、〔発明
の目的および発明の要約〕 本発明の目的は、細菌の生育およびハη殖の■上および
抑制に９効であるばかりでなく、カビの生育および抑制
に有効な細菌の生育および増殖の抑制剤を提供すること
にあり、詳しくは、人体に対して何害でなく、安全に使
用することができる細菌の生育および増殖の抑制剤を提
供することにある。

本発明は、キトサンまたはキトサン何度分解物を有効成
分とする細菌の生育および増殖の抑制剤である。本発明
におけるキトサン何度分Ｍ、物は、生成遺元訪量が１２
０■・Ｄ−グルコサミン／１９・キトサンよりも多くな
い範囲のものであることが好ましく、またキトサン軽度
分解物が、キトサンをバチルスＮｏ、７−＠（Ｒ１研菌
寄第８１３９号）にＦ、り生産されたキトサナーゼによ
り分解されたものであることが好果しい。

［発明の１１体的を工説明〕 本発明の細菌の生Ｒおよび増殖のＩＩＩＩ制剤のａ効嘱
分のキトサンは、キチンの１悦アセチル化度が、いかな
る程度のものであっても、これを使用することができる
が、５０〜１００％の脱アセチル化度のものを使用する
のが好ましい。キトサン軽度分解物は、その還元ＭＨｋ
が１２０■・Ｄ−グルコサミン／Ｉ９・キトサンよりも
多くないものを使用するのが好ましい。

ｍ９・Ｄ−グルコサミン／Ｉｇ・キトサンによって示さ
れる還元ＭＷｋは、１１のキトサン軽度分解物が有する
還元力をＤ−グルコサミンの還元力に換算した数値であ
って、１１１２７１１ｇ・Ｄ−グルコサミン／Ｉ９・キ
トサンは、キトサンがそれを構成するＤ−グルコサミン
に１００％分解され、Ｄ−グルコサミンにまで分解され
たことを示す数値である。

キトサンまたはキトサン軽度分解物は、細菌の生育およ
び増殖を抑制しようとする場所において、少なくともｏ
、ｚｙ／ｌ　　（好ましくは０．２〜２ｇ／ｌの範囲）
になる量において使用される。キトサンまたはキトサン
軽度分解物は、単体の形で使用することができるが、固
体または液体の不活性担体との組成物の形において（史
用することもできる。

細菌の生育および増殖を抑制する組成物における固体ま
たは液体の不活性担体は、通常の食品添加物における担
体のいかなるものであっても、これを使用することがで
きるが、組成物の用途によっては、必ずしも食品添加物
に使用される担体に限らず、クレー、カギリン、バーミ
キュライト、パーライトなどであっても、これを使用す
ることができる。

キトサン軽度分解物をキトサナーゼによって製凸するに
は先ずキトサンを酸水溶液に溶解してキトサン溶成を調
製し、予め反応温度においてブレインキュベートし、こ
れに、予め反応温度においてブレインキュベートしたキ
トサナーゼ溶鍛を加え、３０〜８０°Ｃ（好ましくは４
０″Ｃ前後）の反応温度においてキトサンをキトサナー
ゼによって分解する。反応液のｐＨはキトサナーゼの作
用ｐＨにより異なるが、通常３〜９　（好ましくは６前
後）である。原料のキトサンとしてコロイダルキトサン
を使用する場合は、これを水に懸濁したものであっても
よい。キトサン溶液の調製に使用する酸は、キトサンを
溶解しろるものであれば、いかなるものであっても、こ
れを使用することができるが、塩酸または硝酸の希薄溶
液、ギ酸、酢酸、グルタミン酸またはアスコルビン酸を
使用するのが好ましい。

キトサンの分解の程度は、温度、ｐＩＩおよび反応時間
の反応条件によって変化するから、予備実験において所
望の分解度を得るのに必要な反応条件を求め、これによ
るのが好ましい。キトサンの分解度を、反応生成物の生
成還元結電（ｒｖ・Ｄ−グルコサミン／１９・キトサン
）によって求めるのが簡便で、通常、生成還元Ｗｆｆｉ
が１２０■・Ｄ−グルコサミン／Ｉｇ・キトサンよりも
多くない程度にするのが好ましい。

キトサンの分解は、バチルス（口ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ
、　）ｌｈ７−Ｍ（微工研菌寄第８１３９号）により生
産されたキトサナーゼによって行なうのが好ましい。

バチルスＮｏ、　７−　Ｍは、長＃県南高来郡小浜町雲
仙の原生沼の土壌よりキチンまたはキトサンを唯一の炭
ｙ：原とする培地に生育しうる細菌として公理されたバ
チルス（口ａｅｉｌｌｕｓ　ｓｐ−）　Ｎｏ、　７　Ｆ
Ｊを親株として、この駕株をＮ−メチルーダ−ニトロソ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＣ）で処理して突然変
異を誘発させ、得られたストレプトマイシン耐性の変異
株の中から、高活性のキトサナーゼを生産しうるものと
して公理された変異株であって、微工研菌寄第８１３９
号（ＦＥＲＭ　Ｐ　−８１３９）として通商産業省微生
物工業技術研究所に寄託されている。

バチルスＮｏ、　７−　Ｈの菌学的性質は以下に示され
る。

Ａ・細胞の形態 （１）細胞の形および大きさ：短桿菌、（肉汁および肉
汁寒天斜面培養、３７°ｃ１２４〜７２時間の培養） （２）細胞の多形性の有無：無し、 （３）運動性の有無二有り、 （肉汁寒天半流動高層穿刺培養） （４）胞子の有無：有り、内生胞子および裸の胞子、球
状、 〔トーナー（Ｄｏｒｎｅｒ　）のａ！１色法およびウイ
ツク（ｗｔｔｚ）変法〕 （５）ダラムＱ色性：陽性、 〔肉汁寒天斜面培養、３７°６１１８時間、ヒユッカ−
（１ｌｕｃｋｅｒ　）の変法により染色〕Ｂ、各培地に
おける生育状態 （］）因肉汁天平板１’５＠（３７°Ｃ１２４〜１６８
時間）：糸状の周縁を何する円形で、隆起した乳白色の
コロニーを形成する。コロニーの表面は凹凸でやや光沢
があり、半透明である。時間の経過とともに盛上ってく
る。色素は生産しないう （２）肉汁寒天斜面培養（３７°Ｃ１２４〜１６８時間
）二Ｍ１市状に稲上った乳白色のコロニーを形成する。

