JPH0411196B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は発酵法によるＬ−リジンの製造法に関
する。さらに詳しくは、強化されたスーパーオキ
シドジスムターゼ活性を有するブレビバクテリウ
ム属又はコリネバクテリウム属のＬ−リジン生産
菌を用いる発酵法によるＬ−リジンを製造する方
法に関する。 （従来の技術） 従来、発酵法によるＬ−リジンの製造法として
はＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（以
下AECと記す）耐性菌を使用する方法（特公昭
48−28078号）、AEC耐性でかつＬ−ロイシン、
Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニ
ン、あるいはＬ−アラニン要求性（以下Ala^-と
記す）変異株を使用する方法（特開昭49−36888
号、特開昭49−80289号、特公昭51−21078号）、
AEC耐性でかつβ−ヒドロキシルロイシン（以
下HLと記す）等のロイシンアナログ耐性変異株
を用いる方法（特公昭53−1833）、α−クロロカ
プロラクタム（以下CCLと記す）耐性変異株を
用いる方法（特公昭53−43591）、γ−メチルリジ
ン（以下MLと記す）耐性変異株を用いる方法
（特公昭56−19235）、フルオロピルビン酸（以下
FPと記す）感受性変異株を使用する方法（特開
昭55−9783号）、ピルビン酸キナーゼ活性が低下
した変異株を使用する方法（特開昭58−170487
号）などが知られている。 （本発明が解決しようとする問題点） 本発明が解決しようとする問題点は、更に安価
に発酵法によりＬ−リジンを製造する方法を確立
することにある。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは上述の問題点を解決するためにＬ
−リジン生産菌の菌株改良によつて発酵収率を高
めるべく種々検討した結果、Ｌ−リジン生産菌の
スーパーオキシドジスムターゼ活性を高めること
によつてこの菌のＬ−リジン生産能を大巾に高め
うることを見出し、これに基いて本発明を完成す
るに至つた。 すなわち本発明は、ブレビバクテリウム属また
はコリネバクテリウム属に属し、強化されたスー
パーオキシドジスムターゼ活性を有し、かつＬ−
リジン生産能を有する変異株を培養して培養液中
にＬ−リジンを生成、蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とする発酵法によるＬ−リジンの製
造方法に関するものである。 本発明に使用する微生物は、ブレビバクテリウ
ム属またはコリネバクテリウム属に属しＬ−リジ
ン生産能を有するものを変異処理し、得られた変
異株のうちからスーパーオキシド増産剤、スーパ
ーオキシドジスムターゼ誘導抑制剤、スーパーオ
キシドラジカル反応促進剤またはスーパーオキシ
ドを形成する酸素を供給する酸化剤に耐性を有す
る株を選別することによつて取得できる。このよ
うにして得られた変異株は、強化されたスーパー
オニサイドジスムターゼ活性を有している。 本発明で誘導する変異株の親株としてはブレビ
バクテリウム属又はコリネバクテリウム属に属す
る微生物であれば種、菌株を問わずどのような菌
株でも良いが、以下に示すような、いわゆるコリ
ネフオームのＬ−グルタミン酸生産菌として知ら
れるものが好適である。 ブレビバクテリウム・デバリカタム
ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラブム ATCC14067 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
ATCC13870 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 菌株としては、これら野生株の他に、リジン生
産に有利な性質、例えばAEC耐性、CCL耐性、
ML耐性、ホモセリン要求性、アラニン要求性、
