JPH04501205A - サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ配列決定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サーマスーアクアティクス（Ｔｈｅｒ＋ｎｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のＤＮＡ ポリメラーゼを用いたＤＮＡ配列決定法の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ポリメラーゼ）を利用したＤＮＡ配列決定法を提供する。ＤＮＡ配列決定法は、 分子生物学、遺伝学、医学の診断技術、および法医学の領域で実際によく利用さ れている。ＤＮＡ配列決定法の重要性は、核酸の配列を決定するための試薬およ び自動分析機の製造および販売を中心とした旺盛な商業活動によって裏付けられ ている。

サンガーのジブオキシスクレオチド法〔サンガーら、１９７７゜Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４　：　５４６３−５４６７　］による ＤＮＡ配列決定法は、新規のベクター〔ヤニツシューベロンら、１９８５、箪３ ３　：　１０３−１１９３　、塩基類似体〔ミルズら、１９７９゜Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔ、１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６　：　２２３２−２２３５　、 およびバールら、１９８６．　ＢｉｏＴｅｃｈｉｎｉｑｕｅｓ　４　：　４２８ −４３２　］　、酵素〔タボールら、１９８７．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＩＩｓ八８へ　：　４７６３−４７７１〕、ならびにＤＮＡ配列の 部分的自動解析機〔スミスら、。

１９８６、Ｎａｔｕｒｅ　３２１　：　６７４−６７９　、プロパーら、１９８ ７．５ｃｉｅｎｃｅ２３Ｂ　：　３３６−３４１およびアンソーゲら、１９８７ ．　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１５　：　４５９３−４６０２３の開発を含むかなりの洗練を近年に経験してい る。この塩基配列決定のジデオキシ法は、以下の工程からなる。（１）オリゴヌ クレオチドブライマーを適当な１本鎖または変形２本鎖ＤＮＡの鋳型にアニーリ ングする工程、（２）４つの別個の反応でＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマ ーを伸長させる工程であって、それぞれの反応では、ｄｄＮＴＰのなかの１種類 のα−標識ｄＮＴＰ　（または、標識プライマーを使用することもできる）、各 未標識ｄＮＴＰの混合物、および１種類のｉ伸長停止ジデオキシヌクレオチド− ５’　−１−リホスフエ−）　（ｄｄＮＴＰ）を含むもの、（３）高分解能ポリ アクリルアミド−尿素ゲル上での４種類の反応産物を解析する工程、および（４ ）読み取り可能なゲルからオートラジオグラフィー像を得てＤＮＡ配列を推定す る工程。また、蛍光標識したプライマーまたはヌクレオチドを使用して、反応産 物を同定することができる。既知のジデオキシ配列決定法では、大腸菌ＤＮＡボ リメラ・−ゼ■のタレ、ノ・−断片、逆転写酵素または修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラ ーゼといったＤＮＡボリメラ・−ゼが利用される。しかし、これらの酵素を用い た配列決定法では、Ｔａｑポリメラーゼは使われない。

市販のキットを使用することによって、その手法は極めて単純なものとなり、Ｄ ＮＡ配列決定法があらゆる研究室でルーチンの技術となった。しかし、この手法 においても、バリンドロ・−ムの−・アビンループなどの２次構造を含む核酸、 およびＧＣ含量の多いＤＮＡ　（フーグスティーン型結合の形成によってＤ　Ｎ 　Ａの収縮を生じ得る）を対象とした研究に都合のよい配列決定法にはまだ欠点 がある。一般に、こういったＤ　Ｎ　Ａは、先行技術の配列決定法にとって優れ た材料とはいえず、配列決定を妨害する異常なゲルの移動パターンを表すことが ある。さらに、配列決定のだめの１つの反応からＤＮＡの長いセグメントのＤＮ Ａ配列情報が得られる配列決定法が必要である。現在では、様々な配列決定法を 使って、長短両方の配列決定産物を作製しなければならない。以下に詳述するよ うに、本発明は、１回の配列決定反応で長短両方の配列決定産物を作製すること によって、Ｄ□ＮＡ配列決定の手法に画期的な改良をもたらすものである。

現在市販されている装置は、配列決定の支援機構を備えている。例えば、丁イソ トープを使わない検出、コンピューターによるデータの収集および解析などであ る。こういった発達によって、多くの研究者は、大規模な配列決定計画に参画で き、ヒトの全遺伝子の配列決定も考えられるようになった。

大規模な配列決定計画の最終的な成否は、この技術の高速化と自動化の改良にか かっているといえよう。これには、プロセスの前段階に関するその他の処理法を 開発することが含まれる。すなわち、ＤＮＡ鋳型の調製および配列決定反応の操 作を自動化する方法であって、本発明は、このプロセスの前段階を完全に自動化 する手段を提供するものである。

自動的にＤＮＡを調製する理想的とみえる手法の１つは、ポリメラーゼを使った 遺伝子増幅法（ＰＣＲ）　（米国特許第４．６８３．２０２号に開示された方法 ）によるＤＮＡの選択的増幅である。

ＰＣＲ法では、（１）ＤＮＡの熱変性、（２）増幅すべきＤＮＡセグメントを挾 む２つのオリゴヌクレオチドブライマーのアニーリング、および＜３）ＤＮＡポ リメラーゼを用いたアニーリングプライマーの伸長が行われる。この方法によれ ば、単一コピーのゲノムＤＮＡのセグメントが極めて高い特異性と忠実度をもっ て、１００万倍以上に増幅される。続いて、ＰＣＲ産物を、配列解析に適したベ クターにサブクローン化するか、精製したＰＣＲ産物を、エンゲルヶら［１９８ ８゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、　８５　：　５４ ４−５４８　］　、ウォングら［１９８７，Ｎａｔｕｒｅ、　３３０：３８４− ３８６］およびストフレットら［１９８８゜５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９　：　４ ９１−４９４　］が記載したようにして配列決定することができる。

サイキら［１９８８，５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９　：　４８７−４９４　）は、 ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによってＰＣＲ法が極めて簡単な方法となることを報 じている。このポリメラーゼは、７５℃付近を中心とする幅広い至適温度をもち 、９５℃で繰り返しインキュベーションしても変性しないので、各ＰＣＲサイク ル終了後に新しい酵素を添加する必要はない。高温でのアニーリングおよび伸長 反応でＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用すると、特異性、収率および増幅され得 る産物の長さが増し、希少な標的配列を検出するときのＰＣＨの感度が増大する 。

しかし、この発明以前には、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ配列決定法に用 いられることはなかった。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは高い処理能および大きな 取込み速度を示し、そして鎖伸長を停止させるためのヌクレオチド類似体の使用 及びゲルの収縮を解決するすることができる。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのこれ らの性質は、近年Ｔａｂｏｒら［１９ｇ？、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８４　：　４７６７−４７７１　］によって記載されたバクテリオファ ージの化学修飾型Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの性質と類似している。

しかし、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼとは対照的に、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、 ゲルファントら（欧州特許公開第２５８．０１７号）が記載するように、高温に 極めて安定な単鎖の酵素である。Ｔａｑポリメラーゼは、検出可能な３’、５’ −エンドヌクレアーゼ活性を有さす、一定のｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰ濃度を使 用しない限り、取込みを誤る率が高いので、従来ＴａｑＤＮＡポリメラーゼが配 列決定に用いられることはなかった。本発明は、ＤＮＡ配列決定のための効率的 な方法を提供するものであって、この方法は、ＰＣＲ増幅ＤＮＡを直接配列決定 するために使用可能である。

