JPH04218390A - 水溶液からの重金属の除去および分析のための錯体化および非錯体化錯体形成剤に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

水溶液からの重金属の除去および分析のための錯体化および非錯体化錯体形成剤に対するモノクローナル抗体

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JPH04218390A
JPH04218390A JP3067914A JP6791491A JPH04218390A JP H04218390 A JPH04218390 A JP H04218390A JP 3067914 A JP3067914 A JP 3067914A JP 6791491 A JP6791491 A JP 6791491A JP H04218390 A JPH04218390 A JP H04218390A
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ペーター、ヘルメンチン
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】本発明は、高い特異性及び結合活性でエチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はジエチレントリア
ミン五酢酸（ＤＴＰＡ）のような水溶性コンプレクソン
と結合しかつ金属イオンとのＥＤＴＡ又はＤＴＰＡの錯
体化後もこれらのコンプレクソンに対して高い結合活性
及び特異性を留めているモノクローナル抗体（ｍＡＢ）
に関する。したがって、これらのｍＡＢはＥＤＴＡ又は
ＤＴＰＡと錯体化される毒性重金属を除去するため、例
えばフィルター又は他の支持体に結合されて用いること
ができる。更に、これらのｍＡＢは水溶液中におけるＥ
ＤＴＡ又はＤＴＰＡの定量的測定用にイムノアッセイ（
ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ等）の成分として適している。 【０００２】ＥＤＴＡのようなコンプレクソンと結合す
る重金属は、飲料水供給分野で極めて危険である。この
理由から、ＥＤＴＡ濃度の迅速、正確かつ定量的な測定
は、廃水又は飲料水からのＥＤＴＡ金属錯体の除去と同
じく非常に重要である。 【０００３】腫瘍治療の目的のため親水性コンプレクソ
ンに対するｍＡＢを得る計画において、非錯体化及び金
属錯体化ＥＤＴＡ又はＤＴＰＡの双方に対して高い結合
活性を有するｍＡＢを生成させることに意外にも成功し
た。 【０００４】ｍＡＢは下記のように製造された。例中で
個別的に説明されるように、イソチオシアナトベンジル
‐ＤＴＰＡはハプテンとしてヒト血清アルブミンに結合
され、イットリウムイオンで錯体化された。次いでこの
ハプテン‐“キャリア”‐錯体は適切なマウスを免疫化
するために用いられ、最大抗ＤＴＰＡ抗体力価のマウス
脾臓が適切なミエローマ細胞系と融合された。得られた
ハイブリドーマは下記の特異的酵素結合イムノアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）で試験された。 【０００５】ＥＬＩＳＡではヒト血清アルブミン（ＨＳ
Ａ）‐ベンジル‐ＤＴＰＡ含有溶液が担持された固相を
用いた。ｍＡＢを含有した試験すべき上澄は遊離コンプ
レクソン又はその金属イオン錯体と前インキュベートさ
れ、特異的固相へのその結合量が測定された。この目的
のため、抗マウス免疫グロブリン抗体に結合された酵素