フルオロピルビン酸感受性、スレオニン感受性、
メチオニン感受性などの性質を有する変異株を使
用することもできる。 ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム
属に属し、リジン生産に有利な性質を有する菌株
を用いて、本発明の変異株を得るには、紫外線照
射、Ｘ線照射、変異誘起剤処理等の一般に微生物
を変異誘導する通常の方法を用いればよい。変異
誘起剤処理の例としては、250μg／mlのＮ−ニト
ロ−N′−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンによ
つて30℃で20分間処理する方法がある。 本発明においてはこのようにして得られた変異
株からスーパーオキシド増産剤、スーパーオキシ
ドジスムターゼ誘導抑制剤、スーパーオキシドラ
ジカル反応促進剤、またはスーパーオキシドを形
成する酸素を供給する酸化剤に対する耐性株を選
別取得する。 これらの薬剤はいずれもスーパーオキシド
（O₂ ^-）と不飽和脂肪酸の反応による過酸化脂質
の形成をしやすくするものである。すなわち、こ
れらの薬剤耐性株は細胞活性が低下しやすい環境
下で増殖する細胞活性の強い菌株である筈であ
り、本発明者らはこのような菌株がＬ−リジン生
産用の菌株として極めてすぐれていることを見出
したのである。 スーパーオキシド増産剤とは生体内においてス
ーパーオキシドを増す作用を有するものであり、
例えばメチルビオロゲン、ニトロフラントイン、
ビタミンK₁、モルフイン、ストレプトニグリン、
アドリアマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノマ
イシン、ブレオマイシン、β−ラパコン、cis−
プラチナム（）ジアミノジクロライドの如きも
のである。 スーパーオキシドジスムターゼ誘導抑制剤とは
スーパーオキシドを過酸化水素に変える酵素であ
るスーパーオキシドジスムターゼの生体内におけ
る誘導生成を抑制するもので、例としてはピユー
ロマイシンを挙げることができる。 スーパーオキシドラジカル反応促進剤とは、ス
ーパーオキシドが不飽和脂肪酸と反応して過酸化
脂質を生成する反応を促進するものであり、例と
してフエニルヒドラジンを挙げることができる。 酸化剤は生体内でスーパーオキシドを形成する
酸素を供給するものであり、例えば過酸化ベンゾ
イル、過硫酸アンモニウムの如きものである。 これらの薬剤に対する耐性株の取得は通常の薬
剤耐性株取得方法に準じて行なえばよく、例えば
前記薬剤のいずれかを親株が生育しないような濃
度で含有する寒天培地に変異株を撒いて培養し、
生育したコロニーを採取すればよい。培地中の薬
剤の濃度は薬剤の種類によつて異なり、例えばメ
チルビオロゲンの場合には1.5μg／ml程度、ピユ
ーロマイシンの場合には0.5μg／ml程度、フエニ
ルヒドラジンの場合には20μg／ml程度、過酸化
ベンゾイルの場合には20μg／ml程度が適当であ
る。その他の薬剤を用いる場合には予め培養試験
を行なつて適切な濃度を定めればよいことはいう
までもない。 また、ブレビバクテリウム属またはコリネバク
テリウム属に属する野生株を変異処理し、得られ
た変異株の中からスーパーオキシド増産剤、スー
パーオキシドジスムターゼ誘導抑制剤、スーパー
オキシドラジカル反応促進剤またはスーパーオキ
シドを形成する酸素を供給する酸化剤に耐性を有
する株を選別した後にこれらの耐性株にリジン生
産に有用な性質、例えばAEC耐性やホモセリン
要求性、CCL耐性、ML耐性、フロロピルビン酸
感受性等を付与してもリジン生産能に大巾に高め
た菌株を取得できる。 本発明に使用しうる微生物の例としては、スー
パーオキシド増産剤については、メチルビオロゲ
ンに耐性を有するブレビバクテリウム・ラクトフ
エルメンタムAJ12220（FERM−P8248，FERM
BP−996）、スーパーオキシドジスムターゼ誘導
抑制剤については、ピユーロマイシンに耐性を有
するコリネバクテリウム・アセトグルタミカム
