JPH04505210A - 均質イムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 芳ｌ鼾デ刑ゴ」ｌアッセ瓜 本発明は、液体試験サンプルにおけるリガンドの量を測定するための均質イムノ アッセイ及びそのようなアッセイを実施するだめのキットに関する。

この明細書において、用語りガントとは、いづれがの物質（たとえば抗原、抗体 ）を含むように取られるべきであり、これに対して抗−リガント（たとえば抗体 及び抗−抗体）が生成され得、そして従って、その範囲内でハブテンを包含し、 ここでそれは抗体を生成するために免疫原性にされている。

イムノアッセイ技法は、アッセイされる抗原とイムノアッセイ工程の一部として 添加される抗体との間での複合体の形成に依存する。抗原：抗体複合体形成の量 を検出できる手段が提供される。分析学的に同定できるようにするためにラベル された抗体を使用するイムノアッセイのいくつかの既知方法が存在する。゛サン ドウィッチ”又は゛２一部位”技法は、抗原と２つの抗体試薬との間での複合体 の形成を包含する。

液体サンプル中の抗原と２種の抗体試薬との間での複合体形成を検出する便利な 方法は、複合体が容易に単離され得るように、１つのラベルされた抗体試薬及び 固相支持体に結合されるラベルされていない試薬を供給することである。放射性 活性ラベルが使用される場合、この技法はイムノラジオメトリックアッセイ　（ ＩＲＭＡ）として知られる。

二のタイプのアッセイに間する１つの困難性は、十分に純粋なラベルされた抗体 の産生である。これは行なわれ得るが、それは困難な工程であり、そして従って 比較的費用かががる。

最近、この問題はモノクローナル抗体の入手可能性により減じられる。２種のモ ノクローナル抗体試薬、ラベルされた可溶性モノクローナル抗体及び水不溶性固 相に結合されるモノクローナル抗体の使用を包含するサンドウィッチタイプのイ ムノアッセイが、公開されたヨーロッパ特許出願Ｎ’　００４８３５７に記載さ れている。

有意なインキュベーション期間が、反応が完結する（可能なかぎり）ことを確保 するために通常必要とされることが上記技法の特徴である。これは、溶液中の抗 原が固相に結合される抗体と反応することを必要とされる事実に少なくとも一部 よるものである。

これらの問題を回避するために、均質イムノアッセイが開発されている。しかし ながら、それらの使用は、薬物、ホルモン及び血漿タンパク質の測定に制限され る。ＥＭＩＴ（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｔｓｕｎ、４７：８４６．１９７２）として知ら れている均質イムノアッセイは、ステロイドホルモンのような小さな分子の測定 のために都合良く適用されて来た。改良されたＥＭＩＴにおいて、トレーサーと して使用される酵素の活性は、接合体酵素−ハブテン（Ｅ　−Ｌ　）が抗体（Ａ Ｂ）に結合される場合、凍しられる。これは、ＡＢの存在下で酵素の活性部位に 対する基質の減じられた親和性、立体的妨害又は酵素の配座的変性のいづれかに よると思われる。追加のタイプのＥＭＩＴは、接合されたハブテンにより酵素ト レーサーの阻害に基づく。トレーサーは、ハブテン（Ｌ）に対する抗体（ＡＢ） が接合体ハブテン−酵素（Ｅ−Ｌ）を結合する場合、その活性を再び得る。この 方法は、ＩｇＧのような大きな抗原分子（Ａｎａｌ、Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、　１０ ２＋　１６７、１９８０）のために開発されたが、しかしその報告された感度は 低いように思われた。蛍光励起移行イムノアッセイ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｉ、 ２５１：４１７２．１９７６）は、２種の蛍光分子（１つは抗体上及び他は抗原 上に存在する）間のエネルギーの移行に基づく。再び、遊離分析物は、抗体とラ ベルされた抗原との間での複合体形成を阻止する。

酵素チャネリング法（ＥＣＩＡ）　（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｅｈｅｍ、１０５６：２ ２３．１９７９）（Ａｐｐｌ、旧ｏｃｈｅａ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．６．５３ 〜６４．１９８１）は、第１酵素反応の生成物が第２酵素反応の基質であるよう に、抗体及び２種の異なった酵素によりラベルされた抗原を使用する。全体の反 応速度は、２種の酵素が、溶液に別々に存在する代わりに、同時−同定される場 合、ひじょうに早められる。抗原−ラベルされた蛍光保護アッセイ（ＣＩｉｎ、 Ｃｈｅｍ、２５：１０７７、１９７９）のような他の技法もまた、注目される。

