JPH0468320B2

JPH0468320B2 -

Info

Publication number: JPH0468320B2
Application number: JP59232941A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Myoshi
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1984-11-05
Filing date: 1984-11-05
Publication date: 1992-11-02
Also published as: DE3570440D1; US4816569A; EP0180945A3; JPS61112093A; EP0180945A2; CA1260930A; EP0180945B1

Description

【発明の詳細な説明】

発明の背景技術分野本発明は、新規ヌクレオチド誘導体に関する。
さらに具体的には、本発明は、デオキシシチジン
の3′−リン酸延長上にアルキレン基を介して一級
アミノ基を導入し、かつシトシンのアミノ基にス
ペーサーを介して担体と結合させたヌクレオチド
誘導体に関するものである。先行技術本発明者らは、先に5′−未端にアミノアルキル
基を導入したオリゴヌクレオチド誘導体（以下、
5′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドという）お
よびその製造法について提案した（特開昭59−
93098号、同59−93099号および同59−93100号各
公報）。この5′−末端アミノ化オリゴヌクレオチ
ドは導入されたアミノ基を介して種々の標識物質
や担体との結合が可能である。この場合の標識物質としてはビオチン、２，４
−ジニトロベンゼン、蛍光物質（ローダミン、フ
ルオレセインなど）、酵素タンパク（ワサビパー
オキシダーゼ、アルカリフオスフアターゼ、β−
ガラクトシダーゼ）および金属タンパク（フエリ
チンなど）などが考えられる。このうち、ビオチ
ンおよび２，４−ジニトロベンゼンに関し、これ
らを結合したオリゴヌクレオチド誘導体およびそ
の製造法について本発明者らは既に提案している
（特開昭59−148798号公報および特開昭59−
204200号公報）。また、担体としてはセフアロー
スなどが考えられるが、担体を結合させたオリゴ
ヌクレオチド誘導体（以下固定化ヌクレオチドと
いう）およびその製造法についても本発明者らに
よつて既に提案済みである（特開昭59−27900号
公報）。固定化ヌクレオチドの用途としては、一般的な
mRNAの単離、精製、特異的な塩基配列をもつ
mRNAの単離〔J.Biochem.，81，941（1977）〕、
二本鎖DNAの分離、一本鎖DNAの単離精製、長
鎖オリゴヌクレオチドの合成および核酸関酵素の
単離精製などが考えられる。また、ビオチンや２，４−ジニトロベンゼンな
どの標識物質を結合したオリゴヌクレオチド誘導
体は、非放射性アフイニテイプローブとして標的
遺伝子の検出、核酸結合性タンパクの検出などに
供され、ビオチン−アビジン法〔DNA，３，269
−277（1984）、Nucleic Acids Research，５，
363−384（1978）など〕、酵素免疫法〔Nucleic
AcidsResearch，10，6789−6796（1982）など〕、
蛍光抗体法〔Nucleic Acids Research，12，
1791−1810（1984）など〕、電子顕微鏡法〔上記
Nucleic Acids Researchなど〕などに利用され
る。 Nature，306，5941（1983）、DNA，２，72
（1983）など〕。このようにアミノ化オリゴヌクレオチドおよび
その誘導体は潜在的利用価値が非常に大きい（雑
誌「BIOTECHNOLOGY」AUGUST（1983）
NATURE PUBLISHING COMPANY刊）と
ころから、その合成手段の確立および新規な誘導
