JPH04299986A - 高粘性ｂｓ−１物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は増粘剤または乳化安定剤
等の食品添加物として有用な高粘性ＢＳ−１物質の製造
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】高粘性ＢＳ−１物質は水に容易に溶け、
低粘度で高い粘性を示すことから、増粘剤、タレ防止剤
、分散剤、食感改善剤、凍結安定剤、代用血漿等として
食品及び医薬品分野で広い用途を有し、また乳化安定剤
としても優れた性能を有する。

【０００３】特開昭６２−２８２５９２号公報にはクレ
ブシェラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ）　ＫＰＳ５００２（微工研条寄第　
６２５号）の培養物からこの高粘性ＢＳ−１物質が得ら
れることが開示されている。この培養に際してはラクト
ースのような糖類を炭素源とし、トリプチケースやペプ
トン、酵母エキスなどのような有機態の窒素源およびリ
ン酸塩および微量金属類を添加し、ｐＨを４〜８、特に
好ましくは中性付近に調整することが望ましいと記載さ
れている。しかし、このような培養条件では収量が比較
的低く、最高でも培養液１ｌ当り９ｇ程度しか得られな
かった。従ってＢＳ−１物質の収量を更に上げるような
培養条件を見出すことが要望されていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明はクレブシェラ
属に属する微生物により生産される高粘性ＢＳ−１物質
の収量を増加せしめる製造法を提供することを課題とす
る。本発明者等はクレブシェラ属に属する微生物の培養
において培養液の初発ｐＨをアルカリ側にすることによ
り生産性が向上することを見出し、本発明をなすに至っ
た。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明の高粘性ＢＳ−１
物質の製造法はクレブシェラ属（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
）に属する微生物を培養液の初発ｐＨを８．０　を越え
１１．０以下に調節することにより培養し、培養物から
高粘性ＢＳ−１物質を分離、採取することを特徴とする
ものである。

【０００６】高粘性ＢＳ−１物質は次に示す理化学的性
質を有する高い水溶液粘度を持つものである。

【０００７】ａ　　外観：無味、無臭の白色粉末。

【０００８】ｂ　　溶解性：水に易溶、メタノール、酢
酸エチル、クロロホルム、ベンゼンに難溶、鉱酸により
加水分解。

【０００９】ｃ　　粘度：２０００〜３０００センチポ
イス（１％水溶液、温度３０℃、ずり速度　３．８３ｓ
ｅｃ−１）。

【００１０】ｄ　　主要構成糖成分：ガラクトース５０
〜７０％、マンノース　０．５〜３％、グルコース１〜
５％、グルクロン酸２５〜３７％。

【００１１】ｅ　　呈色反応： フェノール硫酸反応：　　　　陽性 カルバゾール硫酸反応　　　　陽性 モーリッシュ反応　　　　　　　　陽性ニンヒドリン反
応　　　　　　　　陽性ｆ　　分子量：（分子量はゲル
濾過法により測定した。）１０万〜１０００万 ｇ　　元素分析値：Ｃ　　　５．０〜４０．０％Ｈ　　
　２．０〜　６．０％ Ｎ　　　０　　〜　１．０％ ｉ　　赤外線吸収スペクトル： （ＫＢｒ錠剤法） （ｃｍ−１） ３４００，２９２０，１６２０，１４２０，１３００，
１１４０，１０８０，８００また、高粘性ＢＳ−１を更
に精製した精製高粘性ＢＳ−１の理化学的性質は以下の
通りである。