増幅系が用いられた。この方法の詳細は例２及び３で記
載されている。この試験系により、第Ｉ表で記載された
性質を有するｍＡＢが得られた。 【０００６】これらのｍＡＢは、多くの他の抗ＤＴＰＡ
／ＥＤＴＡ　　ｍＡＢと対照的に、ＡＰＡＡＰ技術（Ｃ
ｏｒｄｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ
．Ｃｙｓｔｏｃｈｅｍ．，３２：２１９，１９８４）　
により低温保存組織で調べられるように正常ヒト組織と
結合しない。このため、診断及び治療分野においてイン
ビボでこれらのｍＡＢを用いることが可能である。 【０００７】非錯体化及び錯体化形のコンプレクソンＤ
ＴＰＡ及びＥＤＴＡ（例４）は競合物質として用いられ
た。加えて、構造的に関連した化合物トランスアコニッ
ト酸及び１，２‐ジアミノエタンが阻害剤として用いら
れた（第Ｉ表参照）。ｍＡＢ抗原結合を５０％阻害する
第Ｉ表で示された過剰量の競合物質は、表示されたｍＡ
Ｂが非錯体化ＥＤＴＡ又はＤＴＰＡ及び金属イオンで錯
体化されたＥＤＴＡ又はＤＴＰＡの双方と強い結合を有
することを示している。これらの特徴は、液体から非錯
体化ＥＤＴＡ又はＤＴＰＡ及びＥＤＴＡ‐金属イオン又
はＤＴＰＡ‐金属イオン錯体の双方を除去するため、例
えばフィルター又は他の固体支持体に結合されたｍＡＢ
を用いることを可能にしている。ｍＡＢ‐／ＥＤＴＡ‐
金属イオン錯体の沈降反応も同様に毒性金属イオンを除
去する上で適切である。この使用のために特に適したｍ
ＡＢは、ＥＤＴＡ及びその錯体との相互作用が特に強い
ｍＡＢ　　ＢＷ２０５０／５３５である。 【０００８】したがって本発明は、金属イオンで錯体化
されたＥＤＴＡ又はＤＴＰＡ及び非錯体化ＥＤＴＡ又は
ＤＴＰＡに対して高い親和性のｍＡＢ、その製造方法並
びに診断もしくは治療の成分としての又は毒性金属イオ
ンの除去のためのその使用に関する。本発明は更に例中
でより詳細に記載されており、特許請求の範囲に含まれ
ている。 【０００９】 【実施例】例１：ＥＤＴＡ又はＤＴＰＡ特異性ｍＡＢの
製造 　　イソチオシアナトベンジル‐ＤＴＰＡをハプテンと
して１９ベンジル‐ＤＴＰＡ分子／ＨＳＡ分子の誘導度
化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）でＮ．Ｗ．Ｂｒｅ
ｃｈｂｉｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５：２７７２−２７８１（１９８
６）　で記載される方法に従いキャリアとしてのヒト血
清アルブミン（ＨＳＡ）に共有結合させた。未標識ＹＣ
ｌ３が錯体化されたこのハプテン‐キャリア錯体２０μ
ｇを０日目にフロイントアジュバント、７及び１４日目
に不完全フロイントアジュバント並びに２１日目にＰＢ
Ｓと共にＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射した。２４日目
に最大抗ＤＴＰＡ抗体力価のマウス脾臓をＳＰ２／０‐
Ａｇ１４ミエローマ細胞系〔Ｓｈｕｌｍａｎ　ｅｔ　ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９（１９７６）　〕
と融合させた。 得られたハイブリドーマを特異的ＥＬＩＳＡで高親和性
のｍＡＢ産生のために試験した（例２）。 【００１０】例２：ＤＴＰＡ又はＥＤＴＡ錯体によるｍ
ＡＢに関する定量的阻害ＥＬＩＳＡ 　　ヌンク（Ｎｕｎｃ）製の可分性９６ウェルポリスチ
レンマイクロタイタープレート（Ｕ形）タイプＢ　Ｎｏ
．４‐６０４４５を支持物質として用いた。アッセイは