体の造成が望まれているところである。そこで本発明者らは、上記5′−末端アミノ化オ
リゴヌクレオチドに続き、3′−末端にアミノアル
キル基を導入したオリゴヌクレオチド誘導体（以
下、3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドとい
う）についても提案を行つた（特開昭60−166694
号公報および特開昭60−166695号公報）。この
3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドは、上記
5′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドと同様に
種々の用途が考えられ、また対をなす化合物とし
て5′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドと組み合
せて利用することも可能である。しかしながら、
この3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドは液相
法でしか合成できなかつたため、下記のような問
題点を抱えていた。 (1) 反応ケースが大きくなる。 (2) オリゴヌクレオチド合成の各段階（脱保護、
縮合など）において中間体の精製が必要であ
り、そのうえオリゴヌクレオチドの合成操作に
熟練も必要である。その結果、合成時間、労力
がかかる。従つて、これらの諸問題を解決する方法の開発
が望まれているところであつた。発明の概要要旨本発明は上記問題点に解決を与えることを目的
とし、3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチド合成
に際して有用な出発化合物を提供し、さらに本化
合物を利用して該化合物を製造する方法をも提供
することにより本目的を達成するものである。したがつて本発明によるヌクレオチド誘導体
は、下式〔〕で示されるものであること、を特
徴とするものである。〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれ自然数であ
り、R⁰はリン酸基の保護基であり、R¹は水素、
または5′水酸基の保護基であり、R²は水素、また
はアミノ基の保護基であり、R³はアミノ基を官
能基として具備する担体であり、Ｙは酸素原子
（−Ｏ−）またはイミノ基（−NH−）である。〕効果本発明によるヌクレオチド誘導体は、デオキシ
シチジンのアミノ基延長上にスペーサーを介して
担体と結させているので、3′−末端アミノ化オリ
ゴヌクレオチドを固相法により合成するための出
発物質、すなわち樹脂（ここで樹脂は担体に過ぎ
ないが、樹脂に担持された本発明の化合物は外観
的には樹脂そのものと変らないので樹脂に担持さ
れた化物を以下において単に「樹脂」と呼ぶこと
がある）として使用することができる。従つて、
本発明の化合物を用いて3′−アミノアルキル化オ
リゴヌクレオチドを合成するに際しては下記のよ
うな効果が得られる。 (1) 反応スケールを小さくすることができるので
経済的である。すなわち非放射性アフイニテイ
プローブなどに利用されるオリゴヌクレオチド
は微量（数マイクログラム程度）で十分である
ので、反応スケールを小さくすることによつ
て、無駄がなくなる。 (2) オリゴヌクレオチドの各合成段階で中間体の
精製の必要がないため合成操作が簡単であり、
また、合成操作に熟練の必要もない。従つて、
短時間で3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチド
が合合成可能であつて、省力化、コスト低減が
できる。なお、このような樹脂によれば、それを固体支
持体とする固相法オリゴヌクレオチド合成が可能
であつて、そのような可能性が得られることも本
発明の効果の一つである。この場合のオリゴヌク
レオチドの合成は操作が簡単なので、自動化（機
械化）も可能であろう。発明の具体的説明ヌクレオチド誘導体（化合物〔〕）本発明によるヌクレオチド誘導体は、前記の式
