JPH04258295A - リノール酸を唯一の構成脂肪酸とするホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リノール酸を唯一の構
成脂肪酸とするホスファチジルコリン及びホスファチジ
ルエタノールアミンの、フィアロホーラ属に属する菌株
による製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】複合脂質であるリン脂質は、成分として
ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリ
ン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸などがあ
る。しかし、これらリン脂質種、さらには、構成脂肪酸
の違いによる分子種は、相互に分離することが難しく、
従って単独使用されることはほとんどなかった。

【０００３】しかし、リン脂質は、リポソームを構成す
る際に有用であること、また、生体膜上などで多くの生
理的役割を果たしていることから、医薬品としての使用
が期待されている。

【０００４】特に、リノール酸を唯一の構成脂肪酸とす
るホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノール
アミンは、生体内で重要な生理的役割を果たしているプ
ロスタグランジンなどへの前駆物質である。

【０００５】現在、ペリキュラリア属菌を界面活性剤を
加えた培地に培養して得られた菌体から、アルコール抽
出により脂質を抽出し、得られた脂質よりリノール酸を
唯一の構成脂肪酸とするホスファチジルコリン及びホス
ファチジルエタノールアミンを製造する方法は既に提案
されている（特開昭６４−８６８８８号公報参照）。

【０００６】しかし、ペリキュラリア属菌とは全く異な
るフィアロホーラ属菌を用いて、リノール酸を唯一の構
成脂肪酸とするホスファチジルコリン及びホスファチジ
ルエタノールアミンを製造する方法はこれまで知られて
いない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、リノール酸
を唯一の構成脂肪酸とするホスファチジルコリン及びホ
スファチジルエタノールアミンの新規な製造方法を提供
することを目的とするものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、同化しう
る炭素、窒素、及び無機塩類供給源を含む培地で、リノ
ール酸を唯一の構成脂肪酸とするホスファチジルコリン
及びホスファチジルエタノールアミンを生成する微生物
の検索を行なった。その結果、フィアロホーラ属の微生
物が、リノール酸を唯一の構成脂肪酸とするホスファチ
ジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを生成
することを発見し、本発明をするに至った。

【０００９】本発明は、同化しうる炭素、窒素、及び無
機塩類供給源を含む培地で、フィアロフォーラ属に属す
る菌株を液中で好気的に培養することにより得られた菌
体から、リノール酸を唯一の構成脂肪酸とするホスファ
チジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを採
取することを特徴とするリノール酸を唯一の構成脂肪酸
とするホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノ
ールアミンの製造方法に関するものである。

【００１０】本発明のリノール酸を唯一の構成脂肪酸と
するホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノー
ルアミンを生産する微生物は、フィアロフォーラ属に属
する。その一例として本発明者らが土壌から分離したフ
ィアロフォーラ属に属するフィアロフォーラ　　シクラ
ミニスＷＦ３０１０（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ　ｃｙｃ
ｌａｍｉｎｉｓ　ＷＦ３０１０）株は、本発明に最も有
効に利用しうる。本菌株の菌学的性質を示すと次のとう
りである。

【００１１】（ａ）　形態 よく分枝伸長した気菌糸（２．０−２．５μ）より単生
の梗子（２．０−２．５μ×７．０−１５．０μ）を菌
糸に対して直角方向に着生し、その先端は“じょうご”
状のカラーを持っている。分生子（２．０−２．５μ）
は、梗子の先端部に１個の頭状の粘性のある分生子塊と
して形成され透明で球形をしている。有性生殖器官は認
められない。 （ｂ）　各種培地 培養はすべて３０℃で実施し、コロニーの色調の記載は
（財）日本色彩研究所の“色の標準”の表現法に従った
。

【００１２】（１）　ツァペック寒天培地生育は中程度
で、２週間の培養でコロニーの直径は４５ｍｍであった
。気菌糸は少なく、培地中に菌糸を羽状に広げて伸長し
、周縁部は不定形である。若いコロニーはうすいオリー
ブ灰色であるが、成熟するとオリーブ灰色〜暗いオリー
ブ灰色となる、裏面の色は暗いオリーブ灰色で、水溶性
色素の生成は無い。分生子は十分に生育、成熟したコロ
ニーの気菌糸に着生し、形成量は中程度である。

