JPS61282092A - 発酵法によるｌ−リジンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は発酵法によるＬ　−リジンの製造法に関する。

さらに詳しくは、強化されたスーツや一オキシドジスム
ターゼ活性を有する！レピパクテリウム属又はコリネバ
クテリウム属のＬ−リジン生産菌を用いる発酵法による
Ｉ、−ＩＪジンを製造する方法に関する。

（従来の技術） 従来、発酵法によるＬ−リジンの製造法として１ｓ−（
２−７ミノエチル）−Ｌ−システィン（以下ＡＥＣと記
す）耐性菌を使用する方法（％公昭４２−５５２１３号
）、ＡＥＣ耐性でかつＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、
Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギ＝７、あ、いゆＬ−ア、＝□
よ、δｒＬａ−ｈＹ。

変異株を使用する方法（％開昭４９−３６８８８号、特
開昭４９−８０２８９号、特公昭５１−２１０７８号）
、ＡＥＣ耐性でかつβ−ヒドロキシルロイシン（以下Ｈ
Ｌ！：記ｔ）等のロイシンアナログ耐性変異株を用いる
方法（特公昭５３−１８３３）、α−クロロカグロラク
タム（以下ＣＣＬと記す）耐性変異株を用いる方法（特
公昭５３−４３５９１）、γ−メチルリジン（以下ＭＬ
と記す）耐性変異株を用いる方法（特公昭５６−１９２
３５）　、フルオロピルビン酸（以下ＦＰと記す）感受
性変異株を使用する方法（特開昭５５−９７８３号）、
ピルビン酸キナーゼ活性が低下した変異株を使用する方
法（特開昭５８−１７０４８７号）などが知られている
。

（本発明が解決しようとする問題点） 本発明が解決しようとする問題点は、更に安価に発酵法
によｆｉ　Ｌ　−リジンを製造する方法を確立すること
にある。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは上述の問題点を解決するためにＬ−リジン
生産菌の菌株改良によって発酵収率を高めるべく種々検
討し九結果、Ｌ−リジン生産菌のス−７４−オキシドシ
スムターゼ活性ｔｉめることによってこの菌のＬ　−Ｉ
Ｊレシン産能を大巾に高めうろことを見出し、これに基
いて本発明を完成するに至っ九。

すなわち本発明は、ブレビバクテリウム属を念はコリネ
バクテリウム属に属し、強化されたスーパーオキシドジ
スムターゼ活性を有シ、かつＬ−リジン生産能を有する
変異株を培養して培養液中にＬ−リジンを生成、蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とする発酵法によるＬ
−リジンの製造方法に関するものである。

本発明に使用する微生物は、ブレビバクテリウム属また
はコリネバクテリウム属に属しＬ−リジン生産能を有す
るものを変異処理し、得られた変異株のうちからスーノ
ヤーオキシド増産剤、スーパ−オキシドジスムターゼ誘
導抑制剤、スーパーオキシドラジカル反応促進剤または
スーパーオキシ本発明で誘導する変異株の親株としては
ブレビパフチリウム属又はコリネバクテリウム属に属す
る微生物であれば種、菌株を問わずどのような菌株でも
良いが、以下に示すような、いわゆるコリネフォームの
Ｌ−グルタミン酸生産菌として知られるものが好適であ
る。

グレピパクテリウム・デパリカタム　　　　　ＡＴＣＣ
１４０２０ブレビバクテリウム・フラブム　　　　　　
　ＡＴＣＣ１４０６７！レビバクテリウム・ラクト７ア
ーメンタム　ＡＴＣＣ１３８６９グレピパクテリウム・
ロゼラム　　　　　　　ＡＴＣＣ１３８２５コリネバク
テリウム・アセトアシドフィラム　ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・リリウム　　　　　　　ＡＴＣＣ
１５９９０菌株としては、これら野生株の他に、リジン
生産に有利な性質、例えばＡＥＣ耐性、ＣＣＬ耐性、■
、耐性、ホモセリン要求性、アラニン要求性、フルオロ
ピルビン酸感受性、スレオニン感受性、メチオニン感受
性などの性質を有する変異株を使用することもできる。

ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に属し
、リジン生産に有利な性質を有する菌株を用いて、本発
明の変異株を得るには、紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘
起剤処理等の一般に微生物を変異誘導する通常の方法を
用いればよい。変異誘起剤処理の例としては、２５０μ
９７１１１のＮ−二トローＮ′−メチルーＮ−二トロソ
グアニジンによって３０℃で２０分間処理する方法があ
る。