この発明は、核酸のヌクレオチド配列を決定するための改良型ジデオキシヌクレ オチド法を提供する。この改良法では、使用されるプライマーの伸長に、サーマ ス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｎ＋ｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）からのＤＮＡポ リメラーゼが利用される。この発明の方法は、改良されたまたは非対称のポリメ ラーゼ連鎖反応によって生じた１本鎖ＤＮＡを用いて、１本鎖ＤＮＡを作製する 際に、特に好ましい。

この発明の方法は、既知の配列決定法にはるかに勝る利点を提供するのもである 。これらの利点の多くは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの特別な寄与から生じるの もであって、これは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、リバースト ランスクリプターゼまたは修飾型Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼのために設計されたジ デオキシ配列決定法では正常に機能しないはずである。しかし、本発明の方法を 用いれば、その他の方法では不可能な、Ｔａｑポリメラーゼによる配列情報が得 られる。

例えば、本発明の配列決定反応の工程は広い温度範囲で実施できるが、先行技術 の方法は５０℃を越える温度では操作不能であった。しかし、５０℃の温度では 、多くの単鎖ＤＮＡがヘアピンループなどの２次構造を生じることがある。これ らの構造は、伸長反応における鎖の不適切な停止と、配列決定ゲル上での異常な 移動パターンの発生の両面から、ジデオキシ法の重大な障害となり得る。本発明 が提供するように、高温（すなわち、７０℃）での伸長反応を実施できるために 、上記のような２次構造を含むＤＮＡでの配列決定結果が著しく改善される。高 温が２次構造の安定性を奪うからである。また、この発明によれば高温で操作が できるので、プライマーの特異性が増し、鮮明（バックグラウンドが少ない）で 読み取りやすい配列情報が得られる。

さらに、この発明では７−ジアザグアニンなどの構造安定化塩基類似体を利用で きるために、より良い配列決定結果が得られる。この類似体は、高ＧＣ含有ＤＮ Ａにおけるツーブスティン（Ｆｏｏｇｓｔｅｅｎ）結合の形成を防止するために 使用されるが、もし防止されかったとすれば、ＤＮＡの収縮および配列決定ゲル におけるＤＮＡの異常な移動パターンが生じる。

この方法の別の重要な利点は、１回の配列決定反応（上記のとおり、４つの異な った反応、すなわち、各ヌクレオリドの塩基Ａ、Ｇ、Ｃ，Ｔごとに１つの反応が ある）でヌクレオリドの長いセグメントに関する配列情報が得られることである 。Ｔａｑポリメラーゼは、反応速度が大きく、処理能力が優れており、そして産 物は、短いもの（プライマーの３０ヌクレオリド以内）でも長いもの（プライマ ーより１ｏｏｏヌクレオリドを越す）でも、均一な強度でシグナルを発するこの 発明の方法によって調製することができる。この利点はオートラジオグラフィー を使用する配列決定に限定されるものではない。

むしろ、この方法における伸長産物の生成の性質によって、伸長産物の検出に用 いる方法にかかわらず、１回の配列決定反応で１ｏｏｏ塩基以上のヌクレオチド 配列を決定し得る自動ＤＮＡ配列決定装置の出現が初めて可能となった。この方 法が開発される以前のＤＮＡ配列決定装置は、・１配列決定反応でせいぜい６０ ０塩基を生じるのが限度であった。

この発明のもう一つ別の局面は、ＤＮＡ配列決定装置の設計に大きな影響をもた らすものである。ＰＣＲ法が自動化されており、配列決定のための１本鎖ＤＮＡ 鋳型を作製するために非対照ＰＣＲが使用できる。Ｔａｑポリメラーゼは、ＰＣ Ｒのために好都合であるが、この発明以前は、ＤＮＡ配列決定に用いるには好ま しくなかった。しかし、この発明の登場によって、配列決定の鋳型の作製および 配列決定を１回の自動化された工程で行うことができる。さらに、この発明は、 ＰＣＲ法およびこの方法の両方に使用可能なある種のキット＄よび緩衝液に関す る。

この発明の理解に役立たせるために、以下の図を提示する。

第１図は、次の各産物を展開したポリアクリルアミド尿素ゲルのオートラジオグ ラフィーを示す。（Ａ）標識化反応、（Ｂ）様々な温度で実施した配列決定反応 （伸長−停止）、および（Ｃ）長い時間の電気泳動中に分離した配列決定反応の 産物。標識化反応は、実施例４に記載のとおりに行った。

反応温度は、酵素の添加前に上昇させた。アリコートは、０．５．１．３．５． ７および１０分で採取した。伸長−停止反応は記載されているとおり実施した。

すべての反応は、ホルムアミド−ＢＤＴＡ停止溶液で停止させ、８０℃３分間で 変性され、緩衝液勾配配列決定ゲル上で分離を行った（ビギンら［１９８３゜Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ０口ＳＡ　８０　：　３９６３−３９６５ 　）の記載に従って）。泳動時間を延ばした電気泳動（Ｃ）を、７０℃／３分間 の伸長−停止配列決定反応の産物について行った。試料は、１８ｃｍ　Ｘ　５０ ｃｍ　Ｘ　Ｏ，４ａｍの７％アクリルアミドゲル（２４：１架橋）上で、７Ｍ尿 素およびＩＸＴＢＢを使って２１時間１５Ｗで泳動した。マーカーは、プライマ ーの開始点からヌクレオリド数での距離を表す。すべての配列決定反応セットは Ｇ、Ａ、Ｔ。

Ｃである。

第２図は、塩基類似体で生じた伸長産物を比較するポリアクリルアミド尿素ゲル のオートラジオグラフィーを示す。

ｄＧＴＰをｃ’ｄＧＴＰ　（７−ジアザ−２′−デオキシグアノシン−５′トリ ホスフエートは、明細書中でｃ’ｄＧＴＰと略記されるが、図中ではｄｃ’ＧＴ Ｐと略記される）またはｄｌＴＰで置換した影響は、Ｍ１３：　ｍｐ１８１本鎮 ＤＮ末鎖または部分的パリンドローム構造のクローンＥＫ９上で行った配列決定 反応で示される。各レーンはＧ、Ａ、Ｔ、Ｃである。ＢＫ９ｄＧＴＰとｃ’ｄＧ ＴＰ反応セットの間の線は、収縮された領域の上流及び下流の同一位置を合せて いる。かぎ括弧は、パリンドローム領域の範囲を示す。この領域の正確な配列は 以下のとおりである。

５’　−ＣＣＡＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＧＡＣＴＴＴＣＧＡＣＧＧＧＡＡＴ ＴＣＣＣＧＴＣ”　ＧＡＡＧＴＣＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣ”　ＡＴＡ−３’ 相補塩基には下線を引き、ｄＧＴＰ反応で収縮される塩基は引用符内に示す。

第３図は、（Ａ＞Ｍ１３を基礎とする１重鎮鋳型と（Ｂ）同じ配列の非対照ＰＣ Ｒ鋳型を比較するポリアクリルアミド尿素ゲルのオートラジオグラフィーを示す 。Ｍ１３クローンの配列決定は、［”Ｐ〕−標識プライマーを使った以下の実施 例で記載したとおりに行った。非対照増幅とその後の配列決定は、従来どおりに 行い、すべての伸長産物は、緩衝液勾配配列決定ゲル上で分離した。各反応セッ トはＧ、Ａ、Ｔ、Ｃであった。

