JPH04507197A - 増強された核酸増幅方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 増強された核酸増幅方法 １吋五萎１ 本発明は、特定の核酸配列を増幅するための増強された方法に係わる。

免肌例１遣 試料を相補的核酸配列を用いてプローブすることにより試料中に存在する特定の 核酸配列を検出することは、公知の診断技術である。核酸は、相補的核酸に結合 することにおいて高度に特異的であり、従って、試料中に特定の核酸が存在する かどうか判定するのに有効である。これには、まず検出されるべき特定の核酸の 配列を知り、次いでその特定核酸配列と相補的な核酸配列を有するプローブを構 築することが必要である。

本明細書中、“特定の核酸配列”なる用語は、増幅したい一重鎖または二重鎖核 酸を意味しており、“試料”なる用語は、核酸を含む混合物を意味しており、“ 十分に相補的”なる用語は、プライマー及び鋳型の２つの核酸が、所与のイオン 強度及び温度粂件下で、ＤＮＡの有効なプライマー依存性及び鋳型依存性合成を 特徴とする特定の相互作用をし得ることを意味している。”　Ｄ　Ｍ　Ｓ　Ｏ’ ”は、使用される基質または酵素に全く悪影響のない、分子遺伝学分野の反応に 使用されるのに十分な純度のジメチルスルホキシドを意味する。ＤＭＳ○に代え て、他の機能的に等価のアルキルスルホキシドを使用することもできる。“ＢＳ Ａ”は、分子生物学的反応に使用するのに適した品質のウシ血清アルブミンを意 味しており、これに関して言えば、ＤＮａｓｅ、ＤＮＡニック化活性、ＲＮａｓ ｅ及びプロテアーゼを含有すべきではない。ＢＳＡに代えて、他の機能的に等価 で且つ同等に適した゛″担体°′タンパク質を使用することもできる。

核酸プローブは高度に特異的であるので、場合によっては、核酸配列によって産 生されるタンパク質よりはむしろ核酸配列自体をプローブすることが好ましい。

特定の例として、Ｂ型肝炎ウィルスの感染粒子の存在を検出するためには、単に タンパク質検出に基づく診断方法は、そのＤＮＡゲノムを欠いた非感染性抗原粒 子が有意なレベルで存在するが故に信頼性がない。別の例では、前癌性または良 性頚管腫瘍に見られるヒト乳頭腫ウィルスの種々のサブタイプは、核酸プローブ ハイブリダイゼーションを使用することによってのみ識別される。また、ＡＩＤ Ｓウィルスの特定の遺伝子構造によって、ＡＩＤＳウィルスの特定核酸配列の存 在に基づくアッセイは診断として優れていることが立証されている。

既存の核酸プローブ技術を適用する上で最も大きな障害及び制限は、コピー数の 問題である。例えばウィルスまたは細胞内には、通常は特定遺伝子の単一のコピ ーがある。

この１つのコピーが、遺伝子産物、即ちＲＮＡまたはタンパク質の多数のコピー を生み得る。このことから、検出されるべき特定の核酸配列はタンパク質の何千 ものコピーを生み得るが故に、診断技術は、タンパク質をプローブすることを含 むことが多い。

レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌ　Ｉａ）及びマイコプラズマのような所定の細菌 病原体の核酸プローブ使用の診断を容易にするために、１細胞当たり最高で１０ ０，０００もの多数の天然リポソームＲＮＡが、ＧｅｎＰｒ’ｏｂｅによって使 用されている。しかしながらこの方法は、ウィルスのような非細胞病原体や、プ ローブされる核酸配列のコピー数の低い場合には使用できない。組み込まれたプ ロウィルスが末梢血液リンパ球１万に対して１未満の割合で存在し得るＡＩＤＳ ウィルス検出用核酸プローブ法の開発にとっては、コピー数は特に問題である。

従って、試料中に存在すると推定される特定の核酸配列を増幅することができれ ば、コピー数の問題は解消され得、プローブアッセイはより容易に使用され得る であろう。

数個の細胞しか含まず、従って特定遺伝子の数個のコピーしか含まない通常の生 物試料においては、コピー数の問題を解消するために増幅方法を使用することが 必要である。

１つの増幅方法は、試料を”増殖させる”、即ち試料中に存在する生体生物材料 自体が複製し得るように条件を整えることである。複製によって、核酸配列の量 は検出可能なレベルにまで高められ得る１例えば食品業界では、加工食品の食品 汚染サルモネラ菌を試験するために、食品試料を何日もインキュベートして核酸 コピー数を高めねばならない。臨床試料においては、幾分長い時間増殖させるこ とにより病原体の数を増やさねばならない。

１９８７年７月２８日発行のＣｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ　ｉ　ｏｎ名義の米 国特許第４，６８３．ｉ９５号、及び１９８７年７月２８日発行のＣｅｔｕｓ　 Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ名義の米国特許第４，６８３，２０２はそれぞれが、試 料中に含まれるターゲット（標的）核酸配列を増幅するための方法に係わる。米 国特許第４，６８３，１９５号は、ターゲットＤＮＡ配列を含むと推定される試 料をオリゴヌクレオチドブライマーを用いて処理し、プライマー伸長産物が合成 され、更にそれが鋳型として作用し、ターゲットＤＮＡ配列を増幅する結果とな るような方法に係わる。好ましい実施態様においては、プライマー伸長産物を熱 変性を使用して鋳型から分離する。同様に、米国特許第４，６８３．２０２号は 、２つの別個の相補鎖を有するターゲラ）ＤＮＡ配列を増幅するための方法に係 わる。この方法は、かかる鎖をプライマーで処理して伸長産物を合成し、プライ マー伸長産物を鋳型から分離し、次いでプライマー伸長産物を鋳型として使用す ることを含む。

上記の両米国特許では、増幅プロセス（こおいて使用者による手作業または機械 作業の介入及び複数ステップの操作が必要であり、しかもＤＮＡのみを増幅する ことに制限されている。かかる特許に含まれるステップでは、試料を加熱し、試 料を冷却し、適当な酵素を加え、更にこれらのステップを繰り返すことが使用者 に要求される。温度の変化は、酵素にその活性を失わせる原因となる。従って、 使用者には、増幅プロセスの間、増幅混合物に適当な酵素のアリコートを繰り返 し補充することが要求される。

更に米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号においては、 増幅プロセスの各サイクルは、第１の鋳型から第２の鋳型を合成し、次いで第２ の鋳型を使用して第１の鋳型を合成することにより行われる。この手順が繰り返 され、増幅プロセスの各サイクルは、１つの基質から１つの産物を合成すること に基づいている。

従来の技術において開示されている増幅方法にもかかわらず、増幅方法を改善す る必要性は存在する。もし増幅プロセスが使用者の介入及び操作がより少なくて すみ、ＤＮＡに限定もされないないならば、好ましいであろう。更に、増幅が比 較的一定の周囲温度で行われて、プロセスに関与する酵素の活性が影響されない ならば有利であろう、増幅プロセスの各サイクルにおいて、１つの鋳型を使用し て１つの基質から１つ以上の産物を生成することができるならばより有利である 。

見孔Ωｌ七 本発明は、便宜的であり、且つ通常の増幅方法よりも方法使用者の介入及び操作 が少なくてよい、−重！Ｉ［ＲＮＡ　Ｃ９５ＲＮＡ）、−重ｇＤＮＡ（ｓｓＤＮ Ａ）または二重１ｉ１ＤＮＡ　（ｄｓＤＮＡ）の増幅方法に係わる。増幅は、比 較的一定の周囲温度で行われる。更に、プロセスの各サイクルは、１つのアンチ センスＲＮＡ鋳型由来の産物の多数のコピーを生成する。本発明の増幅方法は、 特定の核酸の量を増大するために使用することができ、従ってコピー数の問題は 解消される。即ちプローブアッセイをより容易に使用することができる。更に本 発明の増幅方法は、通常のクローニング方法のための代替方法として特定の核酸 配列の純度を高めるために使用することができる。

本発明の１つの態様によれば、特定の核酸配列を増幅するための以下の方法力（ 使用される。この方法は、−重鎖ＲＮＡ、−重鎮ＤＮＡ及び二重鎖ＤＮＡの合成 を含む。−重鎖アンチセンスＲＮＡは、第２のプライマーのための第１の鋳型で ある。−重鎖ＤＮＡは、第１のプライマーの第２の鋳型である。二重鎖ＤＮＡは 、第１の鋳型の複数のコピーの合成のための第３の鋳型である。第１または第２ のプライマーの配列は、特定核酸配列の配列と十分に相補的であり、第１または 第２のプライマーの配列は、特定核酸配列の配列と十分に相同である。第２のプ ライマーは第１のＤＮＡ鋳型の３′末端に結合し、第２のＤＮＡ鋳型を生成する 。第１のプライマーの３゛末端は第２のＤＮＡ鋳型の３°末端にハイブリダイズ する。第２の鋳型は第１の鋳型から切り離され、これを使用して相補的ＤＮＡ鎖 を生成する。得られた二重Ｍ　（ｄｕｐ　１ｅｘ）ＤＮＡは、複数の第１の鋳型 を合成するための第３の鋳型として作用し、そうして上記サイクルが繰り返され る。

本発明の別の態様によれば、特定の核酸配列を増幅するための以下の方法が使用 される。この方法は、（ａ）第１のプライマーを第１の鋳型にハイブリダイズす る。第１のプライマーは、第１の鋳型のＲＮＡ配列と十分に相補的なりＮＡ配列 を有する。

（ｂ）第１のプライマーに共有結合しており且つ第１の鋳型のＲＮＡ配列と相補 的である第１のＤＮＡ配列を合成する。第１のＤＮＡ配列及び第１のプライマー は第２の鋳型を含む。

（ｃ）第１の鋳型を第２の鋳型から分離して第２のプライマーのハイブリダイゼ ーションを可能にする。

（ｄ）第２のプライマーを第２の鋳型にハイブリダイズする。第２のプライマー は、第２の鋳型のＤＮＡ配列と十分に相補的なりＮＡ配列を有する。第２のプラ イマーは更に、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターの相補配列及び転写開 始部位の相補的配列をも有する。

（ｅ）第２のプライマーに共有結合しており且つ第２の鋳型のＤＮＡ配列と相補 的な第２のＤＮＡ配列を合成し、且つ、第２の鋳型に共有結合しており且つ第２ のプライマーのＤＮＡ配列と相補的な第３のＤＮＡ配列を合成する。