二特異的モノクローナル抗体（ＢＳＭＡＲ）は、免疫グロブリン分子上の結合部 位が２種の別々な抗原決定基と反応する抗体である。従って、ＢＳＭＡＲは、異 なった抗体と同時に相互作用することができる。

二特異的モノクローナル抗体は、２つのモノクローナル抗体に由来するｍ個フラ グメントの化学的再会合により生成される。他の調製方法は、ヘテロニ官能価ク ロス−リンカ−を用いての異なった特異性の完全なモノクローナル抗体の共有結 合を包含する。二特異的モノクローナル抗体の第３の調製方法（細胞融合）は、 Ｎａｔｕｎｅ　３０５．５３７〜５４０，１９８３：Ｈｕｍａｎ　Ｉｉ＋ｎ＋− ｕｎｏｌ、１２＝２１３．１９８５；５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：８１，１９８１ に記載されている。

そのような抗体は、固体酵素イムノアッセイ及び組織化学に利用され、それらの 方法の抗体−酵素接合体にとって代わる。

均質イムノアッセイにおける二特異的抗体の使用もまた、提案されている（Ｂｉ ｏｔｅｃｈ、Ａｐｐｌ＋ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ＴｅｃｈｎｏｍｉｃｌＬａ ｎｃａ−ｓｔｅｒ、Ｕ、に、、４０１〜４０９ページ、１９８６）。

ハイブリッド抗体の結合部位の１つが二価（又は多価）の分析物（リガンド）の エピトープに結合する場合（他の部位は二価（又は多価）の酵素のエピトープに 結合する）、分析物の存在は、環状複合体の形成を可能にすることによって、酵 素への抗体の結合を増強することができる。

環状複合体の形成を通しての抗体の結合効率のそのような上昇は、いくつかの著 者（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋　９：Ｌ１９８４）により報告されている 。

本発明の１つの目的は、広範囲のりガントに適用できる均質イムノアッセイ法を 提供することである。

本発明の第１の観点によれば、液体試験サンプルにおけるリガンドの均質イムノ アッセイ法が提供され、ここで前記方法は： ａ）（１）液体試験サンプル； （１１）アッセイ下のリガンドがたった１つのエピトープを有する場合、前記リ ガンドのエピトープと異なる少なくとも１つのエピトープを有するいづれかのモ ノ−又はポリ−エピトープ分子と前記リガンドとの共有接合体＝（２）少なくと も二量体形で存在するが又は少なくとも２種の異なったエピトープを有する不安 定酵素；（３）第１の二特異的モノクローナル抗体、ここで１つのパラトープは 酵素上の第１エピトープへの結合を通して酵素の活性を保護することができ、そ して残るバラトープはアッセイ下でリガンド上での第１エピトープと結合するこ とができ；及び （４）第２の二特異的モノクローナル抗体、ここで（ｉ）前記酵素が少なくとも 二量体形で存在する場合、第１パラトープは前記第１の二特異的モノクローナル 抗体の第１パラトープと機能的に同一であり、そして同様に酵素に結合すること ができ、又は（ｉｉ）前記酵素が少なくとも２種の異なったエピトープを有する 場合、第１パラトープは酵素上の第２エピトープに結合することができ（酵素の 活性を保護するためには必ずしも必要でない）、そして第２パラトープは、アッ セイ下でリガンド上の第２の明確なエピトープに又は（前記リガンドがたった１ つのエピトープを有する場合）前記共有接合体のエピトープに結合することがで き； から成る混合物をインキュベートし；それによって四次免疫複合体を形成し； （ｂ）インキュベーションの後、前記混合物を含む液相をそのような四次免疫複 合体に存在しないいづれかの酵素が不活性化される条件下にゆだね；そして （ｃ）四次免疫複合体の一部として結合される検出可能な酵素（存在するなら） の量を測定する〔ここで前記測定は試験サンプルにおけるリガンド（存在するな ら）の量に関係する〕ことを含んで成る。