コロニーは凸円形の隆起があり、光沢がある。生育は良
好で、時間とともに拡がってくる。色素は生産しない。

（３）肉汁液体培養（３７℃、２４〜１６８時間）：表
面に膜を形成しない。時間とともに全体的に濁ってくる
。底部に賀状（顆粒状）の沈デンが形成され、徐々に多
くなってくる。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養（２５°Ｃ１２４〜１６８
時間）： 穿側線に沿って生育し、液化する０表面および斗 内部はＱ＄状に生育し、液化する。液化部分は白濁する
。

（５）リドマスミルク（３７８Ｃ１２４〜１６８時間）
＝２日後から上部が少しずつ液化し、４日目には色は完
全に変色し、酸性となった。凝固はしない。

時間の経過とともに、液化は進み、半透明になった。

Ｃ０生理学的性質 （１）硝酸塩の還元ニー （硝酸塩肉汁培地、３７°０１２４〜１２０時間）（２
）脱窒反応ニー （■形らの方法、発酵管を使用、３７℃、２４〜１２０
時間） （３）ＭＲテスト：＋ （３７℃、２４〜１６８時間） （４）ＶＰテスト（アセチルメチルカルビノール生成試
験二十 （３７°Ｃ１２４〜１６８時間） （５）インドールの生成ニー （３７℃、２４〜１６８時間） （〔５）硫化水素の生成ニー （ＴＳｒ寒天法、３７℃、２４〜１６８時間）（７）デ
シ粉の加水分解：＋ （３７℃、２４〜１６８時間） （８）クエン酸の利用　　゛ （コーザーの培地、３７℃、２４〜１６８時間）：　− （クリステンセンの培地、３７°Ｃ１２４〜１６８時間
）二十 （９）熊機窒素源の利用（３７°Ｃ１２４〜１６８時間
） 硝酸塩：未定、 アンモニウム塩：未定、 （１０）色素の生成 （マンニット・酵母エキス寒天斜面培１１！１）：〔キ
ング（Ｋｉｎｇ　）　　Ａ寒天斜面培地コニ−（１１）
蛍光の有無：無し く１２）ウレアーゼ：＋ （クリステンセンーウレア寒天培地、３７°０１２４〜
１６８時間） （１３）オキシダーゼ：＋ （肉汁寒天培地、３７°Ｃ１２４〜４８時間）（１４）
カタラーゼ：＋ （肉汁寒天培地、３７°０１２４〜４８時間）（１５）
生育の範囲＝　（肉汁寒天培地）温度：未定、 ｐＨ：　５〜１０、 心加食塩濃度：未定、 （１６）酸素に対する態度：好気性 （１％グルコース肉汁高層寒天培地、３７°Ｃ１２４〜
７２時間） （１７）０−Ｆテスト〔ヒュー−ライフソン（Ｉｌｕｇ
ｈ　−Ｌｅｉｆｓｏｎ　）法、３７°Ｃ１Ｄ−グルコー
ス〕　：発酵的に酸を生成する。

（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ　） （１ｓ）Ｍ類からの酸およびガスの生成の有無（３７８
Ｃ１２４〜１６８時間）： 糖　類　　　　　酸　　　ガス Ｄ−グルコース　　＋　　　　− Ｄ−マンノース　　−− Ｄ−ガラクトース　−− Ｄ−フラクトース　＋　　　− Ｌ−アラビノース　−− Ｄ−キシロース　　−− Ｄ−ソルビット　　−− Ｄ−マンニット　　−− イノシヅト　　　　−− マルトース　　　　十　　　　− サヅカロース　　′＋− ラクトース　　　　−　　　　− デン粉　　　　　　＋　　　− セルロース　　　　−− グリセリン　　　−− 以上の菌学的性質について、バージエイス・マニュアル
・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（口ｅ
ｒｇｅｙ’　ｓ　！４ａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖｅ口ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）の第８版
（１９７４年）を検索したところ、Ｎｏ、　７−　Ｍ　
Ｂはバチルス（Ｉｌａｃｉｌｌｕｓ　）　Ｋに属するの
が相当であることがわかった。

バチルスＮｏ、　７−　Ｈにより生産されたキトサナー
ゼの酵素化学的性質は以下に示すとおりである。

（１）作用： キトサンに作用し、分子の内部鎖から任意にβ−１，４
結合を分解して、主としてキトサンオリゴ帖（Ｃ；１ｃ
Ｎ）　　（ｎ＝＝２〜８）　（ｌｆｉ体〜８犠体）を生
成する。キトサンオリゴ糖は高速液体クロマトグラフィ
ーを用いてキトサン分解液から分離することができる。

この分解液におけるキトサンの分解度は約４５％である
。カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）にも作用し、
ある程度はこれを分解するが、キチンには全く作用しな
い。

（２）作用温度範囲および最適作用温度：可溶性キトサ
ンを基質さした場合、８０’（：まで作用し、最適作用
温度は５０６Ｃである。

ｐｌ＋　６．０において１０分間反応させた場合の温度
と比活性の関係を第１図に示す。

（３）作用ｐＨ範囲および最適ｐＨ： ｐＨ３〜９の範囲において作用し、最適ｐＨはｐ１１６
である。

１％可溶性キトサンｌ九ｌに各ｐＨの緩衝液２ｒｒＬβ
および酵素液１　ｒｎｌｌを加えた反応液を３７６Ｃに
おいて１０分間反応させた場合のｐＦＩと酵素の比活性
の関係を第２図に示す。