【００１２】ａ　　外観：無味、無臭の白色粉末。

【００１３】ｂ　　溶解性：水に易溶、メタノール、酢
酸エチル、クロロホルム、ベンゼンに難溶、鉱酸により
加水分解。

【００１４】ｃ　　粘度：２４００〜２６００センチポ
イス（１％水溶液、温度３０℃、ずり速度　３．８３ｓ
ｅｃ−１）。

【００１５】ｄ　　主要構成糖成分：ガラクトース６０
〜６５％、マンノース　１．５〜２．５　％、グルコー
ス２〜３％、グルクロン酸３０〜３５％。

【００１６】ｅ　　呈色反応： フェノール硫酸反応：　　　　陽性 カルバゾール硫酸反応　　　　陽性 モーリッシュ反応　　　　　　　　陽性ニンヒドリン反
応　　　　　　　　陰性ｆ　　分子量：２００万〜１０
００万 ｇ　　元素分析値：Ｃ　　３７．５〜３９％Ｈ　　　５
．５〜　６％ Ｎ　　　０　　〜　０．２％ ｉ　　赤外線吸収スペクトル： （ＫＢｒ錠剤法） （ｃｍ−１） ３４００，２９２０，１６２０，１４００，１３６０，
１２８０，１２２０，１１４０，１０６０，　９２０，
８６０，８００　，７６０高粘性ＢＳ−１物質を生産す
るのに利用されるクレブシェラ属に属する菌種は東京都
の隅田川より分離・同定したものであって、その菌学的
性質を調べた結果、「バージェイズ・マニュアル・オブ
・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ
´ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　第１巻。１９８４版」に
記載されたクレブシェラ・プランティコーラ（ｋｌｅｂ
ｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）　に属する。

【００１７】（１）　　形態：莢膜を有する桿菌、単一
細胞、無胞子、　０．７〜０．９　×　１．０〜２．０
　μｍ　の大きさ。

【００１８】（２）　　グラム染色：陰性（３）　　寒
天培地上の所見：白色、円形又は不定形のコロニー、ス
ライム状の粘質物形成。

【００１９】（４）　　各培地における生育状態：イ　
　肉汁寒天平板培養で良好に生育する。

【００２０】ロ　　肉汁寒天斜面培養で良好に生育する
。

【００２１】ハ　　肉汁液体培養で良好に生育する。

【００２２】ニ　　肉汁ゼラチン穿刺培養で生育する。

【００２３】ホ　　リトマス・ミルクでは良好に生育し
、カゼインの凝集が認められる。

【００２４】 　（５）　　運動性：　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　陰性
　（６）　　カタラーゼ：　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　陽性　（
７）　　オキシダーゼ：　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　陰性　（８）　
　β−ガラクトシターゼ：　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　陽性　（９）　　グルコースか
らのガス産生：　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　陽性（１０）　　炭水化物からの酸生成： 　　　　アラビノース、イノシトール、ラクトース、マ
ルトース、マンニトール、ソ　　　　ルビトール、シュ
ークロース、キシロース、ラムノース、ラフイノース、
　　　　トレハロース、及びサリシンからの酸生成　　
　　　　　　　　　　陽性　　　　アドニトールからの
酸生成　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　陰性（１１）　　クエン酸塩の利用：　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　陽性（
１２）　　マロン酸塩の利用：　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　陽性（１３）　　
グルコン酸塩の利用：　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　陽性（１４）　　ＶＰ（Ｖｏｇ
ｅｓ　Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ）テスト：　　　　　　　　
　　　　　　　　陽性（１５）　　ＭＲ（メチルレッド
）テスト：　　　　　　　　　　　　　　　　　　陰性
（１６）　　硝酸塩の還元：　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　陽性（１７
）　　尿素の加水分解：　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　陽性（１８）　　ア
ルギニンの加水分解：　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　陰性（１９）　　ゼラチンの加水分
解：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　陰性（２０）　　フェニルアラニンテスト：　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　陰性（２１
）　　インドールの生成：　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　陰性（２２）　　リジ
ンデカルボキシラーゼ：　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　陽性（２３）　　オルニチンデカルボキシ
ラーゼ：　　　　　　　　　　　　　　　　陰性（２４
）　　脱窒反応：　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　陰性（２５）
　　硫化水素の生成：　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　陰性（２６）　　でん
ぷんの加水分解：　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　陽性（２７）　　無機窒素源の利用
：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　陽性無機窒素源として硝酸アンモニウム、硝酸
カリウム、尿素、リン酸２水素アンモニウム、リン酸水
素２アンモニウム、リン酸アンモニウムナトリウム及び
硫酸アンモニウムを利用。

