JPH0415238B2 - - Google Patents
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- JPH0415238B2 JPH0415238B2 JP1276999A JP27699989A JPH0415238B2 JP H0415238 B2 JPH0415238 B2 JP H0415238B2 JP 1276999 A JP1276999 A JP 1276999A JP 27699989 A JP27699989 A JP 27699989A JP H0415238 B2 JPH0415238 B2 JP H0415238B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
本発明は、テイコマイシンA2フアクター４の
実質的に純粋な形状の抗生物質およびそれを製造
する方法に関する。 テイコマイシンA2は、同化しうる炭素原、窒
素原および無機塩を含有する倍地中に菌株
Actinoplanes Teichomyceticus nou.sp.
ATCC31121を培養して得られるいくつかの異な
る抗生物質のうちのひとつである。ベルギー特許
No.839259をみよ。上記引用の特許記載の方法によ
ると、テイコマイシンA1，A2およびA3を含有す
る抗生物質の混合物を、発酵ブロスより、水に混
和しない適当な有機溶媒で抽出し、抽出溶媒より
沈澱させる一般的方法で採取する。ついでテイコ
マイシンA2を、Sephadex 上のカラムクロマト
グラフイーを用いて得られた抗生物質混合物より
分ける。スルホン化ポリスチレン樹脂を通して精
製したあとのテイコマイシンA2は１組のペーパ
ーおよび薄層クロマトグラフイーシステムでの
Rf値を含めた、広く１連の種々の化学的物理的
パラメーターで特徴づける。クロマトグラフイー
で、化合物は真に単一生成物として振舞つた。 予期されなかつたこととして、今回、テイコマ
イシンA2は、実際には、いくつかの一緒に生成
する非常に類似した抗生物質の混合物を包含する
ことが分つた。それらの主なフアクターは、テイ
コマイシンA2フアクター１、テイコマイシンA2
フアクター２、テイコマイシンA2フアクター３、
テイコマイシンA2フアクター４およびテイコマ
イシンA2フアクター５と命名された。さらに、
これらの純粋な単一なフアクターは、それらが、
感受性の微生物に対し高度の抗生物質活性を有す
る点で、テイコマイシンA2複合物から区別され
ることが分つた。 本発明の抗生物質を製造するには、上記引用の
ベルギー特許記載のテイコマイシンA2より出発
し、高効率クロマトグラフ法により抗生物質複合
物を単一のフアクターに分け主要なものを採取す
る。 本明細書中に記載の“テイコマイシンA2”、
“テイコマイシンA2複合物”または“抗生物質複
合物”の用語は、たとえば、本明細書中に引用す
るベルギー特許839259の記載により得られ、そこ
でテイコマイシンA2と命名されている、上記の
同時に生産される５種の抗生物質フアクターを含
有する混合物を意味する。この複合物を、主な、
純粋な単一フアクターに分けることは、逆相分配
クロマトグラフイーまたはイオン−交換クロマト
グラフイーで行ないうる。前者では、カラムの充
填に不活化シリカゲルを用い、展開にはアセトニ
トリル／ギ酸アンモニウム水溶液のグラジエント
溶出を用いるのが便宜であり、後者では、静止相
に、ゲル型の弱陰イオン交換体を用い、溶出シス
テムに、水性緩衝液または水性緩衝液と非水性溶
媒との混合物を用いるのが適当である。特に、希
ギ酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとの混
合物に溶解したテイコマイシンA2の溶液をシラ
ン化シリカゲルカラムに通し、同じ溶媒システム
でカラムをグラジエント溶出する。アガロースの
ジエチルアミノエチル誘導体を静止相に用い、緩
衝溶液または緩衝溶液と非水混和性の溶媒との混
合物を用いて徐々に溶出して分ける。 分離操作はHPLCでモニターする。類似の
HPLCのプロフイールを有する分画を合併し、望
むならば調整用HPLCでさらに精製し脱塩する。
これらの溶液より、有機溶媒を蒸発させ、水をス
トリツプして小容量とし、過剰の、化合物の溶解
しない有機溶媒を加えて、生成物を沈澱させる。 本発明方法をさらによく説明するためにつぎに
具体例を示す。しかし、示した特定の条件で本発
明を制限するわけでない。テイコマイシンA2フ
アクター１、２、３、４および５の分離ベルギー
特許839259に記載の方法で得られたテイコマイシ
ンA2複合物の10グラムを0.2％ギ酸アンモニウム
−アセトニトリル（９：１）混合物の１リツトル
に溶解し、１規定NaOHでPH7.5に調整する。こ
の溶液をシラン化シリカゲル60（Merck）の500
グラムを含有するカラムに通す。 カラムは、0.2％ギ酸アンモニウム溶液中10％
から20％までのアセトニトリルの直線状グラジエ
ントで溶出する。全容量は10リツトルとする。 20ml宛の分画を集めHPLCでチエツクする。 次表に、代表的なHPLC分離におけるテイコマ
イシンA2フアクター１、２、３、４および５に
おける保持時間（tR）を示す。操作条件は次表に
示す。 表 １ テイコマイシンA2 フアクター 保持時間（分） １ 21.2 ２ 22.6 ３ 23.3 ４ 25.8 ５ 26.4 ３，５−ジヒドロキシトルエン 8.84 （内部標準） カラム：5μ Zorbax ODS（Du Pont） 移動相：40分のうちに、Ａ中０％Ｂから50％Ｂま
で直線状グラジエント (A) 25ｍＭ NaH2PO4／アセトニトリル
（９：１）0.1N NaOHでPH6.0に緩衝 (B) 25ｍＭ NaH2PO4／アセトニトリル
（３：７）0.1N NaOHでPH6.0に緩衝 流速：２ml／分 検出器：254nｍでのU.V.フオトメーター同じ
HPLCプロフイールの分画を集め、溶媒を減圧
で蒸発させる。残つた水溶液を、シラン化シリ
カゲル（60）（Merck）の10グラムを含有する
カラムに通す。カラムは蒸溜水で洗いギ酸アン
モニウムを除き、50％水性アセトニトリルで溶
出する。溶出液は水を蒸発しやすくするために
ブタノールを加えて小容量に濃縮し、ついで
１：１アセトン−エチルエーテル混合物で沈澱
させる。上記の操作で純テイコマイシンA2フ
アクター１（410mg）およびフアクター２（770
mg）をうる。テイコマイシンA2フアクター３
は、テイコマイシンA2フアクター２と１：１
混合物となつているものを、つぎの操作条件で
精製する。半調製用のHPLCを用いる。 カラム：Whatman Partisil ODS M910／50 移動相：0.2％ギ酸アンモニウム水溶液／アセト
ニトリル（76：24）。 流 速：4.5ml／分 検出器：U.V.フオトメーター254nｍ 添加量：20mg この場合HPLCで各分画をチエツクして精製を
モニターした。 純テイコマイシンA2フアクター２を含有する
分画および純テイコマイシンA2フアクター３を
含有する分画を合併し、脱塩し前記のように沈澱
させた。（収量：510mgのテイコマイシンA2フア
クター２および250mgのテイコマイシンA2フアク
ター３）。 第１のカラムから得られる、フアクター４およ
び５を１：１の割合に含有する分画（約500mg）、
平行して実施した第２の分離より同様に得られた
フアクター４および５の混合物含有別のプール
（約490mg）を合併し、テイコマイシンA2フアク
ター３の精製について上記した操作条件を用いる
半調製用HPLCで分け、350mgのテイコマイシン
A2フアクター４および300mgのテイコマイシンA2
フアクター５を得た。テイコマイシンA2の純単
一フアクターの化学的−物理的特徴 テイコマイシンA2フアクター１は白色無定型
粉末で、加熱すると、約220℃で暗化し始め、225
℃で完全に分解する。つぎの特徴を有する。 (a) PH＞7.0およびPH＜2.0の水、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキサイド、およびプロ
ピレングリコールに自由に溶解する。 メチルセロソルブおよびグリセロールに僅溶 メタノールおよびエタノールに難溶、クロロ
ホルム、ベンゼン、ｎ−ヘキサン、アセトニト
リル、エチルエーテル、アセトン、酢酸エチ
ル、四塩化炭素にほとんど不溶 (b) 第１図に紫外部吸収スペクトルを示す。つぎ
の吸収極大を示す。 0.1N塩酸中：λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝49.5） PH7.4リン酸緩衝液中： λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝50.0） 0.1N水酸化ナトリウム中： λnax297nｍ（Ｅ１％ １cm＝72.1） (c) 第２図にヌジヨール中の赤外部吸収スペクト