第２の及び第３のＤＮＡ配列、即ち第２のプライマー及び第２の鋳型は第３の鋳 型を含む。

（ｆ）第３の鋳型から第１の鋳型のＲＮＡ配列の多数のコピーを合成する。

或いは、本発明の上記増幅方法は以下のステップを含む。

ステップ（Ａ）は、第１のオリゴデオキシヌクレオチドプライマー即ち機能的プ ロモーター配列を含む第１のプライマーと、第２のオリゴデオキシヌクレオチド プライマー即ち機能的プロモーターと相補的な５“末端断片を含む第２のプライ マーと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ と、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと、−重鎮または二重［ＲＮＡまたはＤＮ Ａを加水分解することなくＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを除去するりボ ヌクレアーゼと、リボヌクレオシド三リン酸及びデオキシリボヌクレオシド三リ ン酸と、ＤＭＳＯまたはＢＳＡの少なくとも一方とを含む単一反応培地を提供す る。ステップ（Ｂ）は、前記反応培地に、（ｉ）（ａ）その３′末端において第 ２のプライマーの３′末端の部分にハイブリダイズするセンスＲＮＡ配列、また は（ｂ）その３゛末端に第１のプライマーがハイブリダイズするアンチセンスＲ ＮＡ配列を含む一重ｌＲＮＡ分子、（ｉｉ）　（ａ）その３′末端において第２ のプライマーの３”末端にハイブリダイズする第２プライマー結合ＤＮＡ配列、 または（ｂ）機能的プロモーターと相補的な５′末末端列を含むプロモーター− 相補的ＤＮＡ配列、または（Ｃ）その５′末端に第１のプライマーがハイブリダ イズする第１プライマー結合ＤＮＡ配列を含む一重鎖ＤＮＡ分子、または（ｉｉ ｉ）増幅可能な断片及び機能的プロモーターを、機能的プロモーターが該断片に 隣り合っていて該断片の転写を制御するような向きにあるように含む変性二重ｇ ＤＮＡ分子、のうちの１種以上の分子を加えるために提供する。ステップ（Ｃ） は、ＲＮＡ分子、−重鎖ＤＮＡ分子及び二重鎖ＤＮＡ分子の一部分からなる群の 少なくとも１つが、アンチセンスＲＮＡ配列の１つ以上のコピーを生成するため の鋳型として使用され、アンチセンスＲＮＡ配列が反応培地において以下のステ ップを含むサイクルを開始するような条件を確立するために提供する。これらの ステップは、（ｉ）第１のプライマーをアンチセンスＲＮＡ配列の３′末端にあ る領域にハイブリダイズするステップ、（ｉｉ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラー ゼの作用によって、アンチセンスＲＮＡ配列の少なくとも一部分と相補的であり 且つ第２のＤＮＡ断片を形成するために第１のプライマーの３′末端に共有結合 している第１のＤＮＡ断片を含むＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成するステッ プ、（ｉｉｉ＞アンチセンスＲＮＡ配列の少なくとも幾つかの部分におけるリボ ヌクレアーゼの作用によりＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドから第２のＤＮＡ断片を 切り離すステップ、＜ｉｖ）第２のＤＮＡ断片の３′末端を第２のプライマーの ３°末端にハイブリダイズして、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって、（ ａ）第２のプライマーの３゛末端に共有結合しており且つ第１のＤＮＡセグメン トと相補的である第３のＤＮＡ断片と、（ｂ）第３のＤＮＡ断片及び第１のプラ イマーを含む第４のＤＮＡ断片と、（ｃ）第２のＤＮＡ断片の３′末端に共有結 合しており且つ第２のプライマーの非二重ｇ　（ｎ　ｏ　ｎ　−ｄ　ｕｐｌｅｘ ）５’末端と相補的である第５のＤＮＡ断片と、（ｄ）第２のＤＮＡ断片及び第 ５のＤＮＡ断片を含む第６のＤＮＡ断片とを生成するように作用する相補的結合 体（ｄｕｐｌｅｘ）を形成するステップ、（ｖ）（ａ）該相補的結合体における ＲＮＡポリメラーゼの作用によってアンチセンスＲＮＡ配列に対応する多数のＲ ＮＡ配列と、（ｂ）第４のＤＮＡ断片及び第６のＤＮＡ断片に対応する多数のＤ ＮＡ配列とを生産するステップである。

第１または第２のプライマーの配列は、特定核酸配列の配列と十分に相補的であ り、第１または第２のプライマーの配列は、特定核酸配列の配列と十分に相同で ある。第１のプライマーの３′末端は、相補鎖上では第２のプライマーの３°末 端の方に向けられている。

本発明の別の変形態様においては、ＤＮＡの第２のプライマーは、その３°末端 に第２の鋳型のＤＮＡ配列と十分に相補的な配列を有する。第２のプライマーは その５゛末端に、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターの相補的配列及び転 写開始部位の相補的配列を有する。

本発明の別の変形ａｍにおいては、第２の鋳型に共有結合している第３のＤＮＡ 配列は、第２のプライマーの５′末端におけるＤＮＡ配列と相補的である。

本発明の別の変形態様においては、特定の核酸配列を増幅するための以下の方法 が使用される。この方法は、第１のプライマー、第２のプライマー、リボヌクレ アーゼＨ１ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ 、ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオシド三リン酸及びデオキシリボヌクレオチ ド三リン酸を試料と混合することを含む、、ＤＮＡの第１のプライマーは、ＲＮ Ａの第１の鋳型と十分に相補的な配列を有する。ＤＮＡの第２のプライマーは、 ＤＮＡの第２の鋳型と十分に相補的な配列と、ＲＮＡポリメラーゼによって基質 として認識されるプロモーターの相補的配列及び転写開始部位の相補的配列とを 有する。第１のプライマーまたは第２のプライマーの配列は、特定核酸配列の配 列と十分に相補的であり、第１のプライマーまたは第２のプライマーの配列は、 特定核酸配列の配列と十分に相同である。第１のプライマーの３′末端は、相補 鎖上では第２のプライマーの３゛末端の方に向けられている。

本発明の別の変形態様においては、特定核酸配列を増幅するための以下の方法が 使用される。この方法は、第１のプライマー、第２のプライマー、トリ筋芽細胞 病ウィルスポリメラーゼ（ａｖｔａｎ　ｍｙｏｂｌａｓｔｏｓｉｓｖｉｒａｌ　 ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、Ｅ、ｃｏｌｉリボヌクレアーゼＨ、バクテリオファー ジＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオシド三リン酸及びデオキシリボヌク レオチド三リン酸を試料に加えることを含む。ＤＮＡの第１のプライマーは、Ｒ ＮＡの第１の鋳型と十分に相補的な配列を有する。ＤＮＡの第２のプライマーは 、ＤＮＡの第２の鋳型と十分に相補的な配列と、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによ って基質として認識されるプロモーターの相補配列及び転写開始部位の相補配列 とを有する。第１のプライマーまたは第２のプライマーの配列は、特定核酸配列 の配列と十分に相補的であり、第１のプライマーまたは第２のプライマーの配列 は、特定核酸配列の配列と十分に相同である。第１の１ライマーの３′末端は、 相補鎖上では第２のプライマーの３′末端の方に閏けられている。

本発明の別の態様は、（ａ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー溶液を含む容 器、（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドブライマー溶液を含む容器、（Ｃ）−重鎖 または二重鎖のＲＮＡまたはＤＮＡを攻撃することなく、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブ リッドのＲＮＡを加水分解するりボヌクレアーゼ溶液を含む容器、（ｄ）ＲＮＡ 依存性ＤＮＡポリメラーゼ溶液を含む容器、（ｅ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ ーゼ溶液を含む容器、（ｆ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ溶液を含む容器、 ＜ｇ）リボヌクレオシド三リン酸溶液を含む容器、（ｈ）デオキシリボヌクレオ チド三リン酸溶液を含む容器、（ｉ）ＤＭＳ○溶液を含む容器、及び（ｊ）ＢＳ Ａ溶液を含む容器の集合からなる、核酸分子を増幅するためのキットを提供する 。

本発明の別の態様によれば、ＤＭＳＯが０〜３０％の範囲の濃度で与えられ、Ｂ ＳＡが５〜２５００μｇ　／　ｍ　ｌの範囲の濃度で与えられる核酸増幅方法が 提供される。或いは、ＤＭＳＯは０〜３０％の範囲の濃度で与えられ、ＢＳＡは ５０〜５００μｇ　／　ｍ　１の範囲の濃度で与えられる。

更に、ＤＭＳＯは、１５〜２５％の範囲の濃度で与えられ、ＢＳＡは５０〜５０ ０μｓ／ｍｌの範囲の濃度で与えられる。

本発明の別の態様によれば、ＤＭＳＯ及びＢＳＡを用いた増幅は、ＤＭＳＯまた はＢＳＡを加えない増幅の１０倍以上に増大される。別の態様においては、増幅 は、ＤＭＳＯまたはＢＳＡを加えない増幅の１０００倍以上に増大される。本発 明の更に別の態様においては、増幅は、ＤＭＳＯまたはＢＳＡを加えない増幅の １，０４倍以上に増大される。本発明の別のｉ様においては、増幅は、ＤＭＳＯ またはＢＳＡを加えない増幅の１０６倍以上に増大される。本発明の更に別の態 様においては、増幅は、ＤＭＳＯまたはＢＳＡを加えない増幅の１０６倍以上に 増大される。

の　が 本発明の実施態様を示す図面において、図１ａは、核酸増幅プロセスの一般説明 図であり、図１ｂは、センス（＋）ＲＮＡ分子から出発した核酸増幅プロセスの 例であり、 図１０は、制限エンドヌクレアーゼを用いて切断し、次いで変性したｄｓＤＮＡ から出発した核酸増幅プロセスの例であり、 図１ｄは、変性ｄｓＤＮＡから出発した核酸増幅プロセスの例であり、 図２は、増幅プロセスを試験するために使用される合成オリゴヌクレオチドＤＮ Ａ配列を示しており、図２Ａはｇａｇ試験配列、図２Ｂはｇａｇ２試験配列であ り、図３は、種々のプライマー濃度を使用した増幅反応のＰＡＧＥ分析のオート ラジオグラムであり、図４は、種々の鋳型濃度を使用した増幅反応のＰＡＧＥ分 析のオートラジオグラムであり、 図５は、増幅反応におけるドツト−プロット（Ｄｏｔ−ｂｌｏｔ）ハイブリダイ ゼーションのオートラジオグラムであり、 図６は、鋳型として制限フラグメントを使用した増幅反応のＰＡＧＥ分析のオー トラジオグラムであり、図７は、ＨＩＶターゲット配列を含まず（鋳型なしで） 、０〜２０％のＤＭＳＯを使用し、非特異的産物（ＮＳＰ）に作用することを示 す増幅反応の滴定のためのエチジウムプロミド染色アガロースゲルであり、 図８は、鋳型なしくｎｔ）及び１０４の鋳型コピーで、０％（−）及び１５％の （＋）ＤＭＳＯを使用し、ＮＳＰの排除を示す増幅反応のエチジウムプロミド染 色アガロースゲルであり、 図９は、鋳型なしくｎｔ）並びに１０３及び１０４の鋳型コピーで、０％（−） 及び１５％（＋）のＤＭＳＯを使用し、再現性及び感度の増大を示す増幅反応の スロット−プロットハイブリダイゼーション分析のオートラジオグラムであり、 図１０．Ａは、鋳型なしくｎｔ）及び１０４の鋳型コピーで、５０μｇ／ｍｌ　 ＢＳＡ、０％ＤＭＳＯ及び０％ＢＳＡ、１５％ＤＭＳＯ及び５０μｇ／ｍｌ　Ｂ ＳＡ、１５％ＤＭＳ○及び１００μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、並びに１５％ＤＭＳ○を 使用し、増幅鋳型の検出感度がＢＳＡ及びＤＭＳＯの組合せで増大することを示 す増幅反応のエチジウムプロミド染色アガロースゲルであり、図１０Ｂは、鋳型 なしくｎｔ）及び１０４の鋳型コピーで、５０μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、０％ＤＭＳ Ｏ及び０％ＢＳＡ、１５％ＤＭＳＯ及び５０μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、１５％ＤＭＳ Ｏ及び１００μｇ／ｍ１．ＢＳＡ、１５％ＤＭＳＯを使用し、増幅鋳型の検出感 度がＢＳＡ及びＤＭＳＯの組合せで増大すること及びＤＭＳＯ単独使用で再現性 が増大することを示す、増幅反応のスロット−プロットハイブリダイゼーション 分析のオートラジオグラムであり、図１１は、鋳型なしくｎｔ）並びに１０３及 び１０４の鋳型コピーで、１５％ＤＭＳＯ単独、１５％ＤＭＳ○及び１００μｇ ／ｍ１ＢｓＡを使用し、増幅鋳型の検出感度がＢＳＡ及びＤＭＳ○の組合せで増 大するとこと及びＤＭＳＯ単独使用で再現性を増大することを示す、増幅反応の スロット−プロットハイブリダイゼーション分析のオートラジオダラムである。

