JPH0754321B2 - 免疫反応性リガンドを測定するための試験キットおよび測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、緩衝化組成物および
それを含む試験キットに関する。また、この発明は、各
種の免疫反応性リガンドを検出するための各種の免疫学
的な方法におけるこの組成物の用途にも関する。これら
の方法は、多様な医療状況の検査または各種疾患の診断
および処置を可能にする。

【０００２】

【従来の技術】医療、研究および診断法の実施に際し、
生物学的流体中に存在すると信じられているかまたは知
られている生物学的物質の迅速かつ正確な測定法に対す
る欲求は依然として存在する。例えば、薬物、麻薬、ホ
ルモン、ステロイド、ポリペプチド、タンパク質、多
糖、プラスタグランジンならびに血液、唾液、精液、膣
分泌液、尿、組織培養物および他の生物学的流体中の感
染性生物体の存在は、法外でない価格の適当な診断およ
び処置のための迅速かつ効率のよい方法によって測定さ
れねばならない。

【０００３】このような測定法を提供する目的で、抗体
または抗原物質、薬物またはハプテンのような免疫反応
に関与する生物学的物質または化学物質の存在を単離
し、そして検出する各種の方法が案出されてきた。本明
細書では、これらの物質を「免疫反応体」と称し、そし
てそれらと特異的にバインディング（または反応）して
免疫複合体を形成する生物学的物質または化学物質を
「受容体」と称する。しばしば、このような複合体にお
ける１種もしくはその他の反応体、または最初の２種の
反応体のいずれかと反応性の第三物質をも検出可能なマ
ーカーで標識し、前記複合体を検出する手段を提供す
る。この目的では、一般に、放射性同位体、酵素、化学
発光成分、蛍光成分および色素が使用されてきた。

【０００４】近年、免疫アッセイは、動物またはヒトの
感染体の存在またはその量を検出するための手段として
重要性を増してきた。一般的に、感染体は、それらから
抽出された抗原性成分より形成される免疫複合体の存在
もしくはその量を測定するか、あるいは被検体中の感染
体に対する抗体の存在もしくはその量を測定することに
よって検出されている。

【０００５】最近では、酵素標識が他の標識、特に放射
性同位体および蛍光マーカーを陵駕する利点を提供する
ことからその使用に注目があつまってきた。酵素標識
は、感染体を検出するための競争酵素免疫アッセイ(EI
A) 、直接および間接エンザイムリンクト イムノソル
ベント アッセイ(ELISA) およびイムノメトリックもし
くは「サンドイッチ」アッセイとして当該技術分野で知
られている免疫アッセイにおいて優先的に使用されるよ
うになってきた。

【０００６】免疫アッセイで検出できるこのような感染
体の一つは、クラミジアレス（Chlamydiales) 目、クラ
ミジアセエ（Chlamydiaceae ）属の２つの微生物種の１
つであるクラミジア・トラコマチス（ Chlamydia trac
homatis )(以下、「Ｃ．トラコマチス」とも称する）が
挙げられる。トラコーマ、包入体性結膜炎、性病性リン
パ肉芽腫、非淋菌性尿道炎および直腸肛門炎を初めとす
る多くのヒトの眼および性器の疾病の原因となるこの種
に属する15以上の菌株が存在する。Ｃ．トラコマチスに
由来する感染症は、普遍的な世代間で蔓延し、そのため
非淋菌性尿道炎だけをとっても各年毎に数百万人存在す
ると信じられる。

【０００７】淋病は、ナイセリア（Neisseria ）属、時
にＮ．ゴノローエ（N. gonorrhoeae ）に属する細菌に
起因する性器接触で一般に伝播される疾病である。この
疾病は年に数千の人間を疾病にかからせ、たとえ抗生物
質がその蔓延の抑制に役立っているとはいえ、いまだ世
界の多くの地域の人々の間で伝染性の疾病として存続し
ている。この細菌の検出および処置の重要性は、十分に
認識されている。Ｎ．メニンギチジス（N. meningitid
is) およびＮ．ラクタミカ（N. lactamica ）もまた、
無視できない医療上および診断上の対象の菌種である。

【０００８】これらの疾病の広く蔓延する性質のため、
クラミジア菌体および淋菌菌体の検出に関する迅速、簡
便かつ信頼性のある試験を入手することに相当な興味が
存在する。クラミジア菌体由来の抗原を検出しそして抽
出するための有用な方法を見い出すべく相当な数の研究
が行われてきた。固体支持体を使用して実施されるＣ．
トラコマチスおよびＮ．ゴノローエ用アッセイは、米国
特許第 4,497,899号および同 4,497,900号明細書に記載
されている。記載されたアッセイは、それらの菌体から
抗原を抽出する工程およびそれを裸の固体支持体上に塗
布する工程により行われている。次に、この塗布された
抗原は、１種は適当に標識されている１種または２種の
いずれかの抗体により検出されている。このアッセイの
主な特徴は、どのような材料にも処理されていないか、
または塗布もされていない付着用の固体支持体を使用す
ることにある。抗原の付着は、支持体上に抗原の吸着を
起こさせるのに十分長い時間その塗布支持体をインキュ
ベーションすることにより達成されていることが明らか
である。この吸着時間は、加温（37℃) 下で少なくとも
30分である。米国特許第 4,497,899号明細書に記載され
るアッセイ全体は、少なくとも３時間かけて行われる。
Ｎ．ゴノローエに対する類似するアッセイが米国特許第
4,497,900号明細書に記載されている。

【０００９】改良は、特開平２−156157号公報に記載さ
れそして特許請求されている。イオン的に帯電した支持
体はクラミジア抗原または淋菌抗原を引きつけ、これら
の抗原を迅速かつ感度よく検出することを可能にするこ
とが見い出された。しかしながら、ある種の生物学的被
検体、具体的には膨大な量の全血、粘液または成分を含
むものについてはさらなる改良が必要であった。従っ
て、特開平２−210263号公報に記載の改良が行われた。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】上述の出願では相当な
改良が公表されているとはいえ、依然としてアッセイを
さらに早める（すなわち、20分未満にする）必要性が存
在する。ユーザーがクラミジア感染症や淋菌感染症の迅
速な診断や処置についてより都合がよくそして適するア
ッセイを見い出すには、従来のアッセイのプロトコール
から可能な限り多くの工程を省略することが望まれるで
あろう。さらに、アッセイで使用されるペルオキシダー
ゼ標識抗体結合物は、ある程度の安定性（すなわち、保
存寿命）を有するが、さらなる安定性とより長期の保存
寿命についての欲求が存在する。

【００１１】非常に迅速で正確なアッセイは、発明の名
称「クラミジア抗原または淋菌抗原の測定における酵素
標識抗体フラグメントの使用」として同時に出願係属中
のわが国における特許出願（1990年５月11日出願の米国
特許出願第 522,444号に対応）明細書にさらに詳細に記
載されている。このアッセイでは、抗原を検出するのに
より少ない工程が用いられているので迅速性が増したア
ッセイが達成されている。さらに、酵素標識抗体F(a
b′)₂フラグメントは、酵素で標識された抗体全体より
も安定であることが見い出された。

