JPH04299979A - シュードモナス属微生物の培養方法 - Google Patents
シュードモナス属微生物の培養方法Info
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- JPH04299979A JPH04299979A JP3062031A JP6203191A JPH04299979A JP H04299979 A JPH04299979 A JP H04299979A JP 3062031 A JP3062031 A JP 3062031A JP 6203191 A JP6203191 A JP 6203191A JP H04299979 A JPH04299979 A JP H04299979A
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- culture
- pseudomonas
- fumaric acid
- decarboxylase
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はシュードモナス属に属し
、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物の培
養方法に関するものであり、さらに詳しくは、該酵素活
性の高い菌体を簡便に培養取得する方法に関するもので
ある。
、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物の培
養方法に関するものであり、さらに詳しくは、該酵素活
性の高い菌体を簡便に培養取得する方法に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】アスパラギン酸β−脱炭酸酵素（ＥＣ
４．１．１．１２）は、Ｌ−アスパラギン酸の４位のカ
ルボキシル基を脱炭酸して、Ｌ−アラニンを生成する酵
素であり、Ｌ−アラニンの製造のために産業上有用なも
のである。該酵素を含有する微生物の培養法としては、
培地中に乳酸、ピルビン酸を添加する方法（特公昭６０
−１９９９７号公報）、培地中にＬ−グルタミン酸を添
加する方法（特公昭５３−２７３５５号公報）等が提案
されている。さらに、本発明者らも、フマル酸を主炭素
源とする培地で培養した菌体を用いて、Ｌ−アラニンを
製造する方法を提案した（特開平２−２４２６９０号公
報）。
４．１．１．１２）は、Ｌ−アスパラギン酸の４位のカ
ルボキシル基を脱炭酸して、Ｌ−アラニンを生成する酵
素であり、Ｌ−アラニンの製造のために産業上有用なも
のである。該酵素を含有する微生物の培養法としては、
培地中に乳酸、ピルビン酸を添加する方法（特公昭６０
−１９９９７号公報）、培地中にＬ−グルタミン酸を添
加する方法（特公昭５３−２７３５５号公報）等が提案
されている。さらに、本発明者らも、フマル酸を主炭素
源とする培地で培養した菌体を用いて、Ｌ−アラニンを
製造する方法を提案した（特開平２−２４２６９０号公
報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の方法は、添加する有機酸、アミノ酸が高価であったり
、得られる菌体の収量が十分でない等の欠点があり、工
業上使用する方法としては不満足なものであった。本発
明は、上記した課題を解決し、高いアスパラギン酸β−
脱炭酸酵素を含有するシュードモナス属に属する微生物
を簡便に培養取得する方法の提供を目的としてなされた
ものである。
の方法は、添加する有機酸、アミノ酸が高価であったり
、得られる菌体の収量が十分でない等の欠点があり、工
業上使用する方法としては不満足なものであった。本発
明は、上記した課題を解決し、高いアスパラギン酸β−
脱炭酸酵素を含有するシュードモナス属に属する微生物
を簡便に培養取得する方法の提供を目的としてなされた
ものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意検討を行った結果、該微生物の培養時
における培地のｐＨ調節の少なくとも一部を、フマル酸
またはその塩を用いて行うことにより、その課題が解決
されることを見いだし、本発明を完成した。かくして本
発明によれば、シュードモナス属に属し、アスパラギン
酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物を培養する方法にお
いて、培養時の培地のｐＨ調節の少なくとも一部を、フ
マル酸またはその塩を用いて行うことを特徴とするシュ
ードモナス属微生物の培養方法が提供される。
を達成すべく鋭意検討を行った結果、該微生物の培養時
における培地のｐＨ調節の少なくとも一部を、フマル酸
またはその塩を用いて行うことにより、その課題が解決
されることを見いだし、本発明を完成した。かくして本
発明によれば、シュードモナス属に属し、アスパラギン
酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物を培養する方法にお
いて、培養時の培地のｐＨ調節の少なくとも一部を、フ
マル酸またはその塩を用いて行うことを特徴とするシュ
ードモナス属微生物の培養方法が提供される。
【０００５】本発明に使用する微生物としては、シュー