い　、　の＝日 本発明は、特定の核酸配列を増幅する方法に係わる。本発明の増幅は、ＤＮＡ及 びＲＮＡの交互の合成を含み、図１ａ〜図１ｄに一般的に及び特定的に示す。こ の方法においては、−重鎖アンチセンス（−）ＲＮＡが一重鎖ＤＮＡに変換され 、更に一重鎖ＤＮＡがｄｓＤＮＡに変換されて、元の一重鎖ＲＮＡの複数のコピ ーの合成のための機能的鋳型となる。増幅プロセスにおいては第１のプライマー 及び第２のプライマーが使用される。第１のプライマーまたは第２の１ライマー の配列は、特定核酸配列の配列と十分に相補的であり、第１のプライマーまたは 第２のプライマーの配列は、特定核酸配列の配列と十分に相同である。場合によ っては、例えば特定核酸配列が二重鎖ＤＮＡであるならば、第１のプライマー及 び第２のプライマーはいずれも、特定核酸配列の配列と十分に相補的でもあり十 分に相同でもある。

オリゴヌクレオチドブライマー（第１の１ライマー）をＲＮＡ　（第１の鋳型） の３′末端にハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用して第 １のプライマーからＤＮＡの相補Ｍ（第１のＤＮＡ配列）を合成することにより 、（−）ＲＮＡは一重鎖ＤＮＡに変換される。得られた一重鎖ＤＮＡ（第２の鋳 型）を第１の鋳型から、例えばＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに特異的なりボヌク レアーゼ（例えばリボヌクレアーゼＨ）を使用して第１の鋳型を加水分解するこ とにより分離する。第２の鋳型を、その３°末端に第２の鋳型の３゛末端と十分 に相補的な配列を含み且つその５”末端に向かってプロモーターの相補鎖及び転 写開始部位のアンチセンス配列を含む配列を含む合成オリゴヌクレオチド（第２ のプライマー）をハイブリダイズし、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用し 、第２の鋳型を鋳型として使用して第２のプライマーの３′末端に共有結合して いる第２のＤＮＡ配列を合成し、第２のプライマーを鋳型として使用して第２の 鋳型の３′末端に共有結合している第３のＤＮＡ配列を合成することにより、Ｒ ＮＡ合成し得る形態に変換する。得られた第２の鋳型の機能的誘導体、即ち第３ の鋳型は、第２のプライマーによって定義されるプロモーター及び転写開始部位 に特異的なＩ”（ＮＡポリメラーゼを使用することにより、ＲＮＡ、即ち第１の 鋳型の多数のコピーの合成に使用される。新たに合成された第１の鋳型の各々は 、上記サイクルを繰り返すことにより、第２の鋳型及び第３の鋳型の更なるコピ ーに変換することができる。更に、上記サイクルの繰り返しは、使用者による介 入または操作を必要としない。

増幅プロセスは、適当な鋳型核酸を適当な酵素、プライマー及び補因子に適当な 反応条件下で加えることから始まる。この鋳型核酸は、均一でしかも連続的な増 幅を行ない得、且つ図１ａに表されたサイクルにおいて中間体として機能し得る 形態である。増幅プロセスは、前駆体（プライマー、リボヌクレオシド三リン酸 及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸）の正味の消費と、産物（ＲＮＡ及びＤ ＮＡ）の正味の蓄積を含む、ＲＮＡ及びＤＮＡ合成プロセスは、検出されるのに 十分なレベルの核酸が合成されるまで、非同時的に進行する。増幅プロセスは、 例えば標識前駆体から標識産物が合成されることによってモニターすることがで きる。

増幅は、図１ａに全般的に示したものに加えてまたはこれに代えて、別のプロセ スを含むことも考えられる。許容し得る程度に低い速度で起こるある種の逆上産 性（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）酵素反応も可能である。

起こり得る非生産的副反応としては、鋳型核酸を加えないときのＲＮＡ及び／ま たはＤＮＡの合成を挙げることができる。このようなＲＮＡ及び／またはＤＮＡ 産物は、特定の核酸配列の２つのプライマー付着部位間にのみ認められる特定の 配列が存在するかどうか判定することにより、所望の産物から識別することがで きる。

第１のプライマーは、その３″末端に、第１の鋳型の３゜末端と十分に相補的な 配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドである。第１のプライマーの３′ 末端の配列は、所与のイオン強度及び温度条件下で、第１のＤＮＡ配列の特異的 で且つ有効な合成が行われ得るのに特定の長さ及び塩基組成を有する。剃よりサ イクルにおいては第１のプライマーは、第１の鋳型の３′末端の内側の領域と十 分に相補的であり得る。次のサイクルにおいては、第１のプライマーの５°末端 が第１の鋳型の３′末端と相補的となろう。

第１のプライマーは、天然デオキシリボヌクレオチド以外のヌクレオチドまたは ヌクレオチド類縁体で一部または全部が構成され得ると考えられる。第１の１ラ イマーの５′末端は、第１のサイクルにおいては、第１の鋳型と相補的でない配 列を含み得る。非相補的配列は、固定化され得る核酸、または検出を容易にする ためのリポータ−のような有効な非核酸成分が結合し得る核酸と相補的であるこ とができる。或いは、非相補的配列は、ＲＮＡの合成に使用され得るプロモータ ーの相補的配列及び転写開始部位の相補的配列を含み得る。このＲＮＡは第１の 鋳型と相補的であり、別の増幅サイクルにおいて中間体として使用され得る。

第２のプライマーは、その３′末端に第２の鋳型の３′末端と十分に相補的な配 列を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドである。第２のプライマーは、所与の イオン強度及び温度条件下で第２及び第３のＤＮＡ配列の特異的で且つンチセン ス配列及び転写開始部位のアンチセンス配列を含む。この配列は、第３のＤＮＡ 配列の合成のための鋳型として使用されたとき、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に 且つ有効に結合して所望の部位における転写を開始し得るのに十分な情報を含む 。プロモーター配列は、ｍ能的プロモーターのアンチセンス鎧から誘導すること ができる。転写開始部位は、天然ＲＮＡ転写物の５′末末端列から誘導すること ができる。好ましい実施態様においては、第２のプライマーの５′末末端列は、 ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧである。この配列は 、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのための、プロモーターのアンチセンス配列及び転写 開始部位のアンチセンス配列を含む。或いは、別のファージＲＮＡポリメラーゼ のための、転写開始部位及びプロモーターを使用することもできる。更に、プロ モーター機能に関係のない配列を、第２のプライマーの５′末端に、または転写 開始部位と第２の鋳型にハイブリダイズする第２のプライマーの３′末端にある 配列との間に含むこともできる。第２のプライマーは、天然デオキシリボヌクレ オチド以外のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体で一部または全部を構成す ることができる。

本発明に使用される全ての酵素は、所定の実用仕様を満足すべきである。各酵素 または酵素調製物は、所定のＤＮＡポリメラーゼ及び−重鎖もしくは二重鍾特異 的エキソヌクレアーゼもしくはエンドヌクレアーゼに共存することが多い５°ま たは３゛エキソヌクレアーゼ活性のような、有害なデオキシリボヌクレアーゼ（ ＤＮａｓｅ”　）を含むべきではない。各酵素及び酵素調製物は、ＲＮＡ及びＤ ＮＡハイブリッドに特異的なりボヌクレアーゼ活性（例えばリボヌクレアーゼＨ ）の好ましい添加は例外として、有害なりボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ”）を含 むべきではない。

更に各酵素は、オリゴヌクレオチドプライマーをＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型にハイ ブリダイズするような他の酵素プロセス及び非酵素プロセスに使用される一般的 な反応条件下で、適度に活性であるべきである。

本発明に使用されるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターと称され る特定のＤＮＡ配列に結合し、このプロモーター近傍に規定されている開始部位 において上１ｖｉｔｒｏＲＮＡ合成を特異的に開始し得る任意の酵素であり得る 。プロモーター及び開始部位は第２のプライマーの一部分を形成する。更にＲＮ Ａポリメラーゼは、鋳型の機能的コピー１つ当たり幾つかのＲＮＡコピーを適度 な時間内に合成し得るべきである。好ましい実施態様においては、バクテリオフ ァージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼが使用される。更に、ファージＴ３、ファージ ＸＩＩ、サルモネラファージｓｐ６またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓファージｇｈ −１といった他のバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを使用することもでき る。別の実施態様においては、他の原核細胞または真核細胞ＤＮＡ依存性ＲＮＡ ポリメラーゼを使用することもできる。別のＲＮＡポリメラーゼを使用するなら ば、特定のＲＮＡポリメラーゼの鋳型特異性に従って、第２のプライマーのプロ モーター及び開始配列に対して必要な変更を行なうべきであることを理解された い。

本発明に使用されるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、オリゴデオキシリボヌ クレオチドプライマー及びＲＮＡ１型からＤＮＡを合成し得る任意の酵素とする ことができる。

更にこの酵素は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮａｓｅＨに対する活 性を含み得る。好ましい実施態様においては、トリ筋芽細胞病ウィルスポリメラ ーゼ（“ＡＭ■逆転写酵素”）が使用される。更に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ ラーゼは、Ｍａｌｏｎｅｙネズミ白血病ウィルスのような別のレトロウィルス由 来のものとすることができる。或いは、他の真核細胞ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ ラーゼを使用することもできる。

本発明に使用されるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、オリゴデオキシリボヌ クレオチドプライマー及びＤＮＡ鋳型からＤＮＡを合成し得る任意の酵素とする ことができる。

この酵素は、多くのタイプのＤＮＡポリメラーゼに共存するような５′−または ３′−エキソヌクレアーゼ活性を有するべきではない。好ましい実施態様におい ては、ＡＭＶ逆転写酵素が使用される。しかしながら、自然に５′−または３′ −エキソヌクレアーゼ活性を欠いた他のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用 することもできる。これらの例としては、ウシ胸腺のような哺乳動物組織がら単 離され得るＤＮＡポリメラーゼＡまたはＢのようなある種の真核細胞ＤＮＡポリ メラーゼを挙げることができる。他の不適当なりＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポ リメラーゼ遺伝子を変化させ、次いで変化したポリメラーゼを適当な宿主細胞中 で発現させるか、または−ＤＮＡポリメラーゼタンパク質を化学修飾することに よって望ましくないエキソヌクレアーゼ活性を除去することにより、有効にする ことができる。

ＤＮＡポリメラーゼの変形体は、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノ ウ断片またはバクテリオファージエフＤＮＡポリメラーゼから作製することがで きる。好ましい実施態様においてはＲＮＡ依存性及びＤＮＡ依存性の両方のＤＮ Ａポリメラーゼ活性が同じ酵素によって提供されるため、このような代替のＤＮ Ａ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが寄与す る活性を補充するために追加されることを理解されたい。

本発明に使用することのできるＲＮａｓｅＨは、相補的ＤＮＡにアニーリングさ れているＲＮＡを加水分解し得る任意の酵素とすることができる。この酵素は、 −重もしくは二重ｆｉＲＮＡまたは全てのＤＮＡを加水分解し得るべきではない 。好ましい実施態様においては、Ｅ、ｃｏｌｉＲＮａｓｅＨが使用される。更に 、ウシ胸腺ＲＮａｓｅＨのような他のＲＮａｓｅＨ酵素を使用することもできる 。ＲＮａｓｅＨはＡＭＶ逆転写酵素の固有活性であるが故に、好ましい実施態様 においてはＡＭＶ逆転写酵素のＲＮａｓｅＨによってＥ、ｃｏｌｉ　ＲＮａｓｅ Ｈが補充される。或いは、第１の鋳型から第２の鋳型を分離し得る任意の他の酵 素を使用することもできる。

上述の酵素及びプライマーを、ＤＮＡ及びＲＮＡの両合成に必要な緩衝液及び補 因子をも含む反応容器内で併せて混合する。更に当業者には周知のように、イオ ン条件及び反応温度は、プライマーとＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型との特異的ハイブ リダイゼーションに適合させるべきである。反応混合物は、増幅プロセスを妨害 するであろう物質、特に、酵素活性を著しく阻害したり、プライマーと鋳型との ハイブリダイゼーションを妨害したり、また核酸中間体及び産物を非生産的に分 解し得る物質を含有すべきでない。