本発明においてはこのようにして得られた変異株カラス
−ツク−オキシド増産剤、スー／４−　＃　＊シトシス
ムメーゼ誘導抑制剤、スーパ−オキシドラジカル反応促
進剤、またはスー・平−オキシドを形成する酸素を供給
する醸化剤に対する耐性株を選別取得する。

これらの薬剤はいずれもスーツ４−オキシド（０２−）
と不飽和脂肪酸の反応による過酸化脂質の形成をしやす
くするものである。すなわち、これらＯ薬剤耐性株は細
胞活性が低下しやすい環境下で増殖する細胞活性の強い
菌株である筈であシ、本発明者らはこのような菌株がＬ
−Ｉ７ジン生産用の菌株として極めてすぐれていること
を見出したのである。

スーツ！−オキシド増産剤とは生体内においてスーパー
オキシドを増す作用を有するものであシ、例えばメチル
ビオロゲン、ニトロ７ラントイン、ビタミンに１、モル
フイン、ストレプトニグリン、アドリアマイシン、マイ
トマイシンＣ，ダウノマイシン、ブレオマイシン、β−
ラノ母コン、ｅｉａ−グラチナム（［Ｉ）ジアミノジク
ロライドの如きものである。

スーパーオキシドジスムターゼ誘導抑制剤とはスー・ぐ
−オキシドを過酸化水素に変える酵素であるスーパーオ
キシドジスムターゼの生体内における誘導生成を抑制す
るもので、例としてはピーーロマイシンを挙げることが
できる。

スーツや−オキシドラジカル反応促進剤とは、スー・母
−オキシドが不飽和脂肪酸と反応して過酸化脂質を生成
する反応を促進するものであシ、例としてフェニルヒド
ラノンを挙げることができる。

酸化剤は生体内でスーパーオキシドを形成する酸素を供
給するものであシ、例えば過酸化ベンゾイル、過硫酸ア
ンモニウムの如きものである。

これらの薬剤に対する耐性株の取得は通常の薬剤耐性株
取得方法に準じて行なえばよく、例えば前記薬剤のいず
れかを親株が生育しないような濃度で含有する寒天培地
に変異株を撒いて培養し、生育し九コロニーを採取すれ
ばよい。培地中の薬剤の濃度は薬剤の種類によって異な
）、例えばメチルピオロｒンの場合には１．５μシ’ａ
ｔ程Ｈ、ビューロマイシンの場合には０．５μ１１７ａ
ｔ　徨度、フェニルヒドラジンの場合には２０μシ旬程
度、過酸化ベンゾイルの場合には２０μ７９／ｒｄ程度
が適当である。その他の薬剤を用い゛る場合には予め培
養試験を行なフて適切な濃度を定めればよいことはいう
までもない。

また、グレピパクテリウム属またはコリネパクテリクム
属に属する野生株を変異処理し、得られた変異株の中か
らスーツ臂−オキシド増産剤、スー／４−オキクドソス
ムメーゼ鰐導抑制剤、スーツ４’−オキシドラジカル反
応促進剤ま九はスー・臂−オキシドを形成する酸素を供
給する酸化剤に耐性を有する株を選別し九後にこれらの
耐性株にリジン化してもリジン生産能を大巾に高めた菌
株を取得できる。

本発明に使用しうる微生物の例としては、スーツ々−オ
キシド増産剤については、メチルピオロｒ中シトジスム
ターゼ誘導抑制剤については、ピ。

−ロマイシンに耐性を有するコリネバクテリウ・ム・ア
セトグルタミカムＡＪ　１２，２′２３　（ＦＥＲＭ−
直こまた、スーツや−オキシドラジカル反応促進剤につ
いては、てスー・々−オキシドを形成する酸素を供給す
る酸化剤については、過酸化ベンゾイルに耐性を有すこ
のよ５な微生物を用いてＬ−リジンを生成蓄゛積させる
にはＬ　−Ｕジン発酵に用いられる常法を用いて行なえ
ばよい。

すなわち、使用する培地としては、通常の炭素源、窒素
源、無機イオンその他の栄養素の含有する通常の培地を
用いる。炭素源としては、例えばサトウキビ、甜菜から
の糖汁あるいは廃糖蜜、澱粉加水分解物等の糖質原料等
ま九は酢酸等の有機酸等を用いればよい。