（４）熱安定性： ５０°Ｃにおける１５分間の保温まで、はぼ安定で、６
０６Ｃにおける１５分間の加熱により、酵素の約４０９
６が失活し、７０°Ｃにおける１５分間の加熱により、
完全に失活した。

温度と比活性の関係を第３図に示す。

（５）ｐＨ安定性： ０．１Ｍ緩衝液中で３０°Ｃにおいて２時間２ｉ［した
後、残存する酵素活性を測定したが、ｐＨ５〜１１の範
囲において安定であった。ｐＨ１０−１１において安定
であることは、バチルスＮｏ、　７−　Ｈにより生産さ
れたキトサナーゼの大きな特徴の一つである。ｐｌ＋と
比活性の関係を第４図に示す。

（６）阻害剤： バチルスＮａ　７−　Ｍにより生産されたキトサナ−ゼ
は、Ｉ×ｌＯＨの終濃度のｌＩｇｃＩ　　、ＰｂＣｌ　
　、　ＡｇＮ０　　、およびＰＣＭＢの今任によりはば
１００％が阻害された。

（７）基質特異性： 卯々の基質を使用し、基質の終濃度を０．２５％とした
時に、酵素反応液４　ｎＬｉ：当り酵素山白質１哩によ
って１時間後に遊喝する全還元剪とへキソサミンの＠Ｃ
ｍ９／ｒｒＬＩＢ白質／時）を測定した。

その結果がｉｔ表に示される。

（以下余白） 第１表　１西質待１／４性 注）　※：ライシツヒ（Ｒｅｉｓｓｉｇ　）法によるっ
バチルスＮｏ、　７−　Ｈにより生産されたキトサナー
ゼは、コロイダルキトサン、可溶性キトサンおよびグラ
イコールキトサンをよく分解し、カルボキシメチルセル
ロース（ＣＭＣ）も若干分解したが、粉末キトサンには
作用しなかった。またコ０イダルキチン、グライコール
キチン、粉末キチンおよびメチルセルロースは全く分解
しなかった。

（８）分子量： ５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により分子１丘
を測定した結果を第５図に示す。第５図において（○）
はバチルスＮｏ、　７−　Ｈにより生産されたキトサナ
ーゼの分子量であって、約４１　、０００である。

セファデックスＧ　−１００を用いたゲル濾過法により
分子量を測定した結果を第６図に示す、第６図において
（Ｏ）はバチルスＮｏ、　７−　Ｈにより生産されたキ
トサナーゼの分子量であって、約３０，０００である。

（９）酵素力価の測定法： １ｇの粉末キトサン（２８メツシユ）を５０ｒｒＬＩ！
の０．１■酢酸水溶液に溶解し、Ｏ，１Ｍ酢酸ナトリウ
ム水溶液でｐＨ６，０に調整した後、Ｏ，１Ｍ酢酸将衝
ｉ？２　（ＩＩＨ：　６．０　）を加えて、全容を１０
０ｎ′ＬＡにして、ア、（買の１％可溶性キトサン溶液
を調製するっ３７゛Ｃにおいて５分間ブレインキュベー
トしたＪ、９買の１％可溶性キトサン診液１　ｍＪに、
１４様にブレインキュベートした酵素液１　ｍｌを加え
、３７℃において正確に１０分間酵素反応を行なわせる
。その後反応液を３分間煮沸して酵素反応を停止させ、
反応液中に生成した還元糖を定頃する。

この条件において１　Ｂ＋モルのグルコサミンに相当す
る還元糖を透照させる酵素はを、１屯位（ｕｎｉｔ）の
キトサナーゼ活性とする。

〔発明の効果〕

本発明のキトサンおよびキトサン軽度分解物は、細菌の
生育および増殖を阻止し、または抑制することができる
だけでなく、カビの生育および増殖を訂止し、または抑
制することができる。

キトサンおよびキトサンｌ１ｉＩ度分解物は、古い時代
から食用に供していた材料に由来するから、食品添加用
に使用しても有害でない。

以下において本発明を参考例および実施例に代りうる試
験例によってさらに詳しく説明する。

参考例１ （種培養の調製） ２５０　ｍｌ；容三角フラスコに、酵母エキス０・８％
、ペプトン０．４％、肉エキス０．２％、コロイダルキ
トサン０．５％を含む液体培地（ｐＨ：　７．２）　　
５０ＴｒＬｉｌを入れ、常法により殺菌した後、これに
予め液体培養したバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ−
）　Ｎｏ、　７−Ｍ　　（ＦＥＲＭＰ　−８１３９）を
接即し、３０℃において、１日間振とう培養した。

（酵素生産用培養液の調製） ５１！容三角フラスコ２本に、上記と同一の組成の液体
培地をそれぐれｌｌずつ入れ、常法により殺菌した後、
これに上記で得られた種培養液４０ｒｎｉを接種し、３
０°Ｃにおいて、４日間振どう＠養した。培養液を５．
００Ｏｒ、ｐｏｍにおいて遠心分離して、菌体を除去し
、得られた上澄液のキトサナーゼの活性を前記の酵素力
価のｆｆｌ！ｌ定法によって測定した。上澄液１　ｒｒ
Ｌ７！当り０．９９１Ｊｉ位であった。

（酵素液の精製） 上記で得られた上澄岐を混合し、得られた混合ｉ　１．
８１　／　Ｌ：固体硫安１，０１５　ｆｉ　　（硫安８
０％飽和に相当する）を加え、濾過し、得られた沈デン
物を蒸留水に溶解し、１７７霞ｌとした。この酵素液を
蒸搦水、引き続いて、０．０２　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
：　６．０）に対して透析した後、得られた酵素液を、
予め０．０２　Ｍリン酸緩衝液で平衡化したＣＭ−セフ
ァデックスＣ−５０を充填したカラム（２・６ｃｍ（径
）Ｘ４５ｍ’（長さ）〕に流してキトサナーゼを吸着さ
せた。はとんどの不純蛋白質は素通り区分に集まってい
た。このカラムを０．０２Ｍリン酸緩衝蔽３５０ｍ１で
洗浄した後、０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムで直線的濃
度勾配により酵素蛋白質を溶出した。