可能な検出スキームの説明は、増幅プロセスの応用に有用となろう。増幅プロセ スにおいて合成された核酸を検出するのに使用され得るスキームは、本明細書に 記載のものに限定されないことは理解されたく、他の方法も使用し得ることも考 えられたい。

１つの実施態様においては、標識前駆体を反応混合物に加えることができる。増 幅は、当業者には公知の方法を使用して標識前駆体から単離され得る標識産物の 定量または定性分析によって判定される。標識前駆体は、ＲＮＡ合成を検出する ためにはりボヌクレオシド三リン酸、またＤＮＡ合成を検出するためにはデオキ シヌクレオシド三リン酸もしくはオリゴヌクレオチドプライマーとすることがで きる。標識のタイプは、放射性同位元素、または、ビオチン、発色団（ｃｈｒｏ ｍｏｐｈｏｂｅ）　、発蛍光団、もしくは、抗体場合によってはタンパク質や酵 素に結合し得るハプテンのような有用な化学基とすることができる。標識産物は 、溶解度、電荷または寸法に基づいてＩｆ識前駆体から単離することができる。

更に、標識ＤＮＡまたはＲＮＡを、相補的配列を含み且つ固定化し得る核酸にハ イブリダイズすることもできる。

別の実施Ｒ様においては、増幅プロセスの産物を固定化支持体に結合させ、相補 的配列を含む核酸１０−ブにハイブリダイズし、液中に残存するハイブリダイズ しなかった核酸プローブから単離する。産物、即ちＤＮＡまたはＲＮＡは、疎水 結合、静電結合または共有結合のごとき任意の安定な相互作用によって固体支持 体に直接結合させることができる。更に産物は、例えばアビジンまたはストレプ トアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｔｄｉｎ）のような固定化タンパク質に結合し得 るように、増幅プロセスの間に産物中に組み込まれ得るある種の化学基、例えば ビオチンを含むことができる。更に産物を、相補的配列を含み且つ固定化され得 る核酸にハイブリダイズすることもできる。核酸プローブは、ハイブリダイゼー ション条件下で結合し、しかもハイブリダイズしなかった核酸プローブを除去す るために使用される条件下で結合が維持され得るように、増幅プロセスの産物と 十分に安定な相互作用を行なう相補的配列を含む、好ましい実施態様においては かかる相補的配列は、特定の核酸配列の第１のプライマーと第２のプライマーの 配列間にある部分から誘導される。核酸プローブは一重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ 、−重鎖にされ得る二重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または、デオキシリボヌクレ オチド及び／またはりボヌクレオチドからなり得るオリゴヌクレオチドとするこ とができる。更に核酸プローブは、適当な条件下に産物ＤＮＡまたはＲＮＡに共 有結合し得る化学基を含み得る。核酸プローブは、放射性同位元素、または、例 えばビオチン、発色団、発蛍光団、もしくは抗体に結合し得るハブテンのような 有用化学基を用いて標識することができる。更に核酸プローブは、例えばホスフ ァターゼまたはペルオキシダーゼのようなタンパク質または酵素と複合体形成し 得る。更に核酸プローブは、プローブのｉｎ　ｖｉｔｒｏ複製を可能にする配列 を含み得る。

増幅プロセスの産物は、典型的には分子クローニング技術によって得られた核酸 に使用される方法によって分析することができる。１つの変形態様においては、 特定のＤＮＡ配列の合成は、合成されたＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼを用い て消化し、電気泳動によって分離し、当業者には公知の方法を使用して検出する ことにより検出することができる。別の変形態様においては、増幅されたＲＮＡ の配列は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、第１のプライマーと、ジデオキ シヌクレオシド三リン酸とを使用してＤＮＡ合成することにより決定することが できる（Ｓｔ。

ｆｌｅｔ　ら、１９８８＞。別の変形態様においては、増幅された第３の鋳型の 配列を、増幅プロセスに使用したＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと３′−デオ キシリボヌクレオチド三リン酸とを使用してＲＮＡ合成することにより決定する ことができる（Ａｘｅｌｒｏｄ及びＫｒａｍｅｒ。

１９８５＞。別の変形態様においては、増幅されたＲＮＡは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ で翻訳され得るポリペプチドをコードすることができる。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳 のポリペプチド産物は、抗体を使用することにより分析することができる。

特定の核酸配列を含むと推定されるまたは含むことが判っている試料は、均一で 且つ連続的な増幅をすることが可能であり且つ図１に示したサイクルにおける任 意の中間体であり得る鋳型核酸の形態で反応混合物に加えられる。特に鋳型核酸 は、その５”末端に第２のプライマーの３゛末端にある配列と十分に相同な配列 を含み、且つ第１のプライマーと十分に相補的な配列を含む配列を含む一重１Ｒ ＮＡとすることができる。この形態の鋳型核酸は、増幅プロセスにおける第１の 鋳型として機能する。或いは鋳型核酸は、その３′末端に少なくとも第２のプラ イマーの３”末端と十分に相補的な配列を含み且つ第１のプライマーの３′末端 にある配列と十分に相同な配列を含む一重１ＲＮＡとすることもできる。この形 態の鋳型核酸は、増幅プロセスにおける第２の鋳型として機能する。或いは鋳型 核酸は、その１つの鎖が５°末端に第２のプライマーの全配列を含み且つ第１の プライマーと十分に相補的な配列を含む二重鎖ＤＮＡとすることもできる。二重 鎖ＤＮＡは、増幅プロセスにおける第３の鋳型として機能する。

鋳型核酸の調製は増幅プロセスの一部ではないが、鋳型核酸を生成し得るスキー ムの説明は、増幅プロセスの応用に有用となり得る。Ｓ型核酸を得るのに使用さ れ得るスキームは本明細書に記載の変形態様に限定されないことを理解されたく 、他の方法も使用し得ると考えられたい。

１つの実施態様においては、第１の鋳型として機能し得る鋳型核酸は、天然ＲＮ Ａ、または、当業者には公知の部位特異的加水分解法を使用することにより大き なＲＮＡ分子から生成され得るＲＮＡ断片とすることができる（Ｓｈｉｂａｈａ ｒａ　ら、１９８７＞。

別の変形態様においては、第２の鋳型として機能し得る鋳型核酸は、第２のプラ イマーの３′末端と十分に相補的な配列の直ぐ側部に付いている部位（フランキ ング部位）を有する二重ｔｌｉＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼで消化するこ とにより生成することができる。得られた二重鎖ＤＮＡ断片は、化学的または熱 的変性法を使用することにより一重鎖にすることができる。

別の変形態様においては、第２の核酸として機能し得る鋳型核酸は、ＤＮＡ合成 をブロックし得るオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした一重１ＲＮＡまたは ＲＮＡから生成することができる。このブロック用オリゴヌクレオチドは、適当 な条件下で鋳型に共有結合し得る化学基を含み得る。このブロックされた鋳型か ら第１のプライマーを使用してＤＮＡを合成すると、第２の鋳型と同じ３′末端 を有する合成りＮＡとなり得る。元の鋳型がＲＮＡであるならば、得られるＤＮ Ａ−ＲＮＡハイブリッドを鋳型核酸として直接使用することができる。元の鋳型 がＤＮＡであるならば、得られた第２の鋳型のコピーを、化学的または熱的変性 法を使用して元の鋳型から分離することができる。

別の変形態様においては、第３の核酸として機能し得る鋳型核酸は、第２のプラ イマーを使用してＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成することにより、− 重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡから生成することができる。得られた合成りＮＡは、化 学的または熱的変性法を使用して元の鋳型から分離することができる。更にＲＮ Ａｆｉ型は、化学的または酵素的方法を使用することにより加水分解することが できる。得られた一重鎖ＤＮＡは、その５゛末端に共有結合している第２のプラ イマーの配列を有し且つ第１のプライマーと十分に相補的な配列を含む。この− 重鎖ＤＮＡは、第１のプライマーを二重ｇＤＮＡにハイブリダイズし、第１のプ ライマーに共有結合しており且つ一重鎖ＤＮＡと相補的であるＤＮＡ配列を合成 することにより、転写機能を有する二重ｇＤＮＡに変換することができる。

別の変形態様においては、−重ＭＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型は、化学的、熱的また は場合によっては酵素的な方法を使用することにより、二重ｊｉｉ！［ＤＮＡ、 二重鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドがら得ることができる。次いで 上述の変形スキームの１つを使用することにより、得られた一重鎖ＤＮＡまたは ＲＮＡを使用して、第１、第２または第３の鋳型として機能し得る核酸を生成す ることができる。更に、第１のプライマー及び核酸の一方の鎖を含む代替スキー ム、第２のプライマー及び核酸の他方の（相補的な）ｇＩを含む別の代替スキー ムを同時に使用して、鋳型核酸を生成することができる。

予期せずして、ＤＭＳＯ及びＢＳＡの両方を反応培地に加えると、上述の増幅プ ロセスの感度及び再現性を著しく増大することが判明した。１〜１０’のターゲ ットコピー数が、本発明を使用して検出及び単離し得る。終濃度０％〜３０％の ＤＭＳｏ及び終濃度５　ｔ、ｔ　ｇ　／　ｍ　１〜２５０　ＯＡｔｇ　／　ｍ　 ＩのＢＳＡが、増幅プロセスの感度及び再現性を増強するのに有効である。好ま しい実施態様においては、５０μｇ／ｍ】〜５００μｇ／ｍｌのＢＳＡ濃度及び １５％〜２５％のＤＭＳＯ濃度が使用される。別の好ましい実施態様においては 、１００μｇ／ｍ１〜３ｏｏμｇ／ｍＩのＢＳＡ濃度及び１５％〜２５％のＤＭ Ｓ○濃度が使用され増幅反応培地にＤＭＳＯ及びＢＳＡを使用すると、ＤＭＳＯ 及びＢＳＡを含まない反応培地を使用するよりも感度及び再現性が増強されるが 、反応培地単独でも、ターゲット核酸配列の検出及び単離に十分である。反応培 地におけるＤＭＳＯ及びＢＳＡの使用は、増幅レベルを反応培地単独の１０倍以 上に増大するのに適している。好ましい実施態様においては、本発明に従うＤＭ ＳＯ及びＢｓＡを使用する増幅は、１００倍以上に増大される。別の好ましい実 施態様においては、本発明に従うＤＭＳＯ及びＢＳＡを使用する増幅は、１００ ０倍以上に増大される。更に別の好ましい実施態様においては、本発明に従うＤ ＭＳＯ及びＢＳＡを使用する増幅は、１０．０００以上に増大される。

別の好ましい実施態様においては、本発明に従うＤＭＳＯ及びＢＳＡを使用する 増幅は、１０”倍以上に増大される。

別の好ましい実施態様においては、本発明に従うＤＭＳＯ及びＢＳＡを使用する 増幅は、１０’倍以上に増大される。

別の好ましい実施態様においては、本発明に従うＤＭＳＯ及びＢＳＡを使用する 増幅は、１０’倍以上に増大される。

或いは、ＤＭＳＯ及びＢＳＡ以外の他の特定の増強化学物質＜５ＰＣ）を、ＳＰ Ｃを含まない反応培地を使用したときより増幅レベルを増大するために使用する ことができる。

予期せずして、本発明の増幅プロセスの反応培地に２〜２０％のＤＭＳＯを加え ると、例えば図３に示したように該プロセスの再現性を高めることも判明した。

しかしながら、反応培地中で１５％〜２０％のＤＭＳＯから出発すると、ＤＭＳ Ｏ単独使用は増幅レベルを低下させることも判った。

材１口（ぴ功」ｋ 材料 オリゴヌクレオチドの合成には、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０ Ａ　ＤＮＡシンセサイザーを使用した。オリゴヌクレオチド合成に使用したカラ ム、ホスホラミジット（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）及び試薬は、Ｔｅ ｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｒｋｅｔｉｎｇを介してＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ、Ｉｎｃ。