サンガーの方法およびその他のジデオキシＤＮＡ配列決定法は一連の４つの反応 を含み、それぞれには、配列決定の対象となる核酸（鋳型）にアニーリングされ たオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型依存性伸長反応が含まれる。この伸長反 応は、鋳型依存性重合のための試薬によって触媒される。

鋳型ＤＮＡは１本鎖であるので、プライマーはこの鋳型にアニーリング可能であ る。そして、４つの伸長反応のそれぞれは、４種類のデオキシリボヌクレオチド −５′−トリホスフェ−）　（ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰおよびｄＴＴ Ｐ）の存在下で、または１種類以上のｄＡＴＰ、　ｄ［：ＴＰ、　ｄＧＴＰもし くはｄＴＴＰの天然もしくは合成類似体および１種類のジデオキシヌクレオリド −５′−トリホスフェ−）　（ｄｄＮＴＰ）を含む類似の混合物中で行われる。

ｄｃｌＮＴＰが取り込まれると伸長反応が停止し、反応によって鎖の長さが様々 な分子を生じるように、ｄｄＮＴＰ濃度を調節することができる。１つの反応で あらゆる伸長産物がｄｄＡＴＰで終わり、別の反応ではｄｄｅＴＰで、さらに別 の反応ではｄｄＧＴＰで、４番目の反応ではｄｄＴＴＰで終わるように、４つの 別々の反応を利用する。標識されたプライマー、ｄＮＴＰまたはｄＮＴＰの使用 によって、伸長反応の産物が検出され得る。これら産物のサイズによる分離（す なわち、隣接レーンの配列決定ゲル上で）、および伸長反応産物の視覚化やその 他の検出手段によって、鋳型の配列が容易に調べられる。

この発明の前には、ジデオキシ配列決定法での伸長産物は、大腸菌ＤＮＡポリメ ラーゼＩのクレノー断片、リバーストラスクリブターゼ、または修飾型Ｔ７ＤＮ Ａポリメラーゼなどの重合化試薬によって得られていた。この発明は、サーマス ・アクアティクスからのＤＮＡポリメラーゼを利用して伸長反応を触媒するジデ オキシヌクレオリド配列決定のための顕著に改良された方法を提供する。

この発明は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡの配列を決定するための 簡便で効果的な方法を提供する。この方法では、５′標識プライマーまたは２段 階反応での標識の取込みに関して、方法は同様に長打に行われる。標識を取り込 む両方法は、はしご状のＤＮＡ配列像を形成するために用いられるが、その特徴 は、バックグラウンドバンド及び顕著な酵素の特質がみられること、強度が均一 であること、および長い距離にわたって解読可能なことである。また、この発明 の方法は、アルカリ変性した２末鎖ＤＮＡ鋳型の配列を決定する上で非常に明確 な結果をもたらした。

この発明の長所は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼをほとんどの配列決定のための選 択できるポリメラーゼとしたことろにある。

この発明による配列決定の結果は、クレノー断片またはＡＭ■リバーストランス クリブターゼを用いて得られた結果よりはるかに優れており、修飾型Ｔ７ＤＮＡ ポリメラーゼによる配列決定法で得られた結果より優れていた。これらの優れた 結果が得られる理由は、これらのいかなるポリメラーゼとも異なって、ＴａｑＤ ＮＡポリメラーゼが７５℃を中心とした広い温度範囲で機能する点にある。ＤＮ Ａの２次構造（ヘアピン）の領域は一般に遭遇され、ＤＮＡポリメラーゼを強く 妨害し、プライマーの伸長反応の早すぎる停止を起こすことがある。この結果は 、配列決定ゲル上の４つの全配列レーンを通してバンドとして観察され、どうい った種類の伸長手段で検出しても失敗の原因になる。その他の構造は、配列決定 の上で障害となることもあり、そしてフーグスティーンバンドの形成による収縮 の結果として高ＧＣ含量ＤＮＡにおいて共通しているが、見掛は上正常なりＮＡ において見られることもある。

ＴａｑＤＮＡポリメラーゼが高温および低塩濃度で作用し得る能力をもっている ために、配列決定反応の間で熱によりヘアピンループが不安定となり、酵素がヘ アピン構造を認識できるようになる。この発明の方法にふいて、７−ジアザ−２ ′−デオキシグアノシン−５′−トリホスフェ−）　（ｃ’ｄＧＴＰ）のような 構造不安定化ｄＧＴＰ類似体を併用すると、電気泳動上で完全に分離したＤＮＡ の配列決定を困難にする配列決定産物を作り出す（同一・期日にイキスにより出 願された；弁理士事件整理番号２４７１参照）。

バックグランドバンドがないことおよび均一強度の放射能活性断片はこの方法に よる利点である。もう一つの利点は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼが取扱に優れて いるという事実に基づく。

７０℃で２分以内で、Ｔａｑ酵素は７．２ｋｂの鋳型全体を複製することができ る。これは、１秒間に６０ヌクレオリドを上回るターンホーバー速度に等しい。

また、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは低温で有意な活性をもち、ターンオーバー速 度の計算値は、５５℃、３７℃および２２℃で、それぞれ２４，１．５および０ ．２５ヌクレオリド／秒である。ｄｄＮＴＰが存在しない場合、プライマー／鋳 型に対するポリメラーゼの実質的基質過剰（モル比０゜１＝１）の状態で７０℃ におけるＴａｑＤＮＡポリメラーゼ伸長反応によって、新しい基質上での再イニ シェーションに先立ってほとんどの開始プライマーが完全に伸長することになろ う。伸長速度は、酵素濃度と比較的無縁であって、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼが 高いプロセシング能をもつことを示している。また、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ がブルーフリーディング活性をもつとしても、それは僅かである。

Ｔａｑ酵素のこういった性質によって、本発明の方法は他の配列決定法より好ま しいものとなる。この方法によって、２次構造を有する配列での鎖伸長に対する ポリメラーゼ作用の休止および早過ぎる停止が減少し、ジデオキシヌクレオチド 類似体に対する識別が低下する。これらの利点は、この発明を自動配列決定装置 で使用するに好都合なものとする。しかし皮肉にも、Ｔａｑの関連する３′から ５′方向へのヌクレアーゼ活性を著しく欠くという、配列決定のためのＴａｑポ リメラーゼの長所の１つが、ゲンファルドら〔欧州特許ＢＰ０２５８．０１７号 公号公報上るこの酵素の精製が行われた後でさえも、Ｔａｑポリメラーゼ配列決 定法の発展を阻害したのは疑いのないことである。これは、３′から５′方向へ のヌクレアーゼ活性が欠如する結果、誤って取り込まれた塩基の除去が出来なく なり、鎖伸長停止が生じるためである。取込みの誤りは、先行技術で一般に使用 された、非常に低く通常のバランスを欠くヌクレオリド濃度で生じる。本発明者 らは、１種類以上のｄＮＴＰかに、より極めて低いとき、および／または１種類 のｄＮＴＰ濃度がその他のｄＮＴＰ濃度よりかなり低いとき、配列決定速度は許 容範囲を越えて上昇することを見いだした。また、本発明者らは、長鎖を形成す る反応に関して高い忠実度および触媒効率に有利な条件は、４種類のｄＮＴＰの 各濃度が類似していて、それぞれのｄＮＴＰに対して１０庫以上であることも見 いだした。