【００１２】しかしながら、そのアッセイの開発に際し
て、抗体フラグメントに結合される酵素標識（特に、ペ
ルオキシダーゼ）の早すぎる反応が、アッセイにおける
真の陽性シグナルを不明瞭にする好ましくないバックグ
ランドを与えることがわかった。このことは、アッセイ
のプロトコールが適正に行われたか否かを示すのに使用
される負対照にとって特に問題となる。その結果、好ま
しくない色素の生成が存在した。

【００１３】抗体フラグメントや抗原フラグメントのよ
うな酵素標識免疫反応体の安定組成物は、好ましくない
バックグランドシグナルを伴わない迅速アッセイを提供
するのに必要である。

【００１４】

【課題を解決するための手段】上記課題は、ヘム含有タ
ンパク質と混合した酵素標識免疫反応体を含み、但し
４′−ヒドロキシアセタニリドを含まず、前記ヘム含有
蛋白質が、500 ：１〜10：１の酵素標識免疫反応体に対
する重量比で存在し、そして前記免疫反応体が免疫反応
性リガンドに対する受容体である緩衝化組成物の使用に
よって解決された。

【００１５】この組成物は、免疫反応性リガンドの測定
に有用な試験キットの一部として供給することができ、
このキットは、酵素標識免疫反応体がリガンドに対する
受容体である上記緩衝化組成物を含んでなる。

【００１６】さらに、この発明は、免疫反応性リガンド
を測定するためのものであって、下記の工程： Ａ．目的の免疫反応性リガンドを、前記リガンドの酵素
標識受容体を含み、前記酵素標識受容体にヘム含有タン
パク質が混合せしめられており、但し４′−ヒドロキシ
アセタニリドを含まず、前記ヘム含有タンパク質が、50
0 ：１〜10：１の酵素標識免疫反応体に対する重量比で
存在せしめられている緩衝化組成物と接触させる工程、
および Ｂ．前記リガンドの存在の指標として、未複合体化酵素
標識受容体かもしくは生じた酵素標識免疫複合体のいず
れかの存在を検出する工程、を含んでなる免疫反応性リ
ガンドの測定方法を提供する。

【００１７】また、免疫反応性リガンドを測定するため
のものであって、目的の免疫反応性リガンドに対する未
複合体化酵素標識受容体かまたは前記リガンドによって
形成した酵素標識受容体の酵素標識複合体のいずれかの
存在もしくはその量を、前記リガンドを、ヘム含有タン
パク質と混合した酵素標識受容体を含み、但し前記組成
物は４′−ヒドロキシアセタニリドを含まず、前記ヘム
含有蛋白質が、500 ：１〜10：１の酵素標識免疫反応体
に対する重量比で存在する緩衝化組成物と接触させた後
に、検出することを含んでなる免疫反応性リガンドの測
定方法も提供する。

【００１８】さらに、免疫反応性リガンドの測定のため
のアッセイにおけるバックグランドの実質的な消去方法
であって、酵素標識免疫反応体が免疫反応性リガンドに
対する受容体である前記緩衝化組成物を免疫反応性リガ
ンドと接触させた後、目的の免疫反応性リガンドに対す
る未複合体化酵素標識受容体かまたは前記リガンドによ
って形成した酵素標識受容体の酵素標識複合体のいずれ
かの存在またはその量を検出することを含んでなる方法
も提供する。この発明はまた、被検体中のリガンドの存
在またはその量を検出するための酵素結合物を形成する
ために酵素と結合した抗体または抗原を用いる酵素免疫
アッセイであって、緩衝化組成物に加え、４′−ヒドロ
キシアセタニリドを含まないが、リガンドまたはそれら
の受容体と特異的な反応性を有する酵素と免疫反応体の
結合物およびヘム含有タンパク質を含んでなる免疫アッ
セイも提供する。

【００１９】

【具体的な態様】この発明は、各種の免疫アッセイで使
用できる酵素標識免疫反応体（上記に定義した）を含有
する非常に有用な組成物を提供する。免疫反応性リガン
ドに対する天然または人工的な特異的バインディング受
容体の存在する組成物を使用して被検体中の前記各種の
リガンドを検出することができる。この組成物の酵素標
識免疫反応体はリガンドと直接特異的に反応するか、あ
るいはそのリガンドと特異的に反応する他の生物学的化
合物または化学物質と反応することができる。リガンド
の測定は、定性もしくは定量またはそれらの両者を行う
ことができる。

【００２０】就中、この発明の組成物は、動物、ヒトま
たは植物の生物学的流体、好ましくはヒトの流体のアッ
セイに使用することができる。限定されるものでない
が、このような流体としては、全血もしくはその成分、
リンパ液、胆汁、尿、髄液、精液、涙液、膣分泌液、唾
液、汗、糞便、組織検体および綿棒検体が挙げられる。

【００２１】限定されるものでないが、この発明を用い
て検出できる代表的なリガンドとしては、アミン類、ア
ミノ酸類、ペプチド類、ポリペプチド類、タンパク質
類、糖タンパク質類、薬物、ハプテン類、酵素類、ステ
ロイド類、ホルモン類（例えば、ヒト絨毛性性腺刺激ホ
ルモン）、ビタミン類、多糖類、糖脂質類、アルカロイ
ド類、菌体もしくはその成分〔例えば、連鎖球菌類（St
reptococcal organisms)、クラミジア菌類（Chlamydial
organisms) 、淋菌類（Gonococcal organisms) 、真菌
類（fungi)、糸状菌類（molds)、プロトゾア（protozo
a) ならびにヘルペスおよびレトロウイルスのようなウ
イルス類〕、血液成分、組織および器官の抗原が挙げら
れる。この発明は、クラミジア菌体または淋菌菌体から
抽出された抗原の検出に特に有用である。従って、本明
細書の記載の残余部は殆どがこれらの菌体に向けられる
が、これらの好ましい態様に本発明が限定されるもので
ないことを理解しなければならない。

【００２２】本発明は、いずれかの適当な医療または診
断上の技術を使用して患者から得られた生物学的被検体
中のＣ．トラコマチス（もしくは他のクラミジア種）の
存在またはＮ．ゴノローエ（もしくは他の淋菌種）の存
在を測定する方法として有用である。このような被検体
としては、例えば、患者の頸管、尿道、咽喉または肛門
および滑液または病巣由来の流体もしくは滑液のような
体液から得られる綿棒被検体が挙げられる。こうして得
られる生物学的被検体は、測定されるべきクラミジア抗
原または淋菌抗原（あるいは、それらの混合物）を含む
細菌を含有することが予測される。