【００１３】（２）　ポテトデキストロース寒天培地生
育は２週間の培養で３０ｍｍ径とやや遅いが、気菌糸は
中程度と多く、綿毛状に生育し、周縁部は不定形である
。若いコロニーはうすいオリーブ灰色であるが、成熟す
るとオリーブ灰色〜暗いオリーブ灰色となる、裏面の色
は暗いオリーブ灰色で、水溶性色素の生成は無い。分生
子の形成は成熟したコロニーでも極めて僅かほとんど認
められない。

【００１４】（ｃ）　生育温度 生育温度の範囲は、８〜３７℃であり、生育最適温度は
２５〜３３℃である。５℃あるいは４０℃では生育は認
められない。

【００１５】以上の菌学的性状から本菌はカビ類に分類
され、有性生殖器官が認められないことから不完全菌類
に属する菌である。着色性の菌糸からなり、単生するカ
ラーを持った梗子の先端に頭状の分生子塊を形成するこ
と、及び培養的性状からＷ．ガムス（１９７１）のセフ
ァロスポリウム−アルティゲ　　シンメルピルツェ（“
Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ−ａｒｔｉｇｅ　Ｓｃｈ
ｉｍｍｅｌｐｉｌｚｅ　”）により検索したところ、本
菌はフィアロフォーラ属に分類される菌であった。Ｍ．
Ｂ．スコール−シュワルツのフィアロフォーラ属に関す
る論文：ペルソニア、６巻、５９−９４（１９７０）（
Ｐｅｒｓｏｎｉａ，　６，５９−９４）の記載菌種と比
較したところ、本菌の性状がフィアロフォーラ　　シク
ラミニス（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ　ｃｙｃｌａｍｉｎ
ｉｓ）　の記載性状に一致したことからＷＦ３０１０菌
をフィアロフォーラ　　シクラミニスと同定した。

【００１６】本発明者らは、本菌をフィアロフォーラ　
　シクラミニス　　ＷＦ３０１０（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏ
ｒａ　ｃｙｃｌａｍｉｎｉｓ　　ＷＦ３０１０）　とし
て工業技術院・微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ　　Ｐ
−１１４７５の番号で寄託している。

【００１７】リノール酸を唯一の構成脂肪酸とするホス
ファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミン
の製造には、上記菌株に限らず、フィアロフォーラ属に
属しリノール酸を唯一の構成脂肪酸とするホスファチジ
ルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを生産す
る能力を有するものであれば、全て本発明に使用できる
。

【００１８】上記微生物の培養方法は、原則的には一般
微生物の培養法に準ずるが、通常は液体培養による振盪
培養法、通気撹拌培養法などの好気的条件下で行なうの
が好適である。

【００１９】培養に用いられる培地としては、フィアロ
フォーラ属に属する微生物が利用できる栄養源を含有す
る培地であればよく、各種の合成培地、半合成培地、天
然培地などいずれも用いることができる。培地組成とし
ては炭素源としてのグルコース、シュークロース、フル
クトース、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖蜜、コ
ーン・スティープ・リカー、有機酸などを単独または組
み合せて用い得る。窒素源としてはファーマメデイア、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、カゼイン、
アミノ酸、尿素などの有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫
酸アンモニウムなどの無機窒素源を単独または組み合せ
て用い得る。

【００２０】ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム
塩、リン酸塩、その他重金属塩なども必要に応じて添加
使用され得る。なお、培養中発泡の著しいときは公知の
各種消泡剤を適宜培地中に添加することもできるが、そ
の添加は目的物質の生産に悪影響を与えないものとする
必要がある。

【００２１】培地のｐＨはカビ類の通常の至適ｐＨ範囲
、例えば４．０〜７．５とするのが望ましい。培養温度
は、微生物が良好に生育する温度、通常２０〜４０℃、
とくに好ましくは３０℃付近に保つのがよい。培養時間
は液体培養の場合、一般に１〜５日間程度とされる。上
記培養によって目的とする物質が生成蓄積される。もち
ろん上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特
性、外部条件などに応じて適宜変更でき、またそれぞれ
に応じて上記範囲から最適条件を選択、調節される。