この発明の配列決定法における鎖伸長反応は、以下に詳述するように、ＰＣＨに 適合する緩衝液中で行われる場合が最適条件となる。したがって、Ｔａｑポリメ ラーゼＰＣＲ法の緩衝液（５０ａ＋Ｍ　ＫＣｊ！　、　１０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩｌ、　ｐＨ８，４，２，５ｉ＋Ｍ　ＭｇＣｌ１　ｚ、各ｄＮＴＰ　２００ ｍＭ、およびゲラチン２０ｋ　／ｍｌ）　（サイキら、１９８８゜５ｃｉｅｎｃ ｅ　２３９　：　４８７−４９４）を、本発明者らはＤＮＡ配列決定用に改良し た。サイキらによって記載されたＰＣＲ緩衝液にはＫＣＡが含まれる。しかし、 本発明の目的にかなう最良の伸長反応は、ＫＣｆの非存在下で生じる。本発明に おいて、５０＋ｕＭＭＣＩ！では酵素活性が若干阻害され、７５ｍＭ　ＫＣ１以 上ではＴａｑＤＮＡポリメラーゼ活性は有意に阻害される。ゼラチンはＰＣＲ反 応において酵素の安定剤として作用するが、それは存在していてもいなくても、 配列決定反応自体に影響を与えないが、ゼラチンは電気泳動中に歪みの生じる原 因となることがある。

非イオン系界面活性剤を酵素希釈緩衝液に添加（伸長反応での界面活性剤の最終 濃度は、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．０５％ＮＰ４０）すると、Ｔａ ｑＤＮＡポリメラーゼ活性が昂進し、酵素からの誤った停止によるバックグラウ ンドが減少した。

ＴａｑＤＮＡポリメラーゼはマグネシウムイオンを必要とし、その濃度は一般に 、この発明の配列決定反応で存在するｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰ濃度より高い０ ．８　ｍＭ以上でなければならない。したがって、この発明と共に使用される好 ましいＰＣＲ緩衝液は、ＫＣｆを含まず、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０．０．０ ５％ＮＰ４０および３ｍＭ（またはそれ以上）のＭｇＣｊ？２を含む緩衝液であ る。また、この反応混合物は、プライマー、鋳型、Ｔａｑポリメラーゼ、ｄＮＴ ＰおよびｄｄＮＴＰを含む。

この発明は、特に各ｄＮＴＰの濃度が１０−を上回るとき、多様なヌクレオリド 濃度を許容する。しかし、ｄｄＮＴＰは高価であり、そして有意義な配列情報が 得られるような相当ｄＮＴＰに対する比で、伸長反応中に存在していなければな らない。そのため、いかなるジアロキシ配列決定法でも低濃度のｄＮＴＰが好ま しい。４種類のｄＮＴＰそれぞれの濃度が５−未満で、１種類のｄＮＴＰの濃度 がその他の濃度より低い場合、誤りの停止産物の高いバックグラウンドが現れる が、これは、ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの両者の取込みの誤りによるものである。

したがって、各ｄｄＮＴＰＯ至適温度は、４種類のｄＮＴＰすべて（１０ｍＭ） を含む溶液で実験的に決定されたものである。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは様々 な効率で４種類のｄｄＮＴＰを取込むが、相当するｄＮＴＰよりはるかに非効率 である。鎖伸長の停止産物の至適分布を生じた比は次の通りであった。すなわち 、ｄＧＴＰ　：ｄｄＧＴＰ　＝　１　：　６、ｄＡＴＰ　：　ｄｄＡＴＰ　＝　 １　：　３２、ＴＴＰ　：　ｄｄＴＴＰ＝　１　：４８、およびｄＣＴＰ　：　 ｄｄＣＴＰ　＝　１　：　１６である。

ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ濃度は、１末鎖ＤＮＡ鋳型００２ＰＯＩＯ１゜プライ ７−　Ｑ、　５　ｐｍｏｌ、上記濃度のｄＮＴＰ　：　ｄｄＮＴＰからなる一連 の４種の反応につき工ないし２０単位の範囲にあった。一連の反応でポリメラー ゼ１０単位までの増加にともなって、伸長産物の合成量が増加した。こういった 試薬濃度では、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１０単位は、鋳型−プライマーより酵 素がモルで約２．５倍過剰であることを示していたが、ＴａｑＤＮＡポリメラー ゼ：鋳型−プライマー比が１：１の場合は、廉価であって、有効に作用する。

さらにこの発明は、配列決定反応中に標識ヌクレオリドを取り込む様々な方法を 含む。ある周知の方法では、配列決定（鎖の伸長と停止）反応で標識プライマー が使用される。別の方法では、伸長中のプライマーに標識ヌクレオリドが取り込 まれる。クレノー型のプロトコルでは、プライマーが伸長する間で１種類の標識 ヌクレオリドが他の３種類のより低濃度で存在し、ｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰが 誤って取り込まれるため、そのプロトコルはＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて も有効とはいえないであろう。４種類のｄＮＴＰのそれぞれに対する見かけのに 、値は、１０−ないし２０ＪＭである。ある標識ヌクレオリド、（α−［”Ｓ） チオ）　ｄＡＴＰまたは（α−（”Ｓ〕チオ）　ｄＣＴＰ。

の濃度かに、（すなわち、約０．５ないし１〆）より有意に低い場合、８０〜５ ００−のｄｄＮＴＰは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによって高頻度に不適切に取 り込まれた。１−を越える〔α−”Ｓｌ標識ｄＮＴＰの濃度は実際的ではない。

また、Ｔａｑ酵素は３′から５′方向へのヌクレアーゼ（ブルーフリーディング ）活性を見かけ上欠くので、ｄＮＴＰが誤って取り込まれても、鎖伸長の停止は 起きない。

これらの問題を克服し、Ｔａｑ［）ＮＡポリメラーゼを用いたジデオキシ配列決 定法が極めて効果的であることを理解するために、この発明は２段階法を提供す る。すなわち、それは、最初に、一様に低濃度の４種類のｄＮＴＰ　（そのうち の１種類は標識）を使って低温で標識を行う工程、続いて、ｄｄＮＴＰおよび高 濃度のｄＮＴＰの存在下で配列決定反応を行う工程からなる。

こういった標識法によって、プライマーに隣接する領域で配列データを得るため に、低温および一定ｄＮＴＰ濃度を利用して、敗残基から１００残基以上の長さ の放射活性伸長産物の鎖を作製することが好ましい。各標識ｄＮＴＰの最低濃度 ０．５ｆは、このように−晩放射能にさらして容易に読み取れるシグナルを得る 工程で好ましい。１種類の未標識ｄＮＴＰの濃度を１．０−に高めると、非常に 鮮明なシグナルが得られる。この利点は、どのｄＮＴＰが増加したかとは関係な いようであるが、１種類より多くを増加させる必要はない。