ルを示す。つぎに吸収極大である。3700−
3100、2960−2840（ヌジヨール）、1645、1590、
1510、1460（ヌジヨール）、1375（ヌジヨール）、
1305、1230、1180、1155、1060、1025、970、
890、840、815、720（ヌジヨール）； (d) 不活性気体中約140℃にあらかじめ乾燥した
（％ΔW＝8.5）試料の元素分析値の大体のパー
セント組成（平均値）をつぎに示す：炭素
56.70％；水素4.90％；窒素6.65％；塩素3.80
％；酸素（差）27.95％。 (e) 5μ Zorbax ODSカラムを用いる逆相HPLC
で、40分で溶液Ａ中０％から50％までの溶液Ｂ
の直線状グラジエントで溶出（溶液Ａ：25ｍＭ
のNaH2PO4／アセトニトリル（９／１）0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝、溶液Ｂ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（３／７）、0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝）流速２ml／分（内部
標準：３，５−ジヒドロキシ−トルエンtR8.84
分）。 (f) 数滴のD2O添加DMSO−d6中濃度25mg／0.5
mlで測定して、270MHzの1HNMRスペクトル
（全スペクトルは第３図に示す）はつぎの群の
シグナルを示す（TMSを内部標準として：δ
＝0.00ppm）： 0.8−1.5（ｍ）；1.7−2.3（ｍ）； 2.7−4.0（ｍ）；4.0−4.7（ｍ）； 4.8−5.8（ｍ）；6.2−8.1（ｍ）。 (g) 酸官能基を有し、塩を形成する。 (h) 塩を形成する塩基性官能基を有する。 (i) 高速原子衝撃（FAB）をイオン原に用いる
質量スペクトル分析で測定して分子量は約1875
（FAB質量スペクトルの測定についてはたとえ
ばM.Barber等、Nature、293、No.5830、270−
75（1981））。 テイコマイシンA2フアクター２は白色無定型
粉末で210℃に加熱すると暗化し、250℃で完全に
分解する。つぎの特性を有する。 (a) PH＞7.0またはPH＜２の水、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキサイド、およびプロ
ピレングリコールに自由に溶解し；メチルセロ
ソルブおよびグリセロールに僅溶で；メタノー
ルおよびエタノールに難溶で；クロロホルム、
ベンゼン、ｎ−ヘキサン、アセトニトリル、エ
チルエーテル、アセトン、酢酸エチル、四塩化
炭素に不溶である。 (b) 第４図に紫外部吸収スペクトルを示す。つぎ
の吸収極大を与える。 0.1Nの塩酸中：λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝48） リン酸緩衝液PH7.4中： λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝49.0） 0.1N水酸化ナトリウム中： λnax297nｍ（Ｅ１％ １cm＝70.0） (c) 第５図にヌジヨール中の赤外部吸収スペクト
ルを示す。つぎの吸収極大を認める。3700−
3100、2960−2860（ヌジヨール）、1645、1590、
1510、1460（ヌジヨール）、1375（ヌジヨール）、
1300、1260、1230、1180、1150、1060、1025、
970、890、845、815、720（ヌジヨール）。 (d) 元素分析値、不活性気体中で試料を約140℃
に加熱したあと（％ΔW＝9.8）の大体のパー
セント組成（平均）をつぎに示す：炭素、
56.15％；水素5.15％；窒素、6.30％；塩素3.90
％；酸素（差）、28.50％。 (e) 5μ Zorbax ODSカラムを用いる逆相HPLC
で、40分で溶液Ａ中、溶液Ｂの０％から50％ま
での直線状グラジエント（溶液Ａ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（９／１）0.1Nの
NaOHでPH6.0に緩衝、溶液Ｂ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（３／７）、0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝）で、２ml／分で溶出
し、保持時間（tR）22.6分。（内部標準：３，
５−ジヒドロキシ−トルエンtR8.84分）。 (f) D2O数滴添加DMSO−d6中で記録した270M
Hzの1HNMR（第６図に示す）はつぎのシグナ
ル群を示す（濃度25mg／0.5ml）（TMSの内部
標準を：δ＝0.00ppm）： 0.7−1.5（ｍ）；1.8−2.2（ｍ）； 2.7−4.5（ｍ）；4.6−5.7（ｍ）； 6.2−8.1（ｍ）。 (g) 塩を形成する酸官能基を有する。 (h) 塩を形成する塩基官能基を有する。 (i) FABマススペクトルで測定して約1877の分
子量。 テイコマイシンA2フアクター３は白色無定型
の粉末で、加熱すると205℃で分解を始め、250℃
で完全に分解する。つぎの特性を有する： (a) PH＞7.0またはPH＜2.0の水、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキサイド、およびプロ
ピレングリコールに自由に溶解し；メチルセロ
ソルブおよびグリセロールに僅溶で；メタノー
ルおよびエタノールに難溶で；クロロホルム、
ベンゼン、ｎ−ヘキサン、アセトニトリル、エ
チルエーテル、アセトン、酢酸エチル、四塩化
炭素にほとんど不溶である。 (b) 紫外部吸収スペクトルを第７図に示すが、極
大吸収はつぎのようである。 0.1NのHCl；λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝49.2） PH7.4のリン酸緩衝液中； λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝50.8） 0.1N水酸化ナトリウム中； λnax297nｍ（Ｅ１％ １cm＝72.7） (c) 第８図にヌジヨール中の赤外部スペクトルを
示す。つぎのような吸収極大を認める。3700−
3100、2960−2850（ヌジヨール）；1645、1590、
1510、1460（ヌジヨール）、1375（ヌジヨール）、
1300、1230、1180、1150、1120、1060、1030、
970、890、845、820、800、720（ヌジヨール）。 (d) 元素分析値、不活性気体中であらかじめ約
140℃に加熱した試料（％ΔW＝12.0）は、つ
ぎの大体の組成パーセント（平均）を示す：炭
素、56.26％；水素5.20％；窒素、6.69％；塩素
3.95％；酸素（差）、27.90％。 (e) 5μ Zorbax ODSカラムを用い、溶液Ａ中、
溶液Ｂを、40分のうちに０％から50％とする直
線状グラジエント（溶液Ａ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（９／１）、0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝、溶液Ｂ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（３／７）、0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝）とし、２ml／分の流
速での逆相HPLCで分析して、保持時間（tR）
は23.3分（内部標準：３，５−ジヒドロキシト
ルエンtR8.84分）。 (f) 数滴のD2Oを加えたDMSO−d6中（濃度25
mg／0.5ml）で測定した270MHzの1HNMRスペ
クトルを第９図に示す。つぎのシグナルを示す
（内部標準TMS、δ＝0.00ppm）：0.7−1.5
（ｍ）；1.8−2.0（ｍ）；2.7−4.5（ｍ）；4.6−5.7
（ｍ）；6.2−8.0（ｍ）。 (g) 塩を形成しうる酸性基を有する。 (h) 塩を形成する塩基性基を有する。 (i) FABスペクトルで測定して、分子量約1877。 テイコマイシンA2フアクター４は白色無定型
の粉末で、加熱すると210℃で暗化し始め、250℃
で完全に分解し、つぎの特性を示す。 (a) PH＞7.0またはPH＜2.0の水、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキサイド、およびプロ
ピレングリコール巾に自由に溶解し；メチルセ
ロソルブおよびグリセロールに僅溶である；メ
タノールおよびエタノールに難溶である；クロ
ロホルム、ベンゼン、ｎ−ヘキサン、アセトニ
トリル、エチルエーテル、アセトン、酢酸エチ