下記プロトコールに従い行った。 （１）複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）　１μｇ／ｍｌｐ
Ｈ７．２ＰＢＳの濃度でのＹベンジル‐ＤＴＰＡ‐ＨＳ
Ａ１９‐複合体５０μＬをウェル毎にピペットで入れ、
室温（ＲＴ）で一夜インキュベートする。 （２）上澄を吸引除去し、洗浄をｐＨ７．４の０．０５
Ｍトリスクエン酸緩衝液（洗液１）で３回行う；（１回
の洗浄でほぼ洗液２５０μＬ／ウェルを導入し、２分間
放置し、吸引除去する）。 （３）マイクロタイタープレートが直ちに要求されない
場合には、それをＲＴで一夜セルロース上で（開口部下
向きに）放置する。次いでプレートをバランスデシケー
ター〔ギャプラスト（Ｇａｐｌａｓｔ）　製：ポストフ
ァッヒ５２９，８１００ガーミッシュ‐パーテンキルヒ
ェン（Ｐｏｓｔｆａｃｈ５２９，８１００　Ｇａｒｍｉ
ｓｃｈ−Ｐａｒｔｅｎｋｉｒｃｈｅｎ）　〕と共にフィ
ルムでヒートシールする。これらの条件下で、プレート
は少なくとも８週間＋４℃で保つことができる。 （４）阻止溶液２５０μＬ／ウェルを供し、３７℃で３
０分間インキュベートする。 （５）阻止に際して、希釈されたハイブリドーマ上澄と
競合物質との前インキュベートを行う（例３又は例６参
照）。 （６）適度に前希釈されかつ前インキュベートされた試
験すべきハイブリドーマ上澄５０μＬをウェル毎に供し
、室温で３０分間インキュベートする。 （７）次いで洗浄を洗液２で３回行う。 （８）次いで阻止溶液で１：５００希釈されかつアルカ
リホスファターゼで標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ１抗
体５０μＬをウェル毎に供し、室温で３０分間インキュ
ベートする。 （９）次いで洗浄をエンザイグノスト（Ｅｎｚｙｇｎｏ
ｓｔＲ　）　〔ベーリングベルケ社（Ｂｅｈｒｉｎｇｗ
ｅｒｋｅ　ＡＧ）　〕洗液で３回行う。 （１０）次いで０．１ｍＭＮＡＤＰ５０μＬを加える。 （１１）次いでインキュベートを室温で３０分間行う。 （１２）ＮＡＤＰとのインキュベートに際して、増幅系
は下記のように調製する：プレート毎にｐ‐ヨードニト
ロテトラゾリウムバイオレット（ＩＮＴ）２部及びｐＨ
７．２のＰＢＳ１部を加え、更にジアホラーゼ１部及び
ＡＤＨ１部を混合物中にピペットで入れる。 （１３）増幅系５０μＬをウェル毎に加える。 （１４）透明から赤色までの明確な変色の場合には、反
応を０．１ＮＨ２ＳＯ４溶液１００μＬ／ウェルで停止
させる。 （１５）吸光度をタイターテック・マルチスキャン　（
ＴＩＴＥＲＴＥＫＲ　ＭＵＬＴＩＳＣＡＮ）において４
９２ｎｍで測定する。ＮＡＤＰ５０μＬを増幅溶液５０
μＬ及び０．１ＮＨ２ＳＯ４１００μＬと共にブランク
値として用いる。下記試薬を用いた： ＮＡＤＰ　　　　‐シグマ（Ｓｉｇｍａ）　製，オーダ
ーＮｏ．　Ｎ‐０５０５ＩＮＴ　　　　　　‐シグマ製
，オーダーＮｏ．　Ｉ‐８３７７ＡＤＨ　　　　　　‐
シグマ製，オーダーＮｏ．　Ａ‐３２６３ジアホラーゼ
‐シグマ製，オーダーＮｏ．　Ｄ‐２３８１洗液２　　
　　　　‐ベーリング製，オーダーＮｏ．　ＯＳＥＷ９
６，　　　　　　　　　　　　　　ツイーン（Ｔｗｅｅ
ｎ）／ＰＢＳ含有阻止溶液：カゼインを加えて３０分間
攪拌することによりｐＨ７．２のＰＢＳ中で３％カゼイ
ン溶液を調製し、ｐＨを７．４に調整する。次いで粒子
を４０００ｒｐｍ　で１０分間かけ遠心除去する。希釈
されかつアルカリホスファターゼで標識されたヤギ抗マ
ウスＩｇＧ１抗体〔サザン・バイオテクノロジー・アソ