【００２２】リノール酸を唯一の構成脂肪酸とするホス
ファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミン
の採取は、上記ホスファチジルコリン等を公知の分離手
段、例えば抽出法により菌体から分離し、さらに公知の
精製法により単離精製することにより行われる。抽出法
は、アルコールを用いて行なうことが好ましい。アルコ
ール溶媒としては、通常、メタノール、エタノール、プ
ロパノール等の低級アルコールが用いられるが、メタノ
ールもしくはエタノールの使用が望ましい。抽出処理は
、培養液より濾過法あるいは、遠心分離法によって得ら
れた湿潤した菌体に、アルコールを重量比で５〜１５の
割合で、好ましくは９〜１２の割合で加え、室温で撹拌
機を用いて撹拌することにより効果的に行なうことがで
きる。抽出時間は２〜４時間とすることが適当である。 こうして得られた菌体からのアルコール抽出液は、濾過
法あるいは遠心分離法により菌体固形分から分離される
。

【００２３】このアルコール抽出液は、濃縮後、アルコ
ールを除いた水溶液についてｎ−ブタノール抽出などを
行ない、目的とする脂質を有機溶媒層に抽出する。次い
で抽出液を更に、例えばシリカゲルカラム、セファデッ
クスＬＨ−２０カラム（ファルマシア社製）を用いたク
ロマトグラフィーなどに付して、ホスファチジルコリン
及びホスファチジルエタノールアミンをそれぞれ単離精
製する。

【００２４】かくして得られた２物質は各々Ｌ−α−ホ
スファチジルコリンジリノレオイル（和光純薬工業社製
）及びＬ−α−ホスファチジルエタノールアミンジリノ
レオイル（ＡＶＡＮＴＩ　ＰＯＬＡＲ−ＬＩＰＩＤＳ　
ＩＮＣ　製）の標品とＨＰＬＣ分析における保持時間及
びＩＲ，ＮＭＲ，ＭＳ等のスペクトルを比較して、それ
ぞれリノール酸を唯一の構成脂肪酸とするホスファチジ
ルコリン及びホスファチジルエタノールアミンであると
同定できる。

【００２５】

【発明の効果】本発明の方法により、生体内で重要な生
理的役割を果たしているブロスタグランジンなどへの前
駆物質であるリノール酸を唯一の構成脂肪酸とするホス
ファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミン
をそれぞれ製造することができる。

【００２６】

【実施例】次に実施例により、本発明をさらに具体的に
説明する。なお、培地におけるパーセントは特に断わり
のない限り重量／容量％を示す。

【００２７】実施例１ ＷＦ−３０１０株の斜面培養（ポテト　　デキストロー
ス寒天培地）から１白金耳を１００ｍｌの種培地（馬鈴
薯デンプン２％、グリコース１％、大豆粉２％、リン酸
１カリ０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、ｐＨ無
調整）を入れた５００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、
２８℃で３日間振盪培養して種培養液を得た。この種培
養液２００ｍｌを上記と同じ組成の培地５Ｌを含む１０
Ｌ容ジャーファーメンター（２基）に接種した。培養は
、２８℃で、８８時間通気撹拌培養（通気量５Ｌ／ｍｉ
ｎ　、撹拌３００ｒｐｍ　）を行なった。

【００２８】培養終了後、約１０Ｌの培養液を濾過し、
菌体固形分を得た。この菌体にメタノール１０Ｌを加え
、室温で撹拌機を用いて４時間撹拌して脂質の抽出を行
なった。菌体のメタノール抽出液は、減圧下で濃縮して
メタノールを留去した後、得られた水溶液約４００ｍｌ
をブタノール４００ｍｌで２回抽出して、ホスファチジ
ルコリン及びホスファチジルエタノールアミンをブタノ
ール層に抽出した。

【００２９】ブタノール抽出液８００ｍｌを減圧下に濃
縮して約８０ｍｌとし、あらかじめメタノールで充填し
たセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）カラ
ム（３ｃｍ径、４５ｃｍ）に、４０ｍｌずつ２回に分け
て付し、それぞれメタノール４００ｍｌで溶出した。溶
出液を８ｍｌずつ分取し、各フラクションをシリカゲル
ＴＬＣ（メルク社製　　Ａｒｔ　５７１５）で展開して
（展開液；クロロホルム／メタノール＝５：２、硫酸発
色）、標準試料とＲｆを比較することにより、ホスファ
チジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの検
出を行なった。その結果、フラクション番号２７〜３２
にホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノール
アミンの溶出を確認し、これらのフラクションを集め、
減圧下に濃縮乾固した。