【００２３】このアッセイは、自然のままのクラミジア
菌体または淋菌菌体上の抗原部位の検出を行うことがで
きるが、アッセイ感度を高めるにはそれらの菌体から抗
原を抽出することが一般に望ましい。菌体を溶解し、含
まれる抗原を遊離させるための標準的な技法、例えば溶
媒希釈もしくは高pH溶菌液、酵素処理、加熱および音波
処理もしくは遠心のような物理的攪拌を使用することが
できる。アニオン洗浄剤またはドデジル硫酸ナトリウム
およびデスオキシコール酸ナトリウムのような塩の使用
も既知である。最も好ましい態様では、本発明を使用し
てクラミジアのリポ多糖（糖脂質グループ）抗原を検出
することができる。もう一つの態様では、検出される抗
原が全構成外層膜タンパク質の60％を占めるクラミジア
菌体の主要外層膜タンパク質であってもよい。いくつか
の例では、これらのクラミジア抗原の混合物を、本発明
の実施によって免疫反応体を用いて検出することができ
る。さらにもう一つの態様では、本発明を使用して１種
以上の淋菌抗原（ＩＡもしくはＩＢタンパク質）、ある
いは１種以上の淋菌株に由来する抗原混合物を検出する
ことができる。好ましい抽出組成物は、後述の例１〜５
に示される。その組成物はアルコールアミンまたはその
塩を含み、高いpHを有するものである。さらに、抽出工
程でプロテアーゼを使用して全血および粘液を分解する
ことが好ましい場合もある。菌体から抗原がひとたび抽
出されてしまえば、必須ではないが、次の処理をする前
に被検体を予備濾過して細胞残屑、粒状物および他の不
要物を除去することが望ましい。

【００２４】抽出された抗原は、平均細孔サイズ１〜10
μｍ、好ましくは５μｍを有するポリマー微孔質膜と接
触される。この膜は、アッセイ中にその保全性を維持で
きるいずれか適当な材料、限定されるものでないが焼結
ガラス、多孔質セルロース材料、多孔質ポリマーフィル
ムおよびフィルター材料、繊維織物および当該技術分野
で既知の他の材料から作製することができる。好ましく
は、この膜は、ポリマー主鎖に反復アミド基を有する長
鎖合成ポリマーであるポリアミドから調製される。これ
らは、一般にジアミンとジカルボン酸のコポリマーまた
はアミノ酸のラクタムのホモポリマーである。限定され
るものでないが、代表的な材料としては、ポリヘキサメ
チレンドデカンジアミド（ナイロン612)、ポリヘキサメ
チレンアジパミド（ナイロン66）、ポリ−ε−カプロラ
クタム（ナイロン６）、ポリヘキサメチレンセバカミド
（ナイロン610)およびポリ−７−アミノヘプタンアミド
（ナイロン７）ならびにそれらの混合物が挙げられる。
これらの膜は、場合によってイオン電荷を担持する膜を
使用できるが、非イオン性が好ましい。しかしながら、
これらの膜はクラミジア抗原または淋菌抗原と反応性の
どのような生物学的化合物も実質的に含まないことが必
須である。

【００２５】この発明の実施に際し、場合によって前記
膜は少なくとも20mg／ｍ² の量の１種以上の界面活性剤
を塗布するか、またはそれで処理することができる。限
定されるものでないが、有用な界面活性剤としては、ア
ニオン界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン界面
活性剤が挙げられ、非イオン界面活性剤が好ましい。

【００２６】本明細書で記載する微孔質膜は、アッセイ
を行うために他の備品（ボトル、試験管、綿棒、ビーカ
ーまたはカップ）と組み合わせて使用することができ
る。別法として、好ましくは、アッセイを実施できそし
てすべての流体を収容できる使い捨て試験デバイス中に
微孔質膜を固定する。試験デバイスの有用な形状は当該
技術分野で既知である。抗原と微孔質膜との接触と殆ど
同時に抗原は微孔質膜にバインディングする。抗原は、
他のタンパク質、細胞成分、全血もしくは粘液または被
検体中に存在する可能性のある他の残滓あるいはアッセ
イで使用する試薬類に比べ膜に優先的にバインディング
される。

【００２７】接触の５分以内、好ましくは１〜５以内に
バインディングしていない（未バインディング）抗原を
バインディングした抗原から分離し、次いでバインディ
ングした抗原を、抗原と複合体化して支持体に直接結合
した免疫複合体を形成する免疫反応体を含むこの発明の
緩衝化組成物と接触される。この接触前または接触と同
時に流体およびバインディングしていない物質を除去し
てもよい。必要によって分離洗浄液（後述する）を使用
してもよい。アッセイを使い捨て試験デバイスを使用し
て行う場合には、被検体中の流体および未バインディン
グ物質（例えば、全血および粘液成分）は、抗原が膜に
バインディングされる時間中に膜を通過して適当なコン
パートメントに集められる。

【００２８】この発明の緩衝化組成物は、適当な酵素標
識免疫反応体（抗体、抗−抗体、リポ多糖、タンパク質
もしくは抗体と反応性の他の物質、ハプテンおよび上記
の他のもの）を含む。一般に、この免疫反応体は、上記
定義のごとく検出するリガンドに対する受容体または他
の受容体分子に対する受容体が考慮されている。好まし
くは、免疫反応体は酵素標識抗体またはそれらのフラグ
メント（モノクローナルもしくはポリクローナル）であ
る。最も好ましい態様では、標識免疫反応体は抗体フラ
グメント、例えばF(ab′)₂フラグメントである。

【００２９】抗体フラグメントの調製およびそれらの酵
素、例えばペルオキシダーゼによる標識化の好ましい方
法は、例との関連で後述する。この発明で使用する好ま
しい抗体フラグメントは、１種以上のクラミジア株また
は淋菌株（目的の菌体が何んであるかによって）と特異
的な免疫反応性を有する。

【００３０】この発明の組成物は目的の微生物の菌株１
種以上の抗原１種以上にそれぞれ向けられる複数の酵素
標識免疫反応体〔例えば、F(ab′)₂フラグメント〕を含
むことができる。これは、検出する菌体が各種の株とし
て被検体中に見い出される場合に、特に有用である。

【００３１】免疫反応体は、基質がアッセイに際して検
出可能なシグナルを生じうるいずれか適当な酵素で標識
される。限定されるものでないが、有用な酵素標識とし
ては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、
酸性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコア
ミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエ
ステラーゼ、カタラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒド
ロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
およびβ−アミラーゼが挙げられる。F(ab′)₂フラグメ
ントを標識する好ましい方法では、そのフラグメントを
スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレートと反応させてF(ab′)₂
フラグメント試薬を生成する。酵素、例えばペルオキシ
ダーゼでは、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物と
反応させて反応性メルカプト部分を含有する酵素試薬を
生成する。次に、この部分に前記F(ab′)₂試薬を反応さ
せてこの発明のアッセイで使用するのに好ましい酵素標
識免疫試薬を生成する。この手順のさらなる詳細は後述
の例との関連で示す。