ル、四塩化炭素にほとんど不溶である。 (b) 第１０図に紫外部吸収スペクトルを示す。吸
収極大はつぎのようである。 0.1N塩酸中：λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝52.5） PH7.4リン酸緩衝液中：λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm ＝52.5） 0.1N水酸化ナトリウム中： λnax297nｍ（Ｅ１％ １cm＝75.5） (c) ヌジヨール中の赤外部スペクトルを第１１図
に示す。吸収極大はつぎのようである。：3700
−3100、2960−2840（ヌジヨール）、1645、
1590、1510、1460（ヌジヨール）、1375（ヌジヨ
ール）、1300、1230、1175、1140、1060、1025、
970、890、840、815、720（ヌジヨール）。 (d) 元素分析値、不活性気体中で約140℃に予備
乾燥した試料（％ΔW＝9.8）の大体の組成パ
ーセントをつぎに示す（平均）：炭素、56.50
％；水素、5.10％；窒素、6.50％；塩素、3.80
％；酸素（差）28.10％。 (e) 5μ Zorbax ODSカラムを用い、溶液Ａ中
溶液Ｂを、40分のうちに０％から50％とする直
線状グラジエント（溶液Ａ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（９／１）、0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝、溶液Ｂ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（３／７）、0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝）とし、２ml／分の流
速での逆相HPLCで分析して、保持時間（tR
は）25.8分（内部標準：３，５−ジヒドロキシ
トルエンtR8.84分）。 (f) 塩を形成しうる酸性官能基を有する。 (g) 塩を形成しうる塩基性官能基を有する。 (h) FAB質量スペクトルで測定して分子量約
1891。 テイコマイシンA2フアクター５は白色無定型
粉末で210℃に加熱すると暗化しはじめ、250℃で
完全に分解し、つぎの特性を有する。 (a) PH＞7.0またはPH＜2.0の水、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキサイド、およびプロ
ピレングリコールに自由に溶解し；メチルセロ
ソルブおよびグリセロールに僅溶で； メタノールおよびエタノールに難溶で、クロ
ロホルム、ベンゼン、ｎ−ヘキサン、アセトニ
トリル、エチルエーテル、アセトン、酢酸エチ
ル、四塩化炭素にほとんど不溶である。 (b) 紫外部吸収スペクトルを第１２図に示すが、
吸収極大はつぎのようである。 0.1NのHCl中；λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝49.6） PH7.4のリン酸緩衝液中； λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝51.8） 0.1N水酸化ナトリウム中； λnax297nｍ（Ｅ１％ １cm＝78.8） (c) 第１３図にヌジヨール中の赤外部吸収スペク
トルを示す。つぎのような吸収極大を認める。
3700−3100、2960−2840（ヌジヨール）、1645、
1590、1510、1460（ヌジヨール）、1375（ヌジヨ
ール）、1300、1230、1175、1145、1060、1025、
970、890、840、815、720（ヌジヨール）。 (d) 元素分析値、不活性気体中であらかじめ約
140℃に加熱した試料（％ΔW＝10.1）は、つ
ぎの大体の組成パーセント（平均）を示す；炭
素、56.60％；水素5.05％；窒素、6.63％；塩
素、3.85％；酸素（差）、27.87％。 (e) 5μ Zorbax ODSカラムを用い、溶液Ａ中
溶液Ｂを40分のうちに、０％から50％とする直
線状グラジエント（溶液Ａ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（９／１）、0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝、溶液Ｂ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（３／７）、0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝）とし、２ml／分の流
速での逆相HPLCで分析して、保持時間（tR）
は23.4分（内部標準：３，５−ジヒドロキシト
ルエンtR8.84分）。 (f) 塩を形成しうる酸性基を有する。 (g) 塩を形成しうる塩基性基を有する。 (h) FAB質量スペクトルで測定して分子量約
1891。 テイコマイシンA2フアクター１、２、３、４
および５のそれぞれは塩を形成しうる酸性基を有
する。テイコマイシンA2フアクター１、２、３、
４および５のアルカリ金属、アルカリ土金属およ
び薬剤として許容されるアンモニウム塩は、本発
明のさらに別の目的である。 代表的なアルカリ金属およびアルカリ土金属塩
には、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシ
ウムおよびマグネシウム塩がある。アンモニウム
塩にはアンモニウムおよび１級、２級または３級
（C1−C4）アルキルアンモニウムおよびヒドロキ
シ−（C1−C4）アルキルアンモニウム塩がある。
アルカリおよびアルカリ土金属塩は、金属塩を製
造するためのふつうの方法で製造しうる。たとえ
ば遊離酸形のテイコマイシンA2フアクター１、
２、３、４または５を、プロピレングリコールの
ような適当な溶媒に溶解し、適当な選択した無機
塩基の化学量論的量を、得られた溶液に加える。 生成するアルカリまたはアルカリ土金属塩は、
非溶媒で沈澱させ、濾過して採取する。 別様には、これらの塩を凍結乾燥で実質的に無
水の形に調整しうる。その場合、適当に選択した
アルカリまたはアルカリ土金属の炭酸塩または水
酸化物をPH７から８にするように加えて遊離酸形
を塩にして得られた、望む塩を含有する水溶液よ
り不溶物を濾去し、凍結乾燥する。 有機アンモニウム塩はテイコマイシンA2フア
クター１、２、３、４および５の遊離酸型を適当
な溶媒たとえばプロピレングリコールに含有する
溶液に適当に選択したアミンを加え溶媒および過
剰のアミンを蒸発さすか、または、できるだけ小
量の水中で上記の試剤を接触させ非溶媒を加えて
得られた塩を沈澱さすことにより調製しうる。 前記したように、テイコマイシンA2フアクタ
ー１、２、３、４および５のそれぞれは、塩とな
しうむ塩基性官能基を有する。純粋な単一フアク
ターと、むしろ強い酸、なるべくは鉱酸とを接触
さす、この方面の技術で知られる方法で製造し
た、薬剤として許容されうる酸付加塩は、本発明
の別の目的となる。テイコマイシンA2フアクタ
ー２ナトリウム塩の製造。 テイコマイシンA2フアクター２（150mg、15ml）
の水溶液を、0.1NのNaOHを滴下して、PH8.0と
する。得られた溶液を濾過し、凍結乾燥システム
の室に移し、凍結させる。完全に凍結したら、室
を0.1メートルの真空とし、プレートを０℃に加
熱して氷を昇華させる。操作は生成物がほとんど
乾燥するまで続ける。約１％含水量まで。このよ
うに得られたテイコマイシンA2フアクター２ナ
トリウム塩を25mlのメチルセロソルブ／H2O3/1
に溶解し、0.1NHClで滴定すると、pK：7.03お
よび4.78を特徴とする２つの滴定可能の官能基の
存在を示す。 上記の方法を行なうが、テイコマイシンA2フ
アクター１、３、４および５より出発して、相当
するナトリウム塩をうる。得られた塩中のナトリ
ウムを定量すると、モノナトリウム塩である。 グラム陽性細菌に主に活性を示すテイコマイシ
ンA2フアクター１、２、３、４および５のイン
ビトロ−抗菌活性を、ミクロタイターシステム中
で２倍希釈法を用いて、ぶどう球菌および連鎖球
菌の臨床分離株に対して調べた。Penassayブロ
ス（Difco）を前者に、Todd−Hewittブロス
（Difco）を後者に用いた。ブロス１夜培養物を、
最終接種体が約103コロニー形成単位／mlになる
ように希釈した。37℃で18−24時間インキユベー
シヨンしたあと、肉眼に見える発育を示さない最
低濃度を最小阻止濃度（MIC）とした。
実質的に純粋な形状の抗生物質およびそれを製造
する方法に関する。 テイコマイシンA2は、同化しうる炭素原、窒
素原および無機塩を含有する倍地中に菌株
Actinoplanes Teichomyceticus nou.sp.