ドモナス属に属し、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含
有するものであれば特に限定されないが、例えば、シュ
ードモナス・ダクネー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄａ
ｃｕｎｈａｅ）ＩＡＭ １１５２、同ＡＴＣＣ２１１９
２、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ）ＩＡＭ １５０６、同ＡＴＣＣ ２１
８１２、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ ３
０８１、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＩＡＭ １０５
４等が挙げられる。
ドモナス属に属し、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含
有するものであれば特に限定されないが、例えば、シュ
ードモナス・ダクネー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄａ
ｃｕｎｈａｅ）ＩＡＭ １１５２、同ＡＴＣＣ２１１９
２、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ）ＩＡＭ １５０６、同ＡＴＣＣ ２１
８１２、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ ３
０８１、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＩＡＭ １０５
４等が挙げられる。
【０００６】アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する
微生物菌体の調製に使用される培地の炭素源としては、
通常一般に使用されるものでよいが、例えばフマル酸、
コハク酸、アスパラギン酸などを挙げることができ、中
でもフマル酸が特に好ましい。 培地の窒素源として
は、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム
、硝酸アンモニウム、尿素などの無機塩、ペプトン、酵
母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸などの
有機栄養源を使用することができる。培地の無機塩とし
ては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、
硫酸マグネシウムなどが用いられる。
微生物菌体の調製に使用される培地の炭素源としては、
通常一般に使用されるものでよいが、例えばフマル酸、
コハク酸、アスパラギン酸などを挙げることができ、中
でもフマル酸が特に好ましい。 培地の窒素源として
は、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム
、硝酸アンモニウム、尿素などの無機塩、ペプトン、酵
母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸などの
有機栄養源を使用することができる。培地の無機塩とし
ては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、
硫酸マグネシウムなどが用いられる。
【０００７】アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する
微生物菌体の培養は、通気撹拌、振盪などの好気的条件
下で行い、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２８〜
３２℃である。培養中のｐＨは５〜１０、好ましくは７
〜８付近である。ｐＨの調節は、フマル酸単独またはフ
マル酸とアルカリを用いて行うことが重要である。該ア
ルカリとしては、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸
化カリウム等のアルカリを１種または２種以上使用して
フマル酸含有液を中和したものを用いてもよい。この場
合、フマル酸塩含有溶液が中性（ｐＨ７）に近付くにつ
れて、酸としての効力が弱まるので、該溶液はｐＨ４以
下で用いるのが好ましい。フマル酸は溶解度が低いため
、遊離の酸またはｐＨ４以下の塩で完全に溶解させるこ
とは実質的に不可能であるが、この場合スラリー状とな
っていても何等問題はない。フマル酸またはその塩の濃
度（スラリー状の場合は一定体積のスラリー中に含まれ
るフマル酸またはその塩の重量）は特に制限はないが、
通常５〜５０％（ｗ／ｖ）が用いられる。培養時間は８
時間〜４日間、好ましくは１０時間〜２日間である。
微生物菌体の培養は、通気撹拌、振盪などの好気的条件
下で行い、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２８〜
３２℃である。培養中のｐＨは５〜１０、好ましくは７
〜８付近である。ｐＨの調節は、フマル酸単独またはフ
マル酸とアルカリを用いて行うことが重要である。該ア
ルカリとしては、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸
化カリウム等のアルカリを１種または２種以上使用して
フマル酸含有液を中和したものを用いてもよい。この場
合、フマル酸塩含有溶液が中性（ｐＨ７）に近付くにつ
れて、酸としての効力が弱まるので、該溶液はｐＨ４以
下で用いるのが好ましい。フマル酸は溶解度が低いため
、遊離の酸またはｐＨ４以下の塩で完全に溶解させるこ
とは実質的に不可能であるが、この場合スラリー状とな
っていても何等問題はない。フマル酸またはその塩の濃
度（スラリー状の場合は一定体積のスラリー中に含まれ
るフマル酸またはその塩の重量）は特に制限はないが、
通常５〜５０％（ｗ／ｖ）が用いられる。培養時間は８
時間〜４日間、好ましくは１０時間〜２日間である。
【０００８】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。
的に説明する。
［実施例１］培地１（フマル酸ナトリウム０．５％、フ
マル酸アンモニウム１．０％、酵母エキス０．５％、リ
ン酸二水素カリウム０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０
．０５％含有；ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容
三角フラスコに分注し、１２０℃で、２０分滅菌した後
、シュードモナス・ダクネー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｄａｃｕｎｈａｅ）ＩＡＭ１１５２を一白金耳植菌し
、３０℃にて１２時間振盪培養を行った。培地２（培地
１のフマル酸ナトリウム、フマル酸アンモニウムを各々
０．１７％、０．３３％にし、塩化アンモニウム６ｇを
加えた外は培地１と同じ）１．５ｌを３ｌ容ジャーファ
ーメンターに入れ、１２０℃で２０分間滅菌したものに
、前記三角フラスコ培養液３０ｍｌを植菌し、回転数６
００ｒｐｍ、通気１ｖｖｍ、３０℃で培養を行った。
マル酸アンモニウム１．０％、酵母エキス０．５％、リ
ン酸二水素カリウム０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０
．０５％含有；ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容
三角フラスコに分注し、１２０℃で、２０分滅菌した後
、シュードモナス・ダクネー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｄａｃｕｎｈａｅ）ＩＡＭ１１５２を一白金耳植菌し
、３０℃にて１２時間振盪培養を行った。培地２（培地
１のフマル酸ナトリウム、フマル酸アンモニウムを各々
０．１７％、０．３３％にし、塩化アンモニウム６ｇを
加えた外は培地１と同じ）１．５ｌを３ｌ容ジャーファ
ーメンターに入れ、１２０℃で２０分間滅菌したものに
、前記三角フラスコ培養液３０ｍｌを植菌し、回転数６
００ｒｐｍ、通気１ｖｖｍ、３０℃で培養を行った。
【０００９】ついで、ｐＨ調節用酸としてフマル酸１０
０ｇ、ＮａＯＨ ２０ｇを混合し、脱イオン水を加えて
約８００ｍｌとしアンモニア水５２ｍｌを加えた後、さ
らに脱イオン水を加え１ｌとしたものを調製した。これ
を１２０℃で２０分滅菌し冷却後ｐＨを測定したところ
約３．６であった。本液を用いて培養液のｐＨを７．３
に調節しながら培養を続け、１１時間後に培養を終了し
、遠心分離により菌体を回収し、湿菌体約４０ｇを得た
。得られた菌体を０．９％ＮａＣｌ １ｌに懸濁し、洗
浄後再び遠心分離にて菌体を回収する操作を２回行い、
洗浄菌体を得た。
０ｇ、ＮａＯＨ ２０ｇを混合し、脱イオン水を加えて
約８００ｍｌとしアンモニア水５２ｍｌを加えた後、さ
らに脱イオン水を加え１ｌとしたものを調製した。これ
を１２０℃で２０分滅菌し冷却後ｐＨを測定したところ
約３．６であった。本液を用いて培養液のｐＨを７．３
に調節しながら培養を続け、１１時間後に培養を終了し
、遠心分離により菌体を回収し、湿菌体約４０ｇを得た
。得られた菌体を０．９％ＮａＣｌ １ｌに懸濁し、洗
浄後再び遠心分離にて菌体を回収する操作を２回行い、
洗浄菌体を得た。
【００１０】得られた菌体を下記の方法により、アスパ
ラギン酸β−脱炭酸酵素活性を測定した。反応液（Ｌ−
アスパラギン酸１５００ｍＭ、ピリドキサル５’−リン
酸０．０４ｍＭ、トライトンＸ−１００ ０．１％（ｖ
／ｖ）、アンモニア０．４Ｍ含有；ｐＨ４．７）２０ｍ
ｌに菌体０．２ｇを懸濁し、４２℃で１時間振盪し、生
成したＬ−アラニンの量を薄層クロマトグラフィーまた
は高速液体クロマトグラフィーにて測定、定量した。活
性は４２℃にて１時間に１μｍｏｌのアラニンを生じう
る酵素量を１Ｕ（ユニット）とし、比活性は１ｇ湿菌体
当たりの酵素量（Ｕ／ｇ ｃｅｌｌ）で表示した。この
菌体の比活性は約３７，０００Ｕ／ｇ ｃｅｌｌであっ
た。
ラギン酸β−脱炭酸酵素活性を測定した。反応液（Ｌ−
アスパラギン酸１５００ｍＭ、ピリドキサル５’−リン
酸０．０４ｍＭ、トライトンＸ−１００ ０．１％（ｖ
／ｖ）、アンモニア０．４Ｍ含有；ｐＨ４．７）２０ｍ
ｌに菌体０．２ｇを懸濁し、４２℃で１時間振盪し、生
成したＬ−アラニンの量を薄層クロマトグラフィーまた
は高速液体クロマトグラフィーにて測定、定量した。活
性は４２℃にて１時間に１μｍｏｌのアラニンを生じう
る酵素量を１Ｕ（ユニット）とし、比活性は１ｇ湿菌体