本明細書で使用される用語“″不安定酵素”とは、段階ｂ）で使用される適切な 条件により不活性化され得るいづれかの酵素を表わす。

本発明の方法は、酵素の活性を保護するための抗体の能力に基づき、すなわち抗 体の効果は、段階ｂ）で使用される条件の結果としてその活性を失うことから酵 素を防ぐことであれる。二特異的抗体、不安定酵素及び測定されるべき分析物か ら成る四次（環状）複合体の形成を通して、変性の後に存在する酵素活性の量を サンプル中のりガントの量に相互関係づけることが可能である。この原理は、形 成される環状複合体がひじょうに安定しているので可能である。四次複合体にお ける酵素分子は変性に対して二特異的抗体の結合により保護されるが、四次免疫 複合体として存在しない酵素分子はこの処理により変性される。さらに、非環状 抗体−酵素複合体は、変性条件下で解離し、そして酵素活性の損失をもたらす傾 向がある。酵素に対する抗体の親和性が比較的低い場合、この効果は高められる 。従って、酵素に対する一定の親和性を有するモノクローナル抗体の選択に基づ いて、いづれかのバックグラウンド活性を最少にすることが可能である。四次複 合体は、場合によっては、複数の二特異的モノクローナル抗体を含むことができ る。この場合、複合体に存在する個々の抗体は、リガンド（又はりガント−分子 接合体）及び酵素の両者に結合される。

′“明確なエピトープ”とは、機械的に同一のエピトープであり（しかし、リガ ンド、クガンドー分子接合体又は酵素上の異なった部位で）又はエピトープは機 械的に異なることができることが理解されるであろう。

リガンドがたった１つのエピトープを有する場合、リガンド及びいづれかモノ− 又はポリ−エピトープ分子の適切な接合体は従来の態様で容易に調製され得る。

本発明の好ましい態様によれば、不安定酵素は熱不安定酵素である。熱不安定酵 素は、活性が温度により影響される酵素である。いづれか熱不安定性遊離酵素の 不活性化は、加熱により行なわれる。

従って、たとえば、特に適切なタイプの熱不安定酵素は、酵素不活性化をもたら す６２°Ｃで熱変性を受けるβ−ガラクトシダーゼ酵素である。６２°Ｃでの熱 変性からβ−ガラクトシダーゼ酵素を保護する適切なモノクローナル抗体は、Ｅ ｕｒ、Ｊ、Ｉｍｉｕ−ｎｏｌｏｇ、１９７８，９：６８８〜６９２及びＰ、Ｎ、 Ａ、Ｓ、、ＵＳＡ　７８：２４７８，１９８１に記載されている。

本発明のアッセイをいかに校正するかは当業者に容易に明るためのイムノアッセ イキットを提供する。

本発明の追加の観点によれば、上記のような方法を実施することにおいて使用す るためのキットが提供され、ここで前記キットは： （１）不安定酵素； （ｉｉ）第１の工時異的モノクローナル抗体；及び（田）第２の工時異的モノク ローナル抗体を含んで成る。

そのキットは、場合によっては、リガンドとは異なる少なくとも１つのエピトー プを有するいづれかモノ−又はポリ−エピトープ分子とりガントとの共有接合体 をさらに含んで成る。

場合によっては、上記キットは、校正された対照溶液をさらに含んで成る。

本発明の方法及びキットの主要な利点は、結合された及び遊離するラヘル試薬の 分離が排除されることである。さらに、それは多価リガンドへの均質イムノアッ セイの拡張を可能にする。

ＩＪガントは抗体であることができ、そしてこの場合、第１及び第２の工時異的 モノクローナル抗体は抗−抗体から出発して３用型される。

リガンドが抗体に特異的に結合することができる物質、たとえば抗原である場合 、その工時異的モノクローナル抗体は典型的な工時異的干、ツク１コーナル抗体 であり、すなわちモノクローナル抗体から出発して調製され得る。

本発明の方法はひじょうに広い適用性を有し、そして特に次のもののアッセイに 使用され得る：ホルモン、たとえばペプチドホルモン（たとえば甲状腺刺激ホル モン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈ ｃＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）　、インシュリン及びプロラクチン）又は 非ペプチドホルモン（たとえばステコイドホルモン、たとえばコルチゾール、エ ストラジオール、プロゲストロン及びテス［ステロン、又は甲状腺ホルモン、た とえばチロキシン（Ｔ４）及びトリョートチロニン）、タンパク質（たとえば、 癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びα−フェトプロティン（ＡＦＰ））、薬物（たとえ ばジゴキシン）、糖、毒素、ビタミン、タンパク質、ウィルス、たとえばインフ ルエンザ、パラ−インフルエンザ、アデノ−、ペファチチン、呼吸及びＡＩＤＳ ウィルス、又は微生物。特定の態様においては、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を決定 するために、それを使用することができる。

Ｄ６Ｃ７、すなわちＰ、Ｎ、Ａ、Ｓ、、ｔｌｓＡ、　７８：２４７８，１９８ｉ に記載される千ツク〔ｌ−ナル抗体の結合は、Ｅ、フリのβ−ガラクトシダーゼ （ＧＺ）を熱変性から保護する７四蓋体酵素であるＧＺは、熱変性のために臨界 であるエピトープに関して多価である。

癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は単量体である。２種の異なったエピ１−−プ（ＣＥＡ −１及びＣＥＡ−２）の存在の利点を取ることによって、ＣＥＡについてのアッ セイは、２対のハイブリッド抗体の組合された使用を通して考案されて来た。個 々のハイブリッド抗体はＤ６Ｃ９抗−ＧＺ結合部位を有し、そして他の結合部位 はＣＥＡ−１エピトープ又はＣＥＡ−２エピトープに対して向けられる。

次の好ましい特定の態様は４、本発明を単に例示するものである。

第１回は、本発明の方法により形成された四次免疫複合体を間約に示す。

次の例において、すべての温度は度Ｃで表わされる。

拠 ＣＦＡについてのイムノアッセイ １、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の調製。

ＣＥＡを、結１！！癌から、５Ｉｕｙｔｅｒなと、　（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ３６．１６９６〜１７０４．１９７６年５月）により改良されノＪｒｕ ｐｅｙなど。

（Ｉｎ＋ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７２　、第９巻、６１７−６２２ペ ージ）の方法により精製した。

２、　β−ガラク［・シダーゼ酵素。

β−ガラクトシダーゼ、グレード■をＳｉｇｒｎａがら購入した。酵素活性を、 ｒｔとして。−二１−ロフェニルーβ−Ｄ−ガラクトシダー・ゼ（ＯＮＰＧ　、 　Ｓ　ｉｇｍａ）を用いて測定した。

、３．ＣＥＡに対するモノクローナル抗体（モノ特異的）。

抗−ＣＥＡモノクローナル抗体を、Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔ、ｅ６ｉｎ（ Ｎａｔｕｒｅ　１９７５．２５６．４９５〜７　）の教授に従って調製した。

２つのモノクローナル抗体を、ＣＥＡが固相に被覆されているＥＬＩＳＡを用い て選択した。それらの２種のモノクローナル抗体を、ＣＥＡ〜１及びＣＥＡ−２ として命名した。

４、３−ガラクトシダーゼに対するモノクローナル抗体（千）′ｖＦ異的）。

Ｅ、フリからのβ−ガラクトシダーゼは、４個の同一のサブユニノｊ・から成る 。

抗−β−ガラクトシダーゼモノクローナル抗体を、Ｋｏｅｌ−ｈｅｒ及びＭｉｌ ｓｔｅｉｎ　（上記参照のこと）の技法に従って調製した。得られた抗−β−ガ ラクトシダーゼ王ノックローナル抗体、Ｃｅ１ａｄａ、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　、 　ＵＳＡ、　７８：２４７８／１９８１により記載されるように熱変性からβ− ガラクトシダーセ活性を保護するためにスクリーンした。

保６７、　抗−β−ガラクトシダーセ゛モノクローナル抗体を産生ずるハイブリ ドーマの１つを、０６Ｃ９として命名した。

５゜第１　（ＣＥＡ−１ｘ　Ｄ６Ｃ９）及び第２　（ＣＥＡ−２ｘ　ｎ６ｃ９） 工時異的モノクローナル抗体の調製。

工時異的モ、ノクロ・・−ナル抗体の調製を、Ｐａｔｈａｍ　（ＨｕｍａｎＮｓ ａ＋ｕｒ＋ｏ１．１２：２１３．１９８５）ムこより記載されるようにして行な った。

両組合せ（ＣＥＡ−１ｘ　Ｄ６Ｃ９）及び（ＣＥＡ−２ｘＤ６Ｃ９）　ｃこおけ る測定可能なハイブリッド抗体活性を得た。２種の工時異的モノクローナル抗体 を、ＦＰＬＣ装Ｗ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　’に用いてＦ’＋ｏｎＱ樹脂（Ｐ ｈａ−ｒａａａｃ　ｉａ）上でのイオン交換クロマト・グラフ仁・−処理により 精製した。ｐＨ８，０のトリス−Ｉｌｌ緩衝液におけるサンプルを適用し、そし てタ；／バイノ質を０−０．３　ＭのＮａＣＪ’、グラ・ブエンＦにより溶離し た。

６、工時異的抗体アッセイ。

マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中、ＣＦ、Ａ（１ｍｅｇ／ｄ）により被覆 し、そしてＢ　Ｓ　Ａ　１％アルブミンによりブロックし、た。ハイブリッド抗 体をそのプレー］上で１時間３７°Ｃでインキュベートした。洗浄の後、１蛸／ 〆のβ＝ガラクトシダーゼを添加し、そして３７°Ｃ７’１時間インキュへ−１ −Ｌた。過剰のβ−ガラクトシダーゼを洗浄し、そして０ＮＰＧを添加した。３ ７°Ｃでの色の進行が１時間生じた。