ATCC31121を培養して得られるいくつかの異な
る抗生物質のうちのひとつである。ベルギー特許
No.839259をみよ。上記引用の特許記載の方法によ
ると、テイコマイシンA1，A2およびA3を含有す
る抗生物質の混合物を、発酵ブロスより、水に混
和しない適当な有機溶媒で抽出し、抽出溶媒より
沈澱させる一般的方法で採取する。ついでテイコ
マイシンA2を、Sephadex 上のカラムクロマト
グラフイーを用いて得られた抗生物質混合物より
分ける。スルホン化ポリスチレン樹脂を通して精
製したあとのテイコマイシンA2は１組のペーパ
ーおよび薄層クロマトグラフイーシステムでの
Rf値を含めた、広く１連の種々の化学的物理的
パラメーターで特徴づける。クロマトグラフイー
で、化合物は真に単一生成物として振舞つた。 予期されなかつたこととして、今回、テイコマ
イシンA2は、実際には、いくつかの一緒に生成
する非常に類似した抗生物質の混合物を包含する
ことが分つた。それらの主なフアクターは、テイ
コマイシンA2フアクター１、テイコマイシンA2
フアクター２、テイコマイシンA2フアクター３、
テイコマイシンA2フアクター４およびテイコマ
イシンA2フアクター５と命名された。さらに、
これらの純粋な単一なフアクターは、それらが、
感受性の微生物に対し高度の抗生物質活性を有す
る点で、テイコマイシンA2複合物から区別され
ることが分つた。 本発明の抗生物質を製造するには、上記引用の
ベルギー特許記載のテイコマイシンA2より出発
し、高効率クロマトグラフ法により抗生物質複合
物を単一のフアクターに分け主要なものを採取す
る。 本明細書中に記載の“テイコマイシンA2”、
“テイコマイシンA2複合物”または“抗生物質複
合物”の用語は、たとえば、本明細書中に引用す
るベルギー特許839259の記載により得られ、そこ
でテイコマイシンA2と命名されている、上記の
同時に生産される５種の抗生物質フアクターを含
有する混合物を意味する。この複合物を、主な、
純粋な単一フアクターに分けることは、逆相分配
クロマトグラフイーまたはイオン−交換クロマト
グラフイーで行ないうる。前者では、カラムの充
填に不活化シリカゲルを用い、展開にはアセトニ
トリル／ギ酸アンモニウム水溶液のグラジエント
溶出を用いるのが便宜であり、後者では、静止相
に、ゲル型の弱陰イオン交換体を用い、溶出シス
テムに、水性緩衝液または水性緩衝液と非水性溶
媒との混合物を用いるのが適当である。特に、希
ギ酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとの混
合物に溶解したテイコマイシンA2の溶液をシラ
ン化シリカゲルカラムに通し、同じ溶媒システム
でカラムをグラジエント溶出する。アガロースの
ジエチルアミノエチル誘導体を静止相に用い、緩
衝溶液または緩衝溶液と非水混和性の溶媒との混
合物を用いて徐々に溶出して分ける。 分離操作はHPLCでモニターする。類似の
HPLCのプロフイールを有する分画を合併し、望
むならば調整用HPLCでさらに精製し脱塩する。
これらの溶液より、有機溶媒を蒸発させ、水をス
トリツプして小容量とし、過剰の、化合物の溶解
しない有機溶媒を加えて、生成物を沈澱させる。 本発明方法をさらによく説明するためにつぎに
具体例を示す。しかし、示した特定の条件で本発
明を制限するわけでない。テイコマイシンA2フ
アクター１、２、３、４および５の分離ベルギー
特許839259に記載の方法で得られたテイコマイシ
ンA2複合物の10グラムを0.2％ギ酸アンモニウム
−アセトニトリル（９：１）混合物の１リツトル
に溶解し、１規定NaOHでPH7.5に調整する。こ
の溶液をシラン化シリカゲル60（Merck）の500
グラムを含有するカラムに通す。 カラムは、0.2％ギ酸アンモニウム溶液中10％
から20％までのアセトニトリルの直線状グラジエ
ントで溶出する。全容量は10リツトルとする。 20ml宛の分画を集めHPLCでチエツクする。 次表に、代表的なHPLC分離におけるテイコマ
イシンA2フアクター１、２、３、４および５に
おける保持時間（tR）を示す。操作条件は次表に
示す。 表 １ テイコマイシンA2 フアクター 保持時間（分） １ 21.2 ２ 22.6 ３ 23.3 ４ 25.8 ５ 26.4 ３，５−ジヒドロキシトルエン 8.84 （内部標準） カラム：5μ Zorbax ODS（Du Pont） 移動相：40分のうちに、Ａ中０％Ｂから50％Ｂま
で直線状グラジエント (A) 25ｍＭ NaH2PO4／アセトニトリル
（９：１）0.1N NaOHでPH6.0に緩衝 (B) 25ｍＭ NaH2PO4／アセトニトリル
（３：７）0.1N NaOHでPH6.0に緩衝 流速：２ml／分 検出器：254nｍでのU.V.フオトメーター同じ
HPLCプロフイールの分画を集め、溶媒を減圧
で蒸発させる。残つた水溶液を、シラン化シリ
カゲル（60）（Merck）の10グラムを含有する
カラムに通す。カラムは蒸溜水で洗いギ酸アン
モニウムを除き、50％水性アセトニトリルで溶
出する。溶出液は水を蒸発しやすくするために
ブタノールを加えて小容量に濃縮し、ついで
１：１アセトン−エチルエーテル混合物で沈澱
させる。上記の操作で純テイコマイシンA2フ
アクター１（410mg）およびフアクター２（770
mg）をうる。テイコマイシンA2フアクター３
は、テイコマイシンA2フアクター２と１：１
混合物となつているものを、つぎの操作条件で
精製する。半調製用のHPLCを用いる。 カラム：Whatman Partisil ODS M910／50 移動相：0.2％ギ酸アンモニウム水溶液／アセト
ニトリル（76：24）。 流 速：4.5ml／分 検出器：U.V.フオトメーター254nｍ 添加量：20mg この場合HPLCで各分画をチエツクして精製を
モニターした。 純テイコマイシンA2フアクター２を含有する
分画および純テイコマイシンA2フアクター３を
含有する分画を合併し、脱塩し前記のように沈澱
させた。（収量：510mgのテイコマイシンA2フア
クター２および250mgのテイコマイシンA2フアク
ター３）。 第１のカラムから得られる、フアクター４およ
び５を１：１の割合に含有する分画（約500mg）、
平行して実施した第２の分離より同様に得られた
フアクター４および５の混合物含有別のプール
（約490mg）を合併し、テイコマイシンA2フアク
ター３の精製について上記した操作条件を用いる
半調製用HPLCで分け、350mgのテイコマイシン
A2フアクター４および300mgのテイコマイシンA2
フアクター５を得た。テイコマイシンA2の純単
一フアクターの化学的−物理的特徴 テイコマイシンA2フアクター１は白色無定型
粉末で、加熱すると、約220℃で暗化し始め、225
℃で完全に分解する。つぎの特徴を有する。 (a) PH＞7.0およびPH＜2.0の水、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキサイド、およびプロ
ピレングリコールに自由に溶解する。 メチルセロソルブおよびグリセロールに僅溶 メタノールおよびエタノールに難溶、クロロ
ホルム、ベンゼン、ｎ−ヘキサン、アセトニト
リル、エチルエーテル、アセトン、酢酸エチ
ル、四塩化炭素にほとんど不溶 (b) 第１図に紫外部吸収スペクトルを示す。つぎ
の吸収極大を示す。 0.1N塩酸中：λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝49.5） PH7.4リン酸緩衝液中： λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝50.0） 0.1N水酸化ナトリウム中： λnax297nｍ（Ｅ１％ １cm＝72.1） (c) 第２図にヌジヨール中の赤外部吸収スペクト
ルを示す。つぎに吸収極大である。3700−
3100、2960−2840（ヌジヨール）、1645、1590、
1510、1460（ヌジヨール）、1375（ヌジヨール）、
1305、1230、1180、1155、1060、1025、970、
890、840、815、720（ヌジヨール）； (d) 不活性気体中約140℃にあらかじめ乾燥した
（％ΔW＝8.5）試料の元素分析値の大体のパー
セント組成（平均値）をつぎに示す：炭素
56.70％；水素4.90％；窒素6.65％；塩素3.80
％；酸素（差）27.95％。 (e) 5μ Zorbax ODSカラムを用いる逆相HPLC
で、40分で溶液Ａ中０％から50％までの溶液Ｂ
の直線状グラジエントで溶出（溶液Ａ：25ｍＭ
のNaH2PO4／アセトニトリル（９／１）0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝、溶液Ｂ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（３／７）、0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝）流速２ml／分（内部
標準：３，５−ジヒドロキシ−トルエンtR8.84
分）。 (f) 数滴のD2O添加DMSO−d6中濃度25mg／0.5
mlで測定して、270MHzの1HNMRスペクトル
（全スペクトルは第３図に示す）はつぎの群の
シグナルを示す（TMSを内部標準として：δ
＝0.00ppm）： 0.8−1.5（ｍ）；1.7−2.3（ｍ）； 2.7−4.0（ｍ）；4.0−4.7（ｍ）； 4.8−5.8（ｍ）；6.2−8.1（ｍ）。 (g) 酸官能基を有し、塩を形成する。 (h) 塩を形成する塩基性官能基を有する。 (i) 高速原子衝撃（FAB）をイオン原に用いる