【００３２】酵素標識免疫反応体は、一般的にpH６〜８
に緩衝化したこの発明の組成物中に含められる。この発
明ではまた、１種以上のヘム含有タンパク質も含められ
る。これらの物質は、それに結合した１個以上の鉄原子
を含むタンパク質であり、限定されるものでないが、シ
トクロム、ミオグロビン、ヘモグロビンまたはこれらの
いずれかの混合物が挙げられる。本明細書で使用する
「シトクロム」とは、鉄ポリフリンに結合した数種のタ
ンパク質のいずれかをいい、各種の生物源から得ること
ができる。限定されるものでないが、この語にはシトク
ロムｂ、シトクロムｃ、シトクロムｆ、シトクロムｐお
よび他の現在既知のものもしくは将来発見されるものの
すべての種類を含む。この語は、単一の鉄含有タンパク
質またはこのようなタンパク質の混合物を称するのに使
用できる。ミオグロビンおよびシトクロムｃがこの発明
の実施に際して好ましく、シトクロムｃが最も好ましい
ものである。

【００３３】この組成物において、ヘム含有タンパク質
は、500 ：１〜10：１の酵素標識免疫反応体に対する重
量比で存在する。本発明の組成物は、既知の免疫組成物
に使用されているような４′−ヒドロキシアセタニリド
（フェノール系電子移動剤）を含まない。

【００３４】場合によって、しかし好ましくは、この組
成物の成分としてアッセイにおける非特異的な相互作用
を低減する１種以上の非免疫タンパク質を含んでもよ
い。「非免疫タンパク質」とは、感知できる程度までは
目的の抗原と免疫反応によるバインディングをしないタ
ンパク質を意味する。有用な非免疫タンパク質は周知で
あり、それらとしては、例えば、カゼイン、α−カゼイ
ン、ウシ胎児血清およびブタガンマグロブリンが挙げら
れる。

【００３５】この発明の好ましいアッセイでは、バイン
ディングした抗原が標識免疫反応体を含む緩衝化組成物
と接触すると、ほとんど瞬時にバインディングした免疫
複合体が膜上に形成される。この複合体化を促進するに
は、膜と試薬類を10分以内15〜30℃の温度でインキュベ
ーションすることができる。好ましくは、１〜３分間18
〜25℃（すなわち、室温）でインキュベーションが行わ
れる。これらの温和なインキュベーション条件は、米国
特許第 4,497,899号明細書に裸の支持体に対してクラミ
ジア抗原の吸着を必要とするように記載されている30分
間37℃の条件と非常に対照的である。

【００３６】このインキュベーション後、複合体形成の
開始10分以内（好ましくは、１〜３分以内）にバインデ
ィングした複合体は、一般にpH７〜12の洗液で１回以上
洗浄される。このような洗液はアッセイのいずかの時点
で１回以上使用することができる。好ましくは、この溶
液はバインディングした複合体から未バインディング物
質を分離するのに役立つ界面活性剤１種以上を含む。特
に有用な界面活性剤はカチオン界面活性剤である。

【００３７】洗浄後、バインディングした標識複合体
は、適当に検出される。一般に、微孔質膜上のバインデ
ィングした標識複合体を検出するには、適当な色素生成
組成物をその複合体と接触する。この組成物は、酵素が
存在する場合にその酵素が直接もしくは間接的に検出可
能な色素を生成するような酵素の基質を含む。色素は、
酵素作用によって活性化される単一化合物であるか、あ
るいは２種以上の化合物の酵素作用から生成されるかま
たは２種以上の化合物に由来する中間体から生成するこ
ともできる。適当な基質は当業者にとって容易に明らか
なものであろう。

【００３８】特に好ましい態様では、酵素標識がペルオ
キシダーゼであり、アッセイのある時点で過酸化水素と
適当な色素生成組成物を加えて検出可能な色素を生成す
る。例えば、有用な色素生成組成物には、トリアリール
イミダゾールロイコ染料（米国特許第 4,089,747号明細
書に記載されるような）またはペルオキシダーゼおよび
過酸化水素の存在下で反応して色素を生成する他の化合
物（すなわち、ペルオキシダーゼの触媒作用により色素
を提供するように反応する化合物）を含む。

【００３９】色素生成組成物の添加は、バインディング
した複合体の洗浄後比較的迅速に、すなわち、一般に２
分以内、好ましくはその直後に行われる。場合によっ
て、試薬類が許容する場合にはインキュベーションして
色素の検出を早めてもよい。次に、得られた色素は標準
的な装置および操作によって検出して視覚的もしくは分
光光度計の読み取りが行われる。

【００４０】この発明の好ましい態様の代表例は、次の
工程を含んでなる生物学的被検体中のクラミジア抗原ま
たは淋菌抗原の測定方法である。 Ａ．生物学的被検体中に存在することが予想されるクラ
ミジア菌体または淋菌菌体から抽出された抗原を微孔質
膜と接触してそれに抗原をバインディングする工程、 Ｂ．このバインディングした抗原を、その抗原に向けら
れた酵素標識抗体またはそのフラグメントであって、ヘ
ム含有タンパク質と混合された酵素標識抗体またはその
フラグメントを含むが、４′−ヒドロキシアセタニリド
を含まない緩衝化組成物と接触させて、膜上にバインデ
ィングした前記抗原と酵素標識抗体またはそのフラグメ
ントとの間で酵素標識免疫複合体を形成する工程、 Ｃ．このバインディングした複合体を前記酵素の存在下
で色素を生成する組成物と接触する工程、ならびに Ｄ．被検体中のクラミジア菌体または淋菌菌体の存在ま
たはその量の指標として膜上の色素の存在を検出する工
程。

【００４１】別法として、しかし好ましくはないが、こ
の発明の免疫アッセイは、目的の抗原に向けられた抗体
（またはそのフラグメント）が標識されていないことを
除き、前記好ましい方法と同様に実施される。従って、
膜（または他の適当な支持体）にバインディングした未
標識複合体が形成される。バインディングしていない物
質からバインディング複合体を（例えば、洗浄によっ
て）分離した後、バインディング複合体は、ヘム含有タ
ンパク質およびバインディング複合体の抗原かまたは抗
体のいずれかに向けられた酵素標識免疫反応体を含むこ
の発明の緩衝化組成物と接触される。一般的に、標識免
疫反応体は複合体化された抗体に向けられた抗体であ
る。すなわち、それは酵素標識抗−抗体である。

【００４２】従って、この態様の例は、下記の工程を含
んでなる生物学的被検体中のクラミジア抗原または淋菌
抗原の測定方法である。 Ａ．生物学的被検体中に存在することが予想されるクラ
ミジア菌体または淋菌菌体から抽出された抗原を微孔質
膜と接触してそれに抗原をバインディングする工程、 Ｂ．このバインディングした抗原を、それに向けられた
未標識抗体またはそのフラグメントと接触して、 膜にバインディングした前記抗原と未標識抗体との間で
未標識免疫複合体を形成する工程、 Ｃ．このバインディングした複合体を、未標識抗体に向
けられた酵素標識抗−抗体またはそのフラグメントであ
って、ヘム含有タンパク質を混合した酵素標識抗−抗体
またはそのフラグメントを含むが、４′−ヒドロキシア
セタニリドを含まない緩衝化組成物と接触して、膜にバ
インディングした抗原、未標識抗体および酵素標識抗−
抗体間の酵素標識免疫複合体を形成する工程、 Ｄ．このバインディングした複合体を前記酵素の存在下
で色素を生成する組成物と接触する工程、ならびに Ｅ．被検体中の前記菌体の存在またはその量の指標とし
て膜上の色素の存在を検出する工程。