シエーツ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）　製，Ｃａｔ．Ｎｏ．　
１０８０‐０４〕 ０．１ｍＭＮＡＤＰの調製：ｐＨ９．５の２０ｍＭトリ
ス、０．１ｍＭＭｇＳＯ４１００ｍｌにＮＡＤＰ７．６
５ｍｇを溶解させる；溶液は−２０℃で数ヵ月間貯蔵す
ることができる。 ＩＮＴ（ｐ‐ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット
）の調製：超音波浴において３０％エタノール２．５ｍ
ｇ／ｍｌ　で希釈する；通常新たに調製する。 ジアホラーゼの調製：ｐＨ７．２のＰＢＳｍｌ当たりジ
アホラーゼ１ｍｇを−２０℃で少しずつ貯蔵する。 アルコールデヒドロゲナーゼの調製：ｐＨ７．２のＰＢ
Ｓｍｌ当たりＡＤＨ０．５ｍｇを−２０℃で少しずつ貯
蔵する。 【００１１】例３：ハイブリドーマ上澄と競合物質との
前インキュベーション 　　ハイブリドーマ上澄中のマウスＩｇＧ濃度は市販定
量ＥＬＩＳＡ系で測定することができ、当業界で周知で
ある。ＥＬＩＳＡにおける濃度測定に際して、ハイブリ
ドーマ上澄をＣａ＋＋及びＭｇ＋＋非含有ＰＢＳで１．
２５μｇ／ｍｌに希釈する。 グラムからモルへの変換：１５０，０００ｇ＝ｍＡＢ１
モル １．２５μｇ＝８．３３×１０−１２　モル１＋１比の
ｍＡＢ及び阻害剤を有するように、係数５に増加させた
濃度８．３３×１０−１２　モル／２００μＬの阻害剤
１０μＬを濃度８．３３×１０−１２　モル／ｍｌ　の
ハイブリドーマ上澄５０μＬに加えた。ハイブリドーマ
上澄を１００，０００倍、５０，０００倍、１０，００
０倍、５，０００倍、１，０００倍及び１００倍過剰の
競合物質と共に室温で３０分間インキュベートする。そ
の５０μＬをＥＬＩＳＡにピペットで入れる（例２の項
目６参照）。 【００１２】例４：ＤＴＰＡ又はＥＤＴＡ錯体の生成　
　第Ｉ表で示された金属イオンに関するＤＴＰＡ又はＥ
ＤＴＡの錯体定数は極めて高いため、完全な飽和はＤＴ
ＰＡ又はＥＤＴＡとこれらの金属イオンとの等モル混合
物の場合で予想される。したがって適切な金属イオンを
３倍モル過剰でＤＴＰＡ又はＥＤＴＡと共にインキュベ
ートした。例えば、二重蒸留水（ｄｏｕｂｌｅ−ｄｉｓ
ｔｉｌｌｅｄ　ｗａｔｅｒ）中１０ｍＭ硫酸カドミウム
溶液（例５参照）１７０μＬを二重蒸留水中０．０２８
モルＤＴＰＡストック溶液３０μＬと共に室温で５分間
インキュベートした。この競合物質溶液１０μＬをハイ
ブリドーマ上澄に加えて、ハイブリドーマ上澄中に含有
されたｍＡＢよりも競合物質を１００，０００倍過剰に
する。低比率の競合物質対ｍＡＢは、望ましいモル過剰
に従い特定塩イオン溶液で競合物質溶液を希釈すること
により得た（例３参照）。 【００１３】例５：用いられる金属イオンの供給源及び
関連物理化学パラメーター 　　下記金属イオンの１０ｍｍｏｌ溶液を二重蒸留水で
調製した： 塩化マンガンＭＷ１６１．８８ メルク（Ｍｅｒｃｋ）　製，Ｎｏ．５９３４　　　　　
　Ｍｎのイオン半径：８０ｐｍ 硫酸カドミウムＭＷ２５６．５ リーデル・デ・ハーン（Ｒｉｅｄｅｌ　ｄｅ　Ｈａｅｎ
）製Ｎｏ．３１１４５　　　　　　Ｃｄのイオン半径：
９７ｐｍ塩化亜鉛ＭＷ１３６．２８ メルク製，Ｎｏ．８８１６　　　　　　Ｚｎのイオン半
径：７４ｐｍ硫酸銅ＭＷ１５９．６１ リーデル・デ・ハーン製，Ｎｏ．３１２９４　　　　　
　Ｃｕのイオン半径：９６ｐｍ 塩化イットリウムＭＷ３０３．３６ アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）　製，Ｎｏ．２０，４