から入手した。オリゴヌクレオチドの精製には、ポリアクリルアミドゲル電気泳 動、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーを順次用いた。放射性同位元素［− ”Ｐ］ＵＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏ　Ｉ　）は、Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍから 入手した。ＤＮＡの消化及び結合に用いる酵素は、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉ ｏｌａｂｓから購入し、製造業者の指示通りに使用した。ＤＮＡポリメラーゼ１ （Ｋｌｅｎｏｗ）の大きいフラグメントを含む調製物は、同じ（ＮｅｗＥｎｇｌ ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＲＮａｓｉｎ及びＴ７　ＲＮＡは、Ｐｒ ｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ製のものをＢｉｏ／Ｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｆｃ　 Ｉｎｃ。

を介して購入した。逆転写酵素及びＲＮａｓｅ　Ｈは、Ｐｈａｒｍａｃｉ、ａか ら入手した。ブ１コティナーゼには、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ 　Ｃａｎａｄａ製のものを用いた。すべての形質転換に大腸菌ＨＢ　１０１（Ａ ＴＣＣ３３６９４）を使用した。７”　ラスミドｐＵＣ１９（Ｎｏｒｒａｎｄｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３）は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ ｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓから購入した。

ＤＮＡの単離及び配列決定 ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＹＴ培地（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２） で大腸菌の形質転換体を増殖させた。急速沸腫法（Ｈｏｌｍｅｓ　＆　Ｑｕｉｇ ｌｅｙ。

１９８１）によってプラスミドＤＮＡを精製した。構築に使用したすべてのＤＮ Ａフラグメント及びベクターを、低融点アガロース電気泳動によって分離し、フ ェノール抽出及びエタノール沈殿（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８２＞によって融解アガロースがら精製した。ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ 　ｅｔ　ａｌ、、１９７７）の修正方法（Ｈａｔｔｏｒｉ　ｅｔ　ａｔ、、１９ ８５＞によって１ラスミドＤＮＡを配列決定した。−２０ユニバーサルプライマ ー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて反応混合物を処理した 。

ＴＣＡ沈殿 増幅反応混合物のアリコート（５ｍｌ）を２０ｍ１の１０ｍＭのＥＤＴＡに入れ て反応を停止させ、定時点毎のサンプル採取が完全に終わるまで水上に維持した 。反応を停止させたサンプルをガラスフィルターディスクに塗布し、直ちに、水 冷した５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）−１％ピロリン酸ナトリウムに、ときどき 攪拌しながら１ｏ分間で滴下した。氷冷した５％ＴＣＡで５分間ずつ２回、次い で９５％のエタノールで更に２回、順次洗浄してがら凍結乾固させた。液体シン チレーションカウンターで放射能を測定した。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動 サンプル（１〜６ｍ１）を４〜５ｍｌのホルムアミド染料（９０％脱イオン化ホ ルムアミド、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８，０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、キシレ ンＥ／　７　／　−ル及びブロモフェノールブルー）と混合し、予め処理した１ ２ｃｍ長さの７％変性ポリアクリルアミドゲルに塗布した。ブロモフェノールブ ルー染料が底に達するまでゲルを３５０ボルトで通電した。いくつかの場合には 、オートラジオクラフィーの前にゲルを固定し乾燥させた。固定のために、１０ ％メタノール−７％酢酸中で１５分間洗浄した。

この処理手順で分離したＲＮＡ産生物のプロフィルを室温のオートラジオクラフ ィーで可視化した。

支１九Ｌ：　Ｇａｇ試験系用オリゴヌクレオチドの設計及び合成 ＥｃｏＲ１部位と、Ｔ７フアージプロモーター（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる 転写開始に必要な配列）と、１９ｂｐのハイブリダイゼーション領域（ハイブリ ダイゼーション領域１）とを含む合成りＮＡ配列（第２Ａ図）を設計した。これ らの要素のクローニングに関与した４７ｂのオリゴヌクレオチドから成るアンチ センス！Ｉ（Ｔ７Ｈ１゜ＧＡＧ）は第１プライマーとしても機能する。ハイブリ ダイゼーション領域２は、ハイブリダイゼーション領域１から５３ｂｐ離れてお り、その長さは２０ｂｐである。この領域（Ｈ２，ＧＡＧ）に形成されたプライ マーは、センス餌から複製された２０ｂのオリゴヌクレオチドであり、クローニ ングに使用されない、２つのハイブリダイゼーション領域間の間隔とこれらの領 域自体とを含む配列は、エイズの発病因子であるＨＴＬＶ−１［ゲノムのｇａｇ 部分の９２ｂｐのセグメントから成る。この特定の遺伝子セグメントを選択した 理由は、プライマーが有効にハイブリダイズすると予想されたため、及び、２つ のハイブリダイゼーション領域間の間隔が比較的短いためである。更に、クロー ニングを容易にするために配列の末端にＸｂａ１部位を配置した。ｇａｇ試験配 列はまた、組換え体のスクリーニングを支援するｓｐｈ　１部位及びＰｓｔ　１ 部位を含む。

このフラグメントをクローニングするために、合計４つのオリゴヌクレオチドを 使用した。即ち、Ｎ１　、ＧＡＧは、ｇａｇ試験配列及びｇａｇ２試験配列の双 方の構築に使用され、アンチセンス鎖を完成し、クローニングプロセスでだけ使 用される。同じ＜、Ｔ７４．ＰＲＯは、Ｔ７プロモーターのセンス鎖の成分であ る。Ｎ２．ＧＡＧは、双方の試験フラグメントの構築に使用されるが、増幅サイ クルの２つの段階で中間体（第２鋳型）としても使用された。完全クローン化ｇ ａｇ試験フラグメントはまた、増幅サイクルの中間体（第３鋳型）となり得る。

適当なベクターにクローニングされると、ｇａｇ試験ＤＮＡはＴ７　ＲＮＡポリ メラーゼによって転写され、３つの段階に関与する増幅中間体として有用なＲＮ Ａフラグメント（第１鋳型）を産生する。更に、Ｔ７Ｈ１，ＧＡＧ及びＮ２．Ｇ ＡＧは試験系のプライマーとして機能する。

ｇａｇ２試験系の合成りＮＡフラグメント（第２Ｂ図）は、Ｔ７プロモーターを 含んでいないが、配列の残りの部分はｇａｇ試験配列に等しい、従って、その構 造中にＮｌ。

ＧＡＧ及びＮ２．ＧＡＧの双方を含む、アンチセンス鎖を完成するために必要な オリゴヌクレオチドはＨｌ、ＧＡＧと呼ばれる。ｇａｇ２試験フラグメントは、 クローニングされると、鋳型核酸としてＤＮＡ制限フラグメントを用いる増幅試 験用の鋳型として使用され得る。

！Ｊｕ１ｉ：　Ｇａｇ試験プラスミドの構築７０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，６） と、１０ｍＭのＭｇＣｌ２と、５ｍＭのＤＴＴと、０．５ｍＭのＡＴＰと、５単 位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとを含む２０ｍ１の反応液中で、オリゴヌク レオチドＴ７４．ＰＲＯ及びＮ　１　、ＧＡＧ（各２ｍｇ＞を別々に３７℃で３ ０分間リン酸化した。

リン酸化したＴ７４．ＰＲＯ及びＮ１．ＧＡＧ（各１０ｍ１）を、各１ｍｇの非 リン酸化Ｔ７Ｈ１，ＧＡＧ及びＮ２．ＧＡＧと３ｍｌの１００　ｍ　Ｍ　）リス 塩酸（ｐＨ７，８）及び５００ｍＭのＮａＣ１と混合し、最終容量２９ｍ１のｇ ａｇ試験アセンブリとした。ｇａｇ２試験混合物は、１０ｍ１のリン酸化Ｎ１　 、ＧＡＧと、各１ｍｇの非リン酸化Ｈ１、ＧＡＧ及びＮ２．ＧＡＧと、１．８ｍ ｌの１００ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，８）及び５００ｍＭのＮａＣ１を最終容量 １８ｍ１中に含んでいた。オリゴヌクレオチド混合物を、９０℃に１０分間維持 し次いで１０〜１６時聞で室温まで徐冷することによって別々にハイブリダイズ した。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを一緒に結合するために、５０ｍ Ｍ）リス塩酸（ｐ　Ｈ７，８）と、１０ｍＭのＭｇＣ１□と、２０ｍＭのＤＴＴ と、１ｍＭのＡＴＰと５０μｇ　／　ｍ　ｌのＢＳＡとを含む６０ｍ１の反応液 を使用した。ｇａｇ試験反応混合物に４００単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを添加 し、１５℃で２時間インキュベートした。

ｇａｇ２試験反応混合物は、２００単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼと共に１４〜１ ６時間インキュベートした。

単離し精製した合成りＮＡ上セグメント、ポリリンカー領域内部の制限酵素部位 で消化することによって直鎖化したプラスミドｐＵｃ１９と混合した。”ｌ”４ 　ＤＮＡリガーゼを使用して、ｇａｇ試験配列をｐＵｃ１９のＥｃ　ｏＲ１−Ｘ ｂａｌフラグメントに結合した。ｇａｇ２試験配列はＳｍａ　ｌ　−Ｘｂ　ａ　 Ｔフラグメントに結合した。これらの反応混合物を用いた大腸菌の形質転換後に 得られた形質転換体に由来のプラスミドＤＮＡを、制限分析によってスクリーニ ングし、正しい最終プラスミド（ｐＧＡＧ、ＴＥＳＴ及びｐＧＡＧ２．ＴＥＳＴ ）が得られたことを配列分析によって確認した。

ＩＪＩ：　ＲＮＡ増幅に対するプライマー濃度の影響ｇａｇ試験オリゴヌクレオ チドから転写されたＲＮＡを増幅するために使用した反応混合物（２５ｍｌ）は 、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８，４５）と、６ｍＭのＭ　ｇ　Ｃ１ｚと、４０ ｍＭのＫＣＩと、１０ｍＭのジチオトレイトールと、０．５　ｍＭのＮＴＰ　（ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）と、１ｍＭのｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ、ｄＣＴ Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、２０単位のＲＮａｓｉｎと、１０単位のＴ７　ＲＮ Ａポリメラーゼと、１０単位の逆転写酵素と、０．４単位のＲＮａｓｅ　Ｈと、 １０ｍＣｔのヒ３２Ｐ］ＵＴＰとを含んでいた。２つの反応混合物は、０．５ｎ ｇ（０，０１５ｐｍｏ　Ｉ　ｅ　ｓ　）のＮ２．ＧＡＧを含んでおり、別の２つ の反応混合物は鋳型を含んでいなかった。上記のＮ２．ＧＡＧ含有反応混合物及 び鋳型非含有反応混合物に、プライマーＴ７Ｈ１，ＧＡＧ及びＨ２，ＧＡＧの各 々を、終濃度３．４ｍＭまたは０．３４ｍＭで添加した０反応混合物を４２℃で ２時間インキュベートした。不溶性ＴＣＡの取り込み量ｃｐｍを３０分間隔で測 定することによって総ＲＮＡ合成量をモニターした。鋳型依存性ＲＮＡ合成に対 するプライマー濃度の影響を表１に示す。等量の合成ＲＮＡを含む各反応混合物 のアリコートを、ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーによって分析した（第３ 図、レーン１〜４、反応混合物と同じ番号）。