標識ヌクレオリドが読み取り可能なレベルまで取り込まれた後、各ｄＮＴＰの一 定量（≧１０−）およびｄｄＮＴＰの添加によって配列決定反応が開始される。

本方法では、配列決定反応の間での温度上昇および高ｄＮＴＰ濃度によって、至 適プロセッシング能および忠実度が得られる。配列決定反応は広い温度範囲で成 立する。５５℃での反応は小さい速度で進行し、上記の伸長速度と一致するが、 ７０℃と比較した場合、忠実度に顕著な差は認められなかった。これらの条件下 では、極めて均一なバンド強度が得られ、特異的バンドパターンは検出されなか った。さらに、同一の反応条件は、長短両方のゲル泳動に適用する。第１図（Ｃ ）に見られるように、この方法によっては、プライミング部位から１０００ヌク レオリドを越えるＤＮＡ配列情報は得られる。

さらに、この方法は、高ＧＣ含有ＤＮＡの配列を決定し、そしてバンドの収縮を 除くために、塩基類似体７−ジアザ−２′−デオキシグアノシン−５′−トリホ スフェート（ｃ’ｄＧＴＰ＞を用いて高温で行うことができる。ある種のバンド のゲル上での異常な移動によ、って生じるバンドの収縮は、高ＧＣ含有ＤＮＡ鋳 型でしばしば見られ、塩基組成に見かけ上異常の見られないクローン化ＤＮＡ配 列でも生じる。そういった収縮は、配列決定ゲルの不確実または誤った読み取り につながることがある。ｄＧＴＰの代わりにｄＩＴＰまたはｃ’ｄＧＴＰを用い ると、既知の配列決定法における収縮の人為的結果の分離にいくらか効果的であ る。本方法におけるＴａｑポリメラーゼによる上記のヌクレオリドトリホスフェ ート類似体の取込みは、第２図に示すように、Ｍ１３　：　＠ｐ１ｇ鋳型、また はＭ１３にクローン化された高ＧＣ含有２末鎖対称部分を含む挿入片を使って研 究された。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼはｄＧＴＰと基本的に同じ力イネチフスを もってｃ’ｄＧＴＰを取り込み、高反応温とｃ’ｄＧＴＰとの組み合わせは様々 な配列を分離するのに非常に効果的である。

対照的に、イノシン含有反応は、ｄＧＴＰに比べて４倍高レベルのｄＩＴＰを必 要とし、その標識反応は４分間を要し、ｄｌＴＰに対するｄｄＧＴＰの比は、ｄ ＧＴＰに比べて２０倍減少した。ジデオキシイノシン−５−トリホスフェート（ ｄｌＴＰ）は混乱で塩基対合するので、２次構造の領域で高頻度の鎖伸長−停止 反応がｄｌＴＰによって起きる。したがって、ｄｌＴＰはこの発明の目的に好ま しくない。イノシンによって起こされる停止反応は、その他のｄＮＴＰに比較し て読取りの誤り率が高いこと、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼが３′から５′ 方向へヌクレアーゼ活性（誤って取り込まれた塩基を修復するために必要）を欠 くという事実によっている。ｄｌＴＰによって起こされる停止反応は、反応が７ ０℃で始まる場合は極めて減少する。

ＰＣＲ法の１矢以来、ＰＣＲ産物の配列を直接決定する方法の開発がめられてい る。本発明によって得られたＤＮＡ配列決定の顕著な結果は、ＰＣＲ法と本発明 の方法が適合したものであって、本発明をＰＣＲ産物を直接解析する理想的な方 法とした（第３図参照）。この方法によってクローン化されたＰＣＲ産物の配列 決定は分析が示唆するところによれば、５０〜２００−の各ｄＮＴＰを使ったＰ ＣＨの忠実度は著しく（３５回のＰＣＲ反応を経てＰＣＲ産物をクローン化した のちに、配列決定された４０００ヌクレオリドのうち取込みの誤りは約１つ）、 ＰＣＲ法にその他のＤＮＡポリメラーゼを用いて認められた値に匹敵する。さら に、ＰＣＲ反応で生じるほとんどの取込みの誤りは鎮の伸長停止を生させ、欠陥 分子の増幅を防いでいる。

本方法は、最初に増幅させてから、任意の挿入片から１末鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｓｓ ＤＮＡ）を作製ために予定された濃度でプライマーを用いた非対照ＰＣＲ反応で 使用するとき、特に好ましい。

非対照ＰＣＲ法と呼ばれる方法によって１末鎖ＤＮＡが生じる事は、ジレンシュ テンおよびエールリッヒ０９８８．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５　：　７６５２−７６５６］によ って記載されている。この発明では、ＤＮＡをＭ　１３／　ｐ［Ｊｃ−１ａｃＺ ポリリンカーにクローン化して非対照ＰＣＲ法で５ｓＤＮＡを作製する態様を挙 げた。以下の実施例で記載するように、１方のオリゴヌクレオチドブライマーを その他方より１００倍添加して非対照ＰＣＲ法を行った。その結果、２つのＰＣ Ｒプライマーの一方は、初期の加熱反応の間で欠落した。この反応で他方のプラ イマーから１本鎖の産物が生じた。

この方法による非対照ＰＣＲ法で生じた鋳型の配列決定は、産物の精製を必要と しない。１本鎖産物の推定回収量１−に基づくと、最初に添加された２　ｎｍｏ ｌの各ｄＮＴＰの１／２ないし１／３が、このＰＣＲ反応によって消費される。

さらに、ＰＣＲ反応中でのｄＮＴＰの安定性は、６０回の反応の後に約５０％で あると決定された。したがって、この方法で使用される停止混合物は、配列決定 反応での最終濃度的１０−以上にｄＮＴＰを補充し、上記で定めたように適当な 濃度で特定のｄｄＮＴＰを供給し、そして追加のＤＮＡポリメラーゼ加えるよう に配合された［：”Ｐ）標識配列決定プライマーを、ＰＣＲ産物の精製段階を除 き、配列決定法を１工程の伸長−停止反応に単純化するために使用することがで きるまた、蛍光標識した１種類または多種類の配列決定プライマーをこの方法に 使用することもできようし、その産物を自動ＤＮＡ配列決定装置で解析すること ができる。

非対照ＰＣＲ法で生じた鋳型または鋳型としてＭ１３　：　ｍｐｌＢにクローン 化された同じＤＮＡ挿入片を用いて、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによって得られ たＤＮＡ配列を比較した。得られたはしご型の配列は、Ｔａｑで生じた配列のシ グナルの特徴ともいえる鮮明さおよび均一性を表していた。ＰＣＲ熱反応の間で 生じることがある酵素またはｄＮＴＰのいかなる分解も、鮮明な配列のデータに 影響を与えることはないようである。３５回のＰＣＲ反応での１木調ＤＮＡ鋳型 の合成は、初期のＤＮＡ濃度とはおおよそ無関係であった。非対照ＰＣＲ法は、 ０．１ないし１１００ｎのＭ１３　：　ｍｐｌＯｓｓＤＮＡまたは水１００ｄに 直接入れられたＭ１３ファージプラークを使って行われ、この発明の方法によっ て配列が決定された。

この発明は、Ｍ１３／　ｐＬＩｃベクターにクローン化された挿入片の配列決定 によって以下に詳述されるが、この方法は、λファージやその他のいかなるクロ ーニングベクターの直接配列決定にも応用できる。非対照ＰＣＲ法における５ｓ ＤＮＡの収率の変化が、様々なプライマ一対および比について認められる場合も あり、特定のプライマ一対および鋳型核酸に関する最適の結果が得られるように 各増幅系の反応条件を調整する必要があろう。また、ＰＣＲ法でのｄＮＴＰ濃度 も、様々なサイズの産物および／または増幅効率に応じて変える必要があろう。