【００４３】この発明のさらにもう一つの態様として
は、競争バインディングアッセイ、エンザイム・リンク
ト・イムノソルベント・アッセイ(ELISA)およびイムノ
メトリックアッセイ（サンドイッチ）におけるこの発明
の緩衝化組成物の使用が挙げられ、これらにおいては、
酵素標識免疫反応体を目的のリガンドまたはその受容体
のいずれかにバインディングするのに使用することがで
きる。次に、酵素標識免疫反応体を、適当な基質および
色素生成組成物を用いるアッセイによって複合体化した
リガンドまたは複合体化していないリガンドを検出する
ための手段を提供することができるので、試験試料中の
リガンド（もしくはリガンド混合物）の存在（もしくは
不存在）またはその量の指標を与える。

【００４４】この発明の診断試験キットは、本明細書に
開示する免疫組成物ならびにアッセイを実施するための
１種以上の他の成分の組成物、溶液またはデバイスを含
んでなる。例えば、一般的には、この発明の緩衝化組成
物および適当な色素生成組成物を別々のコンテナーに含
む。このキットの任意構成要素としては、洗液、抽出組
成物、抽出デバイス、綿棒もしくは他の被検体を採取す
る手段および使い捨て試験デバイス（それに固定された
微孔質膜を含む）が挙げられる。

【００４５】

【実施例】以下の例は、この発明をさらに具体的に説明
する目的で提供するものであり、その範囲を限定するも
のでない。すべてのパーセンテージは、別途指摘しない
限り重量基準である。

【００４６】材 料 F(ab′)₂抗−クラミジアフラグメントを調製するのに用
いる抗体は、リン酸緩衝溶液としてクラミジアリポ多糖
抗原に向けられた10G9モノクローナル抗体（6.96mg／m
L、pH7.２）であった。ペプシンは、シグマ化学社（Sig
ma Chemical Co.) から入手した（カタログNo.6 887、9
00 ユニット／タンパク質のmg）。

【００４７】抗体フラグメントの調製 抗−クラミジア抗体（6.96mg／mL) のリン酸緩衝溶液
（14mL）を、分子量30,000カットオフ膜とクエン酸緩衝
液（56mL、0.１モル濃度、pH4.１）を用いてアミコン
（Amicon) 濃縮器によって透析した。最終容量は、クエ
ン酸緩衝液１mL当り10.8mgを含有する溶液９mLであっ
た。この溶液をペプシン（クエン酸緩衝液１mL当り2.５
mg含有液1.169mL)と混合し、得られた混合物を37℃で２
時間回転させた。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン緩衝液（１モル濃度、pH10.8) でpH７に高め、この
溶液を分子量30,000カットオフ膜とトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン緩衝液（20ミリモル濃度、pH８）
を用いるアミコン濃縮器で透析した。得られた溶液（約
30mL) は使用するまで４℃で保存した。

【００４８】この生成物を、最初にトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン緩衝液（25〜30mL、20ミリモル濃
度、pH８）、次いでこの緩衝液（25mL）と塩化ナトリウ
ム（0.75モル濃度）を用いるDEAE−セファロースカラム
で精製した。抗体フラグメントを含む画分(OD₂₈₀) を集
め、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（25ミリ
モル濃度、pH6.５）に対して透析してF(ab′)₂フラグメ
ントおよびF(ab′）フラグメントを合計21.8mg得た。

【００４９】これらのフラグメントを、ＡＢｘカラムお
よび２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（30mL、
25ミリモル濃度、pH5.６）、次いで硫酸アンモニウム
（0.５モル濃度）および酢酸ナトリウム（0.02モル濃
度) からなる溶液（30mL) での溶離を用いるクロマトグ
ラフィーによって分離した。F(ab′)₂フラグメントを含
む画分を集め、それらを合わせ、次いでアミコン濃縮器
でリン酸緩衝溶液に対して透析して純粋なF(ab′)₂フラ
グメント(13.85mg) を得た。

【００５０】標識フラグメントの調製 工程Ａ：西洋ワサビペルオキシダーゼ（乾燥重量100mg)
を４℃で炭酸ナトリウム緩衝液（13.4mL、0.１モル濃
度、pH9.５）に溶解し、４℃以下で１時間乾燥Ｎ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド（17.4mg／mLの 300μＬ）中Ｓ−
アセチルメルカプトコハク酸無水物と反応させた。この
混合物を、予じめ脱イオン蒸留水で10分間湿めらしたSp
ectro Por(商標) 透析バッグにピペットで移した。次
に、このバッグを反応混合物容量の50倍のリン酸緩衝溶
液（pH7.４）中に置き、約４時間４℃でゆっくり攪拌し
た。この溶液をアミコン濃縮器で濃縮して目的の中間体
（18.6mg／mL）を得た。

【００５１】リン酸緩衝溶液（pH7.４）中で調製された
ばかりの中間体（2.61mL、18.6mg／mLを含有する溶液）
を、室温で２時間リン酸緩衝液（0.25モル濃度、pH7.5)
中のヒドロキシルアミン(0.652mL、0.25モル濃度) とエ
チレンジアミン四酢酸(0.001モル濃度）を含有する溶液
と反応させることによって保護基を脱離した。得られた
酵素試薬を、PD−10カラムおよび溶離液としてリン酸緩
衝溶液（pH7.４）を用いるクロマトグラフィーによって
調製した。

【００５２】工程Ｂ：前記の調製したF(ab′)₂フラグメ
ント（リン酸緩衝溶液１mL当り2.５mgの溶液 13.85mg）
を、スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド１mL当り16.7mgの 130.2μＬ）と混合
し、次いで４℃で２時間振盪した。得られた生成物を、
PD−10カラムおよびリン酸緩衝溶液（pH7.４）を溶離液
として用いるクロマトグラフィーによって精製した。

【００５３】工程Ｃ：前記工程Ａで調製した酵素試薬
（リン酸緩衝溶液１mL当り18.6mgの溶液2.６mL）と、工
程Ｂで調製した生成物（リン酸緩衝溶液１mL当り1.32mg
の溶液10.5mL) とを混合し、F(ab′)₂フラグメントの濃
度を約１mg／mLに調整し、次いでこの混合物を25℃で約
15時間回転させた。得られた酵素−標識フラグメントの
結合体を、分子量10,000カットオフ膜を備えるアミコン
濃縮器を用い２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
緩衝液（40μＬ、25ミリモル濃度、pH5.６）に対して透
析した。次に、得られた生成物（５mL）をＡＢｘカラム
を用い、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、次
いで硫酸アンモニウム（0.５モル濃度）および酢酸ナト
リウム（20ミリモル濃度)(pH6.７）のグラジエント溶液
（30mL) で溶離して精製した。約0.６の吸光度比(403／
280)を示す画分を集めて目的のペルオキシダーゼ標識フ
ラグメント4.85mgを得た。この標識フラグメントを、マ
ーシオレート(merthiolate) 防腐剤（0.01％) を含むリ
ン酸緩衝溶液中４℃で保存した（0.２％溶液、pH7.
４）。標識フラグメントの分子量範囲は約 135〜約 250
キロダルトンであった。