ＬＬ：　Ｎ　２　、Ｇ　Ａ　Ｇからの２時間後のＲＮＡ増幅反応物　各プライマ ー濃度（ｍＭ）　鋳型（ｎｇ）　合成ＲＮ＾（ａ＋ｇ＞１　３．４　０．５　２ ．８ ２　３．４　２．１ ３　０．３４　０．５　１．８ 反応混合物１は最大の同位元素取り込み量を示したが、鋳型非含有の対照反応混 合物２も高い割合の取り込み量（反応混合物１の７３％）を示し、極めて類似し た電気泳動プロフィルを生じた。従って、高濃度のプライマーの存在下では、増 幅中に鋳型が全く存在しなくても予想サイズに等しいサイズのＲＮＡ転写物が産 生されると考えられる。プライマー濃度を１／１０に減らしたサンプルを用いて 得られた結果は劇的な違いを示した１反応混合物３におけるＲＮＡの産生量は、 反応混合物４における産生量の２．６倍であるが、反応混合物３においては実質 的に全部の転写物が予想サイズの単一バンドに検出されるのに反して、反応混合 物４においては６０〜７０ｂよりも大きいフラグメントが全く検出されなかった 。従って、プライマー濃度は、ＲＮＡ増幅の確度及び効率において重要な役割を 果たす。

増幅系による産生が予想されるフラグメントのサイズを示すための対照ＲＮＡ転 写物（第３図のレーン０）を、試験プラスミドから転写によって調製した。ｐＧ ＡＧ、ＴＥＳＴをＸｂａＩ消化して直鎖化し、プロテイナーゼに処理しくＭａｎ ｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８２）、フェノール抽出し、エタノール沈殿さ せた。次いで、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを製造業者の指示通りに使用し、得ら れたフラグメント０．５　ｍ　ｇを、１０−ｍｃｔの［−”Ｐ］ＵＴＰを含む２ ５ｍ１の反応混合物中で転写させた。

ｍ工：　ＲＮＡ増幅に対する鋳型濃度の影響ｇａｇ試験オリゴヌクレオチドから 転写されたＲＮＡを増幅するために使用された５０ｍ１標準反応混合物は、０． ３４ｍＭのＴ７Ｈ１，ＧＡＧと、０．３４ｍＭのＨ２、ＧＡＧと、５０ｍＭ）リ ス塩酸（ｐＨ８，４５）と、６ｍＭのＭｇＣｌ２と、４０ｍＭのＫＣＩと、１０ ｍＭのＤＴＴと、０．５ｍＭのＮＴＰと、１ｍＭのｄＮＴＰと、４０単位のＲＮ ａｓｉｎと、２０単位のＴ７　ＲＮＡポリメラーゼと、２０単位の逆転写酵素と 、０．８単位のＲＮａｓｅＨと１０〜２ｏｍＣ１の［−３２ＰコＵＴＰとを含ん でいた。

反応混合物に、ｌｎｇ〜ｌｆｇの範囲の種々の量の鋳型（Ｎ２．ＧＡＧ）を添加 し、１つの反応混合物を鋳型非添加で残した０反応混合物を４２℃で３時間イン キュベートし、該インキュベーション中に、不溶性ＴＣＡの取り込み量ｃｐｍを ３０分間隔で測定することによって総ＲＮＡ合成量をモニターした０表２に示す ように、すべての試験鋳型濃度において総ＲＮＡ合成量が鋳型非含有の対照を上 回っていた。総ＲＮＡ合成量は概して鋳型濃度の低下に伴って減少するが、この ような合成量の減少は定量的ではなかった。出発鋳型あたりのＲＮＡの増幅度は 概して、鋳型濃度が低いほど大きい、１ｆｇのＮ２．ＧＡＧから０．８ｍｇのＲ ＮＡが合成され、８Ｘ１０’の増幅倍率が得られた。

１０２ｂ　Ｎ２．ＧＡＧオリゴヌクレオチドｌｆｇは、約２Ｘ１０’個のの分子 を表す。

民え：Ｎ２．ＧＡＧからの３時間後のＲＮＡ増幅反応物　鋳型　合成ＲＮ　Ａ　 （ｍｇ）　増幅倍率１　１ｎｇ　３．５　３．５Ｘ１０’ ２　１１００ｐ　４．４　４．４ｘｌＯ’３　１０ｐｇ　４．１　４．ｌＸ１０ ’４　１ｐｇ　３．０　３．０Ｘ１０’ ５　１１００ｆ　２．７　２．７Ｘ１０’６　１０ｆｇ　１．９　１．９Ｘ１０ ”７　１ｆｇ　Ｏ，７８７，８Ｘ１０’ ８　０．０４６　− ３時間反応後に合成されたＲＮＡを、各鋳型濃度毎にＰＡＧＥで分析したく第４ 図、レーン１〜８、反応混合物と同じ番号）。ｌｆｇの鋳型を含む反応混合物と 鋳型非含有の反応混合物とを除くすべての反応混合物中に約１００ｂのＲＮＡを 示す主要バンドが存在していた。３時間反応後に、ｌｆｇの鋳型を含む反応混合 物は上記の１００ｂ産生物を多量には含んでいなかったが、総ＲＮＡ合成量は鋳 型非含有反応混合物を上回っており、また定性的にも異なる結果を示した。

工１」Σ：　ＲＮ　Ａ産生物のハイブリダイゼーション分析放射性ｍ＋識ＵＴＰ を削除した以外は実施例４に記載の手順に従って、ｌｐｇ〜０．１ｆｇの範囲の 種々の量のＮ２゜ＧＡＧ鋳型を含む増幅反応混合物を調製した。反応混合物を４ ２℃で３時間インキュベートした。各反応混合物から３０分間隔でアリコートを 採取し、ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に塗布した０反応混合物のこれらのア リコートに含まれている核酸を紫外光に露光して定着させた。終濃度５０％ｖ／ ｖのホルムアミド、５ＸＳＳＣ及び５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ溶液（Ｍａｎｉ ａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８２；５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９７５）から成るブレハイブリ ダイゼーションバッファを、１００ｃｍ’あたり溶液５ｍｌに等価の量で用い、 ５０℃で１時間膜をプレハイブリダイズ−し、ハイブリダイゼーション溶液１ｍ ｌあたり比活性１１０６ｃｐを有する放射性標識プローブとハイブリダイズさせ た。５０％ホルムアミド、５ｘｓｓｃ及び５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ溶液（Ｍ ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８２；５ｏｕｔｈｅｒｎｅｔ　ａｌ、、１ ９７５）中５０℃で１６時間のハイブリダイゼーションを行なった。放射性標識 １０−ブとしては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び［−”Ｐ］ＡＴＰによっ て５′端を標識しておいた合成オリゴヌクレオチド５’ＧＡＴＣＴＧＧＧＡＴＡ ＧＡＧＴＡＣＡＴＣＣＡ３　′を用いた。２ＸＳＳＣ，０，１％ｖ／ＶのＳＤＳ 及び０．２　Ｘ　Ｓ　５Ｃ１０，１％ｖ　／　ｖの５ＤＤ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　 ｅｔａｌ、、１９７５；Ｍａｎｔａｔｔｓ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８２；５ｚｏｓｔａｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９７９）から成る洗浄液で５０℃ で３分間の洗浄を２回連続して行なった。

第５図は、インキュベーションの種々の時点で採取した種々の量のＮ２．ＧＡＧ 鋳型を含む増幅反応混合物のハイブリダイゼーション分析の結果を示す。

第５図の各列は種々の時点（１，３０分；２．６０分；３．９０分；４．１２０ 分；５．１５０分；６．１８０分）を示し、各行はＮ２．ＧＡＧ鋳型の種々の添 加量（１，１ｐｇ；２．１１００ｆ；３．１０℃ｇ；４、ｌｆｇ：５．０．１ｆ ｇ；６．ｆｉ型型温添加を示す。標識プローブにハイブリダイズした核酸の増幅 は、行１〜３　（ｌｐｇ〜１０ｆｇ）で観察されたが、行４〜５　（ｌｆｇ、０ ．１ｆｇ）の特定核酸へのハイブリダイゼーションは行６（鋳型非添加）を上回 ってはいなかった。ハイブリダイゼーションシグナルは時間の経過に伴って増加 するので、行６の標識プローブの明らかに非特異的な結合は、ＤＮＡまたはＲＮ Ａ合成に関係すると考えられる。

去コＬｌｌ−：鋳型としてＤＮＡ制限フラグメントの使用プラスミドｐＧＡＧ２ ．ＴＥＳＴをＭｓｐｌで消化し、プロテイナーゼにで処理し、フェノール抽出及 びエタノール沈殿によって精製し、５分間沸騰させることによって変性した。Ｎ ２．ＧＡＧオリゴヌクレオチドの代わりにＭｓｐＩ消化したｐＧＡＧ２．ＴＥＳ Ｔを鋳型として使用する以外は実施例４に記載の手順に従って増幅反応混合物を 調製し分析した。各反応混合物に対して５５ｎｇ〜５．５ｐｇの範囲の種々の量 のプラスミドを添加し、１つの反応混合物を鋳型非添加で残した。実際のサンプ ル中には存在するはずの付加的なりＮＡをシミュレートするために、１つおきの 反応混合物には、同様に消化し精製し変性しておいたｌｎｇの仔ウシ胸腺ＤＮＡ を添加した。４２℃で３時間インキュベーション後、ＴＣＡ沈殿及びＰＡＧＥ分 析によってＲＮＡの合成を測定した。表３に示すように、全ての試験鋳型濃度で 総ＲＮＡ合成量が鋳型非含有の対照を上回っていた。総プラスミドＤＮＡの１． ８％にあたる実際の鋳型からのＲＮＡ合成に基づいて増幅度を計算した。

鋳型濃度の初期レベルが等しいときの総ＲＮＡ合成量（増幅度）を比較すると、 制限フラグメントを鋳型としたときに得られた結果（表３）は合成オリゴヌクレ オチドを鋳型としたときに得られた結果（表２）を終始下回っていた。

その理由は、制限フラグメントを鋳型としたときには、使用した条件下で相補的 銀との競合が生じるからであろう。

１ｉＥ３：Ｍｓｐｌ−消化ｐＧＡＧ２．ＴＥＳＴからのＲＮＡ増幅 区ｘ　ｆｉＬＬ！　金ｔＲＮコ！■　ｍ＊車１　５５、Ｏｎｇ（ｌｏｇ）　３． ６５　３．７Ｘ　１０コ２　（４，０５）　（４，ＩＸ　ｔｏ″）３　５．５ｎ ｇ（１００ｎｇ）　３．５４　３．５Ｘ　１０’４　（３，１６）　（３，２ｘ 　１０’）５　５５０．０ｐｇ＜１０ｐｇ）　２．２９　２．３ｘ　１０’６　 （２，７９）　（２，８Ｘ　１０’）７　５５、Ｏｐｇ（Ｉｐｇ）　２．６２　 ２．６ｘ　１０’８　（０，６７＞　（０，７ｘ　１０’）９　５．５ｐｇ（１ ００ｐｇ）　１３７　１．４ｘ　１０’１０　（２，２６）　（２，３Ｘ　１０ ’）１１　１．２５ １２　（０，０８） ＊括弧内の数値は、Ｎ２．ＧＡＧ均等量を示す。

寧寧括弧内の数値は、１ｍｇのＭｓｐｌ−消化仔つシ胸ＪＩｉＤＮＡの存在下の ＲＮＡ合成を示す。

３時開反応後に合成されたＲＮＡをＰＡＧＥによって分析したく第６図、レーン １〜６．１１及び１２、反応混合物と同じ番号）。約１００ｂのＲＮＡを示す主 要バンドは、反応混合物（レーン）１〜６に存在していたが、鋳型非含有反応混 合物〈レーン１１及び１２）には存在していなかった。レーン０のＲＮＡは、実 施例３に記載の手順に従って調製した標準である。１μｇのＭｓｐｌ−消化仔ウ シ胸腺ＤＮＡの添加（レーン２．４及び６）または非添加（レーン１．３及び５ ）にかかわりなく合成ＲＮＡに明らかな定性的な違いはなかった。