質量スペクトル分析で測定して分子量は約1875
（FAB質量スペクトルの測定についてはたとえ
ばM.Barber等、Nature、293、No.5830、270−
75（1981））。 テイコマイシンA2フアクター２は白色無定型
粉末で210℃に加熱すると暗化し、250℃で完全に
分解する。つぎの特性を有する。 (a) PH＞7.0またはPH＜２の水、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキサイド、およびプロ
ピレングリコールに自由に溶解し；メチルセロ
ソルブおよびグリセロールに僅溶で；メタノー
ルおよびエタノールに難溶で；クロロホルム、
ベンゼン、ｎ−ヘキサン、アセトニトリル、エ
チルエーテル、アセトン、酢酸エチル、四塩化
炭素に不溶である。 (b) 第４図に紫外部吸収スペクトルを示す。つぎ
の吸収極大を与える。 0.1Nの塩酸中：λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝48） リン酸緩衝液PH7.4中： λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝49.0） 0.1N水酸化ナトリウム中： λnax297nｍ（Ｅ１％ １cm＝70.0） (c) 第５図にヌジヨール中の赤外部吸収スペクト
ルを示す。つぎの吸収極大を認める。3700−
3100、2960−2860（ヌジヨール）、1645、1590、
1510、1460（ヌジヨール）、1375（ヌジヨール）、
1300、1260、1230、1180、1150、1060、1025、
970、890、845、815、720（ヌジヨール）。 (d) 元素分析値、不活性気体中で試料を約140℃
に加熱したあと（％ΔW＝9.8）の大体のパー
セント組成（平均）をつぎに示す：炭素、
56.15％；水素5.15％；窒素、6.30％；塩素3.90
％；酸素（差）、28.50％。 (e) 5μ Zorbax ODSカラムを用いる逆相HPLC
で、40分で溶液Ａ中、溶液Ｂの０％から50％ま
での直線状グラジエント（溶液Ａ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（９／１）0.1Nの
NaOHでPH6.0に緩衝、溶液Ｂ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（３／７）、0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝）で、２ml／分で溶出
し、保持時間（tR）22.6分。（内部標準：３，
５−ジヒドロキシ−トルエンtR8.84分）。 (f) D2O数滴添加DMSO−d6中で記録した270M
Hzの1HNMR（第６図に示す）はつぎのシグナ
ル群を示す（濃度25mg／0.5ml）（TMSの内部
標準を：δ＝0.00ppm）： 0.7−1.5（ｍ）；1.8−2.2（ｍ）； 2.7−4.5（ｍ）；4.6−5.7（ｍ）； 6.2−8.1（ｍ）。 (g) 塩を形成する酸官能基を有する。 (h) 塩を形成する塩基官能基を有する。 (i) FABマススペクトルで測定して約1877の分
子量。 テイコマイシンA2フアクター３は白色無定型
の粉末で、加熱すると205℃で分解を始め、250℃
で完全に分解する。つぎの特性を有する： (a) PH＞7.0またはPH＜2.0の水、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキサイド、およびプロ
ピレングリコールに自由に溶解し；メチルセロ
ソルブおよびグリセロールに僅溶で；メタノー
ルおよびエタノールに難溶で；クロロホルム、
ベンゼン、ｎ−ヘキサン、アセトニトリル、エ
チルエーテル、アセトン、酢酸エチル、四塩化
炭素にほとんど不溶である。 (b) 紫外部吸収スペクトルを第７図に示すが、極
大吸収はつぎのようである。 0.1NのHCl；λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝49.2） PH7.4のリン酸緩衝液中； λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝50.8） 0.1N水酸化ナトリウム中； λnax297nｍ（Ｅ１％ １cm＝72.7） (c) 第８図にヌジヨール中の赤外部スペクトルを
示す。つぎのような吸収極大を認める。3700−
3100、2960−2850（ヌジヨール）；1645、1590、
1510、1460（ヌジヨール）、1375（ヌジヨール）、
1300、1230、1180、1150、1120、1060、1030、
970、890、845、820、800、720（ヌジヨール）。 (d) 元素分析値、不活性気体中であらかじめ約
140℃に加熱した試料（％ΔW＝12.0）は、つ
ぎの大体の組成パーセント（平均）を示す：炭
素、56.26％；水素5.20％；窒素、6.69％；塩素
3.95％；酸素（差）、27.90％。 (e) 5μ Zorbax ODSカラムを用い、溶液Ａ中、
溶液Ｂを、40分のうちに０％から50％とする直
線状グラジエント（溶液Ａ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（９／１）、0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝、溶液Ｂ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（３／７）、0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝）とし、２ml／分の流
速での逆相HPLCで分析して、保持時間（tR）
は23.3分（内部標準：３，５−ジヒドロキシト
ルエンtR8.84分）。 (f) 数滴のD2Oを加えたDMSO−d6中（濃度25
mg／0.5ml）で測定した270MHzの1HNMRスペ
クトルを第９図に示す。つぎのシグナルを示す
（内部標準TMS、δ＝0.00ppm）：0.7−1.5
（ｍ）；1.8−2.0（ｍ）；2.7−4.5（ｍ）；4.6−5.7
（ｍ）；6.2−8.0（ｍ）。 (g) 塩を形成しうる酸性基を有する。 (h) 塩を形成する塩基性基を有する。 (i) FABスペクトルで測定して、分子量約1877。 テイコマイシンA2フアクター４は白色無定型
の粉末で、加熱すると210℃で暗化し始め、250℃
で完全に分解し、つぎの特性を示す。 (a) PH＞7.0またはPH＜2.0の水、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキサイド、およびプロ
ピレングリコール巾に自由に溶解し；メチルセ
ロソルブおよびグリセロールに僅溶である；メ
タノールおよびエタノールに難溶である；クロ
ロホルム、ベンゼン、ｎ−ヘキサン、アセトニ
トリル、エチルエーテル、アセトン、酢酸エチ
ル、四塩化炭素にほとんど不溶である。 (b) 第１０図に紫外部吸収スペクトルを示す。吸
収極大はつぎのようである。 0.1N塩酸中：λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝52.5） PH7.4リン酸緩衝液中：λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm ＝52.5） 0.1N水酸化ナトリウム中： λnax297nｍ（Ｅ１％ １cm＝75.5） (c) ヌジヨール中の赤外部スペクトルを第１１図
に示す。吸収極大はつぎのようである。：3700
−3100、2960−2840（ヌジヨール）、1645、
1590、1510、1460（ヌジヨール）、1375（ヌジヨ
ール）、1300、1230、1175、1140、1060、1025、
970、890、840、815、720（ヌジヨール）。 (d) 元素分析値、不活性気体中で約140℃に予備
乾燥した試料（％ΔW＝9.8）の大体の組成パ
ーセントをつぎに示す（平均）：炭素、56.50
％；水素、5.10％；窒素、6.50％；塩素、3.80
％；酸素（差）28.10％。 (e) 5μ Zorbax ODSカラムを用い、溶液Ａ中
溶液Ｂを、40分のうちに０％から50％とする直
線状グラジエント（溶液Ａ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（９／１）、0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝、溶液Ｂ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（３／７）、0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝）とし、２ml／分の流
速での逆相HPLCで分析して、保持時間（tR
は）25.8分（内部標準：３，５−ジヒドロキシ
トルエンtR8.84分）。 (f) 塩を形成しうる酸性官能基を有する。 (g) 塩を形成しうる塩基性官能基を有する。 (h) FAB質量スペクトルで測定して分子量約
1891。 テイコマイシンA2フアクター５は白色無定型
粉末で210℃に加熱すると暗化しはじめ、250℃で
完全に分解し、つぎの特性を有する。 (a) PH＞7.0またはPH＜2.0の水、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキサイド、およびプロ
ピレングリコールに自由に溶解し；メチルセロ