さらに、選定したゲルの切片からの溶出物を電気泳動で分離して再増幅すること によって、ゲノムＤＮＡから得られたＰＣＲ産物の均一性を増加させた研究者も いる。この発明の配列決定法は、変形ＰＣＲ法に容易に応用できる。方法のいか んに拘らずＤＮＡから得られたＰＣＲ産物を直接配列決定することによって、コ ンセンサス配列が生じる。なお、分子の大部分の一定位置で生じるこれらの塩基 は、オートラジオグラフィー上で最も鮮明な部分であろうし、いかなる低頻度の エラーも検出されないであろう。この発明によるそういったＰ’ＣＲ法の実施例 では、得られる配列データは、増幅産物と同様に鮮明であろう。不均一産物がは しご型の組み合わせ像を呈するのは当然であろう。

ＴａｑＤＮＡポリメラーゼはＰＣＲ法に極めて有用であるので、この発明は、Ｐ ＣＲ法による鋳型の調製と直接配列決定とを連結する。この利点は、この発明の 方法は匹敵する配列決定反応性能の両者を自動化することが今や可能でである点 において意義がある。

当該分野の技術者には、ＤＮＡ配列情報の取得が望まれる様々な状況でこの方法 を利用できることは理解にかたくない。

以下の実施例は、この発明を詳述するために挙げられるものであって、この請求 の範囲を限定するものではない。実施例４はこの発明の好ましい具体例を示すも のである。

以下の方法で使用される材料は、次のように入手した。

Ｔ４感染大腸菌細胞からのポリスクレオチドキナーゼは、ファルマシア社から購 入した。１サブユニツト酵素のＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・アクア ティカＹＴ−１株（ＡＣＴｔＩ２５４３）から精製した。最近では、ＴａｑＤＮ Ａポリメラーゼは、パーキンエルマー・セツスインスツメンツ社より購入した。

このポリメラーゼ（５〜８０単位／ｍｊ’）は、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｉ ！　（ｐ）ｔ８．０　）、１００ｍＭ　ＫＣｌ、０．１　ｍＭ　ＢＤＴＡ　、　 １　ｍＭ　ＤＴＴ、オートクレーブした２０に／−ゲラチン、０．５％ＮＰ４０ ．０．５％Ｔｗｅｅｎ２０および５０％グリセリン中で一２０℃にて保存した。

この酵素は、約２００、０００単位／■の比活性をもつが、その１単位は、サケ の活性化精子ＤＮＡを用いて３０分間で合成された産物１０ｎｍｏｌに相当する 。２′−デオキシおよび２’、３’−デオキシヌクレオリド−５′−トリホスフ ェ−）　（ｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰ）は、ファルマシア社より購入した。７− ジアザ−２′−デオキシグアニジン−５′−トリホスフェ−）　（ｃ’ｄＧＴＰ ）はベーリングマンハイム社より購入した。（α−〔３ＳＳ〕チオ）　ｄＡＴＰ （６５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はアマジャム社から、Ｔ　−［”Ｐｌ　ｄＡＴＰはニ ューイングランド・ヌクレアー社から購入した。配列決定のためのオリゴヌクレ オチドプライマーは、シアノエチルホスホラミヂドの化学反応によってバイオサ ーチ８６００　ＤＮＡ合成装置で合成した。オリゴヌクレオチドプライマーには 、ｒ−［３２ＰｌｄＡＴＰ、？６よびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５′末端 標識（３Ｘ　１０’ｃｐｍ／　ｐｍｏｌ）を行った（マキシムお′よびギルバー ト、１９８０、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｎｚ、、　６５　：　４９９−５６０）。

１本鎖のＭ１３　ＤＮＡ鋳型は、シンダーら［１９８２，Ｇｅｎｅ、　１９：　 １−１０〕の記載するとおりに調製した。

１本鎖のアニーリングおよび標識反応は、４種類の配列反応ごとに１．５ｒｄの 微小遠心管（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で行った。このアニーリング混合物には、 ５ＸＴａｑ配列決定用緩衝液（室温で、Ｔ　Ｓ　Ｂ、　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２お よび１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　；　ｐＨ８−０）中のオリゴヌクレオチド プライマー（（１１ｐｎ＋ｏｌ／〆）５ｐ１、および鋳型ＤＮＡ　（０，０５な いし０．５　ｐｏ＋ｏｉ）　５　ｘｌが含まれていた。

この１０ｄのアニーリング反応後に、標識混合物（ｐＨ８，０の１０ｍＭ　Ｔｒ ｉｓ−ＨＣｊ！に溶けた１０声ｄＧＴＰ　、　５ａＮ　ｄＣＴＰおよび５岸ＴＴ Ｐ）２ｔｄ、（ａ　−［：”Ｓ〕チオ）　ｄＡＴＰ　（ｐＨ＆　０の１０〕Ｍ　 Ｔｒｉｓ−Ｈ（１？で３倍希釈したのちの５ｓＭ）　２ｄ、　ＴａｑＤＮＡポリ メラーゼ（希釈緩衝液−ｐＨ４８，０の１０．ａｔｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２　、 ０．５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＮＰ４０−中で５単位／ｄ）２〆ならび にＨ２Ｏ４〆を加えた。標識反応液は、３７℃で１分間のインキュベーションし た。５′標識プライマーとの配列決定反応では、（α−［”３３チオ）　ｄＮＴ Ｐ、標識混合物および標識反応液の添加は省略し、容量はｐＨ８，０の１０７！ ８　Ｔｒ　１ｓ−）１ｃ　Ｅで調節した。

４種の別個の配列決定（伸長−停止）反応は、各標識鋳型に対して９６穴マイク ロタイタープレート　（ファルコン＄３９１１）中で行った。その際、以下のよ うな濃縮デオキシ／ジデオキシ混合物を使用した、−「Ｃ混合物」　（各ｄＮＴ Ｐ　３０Ｊ１８．０．２５５Ｍ　ｄｄＧＴＰおよび１．１２ｍＭ　ＭｇＣ１２） 、「Ａ混合物」　（各ｄＮＴＰ　３０−１１．　ＯｍＭ　ｄｄＡＴＰおよび１． １２ｍＭ　ＭｇＣｊ！　２）、「Ｔ混合物」　（各ｄＮＴＰ３０Ｊ＝Ｍ、１．５ 　ｍＭ　ｄｄＴＴＰおよび１．６２ｍＭ　ＭｇＣｊ！　、）ならびに「Ｃ混合物 」（各ｄＮＴＰ　３０ＪＩＭ、　Ｏ１５ｍＭ　ｄｄＣＴＰおよび０．６２ｍＭ　 ＭｇＣｊ２２）。

この標識反応液から４〆のアリコートを、２ｉｔ１の適当な停止混合物を含む穴 に室温で加えた。反応液には１０ｘｌの鉱油を積層して蒸発を防ぎ、工ないし３ 分間７０℃でインキュベーションした。反応は、０．１％ブロモフェノールブル ー、０．１％キシレンシアツールおよびＢＤＴＡ　（ｐｆ１７．０　）を含む９ ５％脱イオンホルムアミド２ｐ１を添加して停止させた。ビギンら［Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｌｌ５Ａ、　ｇｏ：　３９６３−３９６５　］が 記載するように、試料は８０℃で３分間加熱してから、Ｊないし２Ｉｔｌを緩衝 液勾配配列決定ゲルに充填した。結果を第１表に示す。