AJ12223（FERM−P8251，FERM BP−998）、
また、スーパーオキシドラジカル反応促進剤につ
いては、フエニルヒドラジンに耐性を有するブレ
ビバクテリウム・フラバムAJ12222（FERM−
P8250，FERM BP−997）を、そしてスーパー
オキシドを形成する酸素を供給する酸化剤につい
ては、過酸化ベンゾイルに耐性を有するブレビバ
クテリウム・ラクトフエルメンタムAJ12221
（FERM−P8249，FERM BP−2329）を挙げる
ことができる。 このような微生物を用いてＬ−リジンを生成蓄
積させるにはＬ−リジン発酵に用いられる常法を
用いて行なえばよい。 すなわち、使用する培地としては、通常の炭素
源、窒素源、無機イオンその他の栄養素の含有す
る通常の培地を用いる。炭素源としては、例えば
サトウキビ、甜菜からの糖汁あるいは廃糖蜜、澱
粉加水分解物等の糖質原料等または酢酸等の有機
酸等を用いればよい。 窒素源も通常のＬ−リジン発酵に用いられるア
ンモニウム塩、アンモニア水、尿素等を用いれば
よく、その他リン酸イオン、マグネシウムイオン
等の有機イオン及びサイアミン等のビタミンを必
要に応じて適宜使用する。 栄養要求性株のような特定の物質を生育に必要
とする菌株を用いるときにはこれらの物質そのも
のを培地に加えるかこれらを含む蛋白加水分解
物、ペプトン、コーンステープリカー、肉エキ
ス、酵母エキスなどを加えた培地を用いればよ
い。 培養条件についても、温度30〜40℃、PH６〜８
の範囲内で好気的条件で実施する等常法によつて
実施すればよい。また、発酵液からＬ−リジンを
取得する方法も常法に従つて行なえばよいことは
いうまでもない。 本発明はＬ−グルタミン酸生産菌にそのスーパ
ーオキシドジスムターゼ活性を強化することによ
つてＬ−リジン生産能を高めるという全く新規な
知見に係るものであり、本発明の方法によつてＬ
−リジンを簡便な手段で安価に取得できる。 次に、本発明の方法に使用する微生物の取得例
を示す。 親株として下記に示す微生物を使用した。 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ3990，FERM−P3387（AEC^r，ML^r，Ala^-） ブレビバクテリウム・フラバムFAEC1−30，
FERM−P282（AEC^r） コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
AJ3792，FERM−P2650（AEC^r，β−HL^r） これらの菌株をブイヨンスラントで24時間培養
し、得られた各菌株をいずれも250μg／mlのＮ−
ニトロ−N′−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン
によつて30℃で20分間処理して変異株を得た。 イーストエキス１ｇ／dl、ペプトン１ｇ／dl、
食塩0.5ｇ／dlおよび寒天２ｇ／dlよりなる培地
に、メチルビオロゲン1.5μg／ml、ピユーロマイ
シン0.5ｇ／ml、フエニルヒドラジン20μg／ml、
過酸化ベンゾイル10μg／mlを添加し、いずれも
PH7.0に調整後120℃で15分間殺菌して寒天培地を
調製した。 前記変異株をこの寒天培地に撒いて31.5℃で48
時間培養し、生成したコロニーを採取して各薬剤
耐性株を取得し、表１に記載された各AJ番号を
付与した。 このようにして得られた各薬剤耐性株および親
株について各薬剤の濃度を変えて生育試験を行な
つた結果を次に示す。 試験方法としては、いずれの菌株もブイヨンス
ラントで24時間培養し、イーストエキス１ｇ／
dl、ペプトン１ｇ／dl、食塩0.5ｇ／dlおよび寒
天２ｇ／dlを含有するPH7.0の培地を直径８cmの
シヤーレに入れて調製した寒天プレート上に菌数
がプレート当り10⁵〜10⁶個になるように撒いた。
そして、その上に第１表に示す濃度の各薬剤を含
有するペーパーデイスクをおいて16〜48時間培養
後、形成される生育阻止円の存在の有無によつて
生育度を求めた。各薬剤耐性株およびその親株に