９１‐９　　Ｙのイオン半径：９２ｐｍ 硝酸鉛（ＩＩ）ＭＷ３３１．２０ リーデル・デ・ハーン製，Ｎｏ．３１１３７　　　　　
　Ｐｂのイオン半径：１２０ｐｍ 【００１４】例６：水性溶媒中のＥＤＴＡ又はＤＴＰＡ
濃度を測定するための競合的酵素イムノアッセイ　　例
２で記載された定量的阻害ＥＬＩＳＡにおいて、測定す
べき未知ＥＤＴＡ含有量の水性サンプル（５０μＬ）を
規定量の競合物質の代わりに加える（例２のステップ５
）。アッセイを更に例２のステップ６‐１５で記載され
るように行う。吸光度の減少は未知サンプル中のＥＤＴ
Ａ又はＤＴＰＡ濃度に比例する。規定ＥＤＴＡ又はＤＴ
ＰＡ濃度及び試験すべき適切な前希釈の未知サンプルを
加えて検量図を作成した後、未知サンプル中のＥＤＴＡ
又はＤＴＰＡ濃度は定量的に測定することができる。 【００１５】例７：特に適切なｍＡＢ　　ＢＷ２０５０
／５３５の記載 　　ｍＡＢ　　ＢＷ２０５０／５３５のＶＨ及びＶＬ遺
伝子をＯｒｌａｎｄｉ　ら〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：３８３３（１９８９）〕
により記載された方法に従いクローニングし、しかる後
配列決定した。ｍＡＢ　　ＢＷ２０５０／５３５のＶＨ
遺伝子のヌクレオチド配列は第ＩＩ表（表１）で、ＶＬ
遺伝子のは第ＩＩＩ　表（表２）で示されている。ＶＨ
遺伝子の配列は成熟タンパク質のアミノ酸４〜１１０に
関するコード配列を含んでいる。ＶＬ遺伝子の配列は成
熟タンパク質のアミノ酸３〜１０６に関するコード配列
を含んでいる。アミノ酸は３文字コードで示されている
。 【００１６】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　第Ｉ表　　　　　　　　ＤＴＰＡ又はＥ
ＤＴＡ錯体によるｍＡＢの定量的阻害アッセイ　　　　
　　　　　　固相抗原への結合を５０％阻害するモル過
剰の競合物質　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１，２−ジアミ
ｍＡＢ　Ｎｏ．　　　ＤＴＰＡ−Ｙ　ＤＴＰＡ　ＤＴＰ
Ａ−Ｍｎ　ＤＴＰＡ−Ｃｄ　ＤＴＰＡ−Ｚｎ　ＤＴＰＡ
−Ｃｕ　ＤＴＰＡ−Ｐｂ　ノエタン　　２０５０／１７
４　　１０４　　　　　１０３　　　１０２　　　　　
１０２　　　　５×１０３　　５×１０３　　　１０３
　　　１０５　まで２０５０／５３１　５×１０４　　
　１０３　　　１０２　　　　　１０２　　　　５×１
０３　　５×１０３　　５×１０３　　　　　〃２０５
０／５３２　５×１０４　　　１０３　　　１０２　　
　　　１０２　　　　５×１０３　　５×１０３　　５
×１０３　　　　　〃２０５０／５３４　５×１０４　
　　１０３　　　１０２　　　　　１０２　　　　５×
１０３　　５×１０３　　５×１０３　　　　　〃２０
５０／５３５　　１０４　　　　　１０２　　　１０２
　　　　　１０２　　　　　１０３　　　　　１０３　
　　　　１０３　　　　　　　〃　　　　　　　　トラ
ンスア ｍＡＢ　Ｎｏ．　コニット酸　　ＥＤＴＡ−Ｙ　ＥＤＴ
Ａ　ＥＤＴＡ−Ｍｎ　ＥＤＴＡ−Ｃｄ　ＥＤＴＡ−Ｚｎ
　ＥＤＴＡ−Ｃｕ　ＥＤＴＡ−Ｐｂ　２０５０／１７４
　　１０５　まで　　　　１０２　　　１０３　　　１
０３　　　　　１０３　　　　　１０３　　　　　１０
３　　　　５×１０３　２０５０／５３１　　　　〃　
　　　　　　　１０３　　　１０３　　　１０３　　　
　　１０３　　　　　１０３　　　　　１０２　　　　
　１０５　２０５０／５３２　　　　〃　　　　　　　