【００５４】例１〜５：緩衝化組成物の比較 これらの例は、この発明の数種の緩衝化組成物およびそ
れらのクラミジア抗原用直接バインディング免疫アッセ
イにおける使用を具体的に説明する。この発明の組成物
は、免疫アッセイにおいてこの発明の範囲外の組成物
（対照Ａ〜Ｆ）と比較する。

【００５５】材 料 クラミジア抗原溶液は、ウシ血清アルブミン（0.１mg／
mL）を含むリン酸緩衝溶液（pH7.２）中にクラミジアの
セロバー（Serovar)Ｇエレメンタリー小体を含めた。ブ
ランク対照溶液は、抗原を含まないリン酸緩衝溶液（pH
7.２）中にウシ血清アルブミン（0.１mg／mL）を含め
た。

【００５６】Surecell（商標）使い捨て試験デバイス
は、各試験ウェルに未塗布 LoProdyne（商標）微孔質膜
（５μｍ）を含めて使用した。抽出管を使用して被検体
からクラミジア抗原を抽出したが、その管の内部の離れ
離れになった場所に（１）チメロサール(thimerosal)防
腐剤 (0.01％) を有するトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン緩衝剤（1.65モル濃度溶液20μＬ、pH11）な
らびに（２）アジ化ナトリウム（1.54ミリモル濃度) 、
エチレンジアミン四酢酸（5.４ミリモル濃度）、５，５
−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン（21.4ミリ
モル濃度）、ジチオスレイトール(0.188モル濃度) およ
びポリ（アクリルアミド)(6.35％)を有する２−（Ｎ−
モルホリノ）エタンスルホン酸（10ミリモル濃度溶液50
μＬ、pH６）の乾燥塗布物を有する。

【００５７】組成物１は、10ミリモル濃度２−（Ｎ−モ
ルホリノ）エタンスルホン酸緩衝剤（pH６）、塩化ナト
リウム（50ミリモル濃度)、塩化カルシウム（５ミリモ
ル濃度）、１，２−プロパンジオール（10％ｗ／ｖ）お
よびチメロサール（0.01％) 中にAmideck(商標）プロテ
アーゼ（４mg／mL、 170ユニット／mg、Genencor, Inte
rnational, Rochester, N.Y.から入手可能) を含めた。

【００５８】抽出組成物は、エタノールアミン塩酸（0.
47モル濃度）、塩化ナトリウム（0.27モル濃度) 、チメ
ロサール（30ミリモル濃度) 、エチレンジアミン四酢酸
（50ミリモル濃度) 、Emcol(商標）CC−36カチオン界面
活性剤（0.45％）および水酸化ナトリウム（0.66規定、
pH13.5になるまで) を含めた。組成物２は、過酸化水素
（水中12％）、ジエチレントリアミン五酢酸（10マイク
ロモル濃度) およびチメロサール（0.01％) を含めた。

【００５９】洗液は、３−シクロヘキシルアミノ−２−
ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸緩衝液（0.05モル
濃度、pH10）、Emcol(商標）CC−９カチオン界面活性剤
（0.75％) およびチメロサール（0.01％) を含めた。色
素生成組成物は、２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ
フェニル）−４，５−ビス（４−メトキシフェニル）イ
ミダゾールロイコ染料(0.008％) 、ポリ（ビニルピロリ
ドン)(１％）、リン酸ナトリウム（10ミリモル濃度、pH
6.８）、ジエチレントリアミン五酢酸（10マイクロモル
濃度) 、４′−ヒドロキシアセトアニリド（２ミリモル
濃度）および過酸化水素（10ミリモル濃度) を含めた。

【００６０】この発明の５種の緩衝化組成物は、リン酸
緩衝溶液（pH7.２）中ヘム含有タンパク質（0.11〜1.25
mg／mL、後述する）、カゼイン（0.05％) 、Lonzaine
（商標）Ｃ両性界面活性剤（0.01％) およびチメロサー
ル（0.01％) を上述のように調製した標識フラグメント
（４μｇ／mL溶液、最終濃度）と混合して調製した。こ
れらの組成物は、フェノール系の電子移動剤である４′
−ヒドロキシアセタニリドを含まない。

【００６１】対照Ａ〜Ｅは、この発明の緩衝化組成物が
さらに４′−ヒドロキシアセタニリド（10ミリモル濃
度) を含む以外はそれらと同様であった。対照Ｆは、ヘ
ム含有タンパク質または４′−ヒドロキシアセタニリド
を含まない他は同様に調製した。

【００６２】例１〜５および対照Ａ〜Ｅは、以下の量の
ヘム含有タンパク質を含む： 例１および対照Ａ：ミオグロビン 0.125mg／mL。 例２および対照Ｂ：ミオグロビン 0.25mg／mL。 例３および対照Ｃ：ミオグロビン 1.25mg／mL。 例４および対照Ｄ：シトクロムｃ 0.11mg／mL。 例５および対照Ｅ：シトクロムｃ 0.23mg／mL。

【００６３】アッセイ操作 各例および対照について、それぞれ以下のアッセイ操作
を施した。抽出管に組成物１（８滴）、次いで前記エレ
メンタリー小体を加えた後、５〜10秒間混合した。次
に、この管と内容物を室温（18〜25℃）で１分間インキ
ュベーションした。抽出組成物（８滴）を加えて管の内
容物と混合し、次いで室温で１分間インキュベーション
した。組成物２（８滴）を加え、５〜10秒混合し、室温
で２分間管の内容物をインキュベーションした。

【００６４】得られた抽出リポ多糖抗原を含む溶液をピ
ペットを使用してその管から採取し、予備濾過した後、
Surecell（商標）使い捨て試験デバイスの各ウェルに移
した（ウェル当り抗原500pg を含有する溶液 160μ
Ｌ）。ウェル中の微孔質膜を通して流体を排液した。次
に、各ウェルを洗液（各 250μＬ）で２度洗浄し、排液
した。

【００６５】ブランク対照溶液は、抽出組成物で同様に
処理し、予備濾過し、そして特定の試験デバイスの各ウ
ェルに移した。次に、試験ウェル（抗原が加えられ、次
いでブランク溶液が加えられたデバイスのウェル）に各
標識フラグメント組成物（例または対照にそれぞれ１
滴）を加え、次いで２分間室温でインキュベーションし
て各ウェルの膜上の免疫複合体を形成した。