【００３０】次に、乾固物をクロロホルム−メタノール
混液（１：１）５ｍｌに溶かし、あらかじめ同一混合溶
媒（クロロホルム／メタノール＝１：１）で充填したシ
リカゲル（ワコーゲルＣ−２００、和光純薬工業社製）
カラム（３ｃｍ径、４７ｃｍ）に付し同混合溶媒（クロ
ロホルム／メタノール＝１：１）９００ｍｌでホスファ
チジルエタノールアミンの溶出を行なった。ホスファチ
ジルエタノールアミンの溶出後、更にメタノール９００
ｍｌでホスファチジルコリンの溶出を行なった。溶出液
は８ｍｌずつ分取し、先と同様に各フラクションをシリ
カゲルＴＬＣで展開してホスファチジルコリン及びホス
ファチジルエタノールアミンの検出を行なった。

【００３１】ホスファチジルコリン及びホスファチジル
エタノールアミンのそれぞれの溶出画分を集め、源圧下
に濃縮、乾固して、再びセファデックスＬＨ−２０カラ
ムにかけた。ホスファチジルエタノールアミンの場合に
は、乾固物をクロロホルム−メタノール混液（１：２）
６ｍｌに溶かし、あらかじめ同一溶媒（クロロホルム／
メタノール＝１：２）で充填したセファデックスＬＨ−
２０カラム（３ｃｍ径、４７ｃｍ）に付し、同溶媒（ク
ロロホルム／メタノール＝１：２）４００ｍｌで溶出し
た。ホスファチジルコリンの場合には、乾固物をメタノ
ール６ｍｌに溶かし、あらかじめメタノールで充填した
セファデックスＬＨ−２０カラム（３ｃｍ径、４４ｃｍ
）に付し、メタノール４００ｍｌで溶出した。各溶出フ
ラクションは、同様にシリカゲルＴＬＣ分析によってホ
スファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミ
ンの検出を行ない、それぞれの溶出フラクションを集め
、減圧下に濃縮、乾固してホスファチジルコリンを７４
９ｍｇ、ホスファチジルエタノールアミンを１５７ｍｇ
それぞれ得た。

【００３２】実施例２ 実施例１で得られたホスファチジルコリンにつきＬ−α
−ホスファチジルコリンジリノレオイル（和光純薬工業
社製）の標品と理化学的性状の比較を行った。その結果
、得られたホスファチジルコリンのＩＲ、　１Ｈ−ＮＭ
Ｒ、１３Ｃ−ＮＭＲ及びＦＡＢ−ＭＳスペクトルは標品
のそれらと完全に一致し、構造が確認された。

【００３３】更にＨＰＬＣ分析においても分析条件： カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ　Ａ−３１２　　６
φ×１５０ｍｍ移動相：アセトニトリル：メタノール（
１：１）流　　速：２．０ｍｌ／分 検　　出：２１０ｎｍ 標品と一致した保持時間８．６４分を示した。

【００３４】実施例３ 実施例１で得られたホスファチジルエタノールアミンに
つきＬ−α−ホスファチジルエタノールアミンジリノレ
オイル（ＡＶＡＮＴＩ　ＰＯＬＡＲ−ＬＩＰＩＤＳ　Ｉ
ＮＣ　製）の標品と理化学的性状の比較を行った。その
結果、得られたホスファチジルエタノールアミンのＩＲ
、　１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及びＦＡＢ−ＭＳス
ペクトルは、標品のそれらと完全に一致し、構造が確認
された。

【００３５】更にＨＰＬＣ分析においても分析条件： カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ　Ａ−３１２　　６
φ×１５０ｍｍ移動相：アセトニトリル：メタノール（
１：１）流　　速：２．０ｍｌ／分 検　　出：２１０ｎｍ 標品と一致した９．２１分を示した。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　フィアロホーラ属に属する菌株を栄養
   培地で培養し、得られた菌体からリノール酸を唯一の構
   成脂肪酸とするホスファチジルコリンを採取することを
   特徴とする、リノール酸を唯一の構成脂肪酸とするホス
   ファチジルコリンの製造方法。
2. 【請求項２】　　フィアロホーラ属に属する菌株を栄養
   培地で培養し、得られた菌体からリノール酸を唯一の構
   成脂肪酸とするホスファチジルエタノールアミンを採取
   することを特徴とする、リノール酸を唯一の構成脂肪酸
   とするホスファチジルエタノールアミンの製造方法。