Ｋ４九Ｌ：鋳型としてＲ，ＮＡフラグメントの使用プラスミドｐＧＡＧ、ＴＥＳ ＴをＸｂ’ａ）で消化し、プロテイナーゼにで処理し、フェノール抽出及びエタ ノール沈殿によって精製した。Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを用い、Ｎ２．ＧＡＧ に相補的な配列のＲＮＡを直鎖化ｐＧＡＧ、ＴＥＳＴプラスミドから転写した。

得られたＲＮＡをＤＮａｓｅ（ＰｒｏＭｅｇａ　ＢｉｏＴｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ 。

ＷＩ）で消化し、次いでフェノール抽出及びエタノール沈殿によって精製した。

精製したＲＮＡを実施例５に記載の増幅反応の鋳型として使用した。各反応混合 物に５５μｇ〜５．５９ｇの範囲の種々の量のＲＮＡを添加し、１つの反応混合 物を鋳型非添加で残した。４２℃で３時間インキュベーション後、特定のＲＮＡ の合成を、実施例５に記載の手順に従って標識オリゴヌクレオチドプローブへの ハイブリダイゼーションによって測定した。

実コＬＬＬ：鋳型としてリポソームＲＮＡの使用内部配列の増幅 大腸菌１６ＳリポソームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）の一部に相補的なＲＮＡ配列を増 幅するために２つのプライマーを使用した。これらのプライマーの１つであるＴ ７ＨＩＲＩＢ３、ＰＲ２（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ ＧＡＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ）は、開始部位とＴ７プロモーター のアンチセンス鎖、更に、１６Ｓ　ｒＲＮＡに相補的な配列を含む、他方のプラ イマーＲＩ　Ｂ８．ＰＲ（ＡＡＴＡＣＣＴＴＴＧＣＴＣＡＴＴＧＡＣＧ）は、Ｔ ７ＨＩＲＩＢ３．ＰＲ２をプライマーとして用い１６Ｓ　ｒＲＮＡを鋳型として 用いて合成したＤＮＡに相補的である。増幅を検出するための第３の合成オリゴ ヌクレオチドＲＩ　Ｂ５．ＰＲ（ＡＧＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣ）は増幅反 応のＲＮＡ産生物に相補的であり、また、このＲＮＡ産生物は出発ｒＲＮＡ鋳型 に相補的である。

反応混合物（２５ｍｌ）は、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，４５）と、６ｍＭの Ｍ　ｇ　ＣＬ　２と、４０ｍＭのＫＣＩと、１０ｍＭのＤＴＴと、０．５ｍＭの ＮＴＰと、１ｍＭのｄＮＴＰと、２０単位のＲＮａｓｉｎと、１０単位のＴ７Ｒ ＮＡポリメラーゼと、１０単位のＡＭＶ逆転写酵素と、０．４単位のＲＮａｓｅ 　Ｈと、０．３４μｇ　（Ｉｍ＞のＴ７ＨＩＲＩＢ３．ＰＲ２と０．３４μｇの ＲＩＢ８．ＰＲとを含む。

反応混合物に５０μｇ〜５０ｆｇの範囲の種々の量の大腸菌ｒ　ＲＮ　Ａを添加 し、１つの反応混合物をｒＮＲＡ無添加で残す。反応混合物を４２℃で３時間イ ンキュベーションし、インキュベーションの開始から３０分、６０分、１２０分 及び１８０分後にアリコートを採取する０反応混合物のアリコートを急冷して反 応を停止させ、ナイロン膜に固定し、実施例５に記載の手順に従って、５′末端 を３２Ｐで標識したＲＩＢ５．ＰＲプローブにハイブリダイズした。

支１１％＋鋳型としてリポソームＲＮＡの使用５′一端配列の増幅 大腸菌１６３　ｒＲＮＡの一部に相同のＲＮＡ配列を増幅するために２つのプラ イマーを使用する。これらのブライ７−の１つＲｒ　Ｂ　１２．ＰＲ（ＴＴＡＣ ＴＣＡＣＣＣＧＴＣＣＧＣＣ）は１６Ｓ　ｒＲＮＡに相補的である。他方の１ラ イマーＴ７ＨＩ　ＲＩ　Ｂ５．ＰＲ（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＡＡ、　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ　 ＣＡ　Ｔ　）は、Ｒ，１Ｂ１２．ＰＲをプライマーとして用い１６Ｓ　ｒＲＮＡ を鋳型として用いて合成されたＤＮＡの３′端に相補的である。増幅を検出する ための第３の合成オリゴヌクレオチドＲＩＢ１１．ＰＲ（ＧＴＴＣＧＡＣＴＴＧ ＣＡＴＧＴＧＴＴＡＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＴＴＣＡＡＴＣＴＧＡＧＣ Ｃ）は増幅ＲＮＡ産生物及び出発ｒ　ＲＮ　Ａ鋳型の双方に相補的である。

ｒ　ＲＮ　Ａに対する増幅反応及び合成されたＲＮＡの検出は、（Ｔ７ＨＩＲＩ Ｂ３．ＰＲ２及びＲＩＢ８．ＰＲの代わりに）Ｔ７ＨＩ　Ｒｒ　Ｂ　５．ＰＲ及 びＲＩＢ１２．ＰＲをフライマーとして用い、（ＲＩＢ５．ＰＲの代わりに）Ｒ ＩＢｌｌ、ＰＲをオリゴヌクレオチドプローブとして用い、実施例８の記載に準 じて行なう。

本発明の好ましい実施例を以上に詳細に説明したが、本発明の要旨または請求の 範囲を逸脱することなく種々の変更が当業者に可能であることは理解されよう。

実」１倒二Ｌ９−ニジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びウシ血清アルブミン ＣＢ　Ｓ　Ａ　）を用いた核酸増幅の増進効果上記実施例の核酸増幅プロセスを 、以下の細菌株、プラスミド及びＲＮＡ鋳型を用いて実施した。ＨＩＶＩ　（Ｈ ｘＢ２株）由来の１４５０ｂｐの制限フラグメントを各々が含むｐＧＥＭ−３− ＬＬＬプラスミド及びＰＵＣ−１免Ｌプラスミドを、Ｄｒ、Ｒ，、Ｇａ１ｌｏ（ ＮＣＩ、ＮＩＨ。

Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から提供されたＢａｍＨＩＥｃｏＲｉサ ブクローンから構築した。この制限フラグメントは、Ｈ’ＩＶＩ　ｍ遺伝子の一 部分とＨＩＶＩ　Ｌ９ＬＬ遺伝子の大部分とを含む。大腸菌Ｈ８１０１株をｐＧ ＥＭ−３−ＬＬＬプラスミドまたはｐＵＣＰｌ９」−プラスミドによって形質転 換した。Ｍａｎ　ｉ　ａｔ　ｔ　ｓｅｔ　ａｔ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩ ＮＧ　−Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　ｐ、８６Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙに記載の方法によって１ラスミ ドＤＮＡを調製した。

Ｌ免１−ＲＮＡ鋳型を得るために、ｐＧＥＭ−３−、ｌ免ＬプラスミドをＥｃ　 ｏＲＩで直鎖化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールに沈殿させ た。ＥｃｏＲＩは挿入り主Ｌ　ＤＮＡの末端を特異的に切断する。５Ｐ６ＲＮＡ ポリメラーゼ（適当なＲＮＡポリメラーゼはＰｒ。

ｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手できる）を用い、Ｍｅｌｔｏｎ　ｅｔ 　ａｔ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１２ニア０３５（１９８４）の方 法に従って、精製ＤＮＡを転写した。ＲＮａｓ’ｅ非含有の５単位のＤＮａｓｅ 　ｒ　（適当なりＮａ５ｅｌは同じくＰｒ。

ｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手できる）を添加し、混合物を３７℃で １５分間インキュベートした。ＲＮＡ産生物をフェノール−クロロホルムで抽出 し、エタノールで沈殿させた。ＲＮＡの収量を分光光度法で測定した。

第７図に示すように、増幅用反応混合物に終濃度Ｏ〜２０％のＤＭＳＯを添加す ると、非産生性副反応による非特異的（特定種以外の）産生物（ＮＳＰ＞が減少 した。第８図は、反応媒体中に１５％のＤＭＳＯを使用すると、目的でない配列 を含むサンプルからＰ　１　：Ｐ　１及びＰｌ：Ｐ２と命名された２種類のＮＳ Ｐが除去されることを示す。

反応媒体中に１５％のＤＭＳＯが存在すると、その結果として、本発明の増幅プ ロセスで処理されるサンプルの再現性が第９図のスロット−プロットで示すよう に向上する。

目的配列を１０３〜１０４のコピー数で使用するとき、ＤＭＳｏ（＋記号で示す ）は各レーンの５つのバンドで示すような再現性の向上を生じ、また、目的配列 を１０３未満のコピー数で使用するときは、＋レーンと−レーンとの比較から分 かるような感受性の向上を生じた。

反応媒体中にＤＭＳＯ及びＢＳＡ（分子生物学用の特別品質の適当なりＳＡはＢ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ−ｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮか ら入手できる）の双方を使用すると、感受性及び再現性は第１０Ａ図及び第１０ Ｂ図に示すようにかなり向上した。これらの図は、目的配列を１０４のコピー数 で使用したときの増幅の増進と、感受性及び再現性の向上とを示す。終濃度１５ ％のＤＭＳＯと共にＢＳＡを、夫々５０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌの濃度 で使用した。ＤＭＳＯ及びＢＳＡを双方とも含まない反応媒体に比べて増幅は１ ００倍以上に増加した。これらの結果から、増幅が１０８倍も増加することも可 能であり、また、目的配列を単一コピーまで検出及び単離することが可能である ことも示唆された。

第１１図は、ＲＮＡ及びＤＮＡｔ７）増幅を、ＤＭＳＯ及びＢＳＡの有無、並び に目的配列のコピー数との間数として示すスロットープロットオートラジオダラ ムである。反応混合物中にＤＭＳＯ及びＢＳＡを使用するとき、ＲＮＡとＤＮＡ との双方が増幅され、同時に感受性及び再現性の向上が得られる。

ＦＩＧ、１Ａ ＦＩＧ、１８ １、　ｆ　牢へｖａ　序、　”ｄＮ丁ｐ゛ｓ’１Ｆ１ＤＮＡ　＝ｉｙｒ＞５　３ °酊。１ｏ・　ｔ）’　０’　１１Ｊ　；’４　まｐ（与ｌ犀米　十ｄＮＴＰ’ ｓ ５　エフ　ＲＮＡ　＃’ｌＡラーｔ−”　”−ＮＴＰ’５ＲＮＡ’ｔ”ｌ　３’ 　Ｃ’　ｂ’　ａ’　ｌ　、’　−５’７　逮ト壬ｇｌキ冬＋　ｄＮ７ｐ“。