〔〕で示されるものである（以下、このヌクレ
オチド誘導体を化合物〔〕という）。式中、（CH₂）_nはアルキレン基を示し、ｍは任
意の自然数である。その場合のｍは実用的には２
〜20であり、特に２〜８が好ましい。また、式中
CO（CH₂）_oCOはスペーサーを示し、ｎは任意の
自然数である。その場合ｎは実用的には２〜20で
あり、特に３〜８が好ましい。 R⁰ はリン酸基を保護する置換基であつて、オ
ルトまたはパラクロロフエニル基、フエニルチ
オ基、５−クロロ−８−オキシキノリル基など
を例示することができる。通常は、オルトクロ
ロフエニル基が用いられる。 R¹ 水素または5′−末端水酸基の保護基であつ
て、これが保護基である場合はトリチル基、モ
ノまたはジメトキシトリチル基、トリメチルア
セチル基、トリチルオキシアセチルなどを例示
することができる。保護基としては、通常ジメ
トキシトリチル基が用いられる。 R² 水素またはアミノ基の保護基であつて、こ
れが保護基である場合はトリフロロアセチル
基、オルトニトロフエニルスルフエニル基など
を例示することができる。保護基としては、通
常トリフロロアセチル基が用いられる。 R³ アミノ基を官能基として具備する担体であ
り、通常アミノメチル化ポリスチレン、アミノ
プロピル化シリカゲルおよび部分アミノ化ポリ
アクリルモルフオリドなどが用いられる。化合物〔〕の合成化合物〔〕、すなわち本発明によるヌクレオ
チド誘導体、は合目的的な任意の方法によつて合
成することができる。一つの好ましい方法は、第１図のフローチヤー
トに示した通りのものである。R⁰〜R³は前記し
た意味を有するものであり、BZはベンゾイル基
を示す。第１図に従つて、化合物〔〕合成の好ましい
方法を述べれば下記の通りである。まず、通常のヌクレオチド合成に適用される方
法あるいは本発明者らが先に提案した方法〔特開
昭60−166695号〕に従つて完全に保護されたシチ
ジン誘導体〔〕を合成する。ついで化合物
〔〕において、塩基部分のアミノ基の保護基を
選択的に除去して化合物〔〕を得る。塩基部分
の保護基の選択的除去は、例えば、Tetrahedron
Letters，22，991−994（1981）の方法に従つて行
うことができる。すなち、化合物〔〕を反応溶
媒中においてエチレンジアミン処理することによ
り化合物〔〕を得る。反応溶媒としては、ジク
ロロメタン、トリクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミドなども考えられるが、R⁰として
賞用されるオルトクロロフエニル基の分解が最も
少ないという点でエチレンジアミン−フエノール
〔１：４（ｖ／ｖ）〕が好ましい。上記操作で遊離した化合物〔〕の塩基部分の
アミノ基にスペーサーを導入して化合物〔〕を
造成したのち、これを担体に固定化することによ
つて、化合物〔〕を得る。すなわち、スペーサ
ー（炭素数２〜20のジカルボン酸であればよく、
特にアジピン酸、グルタル酸が好ましい）の導入
をピリジン中で縮合剤〔例えばジシクロヘキシル
カルボジイミド（以下DCC）〕を用いて行つて化
合物〔〕とする。ついで、化合物〔〕のシト
シン部分のアミノ基延長上に導入されたスペーサ
ーを介して担体と結合させることによつて、化物
（）を得る。すなわち、化合物〔〕とアミノ
基を官能基として有する担体（例えば、アミノメ
チル化ポリスチレン）とををピリジン中で縮合剤
（例えばDCC）を用いて結合させることによつ
て、化合物〔〕を得ることができる。なお、一
般的なヌクレオチド合成法は既に公知であつて、
保護基の種類およびその導入ないし除去ならびに
縮合その他についての詳細は核酸の化学合成に関
する成書や総説、例えば（ヌクレオシド・ヌクレ
オチドの合成」（丸善1977年）、「核酸有機化学」
（化学同人1979年）、「核酸」（朝倉書点1979年）、
Tetrahedron，34，31（1978）、有合化、34，723
（1978）および化学の領域、33，566（1979）など、