優素源も通常のＬ−ＩＪジン発酵に用いられるアンモニ
ウム塩、アンモニア水、尿素等を用いればよく、その他
リン酸イオン、マグネシウムイオン等の有機イオン及び
サイアミン等のビタミンを必要に応じて適宜使用する。

栄養要求性株のような特定の物質を生育に必要とする菌
株を用いるときにはこれらの物質そのものを培地に加え
るか、これらを含む蛋白加水分解物、ペプトン、コーン
ステーｆ＋）カー、肉工Φス、酵母エキスなどを加えた
培地を用いればよい。

培養条件についても、温度３０〜４０℃、ＰＨ６〜８の
範囲内で好気的条件で実施する等常法によりて実施すれ
ばよい。また、発酵液からＬ　−Ｉ７ゾンを取得する方
法も常法に従って行なえばよいことはいうまでもない。

本発明はＬ−グルタミン酸生産菌にそのスーツ４’−オ
キシドジスムターゼ活性を強化することによってＬ−リ
ジン生産能を高めるという全く新規な知見に係るもので
あシ、本発明の方法によってＬ−リジンを簡便な手段で
安価に取得できる。

次に、本発明の方法に使用する微生物の取得例を示す。

親株として下記に示す微生物を使用した。

！レビパクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＪ　３９
９０　、ＦＥＲＭ−Ｐ　３３８７　（ＡＥＣｒ、ＭＬｒ
、ｋｔ＊−）！レピパクテリウム・フラバムＦ’ＡＥＣ
１−３０。

ＦｇＲＭ−Ｐ　２８２　（ｋＥＣ’　）コリネバクテリ
ウム・アセトグルタミカム　ＡＪ３７９２　、　　ＦＥ
ＲＭ−Ｐ　２６５０　（ＡＥＣ’　、　β−ＨＩ、ｒ）
これらの菌株をブイヨンスラントで２４時間培養し、得
られた各菌株をいずれも２５０μｌ／ｒｕｔのＮ−二ト
ローＮ／　−メチル−Ｎ−ニトロソクアニジンによって
３０℃で２０分間処理して変異株を得九〇 イーストエキス１　ｉｔ／ｍ　ｓペグトンＩＦ／ｄｇ、
食塩０、５１１７ｄｌおよび寒天２１７ｄｌよシなる培
地に、メチルビオロゲン１．５μｇ〜、ピューロマイク
７０．５μｇ７ｍｔ、　　フェニルヒドラノン２０μ７
７７ｒｄ、過酸化ベンゾイル１０μｂ包を添加し、いず
れもｐＨ７，０に調整後１２０Ｃで１５分間殺菌して寒
天培地を調製し念。

前記変異株をこの寒天培地に撒いて３１．５℃で４８時
間培養し、生成したコロニーを採取して各薬剤耐性株を
取得し、表１に記載された各ＡＪ番号を付与し友。

このようにして得られた各薬剤耐性株および親株につい
て各薬剤の濃度を変えて生育試験を行なっ之結果を次に
示す。

試験方法としては、いずれの菌株もブイヨンスラントで
２４時間培養し、イーストエキスｌ　１ｌｄｌ−ベグト
ン１１７ｍ　１食塩０．５Ｉ殉および寒天２１１／ｄｉ
を含有するｐＨ７，０の培地を直径８ｔＭのシャーレに
入れて調製し几寒天プレート上に菌数がグレート当シ１
０５〜１０個になるように撒い友。そして、その上に第
１表に示す濃度の各薬剤を含有するペーノ量−ディスク
をおいて１６〜４８時間培養後、形成される生育阻止円
の存在の有無によりて生育度を求めた。各薬剤耐性株お
よびその親株について得られた結果を８１表に示す。な
お、表中井、＋は菌の生育度を表わし、−は生育が観察
されなかりたものを表わしている。

第　　１　　表 前述の各薬剤耐性株およびその親株のスー・量−オキシ
ドシスムターゼ活性を測定し九結果を第２表に示す。

測定は次のようにして行なりた。まず、各菌株の培養液
２０ゴを１０．００　Ｏｒｐｍで１０分間遠心して沈殿
物を集め、ＰＨ７の０．１Ｍリン酸緩衝液で２回洗浄し
た。洗浄した沈殿物に前記リン酸緩衝液を２０１４加え
て懸濁し、超音波処理ｔ−５分間行なりてから１０．０
０　Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、得られた上清液を試料
とした。