ソルブおよびグリセロールに僅溶で； メタノールおよびエタノールに難溶で、クロ
ロホルム、ベンゼン、ｎ−ヘキサン、アセトニ
トリル、エチルエーテル、アセトン、酢酸エチ
ル、四塩化炭素にほとんど不溶である。 (b) 紫外部吸収スペクトルを第１２図に示すが、
吸収極大はつぎのようである。 0.1NのHCl中；λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝49.6） PH7.4のリン酸緩衝液中； λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝51.8） 0.1N水酸化ナトリウム中； λnax297nｍ（Ｅ１％ １cm＝78.8） (c) 第１３図にヌジヨール中の赤外部吸収スペク
トルを示す。つぎのような吸収極大を認める。
3700−3100、2960−2840（ヌジヨール）、1645、
1590、1510、1460（ヌジヨール）、1375（ヌジヨ
ール）、1300、1230、1175、1145、1060、1025、
970、890、840、815、720（ヌジヨール）。 (d) 元素分析値、不活性気体中であらかじめ約
140℃に加熱した試料（％ΔW＝10.1）は、つ
ぎの大体の組成パーセント（平均）を示す；炭
素、56.60％；水素5.05％；窒素、6.63％；塩
素、3.85％；酸素（差）、27.87％。 (e) 5μ Zorbax ODSカラムを用い、溶液Ａ中
溶液Ｂを40分のうちに、０％から50％とする直
線状グラジエント（溶液Ａ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（９／１）、0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝、溶液Ｂ：25ｍＭの
NaH2PO4／アセトニトリル（３／７）、0.1N
のNaOHでPH6.0に緩衝）とし、２ml／分の流
速での逆相HPLCで分析して、保持時間（tR）
は23.4分（内部標準：３，５−ジヒドロキシト
ルエンtR8.84分）。 (f) 塩を形成しうる酸性基を有する。 (g) 塩を形成しうる塩基性基を有する。 (h) FAB質量スペクトルで測定して分子量約
1891。 テイコマイシンA2フアクター１、２、３、４
および５のそれぞれは塩を形成しうる酸性基を有
する。テイコマイシンA2フアクター１、２、３、
４および５のアルカリ金属、アルカリ土金属およ
び薬剤として許容されるアンモニウム塩は、本発
明のさらに別の目的である。 代表的なアルカリ金属およびアルカリ土金属塩
には、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシ
ウムおよびマグネシウム塩がある。アンモニウム
塩にはアンモニウムおよび１級、２級または３級
（C1−C4）アルキルアンモニウムおよびヒドロキ
シ−（C1−C4）アルキルアンモニウム塩がある。
アルカリおよびアルカリ土金属塩は、金属塩を製
造するためのふつうの方法で製造しうる。たとえ
ば遊離酸形のテイコマイシンA2フアクター１、
２、３、４または５を、プロピレングリコールの
ような適当な溶媒に溶解し、適当な選択した無機
塩基の化学量論的量を、得られた溶液に加える。 生成するアルカリまたはアルカリ土金属塩は、
非溶媒で沈澱させ、濾過して採取する。 別様には、これらの塩を凍結乾燥で実質的に無
水の形に調整しうる。その場合、適当に選択した
アルカリまたはアルカリ土金属の炭酸塩または水
酸化物をPH７から８にするように加えて遊離酸形
を塩にして得られた、望む塩を含有する水溶液よ
り不溶物を濾去し、凍結乾燥する。 有機アンモニウム塩はテイコマイシンA2フア
クター１、２、３、４および５の遊離酸型を適当
な溶媒たとえばプロピレングリコールに含有する
溶液に適当に選択したアミンを加え溶媒および過
剰のアミンを蒸発さすか、または、できるだけ小
量の水中で上記の試剤を接触させ非溶媒を加えて
得られた塩を沈澱さすことにより調製しうる。 前記したように、テイコマイシンA2フアクタ
ー１、２、３、４および５のそれぞれは、塩とな
しうむ塩基性官能基を有する。純粋な単一フアク
ターと、むしろ強い酸、なるべくは鉱酸とを接触
さす、この方面の技術で知られる方法で製造し
た、薬剤として許容されうる酸付加塩は、本発明
の別の目的となる。テイコマイシンA2フアクタ
ー２ナトリウム塩の製造。 テイコマイシンA2フアクター２（150mg、15ml）
の水溶液を、0.1NのNaOHを滴下して、PH8.0と
する。得られた溶液を濾過し、凍結乾燥システム
の室に移し、凍結させる。完全に凍結したら、室
を0.1メートルの真空とし、プレートを０℃に加
熱して氷を昇華させる。操作は生成物がほとんど
乾燥するまで続ける。約１％含水量まで。このよ
うに得られたテイコマイシンA2フアクター２ナ
トリウム塩を25mlのメチルセロソルブ／H2O3/1
に溶解し、0.1NHClで滴定すると、pK：7.03お
よび4.78を特徴とする２つの滴定可能の官能基の
存在を示す。 上記の方法を行なうが、テイコマイシンA2フ
アクター１、３、４および５より出発して、相当
するナトリウム塩をうる。得られた塩中のナトリ
ウムを定量すると、モノナトリウム塩である。 グラム陽性細菌に主に活性を示すテイコマイシ
ンA2フアクター１、２、３、４および５のイン
ビトロ−抗菌活性を、ミクロタイターシステム中
で２倍希釈法を用いて、ぶどう球菌および連鎖球
菌の臨床分離株に対して調べた。Penassayブロ
ス（Difco）を前者に、Todd−Hewittブロス
（Difco）を後者に用いた。ブロス１夜培養物を、
最終接種体が約103コロニー形成単位／mlになる
ように希釈した。37℃で18−24時間インキユベー
シヨンしたあと、肉眼に見える発育を示さない最
低濃度を最小阻止濃度（MIC）とした。
【表】
【表】
フアクター１、２、３、４および５の微生物活
性の相対的な比較を、S.aureusATCC6538を試験
菌、テイコマイシンA2複合物を標準にして寒天
拡散法で実施した。テイコマイシンA2フアクタ
ー１、テイコマイシンA2フアクター２、テイコ
マイシンA2フアクター３、テイコマイシンA2フ
アクター４、テイコマイシンA2フアクター５お
よび標準に用いるテイコマイシン複合物の適当量
を2000μｇ／mlにジメチルホルムアミドに溶解す
る。溶液は、１％牛血清を加えた、PH7.4、
0.067Mのリン酸緩衝液でさらに希釈し、2.5、
５、10および20μｇ／mlの濃度とした。 濾紙デイスクを試料溶液で浸し、試験菌の懸濁
液を接種してある寒天プレートの表面上に規則的
に間隔をあけておいた。プレートは37℃で18時間
インキユベートし、阻止帯の直径を測定した。得
られたデーターをコンピユーターに入れ、複合物
を基準として、個々のフアクターの力価を計算し
た。結果を下に示す。 テイコマイシンA2フアクター１ 841U／mg テイコマイシンA2フアクター２ 1086U／mg テイコマイシンA2フアクター３ 1131U／mg テイコマイシンA2フアクター４ 1066U／mg テイコマイシンA2フアクター５ 954U／mg テイコマイシンA2複合物 1000U／mg テイコマイシンA2フアクター２、３、４およ
び５をさらにS.pneumoniaeおよびS.pyogenesで
マウスにおこした感染症について調べてみた。テ
イコマイシンA2複合物と比較して実験した。結
果を次表３に示す。
性の相対的な比較を、S.aureusATCC6538を試験
菌、テイコマイシンA2複合物を標準にして寒天
拡散法で実施した。テイコマイシンA2フアクタ
ー１、テイコマイシンA2フアクター２、テイコ
マイシンA2フアクター３、テイコマイシンA2フ
アクター４、テイコマイシンA2フアクター５お
よび標準に用いるテイコマイシン複合物の適当量
を2000μｇ／mlにジメチルホルムアミドに溶解す
る。溶液は、１％牛血清を加えた、PH7.4、
0.067Mのリン酸緩衝液でさらに希釈し、2.5、
５、10および20μｇ／mlの濃度とした。 濾紙デイスクを試料溶液で浸し、試験菌の懸濁
液を接種してある寒天プレートの表面上に規則的
に間隔をあけておいた。プレートは37℃で18時間
インキユベートし、阻止帯の直径を測定した。得
られたデーターをコンピユーターに入れ、複合物
を基準として、個々のフアクターの力価を計算し
た。結果を下に示す。 テイコマイシンA2フアクター１ 841U／mg テイコマイシンA2フアクター２ 1086U／mg テイコマイシンA2フアクター３ 1131U／mg テイコマイシンA2フアクター４ 1066U／mg テイコマイシンA2フアクター５ 954U／mg テイコマイシンA2複合物 1000U／mg テイコマイシンA2フアクター２、３、４およ
び５をさらにS.pneumoniaeおよびS.pyogenesで
マウスにおこした感染症について調べてみた。テ
イコマイシンA2複合物と比較して実験した。結
果を次表３に示す。
【表】
テイコマイシンA2フアクター１、２、３、４
および５についてのマウス腹腔急性毒性を次表４
に示す。
および５についてのマウス腹腔急性毒性を次表４
に示す。
【表】
上記から、テイコマイシンA2フアクター１、
テイコマイシンA2フアクター２、テイコマイシ
ンA2フアクター３、テイコマイシンA2フアクタ
ー４およびテイコマイシンA2フアクター５は、
活性成分に感受性の病原性細菌でおこる感染症の
予防および治療に、ヒトおよび獣医用の薬に用い
る抗菌性調製物の活性成分として効果的に用いう
ることが分つた。そのような治療で、これらの化
合物はそのままかまたは単一の個々のフアクター