を参照されたい。また、化合物〔〕の合成操作
の詳細は後記実験例を参照されたい。化合物〔〕の利用／オリゴヌクレオチド誘導
体の合成本発明の化合物（一般式〔〕）は、前記した
ように、3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドを
固相法で合成するための出発物質として有用であ
る。本発明の化合物〔〕を用いた3′−末端アミノ
化オリゴヌクレオチドの合成は、この化合物
〔〕を固相合成法に使用する樹脂として用い、
この樹脂に核酸試薬としてヌクレオチドダイマ
ー、トリマーあるいはオリゴマーを順次縮合させ
る合目的的な任意の方法によつて行うことができ
る。一つの好ましい方法を示せば、第２図のフロー
チヤートに示す通りである。なお、フローチヤー
トの記号は下記の意味をもつ。 CE シアノエチル基を示す。 DMTr ジメトキシトリチル基を示す。Ｐ任意の自然数。ｑ任意の自然数。 B′ 保護された塩基を示すが、通常はN⁶−ベン
ゾイルアデニン、Ｎ−イソブチルグアニン、
N⁶−ベンゾイルシトシンおよびチミン（すな
わち、保護不要）より選択される。Ｂ塩基を示すが、通常はアデニン、グアニン、
シトシンおよびチミンより選択される。 R⁰、R¹、R²、R³、Ｙ、ｍおよびｎは、前記した
通りである。 3′−末端アミノ化オリゴヌクレオチドの合成法
について述べれば、下記の通りである。化合物〔〕のDMTrを除去したものと、通
常のオリゴヌクレオチド合成法で合成した化合物
〔O′〕のCEを除去したものとを縮合剤〔例えばメ
シチレンスルホニルニトロトリアゾリド（以下
MSNT）〕存合下で結合して、化合〔Ｖ〕を得
る。この操作を適度に繰り返すことにより所望の
鎖長とし、ついでこの化合物〔〕を担体から脱
離〔担体からの脱離操作はアルカリ処理で行うこ
とができ、通常は濃アンモニアを用いる。なお、
本発明の実験例においても濃アンモニア処理を行
つたが、この処理で担体からの脱離とともに塩基
部分やリン酸の保護基およびトリフルオロアセチ
ル基も除去される〕することによつて化合物
〔〕を得たのち、ついで5′−水酸基の保護基を
除去〔保護基の除去は酸処理、例えば0.1N塩酸
処理、80％酢酸処理などがあり、通常は後者であ
る〕することによつて、化合物〔〕を得る。また、上記と同様にして5′−および3′−未端に
アミノアルキル基を導入した化合物〔〕を得る
こともできる。化合物〔〕合成の好ましい一例
を示せば、第３図のフローチヤートに示す通りで
ある。なお、同図中の記号の意味は前記した通り
である。すなわち、化合物〔〕の合成は通常のオリゴ
ヌクレオチド合成法により造成した化合物〔O′〕
を脱シアノエチルしたものと本発明の化合物
〔〕のR¹（DMTr）を除去したものと結合を縮
合剤存在下で行つて所望の鎖長の化合物〔〕を
得る。ついで、特開昭59−93098号公報記載の方
法に従つて合成した化合物〔〕を脱シアノエチ
ルしたものと化合物〔〕のR¹（DMTr）を除去
したものとの結合を縮合剤存在下で行うことによ
り、化物〔〕を得る。最後に、化合物〔〕の
脱保護および担体からの脱離を行うことにより、
化合物〔〕を得る。なお、オリゴヌクレオチド
の固相合成法に関しては成書や文献が種々ある
が、例えば下記の文献や公開特許公報および後記
実験例を参照することができる。 Tetrahedron Letters1979、3635（1979） Nucleic Acids Research８、5473（1980） Nucleic Acids Research８、5491（1980） Nucleic Acids Research８、5507（1980） Ncleic Acids Research Symposium Series７、281（1980）特開昭59−27900号、同59−93098号、同59−93099号および同59−93100号各公報また、このようにして合成された3′−末端アミ
ノ化オリゴヌクレオチドは、一級アミノ基を介し
て標識物質などを結合することも可能である（特