【００２５】 （２８）　　ウレアーゼ：　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　陽性（２
９）　　生育の範囲： イ　　ｐＨ４．０　〜１３．５（耐アルカリ性）。

【００２６】ロ　　温度１０℃で増殖する。

【００２７】４４．５℃でラクトースからガスを産生し
ない。

【００２８】（３０）　　酵素に対する態度：通性好気
性。

【００２９】（３１）　　ＯＦテスト：Ｄ−グルコース
、シュークロース、ラクトース、イヌリン、Ｌ−ソルボ
ース、Ｌ−アラビノース、ミオーイノシトール、Ｄ−マ
ンニトール、Ｌ−ラムノース、ラフィノース、Ｄ−ソル
ビトール、ドルシトールを基質とした時（Ｆ）、Ｄ−メ
リジトースの時（Ｏ）。

【００３０】 （３２）　　下記の糖類からの酸及びガスの生成：　　
　　Ｄ−マンノース　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　酸及びガス生成
　　　　Ｄ−フラクトース　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　同　　上　　
　　Ｄ−ガラクトース　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　同　　上　　　　
グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　同　　上　　　
　でんぷん　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　同　　上（
３３）　　酵素法によるＧ（グアニン）＋Ｃ（シトシン
）含有量（モル％）５４．８。

【００３１】上記菌学的性質を有する菌種は、クレブシ
ェラ・プランティコーラ（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌ
ａｎｔｉｃｏｌａ）　ＫＰＳ５００３の菌株名で工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第３３００号の
受託番号で寄託されている。

【００３２】高粘性ＢＳ−１物質はクレブシェラ・プラ
ンティコーラＫＰＳ５００３菌株を炭素源、窒素及びそ
の他の生育に必要な栄養成分を含む固体培地もしくは液
体培地中で、湯盪培養や通気撹拌培養のような好気的培
養を行うことにより生産される。ここで培地に用いる炭
素源としては、ラクトース、シュークロース、マルトー
ス、ガラクトース、グルコース、フラクトース等の糖類
を例示し得るが、中でもラクトースが好ましい。これら
糖類の培地中における濃度は使用菌が生育し得る程度で
あれば特に限定されないが、通常１〜１０％（Ｗ／Ｖ）
、好ましくは３〜５％（Ｗ／Ｖ）である。また、窒素源
としては、ポリペプトン、酵母エキス、肉エキス、トリ
プチケースのような有機物、又は硝酸塩、アンモニウム
塩のような無機物を例示し得るが、ＢＳ−１物質の生産
性の観点からは有機態の窒素源が好ましいといえる。さ
らに、培地には必要に応じて、リン酸一カリウムやリン
酸二カリウムのようなリン酸塩、鉄、銅、マグネシウム
、マンガン、モリブテン、亜鉛、ホウ素等の微量金属類
及びビオチン、チアミン、ビタミンＢ１２等のビタミン
類及び核酸類等を添加してもよい。

【００３３】上記培地中での培養温度は、使用菌の増殖
至適温度範囲である２０〜３７℃好ましくは２５〜３２
℃である。

【００３４】本発明においては培養液の初発ｐＨは極め
て重要である。初発ｐＨはアルカリ側であることが必要
で８を越え１１．０以下、特に好ましくは　８．２〜１
０．５であることが必要である。培養液の初発ｐＨが８
以下であると高粘性ＢＳ−１物質の収量が低下し、本発
明の目的が達成されない。またｐＨが１１．０以上の強
アルカリ性領域では菌の増殖は認められるが、高粘性Ｂ
Ｓ−１物質の収量が低下する。

【００３５】培養時間は、培地の粘度が最大に達するま
で行えばよいが、実際上は生産効率の点から通常３〜７
日間でよい。

【００３６】上記菌株を、上述のような培養条件下に培
養すると、経時的に培地の粘度が上昇し、ＢＳ−１物質
が培地中に生産、蓄積されたことがわかる。

【００３７】培養終了後、培地中のＢＳ−１物質を常法
に従って分離、採取する。この分離、採取は、例えば液
体培地を用いた場合には、培養終了後培養液を水で希釈
し、遠心分離などにより菌体等の不純物を除去し、次い
で除菌した培養液にエチルアルコール、メチルアルコー
ル、イソプロピルアルコール、アセトンのごとき有機溶
媒またはセチルトリメチルアンモニウムやブチルアマイ
ドのような第４級アミンを加えると粗ＢＳ−１物質が沈
澱する。この沈澱を洗浄した後、さらにアセトンで脱水
及び脱脂した後乾燥させることにより、高粘性ＢＳ−１
物質が得られる。