この実施例では、この発明の配列決定法によってＤＮＡがどのように生じるかに ついて記載する。非対称ＰＣＲ法の鋳型は、ポリリンカーのＥｃｏＲＩ部位で４ ００塩基挿入片を含む１本鎖のＭ１３　：　ｍｐｌＯ口ＮＡであった。オリゴヌ クレオチド（２０塩基対）を、共通のｒ２０Ｊ　＃よび「逆」配列プライマーの 結合部位のすぐ外側でこのポリリンカーに隣接するように合成した。そして、こ れらのプライマーはそれぞれ、設計したＲＧＯ５（５’　ＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣ ＣＡＧＴＣＡＣＦＡＣ３’　）およびＲＧＯ２（５’　ＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧ ＴＧＡＧＣＧＧＡＴ３　’　）であった。各ＰＣＲ反応物には、総量１００Ｉｔ ！中に、１プライマー２０ｐｍｏｌおよび他のプライマー、　２　ｐｍｏｌ、各 ｄＮＴＰ　２０ｄ’ｌ、ＤＮＡ　１ないし１０ｎｇ、　Ｉ　Ｘ修飾ＰＣＲ緩衝液 （ｐＨ８，０の１０ｊ１Ｍ　Ｔｒ　１ｓ−ＨＣ１２，３０ｚ　Ｍｇ（Ｊ！　２＃ よびそれぞれ０．０５％のＴｗｅｅｎ２０＃よびＮＰ４０）、ならびにＴａｑＤ ＮＡポリメラーゼ２．５単位が含まれていた。

反応物は、パーキンエルマー・セツスサーマルサイクラーを使って、０．５献微 小遠心管中で反応させた。プログラム化した温度プロフィルは９３℃で３０分間 の変性にともなって生じ、プライマーのアニーリングには５０℃で１分間冷却し 、１．５分間で７２℃の伸長温度まで加熱した。このプロフィルを３５回繰り返 し、最後の７２℃のインキュベーションは１０分間に延長した。

ＰＣＲ反応物のアリコートをジデオキシ鎖伸長−停止の配列反応に直接取り込ま せた。４種類の、塩基特異的鎖伸長−停止配列決定混合物を、Ｉ×修飾ＰＣＲ緩 衝液および２０ＪＩＭの各ｄＮＴＰ中で調製した。各混合物は、２５０ｊ＝Ｍ　 ｄｄＧＴＰ、１．２８ｍＭｄｄＡＴＰ　、　１．９２ｍＭ　ｄｄＴＴＰ、または ６４０ｍＭ　ｄｄＣＴＰを含むものであった。配列決定の対象となる各ＰＣＲ産 物に対して、９６穴マイクロタイタープレートの４つの穴に「Ｇ」、「Ａ」、［ Ｔまたはｒ（、＋とラベルし、各穴に適当な配列決定の停止混合物２．５１１１ を添加した。各ＰＣＲ反応物のアリコート２０Ｉｔ１を１．５１１１の微小遠心 管に移し、調製したてのＴａｑポリメラーゼ（４８単位／〆）０．５ｍ、１メの 適当な〔３２Ｐ〕標識Ｍ１３の順方向または逆方向配列決定プライマー（５’　 ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’、および５’　ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧ ＡＣＣＡＴＧ３　’　、それぞれｉ、　２　ｐｍｏｌ／　ｍｌ）ならびにＩＸ修 飾ＰＣＲ緩衝液１０．５ｄとともに混合した。

ＰＣＲ／プライマー調製物は、停止混合物を含む穴で７．５４のアリコート中に 直ちに分散し、ピペッタ−で混合させた。

試料には１０ｉｄの鉱油を積層し、そのプレートを回転させて反応混合物を集め 、鉱油を均一層の穴に分散させた。反応物を７０℃で２分間インキュベーション し、ｐＨ８，０の２０ｍＭ　ＥＤＴＡ　。

ならびに各０．０５％のキシレンシアツールおよびブロモフェノールブルーとと もに９１％のホルムアミド４〆を添加して反応を停止させた。これら反応物５ｄ を７５℃で５分間加熱し、その１ないし２ｊ１１を緩衝液勾配配列決定ゲルに充 填した。結果を第３図に示す。

Ａ、鋳型とプライマーとのアニーリング１．５ｍｌの微小遠心管中に、鋳型ＤＮ Ａ　（０，５ｐｍｏｌ）　１．５ｍｌ。

プライマー（０，５ｐｍｏｌ）　１　ｍｌおよび５メ配列決定緩衝液４１ｔ１を 集める。総量は１０〆とすべきであって、ＤＮＡの容量を少なくすれば、水の量 を変えることになる。この遠心管を７０℃で３分間、続いて４２℃で１０分間加 熱する。

Ｂ、標識反応 ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを酵素希釈緩衝液で１＝１０に希釈して、５Ｕ／−と して氷上に保つ。アニーリングした鋳型／プライマーに以下のものを添加する。

標識混合物（ｄＧＴＰまたはｃ７ｄＧＴＰ）２ｄ、（α−Ｃ”３３チオ）　ｄＡ ＴＰ　（＞　６００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰＨ８，５の１０ａＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ ！で１０ｄｉｎに希釈）ＩｌｌおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ希釈液（５Ｕ／ ｍｌ１）　２ｍ。短時間撹拌して、微小遠心機でこの管を遠心して試料を集め、 ３７℃で２分間インキュベーションする。

ｃ；’ｄＧＴＰを配列決定反応で用いるならば、ｃ’ｄＧＴＰ標識混合物を使用 すべきである。ゲルに収縮が生じるような配列を分離するには、ｃ’ｄＧＴＰの 使用を薦める。停止混合物のアリコートを、標識反応の開始に先立って、マイク ロタイタープレートに分けるべきである。標識プライマーを配列決定に使用する ならば、（α−［”Ｓｌチオ）　ｄＡＴＰ、標識混合物、および標識反応のイン キュベーションは省略し、ｐｔ１８．５のＩＯＪＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで容量 を２０４とする。

Ｃ０停止反応 配列決定の停止反応は、マイクロタイタープレート（ファルコン：１Ｅ３９１１ ）中でＧ、Ａ、ＴおよびＣとラベルした１鋳型／プライマーに対して４穴を使っ て行うこともできる。Ｇとラベルした穴にｄｄＧＴＰ停止混合物２Ｉｔｌを入れ る。同様に、２〆のｄｄＡＴＰ、　ｄｄＴＴＰ＃よびｄｄＣＴＰ停止混合物を適 切なラベルをほどこした穴に入れる。標識反応にｃ’ｄＧＴＰを用いるならば、 ｃ’ｄＧＴＰ停止混合物を使用すべきである。

標識反応が終了すると同時に、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣとラベルした４つの穴のそれ ぞれにアリコー）４ｄを移す。穴の側面にこれらを滴下し、停止混合物とともに 混合して沈降させる。すべての穴をすべての反応物で充填したならば、マイクロ タイタープレートを短時間回転させ、標識反応物と停止混合物との混合が完了し たことを確認する。

穴の底が接触するような断熱材を使って、このマイクロタイタープレートを７０ ℃で２分間インキュベーションする。この時間で、長さ１５００ｂｐを上回る伸 長産物が得られる。インキュベーション時間を長くすると、過剰の蒸発が生じる 。