開昭59−148798号公報、特開昭59−204200号公報
など参照）。実験例Ａ化合物〔〕の合成本発明の化合物〔〕の合成を以下の手順に従
つて行つた。化合物〔〕（Ｙ＝Ｏ）の合成化合物〔〕（Ｙ＝Ｏ）の合成を第４図のフロ
ーチヤートに従つて行つた（なお、図中の記号Ｘ
はハロゲン、トリアゾールまたはオキシベンゾト
リアゾールを示し、他の記号の意味は前記した通
りである）。すなわち、ピリジン共沸により無水
にした化合物〔Ｏ〕（890mg、1.4mmol）に、オ
ルトクロロフエニルスルホジベンゾトリアゾリド
（Ｘがオキシベンゾトリアゾールである化合物）
のジオキサン溶液（７ml／mM、12.6ml）を加え
て２時間反応を行つた。薄層クロマトグラフイー
（以下TLC）により反応の終了を確認した後、ピ
リジン共沸およびトルエン共沸により無水にした
トリフロロアセチル−６−アミノヘキサノール
〔Ｙ＝０、R²＝CF₃CO〕（530mg、2.5mM）およ
び１−メチル−イミダゾール（200μ1、2.5mM）
を加えて、室温で一夜反応を行つた。反応終了
後、溶媒を留去し、クロロホルム（以下CHCl₃）
30mlに溶解し、水、0.5Mリン酸二水素ナトリウ
ム（下NaH₂PO₄）、および５％炭酸水素ナトリ
ウム（以下NaHCO₃）で洗浄を行つたのち、無
水硫酸ナトリウム（以下Na₂SO₄）で乾燥を行つ
た。CHCl₃層を濃縮し、シリカゲルシヨートカラ
ムで精製を行つて、目的化物〔〕（Ｙ＝Ｏ）を
得た〔収量910mg（1.14mM）、81％〕。なお、シリカゲルカラムでの目的物の溶出は、
０〜４％のメタノール含有CHCl₃のグラデイエン
トで行つた〔以下この表現を「MeOH／CHl₃（０
→４％）」とする〕。この化合物の確認は、核磁気共嗚スペクトル
（以下NMR）によつて行つた。 NMR（CDCl₃）：δ＝ 8.12（dd 1H）、6.30（ｍ 1H） 5.30（ｔ 1H）、4.20（ｍ 2H） 3.78（ｓ 6H）、3.33（ｍ 2H） 1.40（ｍ 4H）化合物〔〕（Ｙ＝NH）の合成上記と同様にして化物〔〕（Ｙ＝NH）の合
成を行つた。すなわち、化合物〔Ｏ〕（1.32ｇ、
2mmol）を無水とした後、オルトクロロフエニ
ルホスホジベンゾトリアゾリドのジオキサン溶液
（６ml／mM、16.8ml）を加えて２時間反応を行
つた。これに、無水にしたモノトリフロロアセチ
ル−１，６−ジアミノヘキサン〔Ｙ＝NH、R²＝
CF₃CO〕塩酸塩（900mg、3.6mM）および１−メ
チル−イミダゾール（440mg、5.6mM）を加えて
一夜反応を行つた。以下上記と同様にして目的の
化合物〔〕（Ｙ＝NH）を得た〔収量710mg（44
％）〕。なお、本化合物の確認もNMRで行つた。 NMR（CDCl₃）：δ＝ 8.13（dd 1H）、6.34（ｔ 1H）、5.28（ｍ 1H） 3.77（ｓ 6H）、3.32（ｍ 2H）、3.00（ｍ 2H） 1.34（ｍ 4H）化合物〔〕（Ｙ＝Ｏ〕の合成化合物〔〕（Ｙ＝Ｏ〕（550mg、0.7mM）をエ
チレンジアミン−フエノール（１：４（Ｖ／Ｖ））
15mlに溶解し、40℃で30分間反応を行つた。
TLCで反応の終了を確認した後、溶液の濃縮を
行つた。残留物をCHCl₃に溶解し、ついで0.5M
NaH₂PO₄、５％NaHCO₃、５％塩化ナトリウム
（以下NaCl）、および水で洗浄したのち、無水
Na₂SO₄で乾燥を行つた。CHCl₃を留去したの
ち、シリカゲルシヨートカラム〔MeOH／
CHCl₃（Ｏ→３％）〕で精製を行つた。ついで、こ
れをペンタンに滴下することによつて、化合物
〔〕の粉末を得た（収量、360mg、収率54％）。
なお、本発明の化合物の確認もNMRで行つた。 NMR（CDCl₃）：δ＝ 7.77（ｔ 1H）、6.34（ｑ 1H）、5.45（dd 2H） 5.26（ｍ 1H）、4.19（ｍ 2H）、3.77（ｓ 6H） 3.31（ｔ 2H）、1.37（ｍ 4H）化合物〔〕（Ｙ＝Ｏ）の合成化合物〔〕（Ｙ＝Ｏ〕（100mg、0.11mmol）を