【００３８】上記高粘性ＢＳ−１物質をエチルアルコー
ルを用いて再析出させる操作を繰返し行い、更に必要に
応じて透析処理もしくはクロマトグラフィーで処理して
精製することにより精製高粘性ＢＳ−１物質が得られる
。

【００３９】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。

【００４０】

【実施例】実施例１ 　　クレブシェラ・プランティコーラＫＰＳ５００３（
微工研条寄第３３００号）をラクトース３重量％、トリ
プチケース０．３５重量％、リン酸−カリウム　０．６
重量％、硫酸マグネシウム０．０７重量％、塩化マンガ
ン０．０００１重量％及び寒天　１．４重量％からなる
斜面培地に増殖させたものを白金耳でかき取り、上記培
地において寒天を除いた培養液１０ｍｌに接種し、３０
℃で１日間振盪培養で前培養を行なった。

【００４１】次いで、上記前培養に用いたものと同様な
組成で５ＮＮａＯＨでｐＨ１０．０　に調整した培養液
を　１２０℃、１５分間加熱滅菌したものの１リットル
（ｌ）に、上記前培養したものを無菌的に接種して３０
℃で５日間振盪培養（１２０ｒｐｍ）を行なった。培養
の進行に伴い培養液は粘稠となり、ＢＳ−１物質の生産
、蓄積が認められた。

【００４２】得られた培養液を４℃で１８，０００ｒｐ
ｍ（３１，０００ｇ）で１５分間遠心分離して菌体を除
去したものに、２倍量のエタノールを加えてＢＳ−１物
質を析出させた。析出したＢＳ−１物質を遠心分離によ
り沈澱させ、この沈澱をエタノールにより洗浄した後、
アセトンを加えてホモゲナイズした。次いでアセトンを
除去してデシケーター内で乾燥し、乾燥物１３．３ｇを
得た。

【００４３】得られた乾燥物の理化学的性質を調べた結
果、下記に示すとおりであって、高粘性ＢＳ−１物質で
あると確認された。

【００４４】ａ　　外観：無味、無臭の白色粉末。

【００４５】ｂ　　溶解性：水に易溶、メタノール、酢
酸エチル、クロロホルム、ベンゼンに難溶、鉱酸により
加水分解。

【００４６】ｃ　　粘度：２２７３センチポイス（１％
水溶液、温度３０℃、ずり速度　３．８３ｓｅｃ−１）
。

【００４７】ｄ　　主要構成糖成分：ガラクトース６２
．１％、マンノース１．５％、グルコース　３．２％、
グルクロン酸３３．２％。

【００４８】ｅ　　呈色反応： フェノール硫酸反応　　　　陽性 カルバゾール硫酸反応　　陽性 モーリッシュ反応　　　　　　陽性 ニンヒドリン反応　　　　　　陽性 ｆ　　分子量：２０万以上 ｇ　　元素分析値：Ｃ　　３５．２％ Ｈ　　　４．３％ Ｎ　　　０．３％ ｉ　　赤外線吸収スペクトル（ｃｍ−１）（ＫＢｒ錠剤
法、１．５ｍｇ　ＢＳ−１／１ｇＫＢｒ）島津フーリエ
変換赤外分光光度計　　ＦＴＩＲ−４２００３４００，
２９２６，１６１８，１４１９，１３７０，１１５０，
１０７４，７８９なお図１にここで得られた高粘性ＢＳ
−１物質の赤外吸収スペクトルを示す。上述のごとくし
て得た高粘性ＢＳ−１物質１３．３ｇを蒸留水に溶解し
、４℃　１８０００ｒｐｍ（３１０００　ｇ）で遠心分
離により夾雑物を除去したものに、エタノールを加えて
ＢＳ−１物質を再析出させる操作を２回繰り返して行な
った後、析出物を蒸留水に溶解した。