Ｄ８反応の終止 断熱材から反応物を除き、室温におく。反応終止溶液２Ｉを各穴の側面に注ぐ。

短い時間マイツクロタイタ−プレートを回転させ、終止溶液を混合する。試料は ７日間−２０℃で保存可能であって、分解は最低限度に止まる。

Ｅ、試薬 Ｔａｑ［］ＮＡポリメラーゼ配列決定緩衝液（５倍濃度）は、Ｐ）１８．５の５ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）（Ｃ１および３０ｍＭ　ＭｇＣｊｌ！　２である。

酵素希釈緩衝液は、ｐ）１８．０の１ｈ？４　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ、　０．５％Ｔ ｗｅｅｎ２０および０．５％ＮＰ４０である。

標識混合物（ｃ’ｄＧＴＰ）は、１０＃Ｍ　ｃ’ｄＧＴＰ　、　５Ｊ＝Ｍ　ｄＣ ＴＰおよび５オｄＴＴＰである。

標識混合物（ｄＧＴＰ）は、１０＃　ｄＧＴＰ　、　５Ｍ　ｄＣＴＰおよび５声 ｄＴＴＰである。

ｄｄＧ停止混合物（ｃ７ｄＧＴＰに対して）は、６０ｍＭ　ｃ’ｄＧＴＰ、　３ ０ｍＭの各ｄＡＴＰ、　ＴＴＰおよびｄＣＴＰならびに１８０ＪＩＭ　ｄｄＧＴ Ｐである。

ｄｄＧ停止混合物（ｄＧＴＰに対して）は、３０−の各ｄＮＴＰおよび１８０７ １８　ｄｄＧＴＰである。

ｄｄＡ停止混合物（ｃ’ｄＧＴＰに対して）は、６０ｍＭ　ｃ’ｄＧＴＰ、　３ ０ＩｎＭの各ｄＡＴＰ、　ＴＴＰおよびｄＣＴＰならびにＩＭ　ｄｄＡＴＰであ る。

ｄｄＡ停止混合物（ｄＧＴＰに対して）は、３０−の各ｄＮＴＰおよび１声ｄｄ ＡＴＰである。

ｄｄＴ停止混合物（ｃ’ｄＧＴＰに対して）は、６０ｍＭ　ｃ’ｄＧＴＰ、　３ ０ｍＭの各ｄＡＴＰ、　ＴＴＰおよびｄＣＴＰならびに１．５　＄　ｄｄＴＴＰ である。

ｄｄＴ停止混合物（ｄＧＴＰに対して）は、３０＃Ｍの各ｄＮＴＰおよび１．５ ａＭ　ｄｄＴＴＰである。

ｄｄｅ停止混合物（ｃ’ｄＧＴＰに対して）は、６０ｍＭ　ｃ’ｄＧＴＰ、　３ ０ｍＭ（７）各ｄＡＴＰ、　ＴＴＰおよびｄＣＴＰならびＧ：　５００＄　ｄｄ ｃＴＰテある。

ｄｄｅ停止混合物（ｄＧＴＰに対して）は、３０−の各ｄＮＴＰおよび５ＱＯｊ ＝Ｍ　ｄｄＣＴＰである。

ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、５０Ｕ／ｄの濃度で保存する。

終止溶液は、９５％ホルムアミド、２Ｏ−ＲＤＴＡ　、　０．１％ブロモフェノ ールブルーおよび０゜１％キシレンシアツールである。

上記のこの発明の実施例に関する他の変形例は、分子生物学、医学的診断技術、 生化学および関連分野で通常の知識を有する者には自明であって、当然この発明 の請求の範囲に入る。

ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ・３Ａ　ＦＩＧ、　３Ｂ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０４０９３ 平成１年特許願第５１０１７１号 ２、　発明の名称 サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のＤＮＡポ リメラーゼを用いたＤＮＡ配列配列性定法３正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　シタス　コーポレイション ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面「特許出願人の代表者」の 欄 （２）明細書及び請求の範囲の翻訳文 （３）委任状 ７、補正の内容 （ＩＸ３）別紙の通り （２）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の５第１項の規定による書面　１　弘 （２）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各　１　シ：（３）委任状及びその翻訳 文　各　１ｉ国際調査報告 国際調査報告 ＵＳ　８９０４０９３ ＳＡ　３１３０１

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．ジデオキシヌクレオチドー５′一トリホスフェート鎖伸長停止反応によって 核酸セグメントのヌクレオチド配列を決定する方法であって、該配列が、サーマ ス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラー ゼ、４種類のデオキシリポヌクレオチドー５′一トリホスフェート（ｄＮＴＰ） およびジデオキシヌクレオチドー５′一トリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）の存在 下で鋳型依存的にオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させることによって決定 されるヌクレオチド配列決定法。
2. ２．上記のプライマーが標識されている、請求項１記載の決定法。
3. ３．上記の４種類のｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰが標識されている、請求項１記載 の決定法。
4. ４．上記の４種類のデオキシリポヌクレオチドー５′一トリホスフェートが、ｄ ＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびＴＴＰである、請求項１記載の決定法。
5. ５．上記の４種類のデオキシリポヌクレオチドー５′一トリホスフェートが、ｄ ＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｃ７ｄＧＴＰおよびＴＴＰである、請求項１記載の決定法。
6. ６．上記の４種類のデオキシリポヌクレオチドー５′一トリホスフェートが、ｄ ＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＩＴＰおよびＴＴＰである、請求項１記載の決定法。
7. ７．上記の核酸セグメントが遺伝子増幅法によって生じたものである、請求項１ 記載の決定法。
8. ８．上記の核酸セグメントが非対称遺伝子増幅法によって生じたものである、請 求項１記載の決定法。
9. ９．反応混合物中にＫＣｌは存在しない、請求項１記載の決定法。
10. １０．上記のＤＮＡポリメラーゼが核酸セグメントの２．５倍モル過剰に存在す る、請求項１記載の決定法。
11. １１．上記の伸長反応が、最初に、それぞれの濃度が１ＲＭ未満である３種類の 非標識ｄＮＴＰおよび１種類の標識ｄＮＴＰの存在下で低温で行われ、続いて、 高濃度の非標識ｄＮＴＰ中で高温で行われる、請求項３記載の決定法。
12. １２．ｃ７ｄＧＴＰがプライマーの伸長中にも存在する、請求項４記載の決定法 。
13. １３．各ｄＮＴＰが５ＲＭないし３０ＲＭの濃度で存在する、請求項４記載の決 定法。
14. １４．上記の低温伸長反応の間で標識ｄＮＴＰの濃度が０．５ＲＭであって、各 非標識ｄＮＴＰの濃度が１．０ＲＭである、請求項１１記載の決定法。
15. １５．ｄＡＴＰ：ｄｄＡＴＰの比が１：３２である、請求項４記載の決定法。
16. １６．ｄＣＴＰ：ｄｄＣＴＰの比が１：１６である、請求項４記載の決定法。
17. １７．ｄＧＴＰ：ｄｄＧＴＰの比が１：６である、請求項４記載の決定法。
18. １８．ＴＴＴ：ｄｄＴＴＰの比が１：４８である、請求項４記載の決定法。
19. １９．各ｄＮＴＰの濃度が１０ＲＭである、請求項４記載の決定法。