無水ピリジン（２ml）に溶解し、アジピン酸（50
mg、0.34mmol）およびジシクロヘキシルカルボ
ジイミド（以下DCC）（140mg、0.68mmol）を加
えて、室温で反応を行つた。TLCで反応の終了
を確認後、反応液過し、液の濃縮を行つたの
ち、濃縮物をCHCl₃に溶解し、水、５％
NaHCO₃、および５％NAClで洗浄を行つた。つ
いで、CHCl₃層を濃縮し、少量のベンゼンに溶解
したのち、ペンタンに滴下して粉末として、化合
物〔〕（Ｙ＝Ｏ）の粗精製物を得た（収量90mg、
80％）。粗精製物は、このまま次の反応に用いた。化合物〔〕（Ｙ＝Ｏ）の合成化物〔〕（Ｙ＝Ｏ）（90mg、0.086mmol）を、
アミノメチル化ポリスチレン樹脂（0.12mmol／
ｇ、400mg）（市販品）を懸濁したピリジン溶液
（４ml）に加えたのち、DCC（60mg、0.3mmol）
を加えて、室温で一夜反応を行つた。反応終了
後、樹脂をピリジンで洗浄し、無水酢酸−ピリジ
ン（１：９（ｖ／ｖ））５mlを加えて１時間反応を
行つて、未反応のアミノ基をアセチル基で保護し
た、メタノールで洗浄後、乾燥して、化物〔〕
を得た（420mg）。ここで、化合物〔〕を少量採
つてトリチル基の定量によりシチジン含量を計算
すると、0.046mmol／ｇであつた。また、精製した化合物〔〕（Ｙ＝Ｏ）〔10mg、
9μmol〕、アミノメチルポリスチレン樹脂
（0.13mmol／ｇ、40mg）およびDCC（20mg、
100μmol）を用いて上記方法に従つて化合物
〔〕（Ｙ＝Ｏ）を合成した。なお、この場合のシ
チジン含量は、上記と同様にトリチル基の定量に
よれば0.096mmol／ｇであつた。一方、化合物〔〕（Ｙ＝NH）も、上記方法
に従つて得ることができた。Ｂオリゴヌクレオチドの合成本発明の化合物（一般式〔〕を用いて、オリ
ゴヌクレオチドの合成を行つた。 (a) 化合物〔〕（Ｙ＝Ｏ、Ｂ＝Ｔ、Ｐ＝12）の
合成上記化合物〔〕の合成を第２図のフローチヤ
ートにしたがつて行つた。すなわち、樹脂〔〕
（Ｙ＝Ｏ）20mg、0.096mmol／ｇ、1.9μmol（ここ
で樹脂は担体に過ぎないが、樹脂に担持された本
発明の化合物は外観的には樹脂そのものと変らな
いので、樹脂に担持された当該化合物を以下にお
いて単に樹脂と呼ぶことにする）を○イジクロロメ
タン（以下CH₂Cl₂）１mlで５回洗浄したのち、
○ロ３％トリクロロ酢酸含有CH₂Cl₂（以下３％
TCA／CH₂Cl₂）１mlを用いる20秒間の反応を計
６回行つた。このようにして脱トリチル化した化
合物〔〕を○ハCH₂Cl₂1mlおよびピリジン１mlで
５回ずつ洗浄し、さらにCH₂Cl₂1mlで５回洗浄
後、真空乾燥を行つた。ついで○ニ縮合剤メシチレ
ンスルホニルニトロトリアゾリド（以下MSNT）
25mgおよび脱シアノエチル化したチミジンダイマ
ー（化合物〔O′〕においてＰ＝２、B′＝Ｔ）25
mgの無水ピリジン300μlを加えて、40分間反応を
行つた。反応終了後、樹脂を○ホピリジン１mlで５
回洗浄し、○ヘ無水酢酸−ピリジン−ジメチルアミ
ノピリジン（以下DMAP）〔100μ1−900μ1−10
mg〕１mlを加えて５分間反応を行つて未反応5′−
水酸基をアセチル化したのち、○トピリジン１mlで
５回洗浄を行つた（以上で１回の縮合操作終了）。
引き続き、脱シアノエチル化したチミジンダイマ
ーを用い、上記○イ〜○トの縮合操作を５回くり返す
ことにより、化合物〔〕（Ｙ＝Ｏ、Ｂ＝Ｔ、Ｐ
＝12）を得た〔トリチル基の定量による収率は通
算57％（平均91％）であつた〕。ついで、化合物〔〕を0.5Mテトラメチルグ
アニジン−ピリジン−２−カルボアルドキシムの
ピリジン−水（９：１（ｖ／ｖ））溶液300μlに溶
解し、室温で一夜処理後、濃アンモニア水（３
ml）を加え、密栓して50℃で一夜処理を行つた。
処理後、樹脂を別し、液の濃縮を行い、残渣
を50mMトリエチルアンモニウムバイカーボネー
ト（以下TEAB）PH7.5、１mlに溶解し、エーテ