として、または、それらの活性パターンの類似性
から、５つのフアクターの２つまたはそれ以上の
任意の割合の混合物の形状で用いうる。本発明の
化合物は、経口、局所または注射投与しうる。し
かし注射投与がもつとも有利である。投与のルー
トに応じて、経口、局所または注射投与しうる。
しかし注射投与がもつとも有利である。投与ルー
トに応じて、これらの化合物は種々の投与形態に
処方しうる。経口投与用の調製物はカプセル、錠
剤、液状溶液または懸濁液となしうる。この方面
の技術で知られているように、カプセルおよび錠
剤は、活性成分に加えて、従来から用いられてい
る助剤、乳糖、リン酸カルシウム、ソルビトール
および類似の希釈剤、ステアリン酸マグネシウ
ム、タルク、ポリエチレングリコールのような滑
剤、ポリビニルピロリドン、ゲラチン、ソルビト
ール、トラガカント、アカシア、風味剤のような
結合剤および許容されうる崩壊剤、湿展剤を含有
しうる。一般的に水性または油性の溶液または懸
濁液の形の液体調製物は、懸濁剤のような従来か
ら用いられている添加物を含有しうる。局所的使
用には、本発明の化合物は、皮膚を鼻およびのど
の粘膜または気管の組織を通しての吸収に適当な
形にも調製でき、便宜とあれば、液状スプレーま
たは吸入剤、ロゼンジまたはのどに塗布する形状
ともなしうる。眼や耳に施すには、調製物は液体
または半固体となしうる。軟膏、クリーム、ロー
シヨン、ペイントまたは粉末のように疎水性また
は親水性のベースに処方して、局所施用しうる。
注射用の組成物は、油状または水性のビヒクル中
に懸濁液、溶液またはエマルジヨンとすることが
でき懸濁剤、安定化剤および（または）分散剤の
ような処方用薬剤を含有しうる。別様には、活性
成分を粉末にしておいて、使用時に、無菌水のよ
うな適当なビヒクルで再構成しうる。投与すべき
活性成分の量は、治療しようとする対象の大きさ
および状態、投与のルートおよび瀕度および感染
原といつた種々の要因で変化する。 テイコマイシンA2フアクター１，２，３，４
および５は、体重Kgについて約0.1から約20mgの
１日量が一般的に有効で、ふつう、１日に２回に
分けて投与する。特に望ましい組成物は、約50か
ら約250mg／単位を含有する単位投与形態である。 薬剤組成物を調製する代表的例をつぎに示す。 注射用の無菌水２ml中にテイコマイシンA2フ
アクター２のナトリウム塩の100mgを溶解して注
射用溶液とする。 250mgのテイコマイシンA2フアクター３のナト
リウム塩を３mlの注射用無菌水に溶解して注射用
溶液とする。 200mgのテイコマイシンA2フアクター２ 600mgのポリエチレングリコール4000U.S.P. 1.2ｇのポリエチレングリコール400U.S.P. を用いて局所用軟膏とする。 医薬としての用途の他に、本発明の化合物は動
物生長促進剤に用いられる。 その目的では、本発明の化合物のひとつまたは
ひとつより多くを適当な飼料に加えて経口投与す
る。用いる正確な濃度は、正常量の餌が消費され
た時に、生長促進に有効な量の活性剤が摂取され
るようにする。 本発明の活性化合物を動物飼料に加えるには、
有効量の活性化合物を含有する適当な飼料プレミ
ツクスを調製し、そのプレミツクを完成させた飼
料に添加するのが有利である。 別様には、活性成分を中程度の濃さに含有する
ような飼料添加物を、飼料に混入しうる。 そのような飼料プレミツクスおよび完成飼料を
調製し投与する方法は、参照刊行物（たとえば、
“Applied Animal Nutrition”、W.H.Freedman
and Co.，S.Francisco，USA，1969または
“Livestock Feeds and Feeding”、Ｏ and Ｂ
Books，Corvallis，Oregon，USA，1977）に
記載されているので、これらを本明細書の参照文
献として引用する。
テイコマイシンA2フアクター２、テイコマイシ
ンA2フアクター３、テイコマイシンA2フアクタ
ー４およびテイコマイシンA2フアクター５は、
活性成分に感受性の病原性細菌でおこる感染症の
予防および治療に、ヒトおよび獣医用の薬に用い
る抗菌性調製物の活性成分として効果的に用いう
ることが分つた。そのような治療で、これらの化
合物はそのままかまたは単一の個々のフアクター
として、または、それらの活性パターンの類似性
から、５つのフアクターの２つまたはそれ以上の
任意の割合の混合物の形状で用いうる。本発明の
化合物は、経口、局所または注射投与しうる。し
かし注射投与がもつとも有利である。投与のルー
トに応じて、経口、局所または注射投与しうる。
しかし注射投与がもつとも有利である。投与ルー
トに応じて、これらの化合物は種々の投与形態に
処方しうる。経口投与用の調製物はカプセル、錠
剤、液状溶液または懸濁液となしうる。この方面
の技術で知られているように、カプセルおよび錠
剤は、活性成分に加えて、従来から用いられてい
る助剤、乳糖、リン酸カルシウム、ソルビトール
および類似の希釈剤、ステアリン酸マグネシウ
ム、タルク、ポリエチレングリコールのような滑
剤、ポリビニルピロリドン、ゲラチン、ソルビト
ール、トラガカント、アカシア、風味剤のような
結合剤および許容されうる崩壊剤、湿展剤を含有
しうる。一般的に水性または油性の溶液または懸
濁液の形の液体調製物は、懸濁剤のような従来か
ら用いられている添加物を含有しうる。局所的使
用には、本発明の化合物は、皮膚を鼻およびのど
の粘膜または気管の組織を通しての吸収に適当な
形にも調製でき、便宜とあれば、液状スプレーま
たは吸入剤、ロゼンジまたはのどに塗布する形状
ともなしうる。眼や耳に施すには、調製物は液体
または半固体となしうる。軟膏、クリーム、ロー
シヨン、ペイントまたは粉末のように疎水性また
は親水性のベースに処方して、局所施用しうる。
注射用の組成物は、油状または水性のビヒクル中
に懸濁液、溶液またはエマルジヨンとすることが
でき懸濁剤、安定化剤および（または）分散剤の
ような処方用薬剤を含有しうる。別様には、活性
成分を粉末にしておいて、使用時に、無菌水のよ
うな適当なビヒクルで再構成しうる。投与すべき
活性成分の量は、治療しようとする対象の大きさ
および状態、投与のルートおよび瀕度および感染
原といつた種々の要因で変化する。 テイコマイシンA2フアクター１，２，３，４
および５は、体重Kgについて約0.1から約20mgの
１日量が一般的に有効で、ふつう、１日に２回に
分けて投与する。特に望ましい組成物は、約50か
ら約250mg／単位を含有する単位投与形態である。 薬剤組成物を調製する代表的例をつぎに示す。 注射用の無菌水２ml中にテイコマイシンA2フ
アクター２のナトリウム塩の100mgを溶解して注
射用溶液とする。 250mgのテイコマイシンA2フアクター３のナト
リウム塩を３mlの注射用無菌水に溶解して注射用
溶液とする。 200mgのテイコマイシンA2フアクター２ 600mgのポリエチレングリコール4000U.S.P. 1.2ｇのポリエチレングリコール400U.S.P. を用いて局所用軟膏とする。 医薬としての用途の他に、本発明の化合物は動
物生長促進剤に用いられる。 その目的では、本発明の化合物のひとつまたは
ひとつより多くを適当な飼料に加えて経口投与す
る。用いる正確な濃度は、正常量の餌が消費され
た時に、生長促進に有効な量の活性剤が摂取され
るようにする。 本発明の活性化合物を動物飼料に加えるには、
有効量の活性化合物を含有する適当な飼料プレミ
ツクスを調製し、そのプレミツクを完成させた飼
料に添加するのが有利である。 別様には、活性成分を中程度の濃さに含有する
ような飼料添加物を、飼料に混入しうる。 そのような飼料プレミツクスおよび完成飼料を
調製し投与する方法は、参照刊行物（たとえば、
“Applied Animal Nutrition”、W.H.Freedman
and Co.，S.Francisco，USA，1969または
“Livestock Feeds and Feeding”、Ｏ and Ｂ
Books，Corvallis，Oregon，USA，1977）に
記載されているので、これらを本明細書の参照文
献として引用する。
第１図はテイコマイシンA2フアクター１の紫
外線吸収スペクトルを示す。第２図はテイコマイ
シンA2フアクター１の赤外線スペクトルを示す。
第３図はテイコマイシンA2フアクター１の
1HNMRスペクトルを示す。第４図はテイコマイ
シンA2フアクター２の紫外線吸収スペクトルを
示す。第５図はテイコマイシンA2フアクター２
の赤外線スペクトルを示す。第６図はテイコマイ
シンA2フアクター２の 1HNMRスペクトルを示
す。第７図はテイコマイシンA2フアクター３の
紫外線吸収スペクトルを示す。第８図はテイコマ
イシンA2フアクター３の赤外線吸収スペクトル
を示す。第９図はテイコマイシンA2フアクター
３の 1HNMRスペクトルを示す。第１０図はテ
イコマイシンA2フアクター４の紫外線吸収スペ
クトルを示す。第１１図はテイコマイシンA2フ
アクター４の赤外線吸収スペクトルを示す。第１
２図はテイコマイシンA2フアクター５の紫外線
吸収スペクトルを示す。第１３図はテイコマイシ
ンA2フアクター５の赤外線吸収スペクトルを示
す。
外線吸収スペクトルを示す。第２図はテイコマイ
シンA2フアクター１の赤外線スペクトルを示す。
第３図はテイコマイシンA2フアクター１の
1HNMRスペクトルを示す。第４図はテイコマイ
シンA2フアクター２の紫外線吸収スペクトルを
示す。第５図はテイコマイシンA2フアクター２
の赤外線スペクトルを示す。第６図はテイコマイ
シンA2フアクター２の 1HNMRスペクトルを示