次にキトサナーゼ活性を示した第２１８〜２４０のワラ
クシ３ンを合し、これをダイアフローメンブレンフィル
ターＰＭ−１０（アミコン社製品）を用いた限外濾過装
置で１７倍に濃縮し、このａ縮液に、セファデックスＧ
−１００を用いるゲル濾過を行なった。

このゲル濾過のキトサナーゼ活性を示した第５０〜６３
のフラクションを合し、再びＣＭ−セファデックスＣ−
５０によるカラムクロマトグラフィーを行なった。前回
と同じ条件で酵素を吸着し、０〜０．５Ｍの塩化ナトリ
ウムで直線的ＦＡ度勾配により酵素蛋白質を溶出した。

参考例２　（キトサン分解物の調製） （りキトサン分解物Ａの試料の調製 キトサン１ｇに蒸留水５０−を加え、これに１Ｍ酢酸９
−を加え、充分に撹拌して溶解し、これに１Ｍ酢酸ナト
リウム水溶液を加えて、ｐＨを６．０に調整した後、蒸
留水を加えて、全量を１００−にして、１％キトサン溶
液を調製した。

１％キトサン溶液５−を試験管に取り、これに参考例１
で得たキトサナーゼ溶液を水で希釈して３０　ｕｎｉｔ
　／−の活性としたキトサナーゼ溶液０．１−を加え、
３７℃のインキュベーターにおいて３時間反応した後、
試験管を沸とう浴に浸漬し、５分間沸とうして、反応を
停止し、キトサン分解物Ａを調製した。

キトサン分解物Ａの生成還元糖ｆｆ１（＊ｇ・Ｄ−グル
コサミン／１ｇ・キトサン）をジャーレス（５ｈａｌｅ
ｓ　）　Ｋ法〔ティー・イモト：アグリ力ルチュラル・
バイオロジカル・ケミストリ（Ｔ、　ｉｍｏｔｏ　：　
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　）第３５巻第１１５４−１１５６　ｍ
（１９７１年）〕により測定したところ、５９（Ｌ１９
・Ｄ−グルコサミン／１９・キトサンであった。

（２）キトサン分解物Ｂの試料の調製 キトサナーゼ溶液として、　５　ｕｎｉｔ　／延の活性
としたキトサナーゼ溶液を使用し、口→と同様にして、
ｚ６ａｍｇ・Ｏ−グルコサミン／Ｉｇ・キトサンの生成
還元糖漬のキトサン分解物８の試料を調製した。

（３）キトサン分解物Ｃの試料の調製 キトサナーゼ溶液として、３　ｕｎｉｔ　／−の活性と
したキトサナーゼ溶液を使用し、（１）と同様にして、
１００ｍｇ・Ｄ−グルコサミン／１．９・キトサンの生
成還元Ｗ量のキトサン分解物Ｃの試料を調製したつ （４）キトサン分解物りの試料の調製 キトサナーゼ溶液として、Ｉｕｎｉｔ／−の活性とした
キトサナーゼ溶液を使用し、（１）と同様にして、４０
■・０−グルコサミン／Ｌｌ・キトサンの生成還元活量
のキトサン分解物りの試料を調製した。

（５）キトサン分解物Ｅの試料の調製 キトサナーゼ溶液として、０．５　ｕｎｉｔ　／ｍｌの
活性としたキトサナーゼ溶液を使用し、（１）と同様に
して、８■・Ｄ−グルコサミン／１ｇ・キトサンの生成
還元Ｗｆｆｉのキトサン分解物Ｅの試料を調製した。

（６）キトサン分解物Ｆの試料の調製 キトサナーゼ溶液として、０．０５　ｕｎｉｔ　７ｍｌ
の活性としたキトサナーゼ溶液を使用し、（１）と同様
にして、６■拳０−グルコサミン／１ｇ・キトサンの生
成還元Ｗｆｆｉのキトサン分解物Ｆの試料を調製した。

（７）キトサンの試料の調製 キトサナーゼ溶液の代りに、０．０５　Ｍ酢酸緩衝液（
ｐＨ：　６．０）を使用し、（１）と同様にして、４％
ｇ−Ｄ−グルコサミン／１ｇ・キトサンの生成還元Ｍ量
のキトサンの試料を調製した。

試験例１ 細菌の増殖に対するキトサンの影響について試験を行な
った。

（１）試料の調製 （＋−１）試料（１−１）の調製 肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇおよび塩化ナトリウム
５ｇを蒸留水に溶解し、ｐＩ＋を６．０に調整した後、
蒸留水を加え、全憬をｌｌにして、ブイヨン培地を調製
した。このブイヨン培地８．９−に適当に希釈した参考
例２のキトサンの試料１−を加え、キトサンの最終濃度
が０．０１５％の試料（ｌ−１）を調製した。

（１−２）試料（ｔ−２）の調製 キトサンの最終濃度を０．０２％にしたこと以外は（＋
−１）と同様にして、試料（１−２）を調製した。

（＋−３）試料（Ｇ−１）の調製 （１−１）のブイヨン培地８．９イにグルコサミン塩酸
塩の水ｎ液！づを加え、グルコサミン塩酸塩の最終濃度
が帆５％の試料（Ｇ−１）を調製した。

（１−４）試Ｈ（Ｇ−２）の調製 グルコサミン塩酸塩の最終濃度を０．６％にしたこと以
外は、（１−３）と同様にして、試料（Ｃ−２）を調製
した。

（１−５）試料（（、−３）の調製 グルコサミン塩酸塩の最終濃度を０．７％にしたこと以
外は（ｔ−３）と同様にして、試料（Ｇ　−３）を調製
した。

（１−６）対照試料の調製 （１−１）におけるブイヨン培地８．９−に参考例２の
（１）試しの調製において使用した溶媒１ｍｌを加え、
対照試料とした。

（２）試験方法 第２表における被験菌の培養物０．１−をそれぞれの試
料に接即し、３０℃において２４時間振とう培養を行な
い、混濁の生成を観察し、混濁を生じたものを（＋）と
し、混濁を生じなかったものを（−）とした。そして混
濁の発生は被験菌の増殖を示す。