ル１mlで３回洗浄した。水層を濃縮後、TEAB
に溶解し、その半量をセフアデツクスＧ−50
（直径1.5cm×長さ120cm、溶出液50mM TEAB）
にかけて粗精製を行つて化合物〔〕（Ｙ＝Ｏ、
Ｂ＝Ｔ、Ｐ＝12）の粗精製物6.0〜9.0ODを得た。
ついでこれを逆相カラムを用いた高速液体クロマ
トグラフイー（以下HPLC）で分離精製した（そ
のときの溶出パターンを第５図に示す）。HPLC
で分取した化合物〔〕を80％酢酸で10分間処理
したのち、再びHPLCで分離精製を行つて化合物
〔〕（Ｙ＝Ｏ、Ｂ＝Ｔ、Ｐ＝12）を得た（そのと
きの溶出パターンを第６図に示す）。第５図およ
び第６図において、溶出パターンはいずれも単一
ピークを示し、従つてそれぞれ化合物〔〕およ
び〔〕を純粋に得ることができた。また、化合物〔〕の確認は³²Pでラベル化し
たのち、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行な
うことによつても行つた。なお、上記のHPLCの条件は、下記の通りであ
る。カラム：μBondapak C18 温度：50℃ 流速：２ml／分溶出液Ａ：50mMトリエチルアンモニウムアセ
テート（以下TEAA）PH7.2 Ｂ：50mM TEAA（PH7.2）−アセトニト
リル（CH₃CN）＝（１：１（ｖ／ｖ））化合物〔〕の場合は、溶液Ｂの20−60％の直
線濃度勾配とし、溶出時間は16分であつた。以下
このような内容の表現を（20−60％緩衝液／16
分）とする。また、化合物〔〕の場合は、（０
−40％Ｂ緩衝液／16分）である。 (b) 化合物〔〕（Ｙ＝Ｏ、Ｂ＝Ａ、Ｐ＝12）の
合成樹脂〔〕（40mg、0.046mmol／ｇ、1.8μmol）
と核酸試薬としてアデノシンダイマー（25mg）を
無水ピリジン（400μl）に溶解したものを用い、
上記実験(a)の○イ〜○トの操作に従つて化合物〔〕
の合成を行つた（平均収率90％）。第７図は、本
実験(b)の化合物〔〕をHPLC（０→40％Ｂ緩衝
液／16分）で分離精製したときの溶出パターンで
ある。 (c) 化合物〔〕（Ｙ＝Ｏ、Ｐ＝14、Ｂは第１表
参照）の合成樹脂〔〕（100mg、0.046mmol／ｇ、4.6μmol）
と核酸試薬として種々のダイマー（GC、TA、
TG、GA、CC、CAおよびTTをこの順に縮合）
を無水ピリジン（800μl）に溶解したものを用い、
他の操作は前記実験(a)の○イ〜○トに従つて化合物
〔〕の合成を行つた。第８図は、本実験(c)の化
合物〔〕をHPLCで（０→40％Ｂ緩衝液／16
分）で分離精製したときの溶出パターンである。なお、上記実験(a)〜(c)で合成した化合物の内容
を示せば第１表の通りである。

【表】上表および上記文中において、Ｔはチミン、Ａ
はアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示す
ものとして本発明の技術分野において了承されて
いる暗号である。 (d) 化合物〔〕（Ｙ＝Ｏ、Ｂ＝第２表に記載、
ｍ＝6p＋ｑ＝14）の合成第３図のフローチヤートに従つて化合物〔〕
（Ｙ＝Ｏ、Ｂ＝第２表に記載、ｐ＋ｑ＝14）を合
成した。(イ)化合物〔〕の合成まず、上記実験(a)〜(c)と同様の方法で化合物
〔〕（R¹＝DMTr、R²＝CF₃CO−、Ｙ＝Ｏ、Ｂ
＝CACCGA TGTAGC、Ｐ＝12、ｍ＝６、ｎ＝
４）の合成を行つた。 (ロ) 化合物〔〕の合成化合物〔O′〕（R¹＝Ｈ、B′＝Ｔ、R⁰＝オルトク
ロロフエニル、Ｐ＝２）〔450mg、0.5mmol〕をピ
リジン共沸して無水とし、これにオルトクロロフ
エニルホスホジベンゾトリアゾリドのジオキサン
溶液（0.7mmol）を加えて、２時間反応を行つ
た。TLCで反応の進行を確認したのち、トリフ
ロロアセチル−６−アミノヘキサノール（190mg、
0.9mmol）および１−メチル−イミダゾール
（750mg、0.9mmol）を加えて、３時間反応を行つ
た。反応終了後、溶液の濃縮を行い、濃縮物を