【００６６】色素生成組成物（２滴）を加え、室温で３
分間インキュベーション後、膜上に生成した色素を、０
が色素濃度が存在しないことを示しそして10が最高の色
素濃度を示す０〜10の値をもつ段階カラーチャートに対
して評価した。試験デバイス（抽出されたクラミジア抗
原を有するものと有しないもの）中で観察された値を、
各試験に対する３度の個別アッセイの各試験に対する平
均値として図１に示す。バックグランドシグナルは抗原
を加えなかった（ブランク対照溶液）試験ウェルで観察
した。

【００６７】これらの結果は、この発明の組成物（ヘム
含有タンパク質を含むが、４′−ヒドロキシアセタニリ
ドを含まない）がバックグランドの割合について許容で
きるシグナルを与えることを示す（不十分な洗浄または
膜の変性によって異常値を示したものと思われる例３は
除く）。しかしながら、抗原を加えなかった試験ウェル
の濃度の評価によって示されるように、４′−ヒドロキ
シアセタニリドが組成物中に存在する場合（対照Ａ〜
Ｅ）は、一般にバックグランドが非常に高い。組成物が
ヘム含有タンパク質を含み、４′−ヒドロキシアセタニ
リドを含まない場合には、同様な試験ウェルは色素を示
さなかった。

【００６８】例６：CK−MB抗体フラグメントを含有する
緩衝化組成物 この発明のもう一種の緩衝化組成物は、西洋ワサビペル
オキシダーゼを結合したクレアチンキナーゼ−MB F(ab
′)₂抗体フラグメント（５μｇ／mL）、カゼイン（0.0
5％) 、Lonzaine（商標）Ｃ両性界面活性剤（0.01％)
、シトクロムｃ（0.５mg／mL）およびチメロサール
（0.01％) をリン酸緩衝溶液（pH7.２）中で共に混合し
て調製した。標識フラグメントは、上記例１で使用した
標識フラグメントについて記載したのと同じ操作で調製
した。しかしながら、最後のクロマトグラフィーは、標
準滴なＡＢｘカラムに代え標準的なEDAEカラムを使用し
て行った。使用した溶離緩衝液は、（１）トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン（20ミリモル濃度、pH８）
および（２）塩化ナトリウム（0.74モル濃度) を含むト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（20ミリモル濃
度、pH８）であった。

【００６９】例７：抗体の全体を含む緩衝化組成物およ
びアッセイでの使用 この例は、酵素標識抗−抗体（標識抗体でない）を緩衝
化組成物が含む以外は、例１〜６と同様な直接バインデ
ィングアッセイでのこの発明の緩衝化組成物の使用を具
体的に説明する。

【００７０】材 料 抗原溶液（１μＬ当り約2900ngのSerovar G 抗原含有液
５μＬ）は、リン酸緩衝溶液中ウシ血清アルブミン（0.
１mg／mL、pH7.２）で希釈して最終濃度約 500pgにし、
このものはSurecell（商標）試験デバイスの各試験ウェ
ルにその量で通常加えられた。

【００７１】クラミジアリポ多糖抗原に対するマウスモ
ノクローナル抗体は、標準的なハイブリドーマ技法およ
び標準的なマウスセルラインを使用して調製し、アジ化
ナトリウム（0.01％）含有リン酸緩衝溶液（pH7.２）の
溶液として保存した。抗体試薬組成物は、ブロッキング
タンパク質としてカゼイン（0.５％）およびLonzaine
（商標）Ｃ両性界面活性剤（0.01％) を含有するリン酸
緩衝溶液に抗体溶液試料を加え（希釈１：800)て調製
し、次いで0.22μｍのフィルターを通して作業溶液とし
た。

【００７２】ポリクローナルヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体
は西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した。この結合物
を、カゼイン（0.５％）、Lonzaine（商標）Ｃ両性界面
活性剤（0.01％) およびシトクロムｃ（0.５mg／mL）を
含有するリン酸緩衝溶液で約１：750まで希釈してこの
発明の緩衝化組成物を調製した。次にそれを予備濾過し
た。対照組成物は、シトクロムｃを添加しない以外は同
様に調製した。

【００７３】負対照試薬組成物は、クレアチンキナーゼ
−ＭＢ抗体（５μｇ／mL）、カゼイン（0.５％）、Lonz
aine（商標）Ｃ両性界面活性剤（0.01％) およびチメロ
サール防腐剤（0.01％) を用いリン酸緩衝溶液（pH7.
２）中で調製した。Surecell（商標）使い捨て試験デバ
イスは、各試験ウェルに未塗布 LoProdyne（商標）微孔
質膜（５μｍ）を含めて使用した。この例で使用した他
の組成物は、上記例１〜５で使用したものと同じであっ
た。

【００７４】アッセイ操作 ８つのSurecell（商標）使い捨て試験デバイスをこの例
では使用した。各アッセイ（例および対照）は２度ずつ
行った。２組の試験デバイスは抽出抗原溶液に使用し、
そして２組は抗原を含まないもの（負対照試薬組成物）
について実施した。各組の試験は、この発明の緩衝化組
成物および対照組成物（シトクロムｃを含まない）を用
いて実施した。

【００７５】組成物１（８滴）、次いでエレメンタリー
小体を抽出管に加えて５秒混合した後、１分間室温でイ
ンキュベーションした。抽出組成物（８滴）を前記管に
加え、その内容物を５秒間混合し、次いで室温で１分間
インキュベーションした。次に、組成物２（８滴）をそ
の管に加えて５秒間その内容物を混合し、次いで室温で
２分間インキュベーションした。

【００７６】ブランク試料（抗原を含まない）も同様に
処理した。抗原を含む試料と抗原を含まない試料をピペ
ットを使用して抽出管から採取し、個別のSurecell（商
標）試験デバイスの試験ウェルに加えた（存在する場
合、抗原約500pg を含む各 160μＬ) 。膜を通して流体
を排液した後、各試験ウェルを洗液（約 300μＬ）で洗
浄し、排液した。未標識モノクローナル抗体組成物（２
滴）を各試験デバイスの試験ウェルに加えた。対照試薬
組成物（２滴）を各デバイスの別の試験ウェルに加え
た。これらの試験デバイスを室温で２分間インキュベー
ションした後、各試験ウェルを洗液（約 300μＬ）を使
用して洗浄した。

【００７７】シトクロムｃを含有するこの発明の緩衝化
組成物（２滴）を、１組の試験デバイスのすべての試験
ウェルに加えた。対照緩衝化組成物（２滴）を、もう１
組の試験デバイスに同様に加えた。すべての試験デバイ
スを５分間室温でインキュベーションした後、これらの
試験ウェルを洗液で２度（毎時、約 300μＬ）洗浄し
た。次に、色素生成組成物（２滴）を加え、試験デバイ
スをさらに５分間室温でインキュベーションした。色素
濃度を、例１〜５に記載するように評価した。