ＩＱ　ｉｔ　雫罠７ｍシ米　中ｄ〜Ｔり５Ｉｔ、Ｔ７　ＲＮＡ　ｎ”ｒ％ラーｉ ’　＋　ＮＴＰ’ｓ“Ａ４”　３°　Ｌ二りｍ−」二一一二二一−５゜１１″Ｉ ＦＬｕ庫。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．比較的一定の温度で且つ反応物質を逐次加えることなく核酸配列を増幅する 方法であって、 （Ａ）第１のＲＮＡ鋳型の３′末端にハイブリダイズする第１のオリゴデオキシ ヌクレオチドプライマーと、第２のＤＮＡ鋳型の３′末端にハイブリダイズし且 つ機能的プロモーターのアンチセンス配列を含む第２のオリゴデオキシヌクレオ チドプライマーと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポ リメラーゼと、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと、一重鎖または二重鎖ＲＮＡ またはＤＮＡを加水分解することなくＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加 水分解するリボヌクレアーゼと、リボヌクレオシド三リン酸及びデオキシリボヌ クレオシド三リン酸と、アルキルスルホキシド及び適当な担体タンパク質の少な くとも一方とを含む単一反応培地を与えるステップと、（Ｂ）前記反応培地に、 （ｉ）一重鎖ＲＮＡ分子、 （ｉｉ）（ａ）その３′末端で前記第１のプライマーにハイブリダイズし且つそ の５′末端が前記第２のプライマーの配列を含む第１のＤＮＡ配列、または（ｂ ）その３′末端で前記第２のプライマーの３′末端にハイブリダイズし且つ前記 第１のプライマーの配列を含む第２の鋳型 を含むー重鎖ＤＮＡ分子、 （ｉｉｉ）（ａ）前記第２の鋳型の配列とその３′末端に共有結合している機能 的プロモーターのセンス配列、及び （ｂ）その５′末端に前記第２のプライマーの配列を含むＤＮＡ配列 の相補的結合体からなる二重鎖ＤＮＡ、（ｉｖ）（ａ）前記ＲＮＡ配列及び前記 第１のＤＮＡ配列、または （ｂ）前記第１の鋳型及び前記第２の鋳型の相補的結合体からなるＲＮＡ−ＤＮ Ａハイブリッド分子 のうちの１種以上の分子を加えるステップ、（ｃ）前記培地中に含まれる１種以 上の成分を使用し、前記ステップ（Ｂ）で特定された任意の分子から第１の鋳型 を生成するステップであって、前記第１の鋳型の５′末端が前記第２のプライマ ーの３′末端を含んでおり、この際、前記第１の鋳型が前記培地中で、 （ｉ）前記第１のプライマーを前記第１の鋳型にハイブリダイズするステップと 、 （ｉｉ）前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの作用によって、第２の鋳型を形 成するために前記第１のプライマーの３′末端に共有結合している第１のＤＮＡ 配列を含むＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと、（ｉｉｉ）前記 ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを前記リボヌクレアーゼを用いて加水分解 し、前記第２のプライマーが前記第２の鋳型に結合し得るようにするステップと 、 （ｉｖ）前記第２の鋳型を前記第２のプライマーにハイブリダイズするステップ と、 （ｖ）二重鎖の機能的プロモーターと、（ａ）前記第２のプライマー、 （ｂ）前記第２の鋳型の少なくとも一部分と相補的である、前記第２のプライマ ーの３′末端に共有結合している第２のＤＮＡ配列、 （ｃ）前記第２の鋳型、及び （ｄ）前記第２のプライマーの５′末端と相補的である、前記第２の鋳型の３′ 末端に共有結合している第３のＤＮＡ配列 とを含む第３の鋳型を、前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの作用によって形 成するステップと、（ｖｉ）前記第３の鋳型における前記ＲＮＡポリメラーゼの 作用によって多数の第１の鋳型を生産するステップとを含むサイクルを開始する ステップ、及びその後、（Ｄ）前記第１の鋳型、前記第２の鋳型、前記第３の鋳 型及び前記ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドからなる群から任意のものを検出するス テップ からなる方法。 ２．前記ステップ（Ｄ）が、前記多数の第１の鋳型の濃度をモニターすることを 含む請求項１に記載の方法。 ３．前記アルキルスルホキシドがＤＭＳＯであり、前記適当な担体タンパク質が ＢＳＡである請求項１に記載の方法。 ４．前記アルキルスルホキシドが０〜３０％の範囲の濃度で与えられ、前記適当 な担体タンパク質が５〜２５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で与えられる請求項１ に記載の方法。 ５．前記アルキルスルホキシドが０〜３０％の範囲の濃度で与えられ、前記適当 な担体タンパク質が５０〜５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で与えられる請求項１ に記載の方法。 ６．前記アルキルスルホキシドが１５〜２５％の範囲の濃度で与えられ、前記適 当な担体タンパク質が５０〜５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で与えられる請求項 １に記載の方法。 ７．前記アルキルスルホキシド及び前記適当な担体タンパク質の量が、アルキル スルホキシドまたは適当な担体タンパク質を加えないときの増幅に比べて、増幅 を１０倍以上に増大させるのに十分なものである請求項１に記載の方法。 ８．前記アルキルスルホキシド及び前記適当な担体タンパク質の量が、アルキル スルホキシドまたは適当な担体タンパク質を加えないときの増幅に比べて、増幅 を１００倍以上に増大させるのに十分なものである請求項１に記載の方法。 ９．前記アルキルスルホキシド及び前記適当な担体タンパク質の量が、アルキル スルホキシドまたは適当な担体タンパク質を加えないときの増幅に比べて、増幅 を１０００倍以上に増大させるのに十分なものである請求項１に記載の方法。 １０．前記アルキルスルホキシド及び前記適当な担体タンパク質の量が、アルキ ルスルホキシドまたは適当な担体タンパク質を加えないときの増幅に比べて、増 幅を１０４倍以上に増大させるのに十分なものである請求項１に記載の方法。 １１．前記アルキルスルホキシド及び前記適当な担体タンパク質の量が、アルキ ルスルホキシドまたは適当な担体タンパク質を加えないときの増幅に比べて、増 幅を１０５倍以上に増大させるのに十分なものである請求項１に記載の方法。 １２．前記アルキルスルホキシド及び前記適当な担体タンパク質の量が、アルキ ルスルホキシドまたは適当な担体タンパク質を加えないときの増幅に比べて、増 幅を１０５倍以上に増大させるのに十分なものである請求項１に記載の方法。 １３．前記アルキルスルホキシド及び前記適当な担体タンパク質の量が、アルキ ルスルホキシドまたは適当な担体タンパク質を加えないときの増幅に比べて、増 幅を１０７倍以上に増大させるのに十分なものである請求項１に記載の方法。 １４．前記増幅が、アルキルスルホキシドまたは適当な担体タンパク質を加えな いときの増幅に比べて、１０■倍以上に増大される請求項１に記載の方法。 １５．前記リボヌクレアーゼが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ　ｉａ　ｃｏｌｉ ）リボヌクレアーゼＨ及びトリ筋芽細胞症ウイルスポリメラーゼのリボヌクレア ーゼＨを含む請求項１に記載の方法。 １６．前記リボヌクレアーゼが、ウシ胸腺リボヌクレアーゼＨである請求項１に 記載の方法。 １７．前記第１または第２のオリゴヌクレオチドプライマーが、固定支持体上に 可逆的に結合される請求項１に記載の方法。 １８．前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオファージＲＮＡポリメ ラーゼであり、更に機能的プロモーターの前記アンチセンス配列が前記バクテリ オファージＲＮＡポリメラーゼに結合する請求項１に記載の方法。 １９．前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼであり、 更に、機能的プロモーターの前記アンチセンス配列が前記Ｔ７ＲＮＡポリメラー ゼに結合する請求項１８に記載の方法。 ２０．機能的プロモーターの前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド配列： 　ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧを含む請求項１９ に記載の方法。 ２１．前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがファージＴ３ポリメラーゼであり 、更に、機能的プロモーターの前記アンチセンス配列が前記ファージＴ３ポリメ ラーゼに結合する請求項１８に記載の方法。 ２２．前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがファージφＩＩポリメラーゼであ り、更に、機能的プロモーターの前記アンチセンス配列が前記ファージφＩＩポ リメラーゼに結合する請求項１８に記載の方法。 ２３．前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ ａ）ファージｓｐ６ポリメラーゼであり、更に、機能的プロモーターの前記アン チセンス配列が前記ファージｓｐ６ポリメラーゼに結合する請求項１８に記載の 方法。 ２４．前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがシュードモナス（Ｐｓｃｕｄｏｍ ｏｎａｓ）ファージｇｈ−１ポリメラーゼであり、更に、機能的プロモーターの 前記アンチセンス配列が前記ファージｇｈ−１ポリメラーゼに結合する請求項１ ８に記載の方法。 ２５．前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、レトロウイルス逆転写酵素であ る請求項１に記載の方法。 ２６．前記レトロウイルス逆転写酵素が、トリ筋芽細胞症ウイルスポリメラーゼ である請求項２５に記載の方法。 ２７．前記レトロウイルス逆転写酵素が、モロニーネズミ白血病ウイルスポリメ ラーゼである請求項２５に記載の方法。 ２８．前記反応培地中の全てのＤＮＡポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼまた はエンドヌクレアーゼ活性を欠いている請求項１に記載の方法。 ２９．前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、トリ筋芽細胞症ウイルスポリメ ラーゼである請求項１に記載の方法。 ３０．更に、増幅されるべき核酸配列を含むと推定される第１の試料の増幅量と 、増幅されるべき核酸配列が存在しない第２の試料の増幅量とを比較することに より、増幅されるべき核酸配列の存在を検出することを含む請求項１に記載の方 法。 ３１．更に、増幅されるべき核酸配列の存在をプローブを用いて検出することを 含む請求項１に記載の方法。 ３２．更に、増幅されるべき核酸配列の存在を、制限エンドヌクレアーゼ及び電 気泳動分離を使用して検出することを含む請求項１に記載の方法。 ３３．更に、増幅されるべき核酸配列の存在を、制限エンドヌクレアーゼ及び電 気泳動分離を使用して検出することを含む請求項３０に記載の方法。 ３６．更に、増幅されるべき核酸配列の存在をプローブを用いて検出することを 含む請求項３０に記載の方法。 ３７．請求項１に記載の方法によって増幅された特定核酸配列。 ３８．前記ステップ（Ｂ）が、前記一重鎖ＲＮＡ分子を前記反応培地に加えるこ とを含む請求項１に記載の方法。 ３９．前記ステップ（Ｂ）が、前記一重鎖ＤＮＡ分子を前記反応培地に加えるこ とを含む請求項１に記載の方法。 ４０．前記ステップ（Ｂ）が、二重鎖ＤＮＡ分子を前記反応培地に加えることを 含む請求項１に記載の方法。 ４１．前記ステップ（Ｄ）が、前記第２の鋳型の濃度をモニターすることを含む 請求項１に記載の方法。 ４２．前記ステップ（Ｄ）が、前記第３の鋳型の濃度をモニターすることを含む 請求項１に記載の方法。 ４３．前記ステップ（Ｄ）が、前記ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの濃度をモニタ ーすることを含む請求項１に記載の方法。 ４３．前記ステップ（Ｄ）が、前記条件を３０分間〜４時間の間維持することを 含む請求項１に記載の方法。 ４４．転写が開始されるように、ＲＮＡポリメラーゼが機能的プロモーターの前 記アンチセンス配列を認識する請求項１に記載の方法。 ４５．前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼαまたはβで ある請求項１に記載の方法。 ４６．前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがウシ胸腺ＤＮＡポリメラーゼであ る請求項１に記載の方法。 ４７．前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ活性を欠い たＤＮＡポリメラーゼである請求項１に記載の方法。 ４８．更に、増幅された核酸配列をクローニングベクター中に結合し、次いで前 記核酸配列をクローニングするかまたは発現系内で前記核酸配列によってコード される産物を発現させるステップを含む請求項１に記載の方法。 ４９．（ａ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー溶液を含む容器、 （ｂ）第２のオリゴヌクレオチドプライマー溶液を含む容器、（ｃ）一重鎖また は二重鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを攻撃することなくＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの ＲＮＡを加水分解するリボヌクレアーゼの溶液を含む容器、（ｄ）ＲＮＡ依存性 ＤＮＡポリメラーゼ溶液を含む容器、（ｅ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ溶 液を含む容器、（ｆ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ溶液を含む容器、（ｇ） リボヌクレオシド三リン酸溶液を含む容器、（ｈ）デオキシリボヌクレオチド三 リン酸溶液を含む容器、（ｉ）アルキルスルホキシド溶液を含む容器、（ｊ）適 当な担体タンパク質の溶液を含む容器の集合を含む、核酸分子を増幅するための キット。