（３）試験の結果 試験の結果は第２表に示すとおりであった。

（以下余白） 第２表によると、キトサンは最終濃度０．０２％におい
て総べての被験菌の増殖を抑制して抗菌性を示すのに対
して、グルコサミン塩酸塩は、最終濃度０．７％におい
て、総べての被験閑の増殖を抑制し、＠菌性を示すにと
どまった。

これによってキトサンはグルコサミン塩酸塩のおおよそ
ｌ／４０の濃度において抗菌性を発揮することがわかる
。

試験例２ エシェリヒア・コリ口の増殖に対するキトサンの影響に
ついて試験を行なった。

（１）試料の調製 （１〜１）対照試料の調製 肉エキスｌｏｇ、ペプトン１θｙおよび塩化ナトリウム
５ｇを蒸留水に溶解し、ｐＩ（を６・０に週４各した後
、蒸留水を加え、全量を５００艷にして、２倍濃度のブ
イヨン培地を調製し、その２．５ｍｌを試験管に取り、
これに０．０４　Ｍ酢酸Ｍｍ液（ｐＨ：６．０）を加え
、全量を５−にしてキトサンを含まない対照試料を調製
した。

（１−２）試料（２−１）の調製 （１−１）のブイヨン培［１１５−を試験管に取り、参
考例２のキトサンの試料の０．０８％溶液０・６２−（
キトサンの最終濃度０．０１％に相当する）を加え、さ
らに０．０４　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ：　６．０）を加え
、全欧を５−にして試Ｈ（２−１）をＭ製した。

（ｌ−３）試料（２−２）の調製 参考例２のキトサンの試料の０．０８％溶液を０．７５
−の量において使用しくキトサンの最終濃度０．０１２
％に相当する）、（１−２）と同様にして、試！（２−
２）を調製した。

（１−４）試料（２−３）の調製 参考例２のキトサンの試料の０．０８％溶液を１．２５
−の量において使用しくキトサンの最終濃度ｏ、ｏｚ９
６に相当する）、（＋−２）と同様にして、試料（２−
３）を調製した。

（１−５）試料（ｚ−４）の調製 参考例２のキトサンの試料の０．０８％溶液を１．８７
５−の量において使用しくキトサンの最Ｍａ度０・０３
９６に相当する）、（ｌ−２）と同様にして、試Ｂ（２
−４）を調製した。

（＋−６）試料（２−５）の調製 参考例２のキトサンの試料の０．０８％溶液を２．５−
の量において使用しくキトサンの最終濃度０．０４％に
相当する＞　、（１−２）と同様にして、試料（２−５
）を調製した。

（２）試験方法 それぞれの試料を滅菌し、これにエシェリヒア・コリＢ
　　（Ｅｓｅｈｅｒｉｅｈｉａ　ｅｏｌｉｏ）を接種し
、３０°Ｃにおいて振とう培養を行なった。

培養後の試料の濁度を６６０　ｎｍにおける吸収によっ
てｆｔＰＪシた。

（３）試験の結果 試験の結果は第７図に示すとおりであった。

第７図のヨコ軸は培養時間（時間）であり、そのタテ軸
は６６０　ｎｍにおける吸収であって、試料の濁度を示
し、試料の濁度の大きいものはエシェリヒア・コリの増
殖したことを示す。

第７図において、実線における（−Ｘ−）は対照試料、
点線における（−△−）は試料（２−１）、一点鎖線に
おける（−Δ−）は試料（２−２３、実線における（−
０−）は試料（２−３）、点線における（−０−）は試
Ｂ（２−４）、および一点鎖線における（−０−）は試
料（２−５）のそれぞれの結果を示す。

第７図の結果によると、キトサンを添加していない対照
試料に比べて試料（２−ｔ）および試料（２−２）は、
１日エシェリヒア・コリの増殖が抑制されたが、試＠（
２−３）、試料（２−４）および試料（２−５）では４
日間の培養においてエシェリヒア・コリが全く増殖しな
かった。このことからキトサンの最終濃度を０．０２％
以上にすると、すぐれた抗菌性を示すことがわかる。

試験例３ バチルス・サブチリスの増殖に対するキトサンの影響に
ついて試験を行なった。

（１）試料の調製 試験例２と同じ試料を使用した。

（２）試験方法 試験例２におけるエシェリヒア・コリの代りに、バチル
ス・サブチリスを使用し、試験例２と同様にして、試験
を行なった。

（３）試験の結果 試験の結果は第８図に示すとおりであった。

第８図のヨコ軸は培養時間（時間）であり、そのタテ軸
は６６０　ｎｍにおける吸収であって、試料の濁度を示
し、試料の濁度の大きいものはバチルス・サブチリスの
増殖したことを示す。

第８図における試料は第７図と同じである。

第８図の結果も第７図と同じであって、キトサンの最終
濃度を０．０２％以上にすると、キトサンはバチルス・
サブチリスに対してすぐれた抗菌性を示すことがわかる
。

試験例４ フザリウム・オキシスポラムの増殖に対するキトサンの
影響について試験を行なった。

（１）試料の１調製 （１−１）試料（４−１）の調製 可成のポテトデキストロース寒天培＠（栄研化学社製）
５．４６ｇを恭留水７０イに加え、加温溶解し、その５
イを試験管に取り、これにキトサンの１％溶液０．５−
を加え（最終濃度０．０５％に相当すル）、さらｉｃＯ
１０５Ｍ酢酸ｆ、Ｌ４？ｅ　（ｐＨ：　６．０　）を加
え、全潰を１０籠にした。これを滅菌した後、シャーレ
に移し、ゲル化して、試料（５−１）を調製した。