【００７８】これらの評価の結果は、シトクロムｃ含有
緩衝化組成物を使用して実施するこの発明のアッセイが
バックグランドを伴うことなく約４の視覚的色素濃度を
与えることを示した。対照緩衝化組成物を使用して実施
したアッセイは、４〜５の色素濃度を与えたが、バック
グランドが許容範囲外の0.５であった。

【００７９】例８：ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)
のアッセイ この例は、サンドイッチアッセイによりこの発明の緩衝
化組成物を用いるｈＣＧの検出に関する本発明の実施を
具体的に説明する。

【００８０】材 料 Surecell（商標）使い捨て試験デバイスは、それぞれEl
uorad(商標）FC 135非イオン界面活性剤を塗布（0.05ｇ
／ｍ² ）したLoProdyne(商標) 微孔質膜（５μｍ）を含
めて使用した。アフィニティー精製ヤギ抗−ｈＣＧアル
ファポリクローナル抗体を誘導体化したスチレンビーズ
にバインディングした。グリシン緩衝液（0.１モル濃
度、pH8.５）中前記ビーズ（0.９％）、ポリアクリルア
ミド（５％）、Uvitex（商標）色素（0.01％) およびチ
メロサール防腐剤（0.01％) を含む組成物（２μＬ）
を、試験ウェルの一つの限定区域にのせた（試料ウェル
と称する）。

【００８１】ヤギガンマグロブリンを同じタイプのビー
ズにバインディングして別の試験ウェルの膜上にのせた
（負対照ウェルと称する）。第３の試験ウェル（正対照
ウェルと称する）は、ビーズにバインディングした抗−
ｈＣＧ抗体とその抗体に予めバインディングしたｈＣＧ
抗原を含めた。

【００８２】試験溶液は、リン酸緩衝溶液（塩化ナトリ
ウム 150ミリモル濃度、リン酸ナトリウム50ミリモル濃
度、pH6.２）、ウシ血清アルブミン（0.７％）およびマ
ーシオレート（0.01％）の溶液にｈＣＧ(50mI.U.／mL)
を含めた。抗−ｈＣＧモノクローナル抗体および西洋ワ
サビペルオキシダーゼ(Miles) の結合物を調製した。こ
の結合物を、２−（４−モルホリノ）エタンスルホン酸
緩衝剤（4.88％) 、シトクロムｃ（0.05％) 、ウシ血清
アルブミン（１％）およびチメロサール（0.01％) と混
合してこの発明の緩衝化組成物を調製した。

【００８３】洗液は、リン酸ナトリウム（0.１モル濃
度、pH7.２）、デシル硫酸ナトリウム(100ミリモル濃
度、2.７％）、塩化ナトリウム（0.３モル濃度）および
チメロサール（0.01％)から調製した。色素生成組成物
は、２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−
４，５−ビス（４−メトキシフェニル）イミダゾールロ
イコ染料(0.005％) 、ポリ（ビニルピロリドン)(1 ％)
、リン酸ナトリウム緩衝剤（５ミリモル濃度、pH6.
８）、ジエチレントリアミン五酢酸（10マイクロモル濃
度) 、４′−ヒドロキシアセタニリド（２ミリモル濃
度）および過酸化水素（10ミリモル濃度) を含めた。

【００８４】アッセイ操作 試験デバイスの３つの試験ウェルにｈＣＧ(50mI.U.／m
L）を含む試験液(150μＬ）を加え、流体を膜を通して
排液した。標識抗体を含む緩衝化組成物（１滴、約40μ
Ｌ）を各試験ウェルに加え、膜を通して排液した。それ
らの試験ウェルを２度洗浄（毎時、 300mL) し、次いで
膜を通して排液した。次に、色素生成組成物を各試験ウ
ェルに加え、同様に排液した。室温で短時間インキュベ
ーションした後、膜上の色素濃度の評価し、上記例１〜
５に記載したようなカラーチャートに対して採点した。
試験ウェルに塗布した組成物区域の周辺をバックグラン
ドとして評価した。このアッセイを３度行った。

【００８５】３度の試験のそれぞれについて特定の試験
ウェルに見られる可視色素濃度としての結果を下記表１
に示す。

【００８６】

【表１】

【００８７】これらのデータは、３つの別個のアッセイ
において、非常の低濃度のｈＣＧ（50mI.U.)がバックグ
ランド０のまま容易に検出できることを示す。

【００８８】

【発明の効果】この発明のアッセイは、特に、クラミジ
ア抗原および淋菌抗原の検出について迅速かつ正確であ
るだけでなく〔従って、同時にわが国に特許出願係属中
の出願明細書（上述の1990年５月11日付出願の米国特許
出願第 522,444号明細書に対応する) に記載され特許請
求されている発明の利点を有する〕、さらなる利点も有
する。酵素標識免疫反応体と混合するヘム含有タンパク
質の使用がその免疫反応体を安定化するので、バックグ
ランド色素の形成はもはや問題点とならない。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の数種の緩衝化組成物を使用して得ら
れる色素濃度シグナルを示す。これは、上記例１〜５に
おいて詳細に検討されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬ ＯＧＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ，ＶＯＬ. 104，（1987），Ｐ．259−263

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヘム含有タンパク質と混合した酵素標識
   免疫反応体を含み、但し４′−ヒドロキシアセタニリド
   を含まず、前記ヘム含有蛋白質が、500 ：１〜10：１の
   酵素標識免疫反応体に対する重量比で存在し、そして前
   記免疫反応体が免疫反応性リガンドに対する受容体であ
   る緩衝化組成物を含んでなる免疫反応性リガンドの測定
   に有用な試験キット。
2. 【請求項２】 免疫反応性リガンドを測定するためのも
   のであって、下記の工程： Ａ．目的の免疫反応性リガンドを、前記リガンドの酵素
   標識受容体を含み、前記酵素標識受容体にヘム含有タン
   パク質が混合せしめられており、但し４′−ヒドロキシ
   アセタニリドを含まず、前記ヘム含有タンパク質が、50
   0 ：１〜10：１の酵素標識免疫反応体に対する重量比で
   存在せしめられている緩衝化組成物と接触させる工程、
   および Ｂ．前記リガンドの存在の指標として、未複合体化酵素
   標識受容体かもしくは生じた酵素標識免疫複合体のいず
   れかの存在を検出する工程、を含んでなる免疫反応性リ
   ガンドの測定方法。
3. 【請求項３】 免疫反応性リガンドを測定するためのも
   のであって、目的の免疫反応性リガンドに対する未複合
   体化酵素標識受容体かまたは前記リガンドによって形成
   した酵素標識受容体の酵素標識複合体のいずれかの存在
   もしくはその量を、前記リガンドを、ヘム含有タンパク
   質と混合した酵素標識受容体を含み、但し前記組成物は
   ４′−ヒドロキシアセタニリドを含まず、前記ヘム含有
   蛋白質が、500 ：１〜10：１の酵素標識免疫反応体に対
   する重量比で存在する緩衝化組成物と接触させた後に、
   検出することを含んでなる免疫反応性リガンドの測定方
   法。