　１０２　　　１０３　　　１０３　　　　　１０３　
　　　　１０２　　　　５×１０３　　　１０５　２０
５０／５３４　　　　〃　　　　　　　　１０２　　　
１０３　　　１０２　　　　　１０２　　　　　１０３
　　　　　１０３　　　　５×１０３　２０５０／５３
５　　　　〃　　　　　　　　１０２　　　１０２　　
　１０２　　　　　１０２　　　　　１０２　　　　　
１０２　　　　　１０２　 【００１７】 【表１】 【００１８】 【表２】

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】錯体化又は非錯体化状態でＥＤＴＡ又はＤ
    ＴＰＡに対して高い親和性を有しかつほぼ同様の特異性
    及び結合活性で反応するモノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】ハプテンとしてヒト血清アルブミンに結合
    されたイソチオシアナトベンジル‐ＤＴＰＡ又はイソチ
    オシアナトベンジル‐ＥＤＴＡが免疫化用のキャリアと
    して用いられる、請求項１に記載のモノクローナル抗体
    。
  3. 【請求項３】得られたハイブリドーマから固相としての
    ヒト血清アルブミン‐ベンジル‐ＤＴＰＡ又はヒト血清
    アルブミン‐ベンジル‐ＥＤＴＡでの競合的ＥＬＩＳＡ
    により単離される、請求項２に記載のモノクローナル抗
    体。
  4. 【請求項４】免疫化用にヒト血清アルブミンに結合され
    たイソチオシアナトベンジル‐ＤＴＰＡ又はイソチオシ
    アナトベンジル‐ＥＤＴＡを用いることを特徴とする、
    請求項１〜３のいずれか一項に記載されたモノクローナ
    ル抗体の製造方法。
  5. 【請求項５】高親和性のモノクローナル抗体が固相とし
    てのヒト血清アルブミン‐ベンジル‐ＤＴＰＡ又はヒト
    血清アルブミン‐ベンジル‐ＥＤＴＡでの競合的ＥＬＩ
    ＳＡにより単離される、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】重金属イオンで汚染された水溶液を精製す
    るための、請求項１〜３のいずれか一項に記載されたモ
    ノクローナル抗体の使用。
  7. 【請求項７】請求項１〜３のいずれか一項に記載された
    モノクローナル抗体を含有するフィルター物質。
  8. 【請求項８】イムノアッセイによる水溶液中のＥＤＴＡ
    又はＤＴＰＡ濃度の定量的測定のための、請求項１〜３
    のいずれか一項に記載されたモノクローナル抗体の使用
    。
  9. 【請求項９】請求項１、２又は３に記載されたモノクロ
    ーナル抗体を用いることを特徴とするイムノアッセイ。
  10. 【請求項１０】好ましくは適切なイムノアッセイの形で
    請求項１又は２に記載される製造されたモノクローナル
    抗体を用いることを特徴とする、水溶液中におけるＥＤ
    ＴＡ又はＤＴＰＡの定量的測定のための方法。
  11. 【請求項１１】ＶＨおよびＶＬ遺伝子が第ＩＩ表及び第
    ＩＩＩ　表で記載されたヌクレオチド配列を有する、請
    求項１に記載のモノクローナル抗体。
JP3067914A 1990-03-07 1991-03-07 水溶液からの重金属の除去および分析のための錯体化および非錯体化錯体形成剤に対するモノクローナル抗体 Expired - Lifetime JP3065370B2 (ja)

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