ついて得られた結果を第１表に示す。なお、表中
，＋は菌の生育度を表わし、−は生育が観察され
なかつたものを表わしている。

【表】 前述の各薬剤耐性株およびその親株のスーパー
オキシドジスムターゼ活性を測定した結果を第２
表に示す。 測定は次のようにして行なつた。まず、各菌株
の培養液20mlを10000rpmで10分間遠心して沈殿
物を集め、PH７の0.1Mリン酸緩衝液で２回洗浄
した。洗浄した沈殿物に前記リン酸緩衝液を20ml
加えて懸濁し、超音波処理を５分間行なつてから
10000rpmで10分間遠心し、得られた上清液を試
料とした。 試験管にPH10.2の0.05M炭酸ナトリウム緩衝液
2.4mlをとり、3mMキサンチン、3mM EDTA、
0.15％ウシアルブミン、および0.75mMニトロブ
ルーテトラゾリウムを各々0.1ml添加した。これ
に前記試料0.1mlを加えて25℃で10分間放置し、
後述するキサンチンオキシダーゼ溶液0.1mlを加
えすばやく撹拌して25℃でインキユベートした。
20分後に6mM CuCl₂0.1mlを添加して反応を停止
させ、560nmにおける吸光度を測定した。一方、
試料のかわりに蒸溜水を用いて同様の操作を行な
い、得られた吸光度をブランクとした。 活性単位は、このような測定条件でキサンチン
オキシダーゼ反応を1/2阻害するスーパーオキシ
ドジスムターゼ活性を１単位とした。 なお、前記キサンチンオキシダーゼ溶液は、ブ
ランク試験における吸光度が0.23前後になるよう
にキサンチンオキシダーゼを2M（NH₄）₂SO₄で希
釈したものであり、キサンチンオキシダーゼ濃度
は約2.1×10^-7Mであつた。

【表】 ムターゼ
以下、実施例を示す。 実施例 １ グルコース36mg／ml、塩化アンモニウム20mg／
ml、KH₂PO₄1mg／ml、MgSO₄・7aq0.4mg／ml、
FeSO₄・7aq10μg／ml、MnSO₄・4aq8μg／ml、
大豆蛋白酸加水分解物（窒素として）1μg／ml、
サイアミン塩酸塩0.1μg／mlおよびビオチン
0.3μg／mlを含有する培地を調製し、その30mlづ
つを500ml容の振盪フラスコに入れて115℃で10分
間加熱殺菌し、あらかじめ乾熱滅菌した炭酸カル
シウムを１ｇを加えた。この培地に第２表に示す
菌株を接種し、往復振盪機により31.5℃で培養を
行つた。48時間で発酵を終了し発酵液中に蓄積し
たＬ−リジンを測定した。その結果、第３表に示
すようにいずれの薬剤耐性株も良好なＬ−リジン
（塩酸塩換算）を蓄積していた。

【表】 実施例 ２ 廃蔗糖蜜を糖として80mg／ml、KH₂PO₄1mg／
ml、MgSO₄・7aq1mg／ml、大豆加水分解物を窒
素換算で１mg／mlおよび硫酸アンモニウム
500μg／mlの組成を有する培地を調製し（PH7.0）、
その20mlづつを500ml振盪フラスコに分注して加
熱殺菌し、あらかじめ別殺菌した炭酸カルシウム
を１ｇ加えた。この培地に下記の菌株を接種し、
往復振盪機により31.5℃で培養を行つた。 72時間で発酵を終了し、発酵液中に蓄積したＬ
−リジンを測定した。その結果、第４表に示すよ
うにいずれの薬剤耐性株もＬ−リジン（塩酸塩換
算）を良好に蓄積した。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ブレビバクテリウム属またはコリネバクテリ
   ウム属に属し、強化されたスーパーオキシドジス
   ムターゼ活性を有し、かつＬ−リジン生産能を有
   する変異株を培養して培養液中にＬ−リジンを生
   成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
   る発酵法によるＬ−リジンの製造方法。 ２ 変異株がスーパーオキシド増産剤、スーパー
   オキシドジスムターゼ誘導抑制剤、スーパーオキ
   シドラジカル反応促進剤、またはスーパーオキシ
   ドを形成する酸素を供給する酸化剤に耐性を有す
   るものである特許請求の範囲第１項記載の製造方
   法。