当たりの酵素量（Ｕ／ｇ ｃｅｌｌ）で表示した。この
菌体の比活性は約３７，０００Ｕ／ｇ ｃｅｌｌであっ
た。
【００１１】
［実施例２］菌株としてシュードモナス・ダクネ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄａｃｕｎｈａｅ）ＩＡＭ １１
５２を用い、ｐＨ調節をフマル酸懸濁液（フマル酸５５
ｇを脱イオン水２００ｍｌに懸濁し、１２０℃で２０分
間滅菌したもの）で行った他は、実施例１と同様に、三
角フラスコ、ついでジャーファーメンターで培養し、湿
菌体を４５ｇ／ｌの濃度で得た。実施例１と同様に遠心
洗浄を行い、洗浄菌体について比活性を求めたところ約
４０，０００Ｕ／ｇ ｃｅｌｌであった。
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄａｃｕｎｈａｅ）ＩＡＭ １１
５２を用い、ｐＨ調節をフマル酸懸濁液（フマル酸５５
ｇを脱イオン水２００ｍｌに懸濁し、１２０℃で２０分
間滅菌したもの）で行った他は、実施例１と同様に、三
角フラスコ、ついでジャーファーメンターで培養し、湿
菌体を４５ｇ／ｌの濃度で得た。実施例１と同様に遠心
洗浄を行い、洗浄菌体について比活性を求めたところ約
４０，０００Ｕ／ｇ ｃｅｌｌであった。
【００１２】
［比較例］菌株としてシュードモナス・ダクネ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｄａｃｕｎｈａｅ）ＩＡＭ １１５
２を用い、ｐＨ調節を脱イオン水で５倍に希釈した濃硫
酸水溶液を用いると共に、ジャーファーメンター培養の
培地も前記培地１と同じにした他は、実施例１と同様に
、三角フラスコ、ついでジャーファーメンターで培養し
、湿菌体を４３ｇ／ｌの濃度で得た。実施例１と同様に
遠心洗浄を行い、洗浄菌体について比活性を求めたとこ
ろ約２９，０００Ｕ／ｇ ｃｅｌｌであった。
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｄａｃｕｎｈａｅ）ＩＡＭ １１５
２を用い、ｐＨ調節を脱イオン水で５倍に希釈した濃硫
酸水溶液を用いると共に、ジャーファーメンター培養の
培地も前記培地１と同じにした他は、実施例１と同様に
、三角フラスコ、ついでジャーファーメンターで培養し
、湿菌体を４３ｇ／ｌの濃度で得た。実施例１と同様に
遠心洗浄を行い、洗浄菌体について比活性を求めたとこ
ろ約２９，０００Ｕ／ｇ ｃｅｌｌであった。
【００１３】
【発明の効果】本発明によれば、シュードモナス属に属
する微生物を、培地のｐＨ調節をフマル酸またはその塩
を用いて行うことにより、アスパラギン酸β−脱炭酸酵
素活性の高い菌体を得ることができる。
する微生物を、培地のｐＨ調節をフマル酸またはその塩
を用いて行うことにより、アスパラギン酸β−脱炭酸酵
素活性の高い菌体を得ることができる。
Claims (1)
- 【請求項１】シュードモナス属に属し、アスパラギン酸
β−脱炭酸酵素を含有する微生物を培養する方法におい
て、培養時の培地のｐＨ調節の少なくとも一部を、フマ
ル酸またはその塩を用いて行うことを特徴とするシュー
ドモナス属微生物の培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3062031A JPH04299979A (ja) | 1991-03-26 | 1991-03-26 | シュードモナス属微生物の培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3062031A JPH04299979A (ja) | 1991-03-26 | 1991-03-26 | シュードモナス属微生物の培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04299979A true JPH04299979A (ja) | 1992-10-23 |
Family
ID=13188393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3062031A Pending JPH04299979A (ja) | 1991-03-26 | 1991-03-26 | シュードモナス属微生物の培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04299979A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102660626A (zh) * | 2012-04-28 | 2012-09-12 | 淮北新旗氨基酸有限公司 | 一种生物拆分制备n-甲基-d-天门冬氨酸的方法 |
-
1991
- 1991-03-26 JP JP3062031A patent/JPH04299979A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102660626A (zh) * | 2012-04-28 | 2012-09-12 | 淮北新旗氨基酸有限公司 | 一种生物拆分制备n-甲基-d-天门冬氨酸的方法 |
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