（１−２）試料（４−２）の調製 キトサンの１％溶液の使用量をｌｄ（最終濃度０．１％
に相当する）にしたこと以外は（＋−１）と同様にして
、試料（５−２）を調製した。

（＋−３）試料（４−３）の調製 キトサンの１％溶欣の使用量を２冠（最終濃度０．２％
に相当する）にしたこと以外は（１−１）と同様にして
、試料（５−３）を調製した。

（１−４）対照試料の調製 キトサンの１　％　Ｍ　ｔＴｌを使用しなかったこと以
外は、（１−１）と同様にして、対照試料を調製した。

（２）試験方法 それぞれの試料にフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　）をｆｆ１ｉし、３
７℃において静ｊｊ／ｌ培養を行なった。接種をしてか
ら、３日後、４０後および６日後に、試料の表面のコロ
ニーの径をｔｔ　ｔ＋’ＪＪし、府側試料におけるコロ
ニーの径との比率（％）を算出した。

（３）試験の結果 試験の結果は第３表に示すとおりであった。

第３表　フザリウム・オキシスポラムの増殖に対第３表
によると、キトサンの濃度が０．２％になると、６日後
においても閑の増殖がみられず、その抗カビ性はｌｌ’
ｆｆ＝、ｆｆであることがわかる。

試験例５ フザリウム・オキシスポラム・カバエ （Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　ｅａｐａｅ
　）の増殖に対するキトサンの０１度のｉ影響について
試験を行なった。

（１）試料の調製 試験例・１と１．′ｄじものを使用したつ（２）試験方
法 試験例４におけるフザリウム・オキシスポラムの代りに
、フザリウム・オキシスポラム・カパエを使用し、試験
例４と同様にして、試験を行なった。

（３）試験の結果 試験の結果は第４表に示すとおりであった。

（以下余白） 第４表　フザリウム・オキシスポラム・カバエの増殖に
対するキトサンの１度の影博 第４表によると、キトサンの濃度が０・２％になると、
６日後においても菌の増殖がみられず、その抗カビ性は
顕著であることがわかる。

試験例６ エシェリヒア・コリの増殖に対するキトサンおよびキト
サン分解物の影響について試験を行なった。

（＋）試料の調製 （ｌ−ｔ）試料（６−Ａ）の調製 試験例１のブイヨン培ａ（肉エキス＝１％、ペプトン＝
１％および塩化ナトリウム０．５％）８．９−に、適当
に希釈した参考例２のキトサン分解物Ａの試料ｌ艷を加
え、キトサン分解物Ａの最終濃度が０．００４％の試９
（６−Ａ）を調製した。

（１−２）試料（６−８）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサン分解物８の
試料を使用し、（１−１）と同様にして、キトサン分解
物Ｂの最終濃度が０．００４％の試料（６−８）を調製
した。

（１−３）試料（６−Ｃ）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサン分解物Ｃの
試料を使用し、（１−１）と同様にして、キトサン分解
物Ｃの最終濃度が０・００４％の試料（６−Ｃ、）を調
製した。

（１−４）試料（ａ−Ｏ）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサン分解物りの
試料を使用し、（１−１）と同様にして、キトサン分解
物りの最終濃度が０．００４％の試料（６−Ｄ）を調製
した。

（１−５）試＠（６−Ｅ）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサン分解ｌａＥ
の試料を使用し、Ｈ−Ｂと同様にして、キトサン分解物
Ｅの最終濃度が０．００４％の試料（６−Ｅ）を調製し
た。

（＋−６）試料（６−Ｆ）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサン分解物Ｆの
試料を使用し、（１−ｔ）と同様にして、キトサン分解
物Ｆの最終濃度が０・００４％の試料（６−Ｆ）を調製
した。

（１−７）試ａ（６−Ｃ，）の調製 キトサン分解物Ａの試料の代りに、参考例２のキトサン
の試料を使用し、（１１）と同様にして、キトサンの最
終濃度が０．００４％の試！（６−Ｇ）を調製した。

（１−８）対照試料の調製 （１−１）のブイヨン培地８．９−に参考例２の（１）
試料の調製に使用した溶媒１−を加え、対照試料を調製
した。

（２）試験方法 エシェリヒア・コリの培養物０．１−をそれぞれの試料
に接種し、３０６Ｃにおいて２４時間振とう培養を行な
い、混濁の生成をｗＩＪ察し、混濁を生じたものを（＋
）とし、混濁を生じなかったものを（−）とした。混濁
を生じたものは、エシェリヒア・コリの増殖を示し、混
濁を生じなかったものはエシェリヒア・コリの増殖しな
かったことを示す。

（３）試験の結果 試験の結果は第５表に示すとおりであった。

（以下余白） 第５表　エシェリヒア・コリの増殖に対するキトサンお
よびキトサン分解物の影響 第５表によると、キトサン分解物Ｃ，Ｄ、Ｅ。

Ｆｌおよびキトサンの試料がエシェリヒア・コリの増殖
を抑制し、抗菌性を有することがわかる。

試験例７ 細菌の増殖に対するキトサンおよびキトサン分解物の影
響について試験を行なった。

（１）試料の調製 （＋−１）試料（７−Ｅ）の調製 試験例１のブイヨン培地（肉エキス：１％、ペプトン：
１％および塩化ナトリウム＝０．５％）８．９ｍｌに適
当に希釈した参考例２のキトサン分解物Ｅの試Ｈ１ｍｌ
を加え、キトサン分解物Ｅの最終濃度が０．０２％の試
料（７−Ｅ）を調製した。

（１−２）試料（７−Ｆ）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサン分解物Ｆの
試料を使用し、（１−１）と同様にして、キトサン分解
物Ｆの最終濃度が０．０２％の試料（７−Ｆ）を調製し
た。