CHCl₃に溶解し、水、５％NaHCO₃、0.5M
NaH₂PO₄および５％NaClで洗浄したのち、無水
Na₂SO₄で乾燥を行つた。ついで、CHCl₃層を濃
縮し、シリカゲルシヨートカラムで精製して、化
合物〔〕（R⁰＝オルトクロロフエニル、R²＝
CF₃CO、B′＝Ｔ、ｑ＝２）を得た。なお、目的
物はｎ−ペンタンに滴下して粉末とした〔収量
460mg（72％）〕。(ハ) 化合物〔〕の合成つぎに、化合物〔〕のDMTrを除去したも
のと化合物〔〕のCEを除去したものとを
MSNT存在下で縮合させて、化合物〔〕（R⁰＝
オルトクロロフエニル、R²＝CF₃CO、R³＝アミ
ノメチル化ポリスチレン、ｎ＝４、ｍ＝６、ｐ＋
ｑ＝14、Ｙ＝０）を得た。ついで、これを前記実
験(a)と同様に濃アンモニア処理してすべての保護
基をはずしたのち、HPLCで精製して、化合物
〔〕（Ｙ＝０、ｐ＋ｑ＝14、ｍ＝６）を得た。なお、HPLCでの化合物〔〕の溶出パターン
は、第９図に示す通りであつた。不純物のピーク
がみられるが、HPLCでのメインークを分取する
ことにより目的物を純粋に得ることができた。 (e) 化合物〔〕（5′側のＹ＝NH、3′側のＹ＝
Ｏ、ｐ＋ｑ＝13、ｍ＝６）の合成ピリジン共沸により無水にした化合物〔O′〕
（R⁰＝オルトクロロフエニル、R′＝Ｈ、B′＝Ｔ、
ｐ＝１）（1mmol、480mg）オルトクロロフエニ
ルホスホジベゾトリアゾリドのジオキサン溶液
（1.4mmol）を加えて１時間反応を行つた。つい
で、これに無水にしたモノトリフロロアセチル−
１，６−ジアミノヘキサン塩酸塩（1.8mmol、
450mg）および１−メチルイミダゾール
（2.8mmol、220mg）を加えて２時間反応を行つ
た。以後、実験(d)の(ロ)と同様にして、化合物
〔〕を得た。つぎに、化合物〔〕と実験(d)の
(イ)で得た化合物〔〕とを用い上記実験(d)の(ハ)と
同様の操作で化合物〔〕（第２表参照）を得た。
第１０図は、化合物〔〕をHPLCで精製した際
の溶出パターである。HPLCのピークを分取する
ことにより目的物を純粋に得ることができた。なお、実験(d)および(e)に合成した化合物の内免
を示せば、第２表の通りである。

【表】【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の化合物〔〕を合成する方
法の一例を示すフローチヤートである。第２図
は、本発明の化合物〔〕を用いてオリゴヌクレ
オチド誘導体〔〕を合成する方法の一例を示す
フローチヤートである。第３図は、本発明の化合
物〔〕を用いてオリゴヌクレオチド誘導体
〔〕を合成する方法の一例を示すフローチヤー
トである。第４図は、本発明の化合物〔〕を合
成するために用いた化合物〔〕を合成する方法
の一例を示すフローチヤートである。第５図は、
実験(a)の化合物〔〕をHPLCで分離精製したと
きのクロマトグラムを模写したものである。第６
図は、実験(a)の化合物〔〕をHPLCで分離精製
したときのクロマトグラムを模写したものであ
る。第７図は、実験(b)の化合物〔〕をHPLCで
分離精製したときのクロマトグラムを模写したも
のである。第８図は、実験(c)の化合物〔〕を
HPLCで分離精製したときのクロマトグラムを模
写したものである。第９図は、実験(d)の化合物
〔〕をHPLCで分離精製したときのクロマトグ
ラムを模写したものである。第１０図は、実験(e)
の化合物〔〕をHPLCで分離精製したときのク
ロマトグラムを模写したものである。

Claims

【特許請求の範囲】１下式〔〕で示されるものであることを特徴
とするヌクレオチド誘導体。〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれ自然数であ
り、R⁰はリン酸基の保護基であり、R¹は水素、
または5′水酸基の保護基であり、R²は水素、また
はアミノ基の保護基であり、R³はアミノ基を官
能基として具備する担体であり、Ｙは酸素原子
（−Ｏ−）またはイミノ基（−NH−）である。〕