試験管にｐＨ１０，２の０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝
液２．４　ａｌ　ｔ−とシ、３ｍＭキサンチン、３ｍＭ
ＥＤＴ人、０．１５％５％クシアルブミンよび０゜７５
２？ＩＭニトログルーテトラゾリウムを各々０．１ｄ添
加し次。これに前記試料０．１　ｍを加えて２５℃で１
０分間放置し、後述するキサンチンオキシダーゼ溶液０
．１ｄを加えすばやく攪拌して２５Ｃでインキ−ベート
した。２０分後に６ｍＭＣ託旬０．ＩＭｌを添加して反
応を停止させ、５６０　ｎｍにおける吸光度を測定した
。一方、試料のかわ９に蒸溜水を用いて同様の操作を行
ない、得られ九吸光度をブランクとした。

活性単位は、このような測定条件でキサンチンオキシダ
ーゼ灰石を１／２阻害するスーツクーオキシドジスムタ
ーゼ活性を１単位とした。

なお、前記キサンチンオキシダーゼ溶液は、ブランク試
験における吸光度が０．２３前後になるようにキサンチ
ンオキシダーゼを２Ｍ（ＮＨ４）２８０４で希釈し友も
のであシ、キサンチンオキシダーゼ濃度は約２．ｌＸ１
０　　Ｍでありた。

第　　２　　表 以下、実施例を示す。

実施例１ グルコース３６１９／ｌＥｊ、塩化アンモニウム２０ｒ
ｒ９／ｋｌ、ＫＨ２ＰＯ４１ｗ／ｋｌ、Ｍｇ５Ｏ４・７
　ａｑ　Ｏ，４ｍ９／Ｍ　。

Ｆ＠５Ｏ４４ａｑ　１０　ｔｓｌ／ｍｌ、ＭｎＳＯ４４
ａｑ　８　ｆｉ１７７ｋｌ、大豆蛋白酸加水分解物（窒
素として）１Ｍｇ／ｒｔｔｌ　、サイアミン塩酸塩０．
１μシｎおよびピオチン０．３μ／１７ｆｎｌを含有す
る培地を調製し、その３０ｄづつを５００４容の振盪フ
ラスコに入れて１１５℃で１０分間を接種し、往復振盪
機によシ３１．５℃で培養を行っ次。４８時間で発酵を
終了し発酵液中に蓄積したＬ　−ＩＪジンを測定し次。

その結果、第３表に示すようにいずれの薬剤耐性株も良
好なＬ　−ＩＪジン（塩酸塩換算）を蓄積していた。

第　　３　　表 実施例２ 廃蔗糖蜜を糖として８０〃旬、正２ＰＯ４１４旬、Ｍｇ
ＳＯ４・７ａｑ　１　ｍ９／ｍｌ、大豆加水分解物を窒
素換算で１４旬および硫酸アンモニウム５００μｇ７ｒ
ｔｔｔの組成を有する培地を調製しくｐ）（７，０）、
その２０ゴづつを５００ｄ振盪フラスコに分注して加熱
殺菌し、あらかじめ別殺菌した炭酸カルシウムを１．９
加えた。この培地に下記の菌株を接種し、往復振盪機に
よ、９３１．５℃で培養を行つ次。

７２時間で発酵を終了し、発酵液中に蓄積し九Ｌ−リジ
ンを測定し比。その結果、第４表に示すようにいずれの
薬剤耐性株もＬ　−ＩＪレシン塩酸塩換算）を良好に蓄
積し念。

第　　４　　表

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属
   に属し、強化されたスーパーオキシドジスムターゼ活性
   を有し、かつＬ−リジン生産能を有する変異株を培養し
   て培養液中にＬ−リジンを生成、蓄積せしめ、これを採
   取することを特徴とする発酵法によるＬ−リジンの製造
   方法。 ２、変異株がスーパーオキシド増産剤、スーパーオキシ
   ドジスムターゼ誘導抑制剤、スーパーオキシドラジカル
   反応促進剤、またはスーパーオキシドを形成する酸素を
   供給する酸化剤に耐性を有するものである特許請求の範
   囲第１項記載の製造方法。