（＋−３）試！（７−Ｇ）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサンの試料を使
用し、（＋−１）と同様にして、キトサンの最終濃度が
０．０２％の試料（７−Ｇ）を調製した。

（１−４）試料（７−Ｃ）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサン分、解物Ｃ
の試料を使用し、（１−１）と同様にして、キトサン分
解物Ｃの最終濃度が０．０２％の試料（７−Ｃ）を調製
した。

（１−５）試料（７−Ｄ）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサン分解物Ａの
試料を使用し、（１−１）と同様にして、キトサン分解
物Ａの最終濃度が０．０２％の試料（７−Ｄ）を調製し
た。

（１−６）対照試料の調製 （１−ｔ）のブイヨン培＠８．９−に参考例２の（１）
試料の調製に使用した溶媒１ｍｌを加え、対照試料を調
製した。

（２）試験方法 第４表の被験菌の培養物０．１ｍｊｌをそれぞれの試料
に接種し、３０℃において２４時間振とう培養を行ない
、混濁の生成を観察し、混濁を生じたものを（＋）とし
、混濁を生じなかったものを（−）とした。混濁を生じ
たものは被験菌の増殖を示し、混濁を生じなかったもの
は被験菌の増殖しなかったことを示す。

（３）試験の結果 試験の結果は第６表に示すとおりであった。

（以下余白） 第６表によると、キトサンを添加した試＠（７−Ｃ）は
総べての細菌の増殖を抑制する効果があり、キトサン分
解物を添加した場合は、キトサン分解物Ｃを０加した試
料（７−Ｃ）がストレプトミセス・アウレウスの増殖を
抑制する効果がなかったことを除いて総べての細菌の増
殖を抑制する効果があったことがわかる。

試験例８ エシェリヒア・コリの増殖に対するキトサン分解物の影
響について試験を行なった。

（１）試料の調製 （ｔ−Ｂ試Ｈ（８−Ａ）の調製 試験例１のブイヨン培地に、参考例２のキトサン分解物
Ａの試料を最終濃度が０．０１％になるように加え、そ
の５−を試験管に取り、滅菌して、試！（８−Ａ）を調
製した。

（１−２）試料（８−Ｂ）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサン分解物Ｂの
試料を使用し、（１−１）と同様にして、試料（８−Ｂ
）を調製した。

（＋−３）試ａ（８−Ｅ）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサン分解物Ｅの
試料を使用し１、（１−１）と同様にして、試料（８−
Ｅ）を調製した。

（１−４）試料（８−Ｆ）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサン分解物Ｆの
試料を使用し、Ｎ　　ｔ）と同様にして、試料（ｓ−ｐ
）を調製した。

（１−５）試ａ（８−（１；）の調製 キトサン分解物の代りに、参考例２のキトサンの試料を
使用し、Ｎｔ）と同様にして、試料（８−Ｃ，）を調製
した。

（＋−６）対照試料の調製 試験例１のブイヨン培地にキトサンおよびキトサン分解
物を加えることなく、（１−１）と同様にして対照試料
を調製した。

（２）試験方法 それぞれの試料にエシェリヒア・コリを接種し、３０６
Ｃにおいて９１時間培養し、それぞれの試料の濁度を６
６０　ｎｍにおける吸収によって測定した。

濁度の大きいものは、エシェリヒア・コリが増殖したこ
とを示し、濁度の小さいものはエシェリヒア・コリが増
殖しなかったことを示す。

（３）試験の結果 試験の結果は第９図に示すとおりであった。

第９図のヨコ軸は培養時間（時間）であり、そのタテ軸
は６６０　ｎｍにおける吸収であって、°試料の濁度を
示す。試料の濁度の大きいものはエシェリヒア・コリが
増殖したことを示し、試料の濁度の小さいものはエシェ
リヒア・コリが増殖しなかったことを示す。

第９図において、点線における（−へ一）は試料（８−
Ａ）、一点鎖線における（−△−）は試料（８−Ｂ）、
実線における（−０−）は試料（８−Ｅ）、一点鎖線に
おける（−〇−）は試料（８−Ｆ）、点線における（−
〇−）は試料（８−Ｇ）、および実線における（−Ｘ−
）　　は対照試料のそれぞれの結果を示す。

第９図によると、試料（８−Ｆ）Ｃキトサン分解物Ｆ〕
、および試料（８−に）（キトサン〕では、エシェリヒ
ア・コリの増殖が、試Ｘ−）（８−Ａ）および試料（８
−８）より２４時間迷れ、また試Ｂ（８−Ｅ）では、エ
シェリヒア・コリの増殖が４８時間遅れたことがわかる
。

試験例９ エシェリヒア・コリに対するキトサンおよびキトサン分
解物の殺菌効果について試験を行なった。

（１）試料の調製 （１−１）試！（９−Ａ）の調製 試験例１のブイヨン培＠５ｍ１．を試験管に取り、滅菌
した径、エシェリヒア・コリを接種し、３０°Ｃにおい
て１８時間培養し、その培養液０．１ｄを試験例１のブ
イヨン培地５ゴに加え、３０°Ｃにおいて４時間培養し
てエシェリヒア・コリの培養液を得た。このエシェリヒ
ア・コリの培養液を１０倍に希釈し、その０．５−を試
験管に取り、これに参考例２のキトサン分解物Ａの試ａ
（キトサン分解物Ａの最終濃度１％に相当する）０．５
−および０．０５　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ：　６．０）　
　４．０−を加え、３７°Ｃにおいて１時間振とう培養
して、試料（９−Ａ）を調製した。

（１−２）試料（９−１１）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサン分解物Ｂの
試料を使用し、（１−１１と同様にして、。

試料（９−１３）を調製した。

（１−３）試料（９−Ｅ）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサン分解物Ｅの
試料を使用し、（＋−１）と同様にして、試料（９−、
Ｅ）を調製した。

Ｈ−ａ）試Ｂ（９−Ｐ）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサン分解物Ｆの
試料を使用し、（１−１）と同様にして、試Ｂ（９−Ｆ
）を調製した。