【００４９】この水溶液を透析膜に入れ、純水に対して
２４時間透析を行い、次いで真空凍結乾燥を行い、白色
塊状の精製物９ｇを得た。得られた精製物の理化学的性
質は下記に示すとおりである。

【００５０】ａ　　外観：無味、無臭の白色粉末。

【００５１】ｂ　　溶解性：水に易溶、メタノール、酢
酸エチル、クロロホルム、ベンゼンに難溶、鉱酸により
加水分解。

【００５２】ｃ　　粘度：２４３２センチポイス（１％
水溶液、温度３０℃、ずり速度　３．８３ｓｅｃ−１）
ｄ　　構成成分：ガラクトース５６．１％、マンノース
　１．３％、グルコース　１．８％、グルクロン酸２９
．０％。

【００５３】（主要構成糖成分比率）：ガラクトース６
３．６％、マンノース　１．５％、グルコース　２．０
％、グルクロン酸３２．９％。

【００５４】ｅ　　呈色反応： フェノール硫酸反応　　　　陽性 カルバゾール硫酸反応　　陽性 モーリッシュ反応　　　　　　陽性 ニンヒドリン反応　　　　　　陰性 ｆ　　分子量：　２００万以上 ｇ　　元素分析値：Ｃ　　３８．５％ Ｈ　　　５．８％ Ｎ　　　０．１％ ｉ　　赤外線吸収スペクトル（ｃｍ−１）３４２２，２
９２６，１６１７，１４１２，１３７３，１３００，１
２３４，１１５０，１０７３，　９２４，　８８９，　
７８９，　６６２なお、図２に、ここで得られた精製高
粘性ＢＳ−１物質の赤外吸収スペクトルを示す。

【００５５】実施例２〜３、参考例１〜２　　実施例１
と同様の組成の培養液の初発ｐＨを　７．４（参考例１
）、　８．２（実施例２）、　９．３（実施例３）、１
１．５（参考例２）として実施例１と同じ条件で培養を
行った。

【００５６】培養時の培養液のｐＨ、粘度、製品収量及
び製品粘度を実施例１を含め第１表に示した。

【００５７】

【表１】 初発ｐＨが本発明の範囲であると培養液の最終粘度（培
養５日間）が高く、ＢＳ−１物質の収量が大であること
が判る。

【００５８】尚、実施例２〜３、参考例１〜２は何れも
その理化学的性質が高粘度ＢＳ−１物質の理化学的性質
　（ａ）〜（ｉ）　を満足し、高粘度ＢＳ−１物質であ
ることが確認された。

【００５９】

【発明の効果】本発明ではクレブシェラ属に属する微生
物を培養液の初発ｐＨを８．０　を越え１１．０以下に
調整して培養するため、得られた高粘性ＢＳ−１物質の
培養液１リットル当りの収量を顕著に改善することがで
きた。従来の方法ではｐＨ４〜８で行なわれていた為、
その収量は最高でも９．０ｇ／ｌであったが本発明では
高粘度のＢＳ−１物質を１０〜１３．３ｇ　／ｌの高収
量で得ることができた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例１で得られた高粘性ＢＳ−１物質
の赤外吸収スペクトルを示す。

【図２】図２は実施例１で得られた精製高粘性ＢＳ−１
物質の赤外吸収スペクトルを示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　クレブシェラ属（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ
   ａ）に属する微生物を培養液の初発ｐＨを８．０　を越
   え１１．０以下に調整することにより培養し、培養物か
   ら高粘性ＢＳ−１物質を分離、採取することを特徴とす
   る高粘性ＢＳ−１物質の製造法。
2. 【請求項２】　　クレブシェラ属に属する微生物がクレ
   ブシェラ・プランティコーラ（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　
   ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）　ＫＰＳ５００３（微工研条寄
   第３３００号）である請求項１記載の高粘性ＢＳ−１物
   質の製造法。