す。第７図はテイコマイシンA2フアクター３の
紫外線吸収スペクトルを示す。第８図はテイコマ
イシンA2フアクター３の赤外線吸収スペクトル
を示す。第９図はテイコマイシンA2フアクター
３の 1HNMRスペクトルを示す。第１０図はテ
イコマイシンA2フアクター４の紫外線吸収スペ
クトルを示す。第１１図はテイコマイシンA2フ
アクター４の赤外線吸収スペクトルを示す。第１
２図はテイコマイシンA2フアクター５の紫外線
吸収スペクトルを示す。第１３図はテイコマイシ
ンA2フアクター５の赤外線吸収スペクトルを示
す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 化学的物理的性質として、無定型の白色粉末
であり、加熱すると約210℃で暗化を始め250℃で
完全に分解し、 (a) PH＞7.0またはPH＜2.0の水、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキサイド、およびプロ
ピレングリコールに自由に溶解し、メチルセロ
ソルブおよびグリセロールに僅溶でメタノール
およびエタノールに難溶で、クロロホルム、ベ
ンゼン、ｎ−ヘキサン、アセトニトリル、エチ
ルエーテル、アセトン、酢酸エチル、四塩化炭
素に不溶であり、 (b) 0.1N塩酸中λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝52.5） PH7.4リン酸塩緩衝液中λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm ＝52.5）0.1N水酸化ナトリウム中λnax297nｍ
（Ｅ１％ １cm＝75.5） の吸収極大を有する紫外線吸収スペクトルを有
し、 (c) ヌジヨール中、3700−3100、2960−2840（ヌ
ジヨール）、1645、1590、1510、1460（ヌジヨー
ル）、1375（ヌジヨール）、1300、1230、1175、
1140、1060、1025、970、890、840、815、720
（ヌジヨール）に吸収極大を有する赤外線スペ
クトルを有し、 (d) 不活性気体中約140℃にあらかじめ試料を乾
燥して（％ΔW＝9.8）、おおよそのパーセント
組成（平均）とし、炭素56.50％；水素5.10
％；窒素6.50％；塩素3.80％；酸素（差）28.10
％を与える元素分析値を有し、 (e) 5μ Zorbax ODSカラムを用い、溶液Ａ中
溶液Ｂを、40分のうちに０％から50％までの直
線状グラジエント（溶液Ａ：0.1NのNaOHで
PH6.0に緩衝した25ｍＭのNaH2PO4／アセトニ
トリル（９／１）、溶液Ｂ：0.1NのNaOHでPH
6.0に緩衝した25ｍＭのNaH2PO4／アセトニト
リル（３／７））とし、２ml／分の流速で溶出
する逆相HPLCで分析して保持時間（tR）が
25.8分（内部標準：３，５−ジヒドロキシトル
エンtR8.84分）であり、 (f) 塩を形成しうる酸性官能基と、 (g) 塩を形成しうる塩基性官能基と、 (h) FAB質量スペクトルで測定して約1981の分
子量を有するテイコマイシンA2フアクター４
及び薬剤として許容されうるその塩。 ２ 薬剤として許容されうる塩がアルカリ金属
塩、アルカリ土金属塩またはアンモニウム塩であ
る特許請求の範囲第１項記載のテイコマイシン
A2フアクター４。 ３ 逆相分配またはイオン交換クロマトグラフイ
ーによりテイコマイシンA2複合物より、 化学的物理的性質として、無定型の白色粉末で
あり、加熱すると210℃で暗化を始め250℃で完全
に分解し、 (a) PH＞7.0またはPH＜2.0の水、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキサイド、およびプロ
ピレングリコールに自由に溶解し、メチルセロ
ソルブおよびグリセロールに僅溶でメタノール
およびエタノールに難溶で、セクロロホルム、
ベンゼン、ｎ−ヘキサン、アセトニトリル、エ
チルエーテル、アセトン、酢酸エチル、四塩化
炭素に不溶であり、 (b) 0.1N塩酸中λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝52.5） PH7.4リン酸塩緩衝液中λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm ＝52.5）0.1N水酸化ナトリウム中λnax297nｍ
（Ｅ１％ １cm＝75.5） の吸収極大を有する紫外線吸収スペクトルを有
し、 (c) ヌジヨール中、3700−3100、2960−2840（ヌ
ジヨール）、1645、1590、1510、1460（ヌジヨー
ル）、1375（ヌジヨール）、1300、1230、1175、
1140、1060、1025、970、890、840、815、720
（ヌジヨール）に吸収極大を有する赤外線スペ
クトルを有し、 (d) 不活性気体中約140℃にあらかじめ試料を乾
燥して（％ΔW＝9.8）、おおよそのパーセント
組成（平均）とし、炭素56.50％；水素5.10
％；窒素6.50％；塩素3.80％；酸素（差）28.10
％を与える元素分析値を有し、 (e) 5μ Zorbax ODSカラムを用い、溶液Ａ中
溶液Ｂを、40分のうちに０％から50％までの直
線状グラジエント（溶液Ａ：0.1NのNaOHで
PH6.0に緩衝した25ｍＭのNaH2PO4／アセトニ
トリル（９／１）、溶液Ｂ：0.1NのNaOHでPH
6.0に緩衝した25ｍＭのNaH2PO4／アセトニト
リル（３／７））とし、２ml／分の流速で溶出
する逆相HPLCで分析して、保持時間（tR）が
25.8分（内部標準：３，５−ジヒドロキシトル
エンtR8.84分）であり、 (f) 塩を形成しうる酸性官能基と、 (g) 塩を形成しうる塩基性官能基と、 (h) FAB質量スペクトルで測定して約1981の分
子量を有するテイコマイシンA2フアクター４
を分け、そして、望むならば、既知の方法によ
り得られたテイコマイシンA2フアクター４を
相当する薬剤として許容される塩に変えること
からなるテイコマイシンA2フアクター４の製
造方法。 ４ シラン化シリカゲルカラムおよび、展開に、
希水性ギ酸アンモニウム中アセトニトリルによる
グラジエント溶出を用いるカラムクロマトグラフ
イーで分離を行なう、特許請求の範囲第３項記載
の方法。 ５ 0.2％ギ酸アンモニウム溶液中10から20％ま
でのアセトニトリルの直線状グラジエントでカラ
ムを展開する特許請求の範囲４項記載の方法。 ６ カラムより２つのフアクターの混合物を採取
した時に、オクタデシルシランカラムおよびアセ
トニトリル：0.2％水性ギ酸アンモニウムの24：
76の混合物展開剤を用いる逆相クロマトグラフイ
ーにより単一にフアクターに分けることを特徴と
する、特許請求の範囲５項記載の方法。 ７ アガロースのジエチルアミノエチル誘導体を
静止相に、そして、緩衝溶液、または緩衝溶液と
非水性水混和性の溶媒との混合物を溶出液に用い
るカラムクロマトグラフイーで分離を行なう、特
許請求の範囲３項記載の方法。 ８ 化学的物理的性質として、無定型の白色粉末
であり、加熱すると210℃で暗化を始め250℃で完
全に分解し、 (a) PH＞7.0またはPH＜2.0の水、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキサイド、およびプロ
ピレングリコールに自由に溶解し、メチルセロ
ソルブおよびグリセロールに僅溶でメタノール
およびエタノールに難溶で、クロロホルム、ベ
ンゼン、ｎ−ヘキサン、アセトニトリル、エチ
ルエーテル、アセトン、酢酸エチル、四塩化炭
素に不溶であり、 (b) 0.1N塩酸中λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm＝52.5） PH7.4リン酸塩緩衝液中λnax278nｍ（Ｅ１％ １cm ＝52.5）0.1N水酸化ナトリウム中λnax297nｍ
（Ｅ１％ １cm＝75.5） に吸収極大を有する紫外線吸収スペクトルを有
し、 (c) ヌジヨール、中3700−3100、2960−2840（ヌ
ジヨール）、1645、1590、1510、1460（ヌジヨー
ル）、1375（ヌジヨール）、1300、1230、1175、
1140、1060、1025、970、890、840、815、720
（ヌジヨール）に吸収極大を有する赤外線スペ
クトルを有し、 (d) 不活性気体中約140℃であらかじめ試料を乾
燥して（％ΔW＝9.8）、おおよそのパーセント
組成（平均）として、炭素56.50％；水素5.15
％；窒素6.50％；塩素3.80％；酸素（差）28.10
％を与える元素分析値を有し、 (e) 5μ Zorbax ODSカラムを用い、溶液Ａ中
溶液Ｂを、40分のうちに０％から50％までの直
線状グラジエント（溶液Ａ：0.1NのNaOHで
PH6.0に緩衝した25ｍＭのNaH2PO4／アセトニ
トリル（９／１）、溶液Ｂ：0.1NのNaOHでPH
6.0に緩衝した25ｍＭのNaH2PO4／アセトニト
リル（３／７））とし、２ml／分の流速で溶出
する逆相HPLCで分析して保持時間（tR）が
25.8分（内部標準：３，５−ジヒドロキシトル
エンtR8.84分）であり、 (f) 塩を形成しうる酸性官能基と、 (g) 塩を形成しうる塩基性官能基と、 (h) FAB質量スペクトルで測定して約1981の分
子量を有するテイコマイシンA2フアクター４
または薬剤として許容されうるその塩を活性成
分として含有する抗細菌薬剤組成物。
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