（１−５）試料（９−Ｇ）の調製 キトサン分解物の代りに、参考例２のキトサンの試料Ｇ
を使用し、（１−１）と同様にして、試料（９−Ｃ）を
調製した。

（１−６）対照試料の調製 試験例１のブイヨン培地に、キトサンおよびキトサン分
解物を加えることなく、（１−＋）と同様にして、対照
試６を調製した。

（２）試験方法 それぞれの試料を１０倍に希釈し、その希釈波０．１−
を融解寒天ｔ３地（肉エキス＝１％、ペプトン＝１％、
塩化ナトリウム：０．５％、ｐＨ：　６．０）１０冠に
加え、撹拌し、ペトリ皿に拡げた。このベトリ皿を３７
８Ｃにおいて２４時間培養し、ペトリ皿上に生じたコロ
ニーにおける生菌数を計測した。

（３）試験の結果 試験の結果は第７表に示すとおりであった。

（以下余日） 第７表　エシェリヒア・コリに対するキトサン第７表に
よると、キトサンおよびキトサン分解物の総べてにおい
てエシェリヒア・コリに対する殺菌効果があったが、キ
トサン分解物Ｅ１キトサン分解物Ｆおよびキトサンを使
用した試料における殺菌効果が顕著であることがわかる
。

試験例１０ フザリウム会オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙ
ｓｐｏｒｕｍ　）の増殖に対するキトサンおよびキトサ
ン分解物の影響について試験を行なった。

（＋）試料の調製 （＋−１）試料（ｔｏ−Ａ）の調製 回収のポテトデキストロース寒天培地（栄研化学社製）
５．４６ｇを蒸留水７０ｄに加え、加温溶解した後、そ
の５−を試験管に取り、最終濃度が０．１％になるよう
に参考例２のキトサン分解物Ａの試料ｌ艷を加え、さら
に０．０５　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ：　６．０）　　４イ
を加えて、試＠（１０−Ａ）を調製した。

（１−２）試料（ｔｏ　−８）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサン分解物Ｂの
試゛絡を使用し、（１−１）と同様にして、ｔｃＨＨｏ
−ｎ）を調製した。

（１−３）試料（１０−Ｅ）の調製 キトサン分解物さして、参考例２のキトサン分解ｖｌＥ
の試料を使用し、（＋−１）と同様にして、試料（１０
−Ｅ）を調製した。

（１−４）試１（１０−Ｆ）の調製 キトサン分解物として、参考例２のキトサン分解物Ｆの
試料を使用し、（Ｉｔ）と同様にして、試料（１０−Ｆ
　）を調製した。

（１−５）試料（１０−Ｇ　）の調製 キトサン分解物の代りに、参考例２のキトサンの試料を
使用し、（ｔ　　ｔ）と同様にして、試料（１０−Ｃ，
）を調製した。

（２）試験方法 それぞれの試料を滅菌し、これらをそれぞれのシャーレ
に移して、ゲル化した後、これらの試料にフザリウム・
オキシスポラムを接種し、３７°Ｃにおいて静置培養を
行なった。接種をしてから３日後、４日後および６日後
のフザリウム・オキシスポラムのコロニーの径をｉｔ側
し、キトサンおよびキトサン分解物を加えることなく調
製した対照試料を使用して同様に試験を行なった対照試
料におけるコロニーの径との比を算出した。

（３）試験の結果 試験の結果は第８表に示すとおりであった。

第８表　フザリウム・オキシスポラムの増殖に対するキ
トサンおよびキトサン分解物 の影響 第８表によると、キトサンおよびキトサン分解物を６加
した総べての試料において、フザリウム・オキシスポラ
ムの増殖に対して抑制効果があることがわかるが、その
増殖抑制効果は、試料（１０−Ｅ）、試料（１０−Ｆ）
において顕著であり、キトサンおよびキトサン軽度分解
物の抗力とカの大きいことがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、バチルスＮｏ、　７−Ｍにより生産されたキ
トサナーゼにおける塩度と比活性の関係を示す図表、第
２図は、バチルスＮｏ、　７−　Ｈにより生産されたキ
トサナーゼにおけるｐＨと比活性の関係を示す図表、第
３図は、バチルスＮｏ、　７−　Ｈにより生産されたキ
トサナーゼにおける塩度と比活性の関係を示す図表、第
４図は、バチルスＮｏ、　７−　Ｍにより生産されたキ
トサナーゼにおけるｐＨと比活性の関係を示す図表、第
５図は、バチルス冷、７−Ｍにより生産されたキトサナ
ーゼの電気泳動法による分子Ｍを示す図表、そして第６
図は、バチルスＮｏ、　７−　Ｈにより生産されたキト
サナーゼのゲル濾過法による分子量を示す図表であり、
第７図は、試験例２の試験の結果におけるエシェリヒア
・コリ口の生育状態を示す試料の濁度と培養時間の関係
を示す図表、第８図は、試験例３の試験の結果における
バチルス・サブチリスの生育状態を示す試料の濁度と培
養時間の関係を示す図表、そして第９図は、試験例８の
試験の結果におけるエシエリヒア・コリの生育駄態を示
す試料の濁度と培養時間の関係を示す図表であろう

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）キトサンまたはキトサン軽度分解物を有効成分と
   することを特徴とする細菌の生育および増殖の抑制剤。
2. （２）キトサン軽度分解物が、キトサンをキトサナーゼ
   によって、生成する還元糖量（ｍｇ・Ｄ−グルコサミン
   ／１ｇ・キトサン）が１２０ｍｇより多くない範囲に分
   解されたキトサン軽度分解物であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項に記載の細菌の生育および増殖の抑
   制剤。
3. （３）キトサナーゼがバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
   ｐ．）Ｎｏ．７−Ｍ（微工研菌寄第８１３９号）により
   生産されたものであることを特徴とする特許請求の範囲
   第２項に記載の細菌の生育および増殖の抑制剤。