７、　均質イムノアッセイ。

工時異的抗体調製物１００１１１、β−ガラクトシダーゼ（１ｔｒｔｒ　／　ｄ 　）　５０ｍｃ　ｌ及びｃＥＡ（０〜１０ｘ／ｄの濃度、すべて１％ヒトアルブ ミン−ＰＢＳにおいて）５０ｗｃ４を、室温で１０分間、マイクロタイタープレ ートにおいてインキュベートした。次にそのプレートを６２°Ｃの水槽に移し、 そして１時間インキュベートした。水道水での急冷の後、０ＮＰＧ　（５Ｍｇ／ 　ｄ　）　５０Ｊを添加し、そしてその反応を２０〜３０分後に停止せしめた。

光学密度を４０５　ｉｌｌで測定した。四次免疫複合体による酵素活性は、７５ ｎｇ／ｄのＣＥＡ濃度までの上昇を示した。このＣＥＡ濃度以上で、酵素活性は 低下し、そして６００ｎｇ／ｄで０レベルに達し、これは高いＣＥＡＩ度で、四 次免疫複合体が解離することを示した。

Ｆｉｇ、１ 四次免疫複合体（環状タイプ） 国際調査報告 ｋｌ−ｓｎ−Ｉ　Ａ″”１１′”−”＝　ＰＣＴ／ＥＰ　８９１０１６１２国際 調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．液体試験サンプルにおけるリガンドの均質イムノアッセイ方法であって： ａ）（１）液体試験サンプル； （１ｉ）アッセイ下のリガンドがたった１つのエピトープを有する場合、前記リ ガンドのエピトープと異なる少なくとも１つのエピトープを有するいづれかのモ ノ−又はポリーエピトープ分子と前記リガンドとの共有接合体；（２）少なくと も二量体形で存在するか又は少なくとも２種の異なったエピトープを有する不安 定酵素；（３）第１の二特異的モノクローナル抗体、ここで１つのパラトープは 酵素上の第１エピトープへの結合を通して酵素の活性を保護することができ、そ して残るパラトープはアッセイ下でリガンド上での第１エピトープと結合するこ とができ；及び （４）第２の二特異的モノクローナル抗体、ここで（ｉ）前記酵素が少なくとも 二量体形で存在する場合、第１パラトープは前記第１の二特異的モノクローナル 抗体の第１パラトープと機能的に同一であり、そして同様に酵素に結合すること ができ、又は（ｉｉ）前記酵素が少なくとも２種の異なったエピトープを有する 場合、第１パラトープは酵素上の第２エピトープに結合することができ（酵素の 活性を保護するためには必ずしも必要でない）、そして第２パラトープは、アッ セイ下でリガンド上の第２の明確なエピトープに又は（前記リガンドがたった１ つのエピトープを有する場合）前記共有接合体のエピトープに結合することがで き； から成る混合物をインキュベートし；それによって四次免疫複合体を形成し； （ｂ）インキュベーションの後、前記混合物を含む液相をそのような四次免疫複 合体に存在しないいづれかの酵素が不活性化される条件下にゆだね；そして （ｃ）四次免疫複合体の一部として結合される検出可能な酸素（存在するなら） の量を測定する〔ここで前記測定は試験サンプルにおけるリガンド（存在するな ら）の量に関係する〕ことを含んで成る方法。 ２．前記不安定酵素が熱不安定酵素である請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記熱不安定酵素がβ−ガラクトシダーゼである請求の範囲第２項記載の方 法。 ４．前記酵素が熱変性により不活性化される請求の範囲２又は３項記載の方法。 ５．前記熱変性が６２℃で行なわれる請求の範囲第４項記載の方法。 ６．前記測定されるべき分析物が癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である請求の範囲第１ 〜５のいづれか１項記載の方法。 ７．請求の範囲第１〜６のいづれか１項記載の方法を実施することに使用するた めのキットであって：（ｉ）不安定酵素； （ｉｉ）第１の二特異的モノクローナル抗体；及び（ｉｉｉ）第２の二特異的モ ノクローナル抗体を含んで成キット。 ８．リガンドとは異なる少なくとも１つのエピトープを有するいづれかモノ−又 はポリーエビトープ分るとリガンドとの共有接合体をさらに含んで成る請求の範 囲第７項記載のキット。 ９．校正された対照溶液をさらに含んで成る請求の範囲第７又は８項記載のキッ ト。