JPH0472505B2 - - Google Patents
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- JPH0472505B2 JPH0472505B2 JP59056379A JP5637984A JPH0472505B2 JP H0472505 B2 JPH0472505 B2 JP H0472505B2 JP 59056379 A JP59056379 A JP 59056379A JP 5637984 A JP5637984 A JP 5637984A JP H0472505 B2 JPH0472505 B2 JP H0472505B2
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Description
本発明は、新規なマルトースを産生しつつデン
プンを加水分解し得る酵素（以下、マルトース産
生アミラーゼとも言う）およびその製造方法に関
する。 発明の背景 β−アミラーゼは、マルトース産生エキソ−ア
ミラーゼであり、アミロース、アミロペクチン又
はグリコーゲンの非還元性末端からα−１，４−
グルコシド結合を加水分解し、マルトースのβ形
を与える。マルトースのβ形は、水溶液でα−形
およびβ−形の混合物に自然的に異性化するであ
ろう。 β−アミラーゼは、製糖産業、製パン産業、お
よび醸造産業において用いるマルトース含有シロ
ツプを得るために用いられる。 β−アミラーゼは、種々の植物および微生物か
ら単離されてきている（W.M.FogartyおよびC.
T.Kelly、Progress in Industrial
Microbiology、15巻、112−115頁、1973年）。植
物（大麦、甘しよおよび大豆）およびバシラス
（Bacillus）種、B.ミコイデス（B.mycoides）、
B.メガテリウム（B.megaterium）、およびB.ポ
リミキサ（B.polymyxa）由来のβ−アミラーゼ
は、サルフイデイリル（sulphydryl）試薬、例え
ば活性部位がSH基を含むことが示されるような
PCMB（パラクロロ安息香酸水銀）によつて活性
が阻害される全酵素である。 これまでPCMBによつて阻害されないとして
説明されてきた唯一のβ−アミラーゼは、バシラ
ス サーキユランス（Bacillus circulans）であ
る（米国特許4001136）。B.サーキユランス（B.
circulans）β−アミラーゼは、上述のβ−アミ
ラーゼよりもより熱的に安定である。しかし、65
℃およびそれ以上で急速に失活する。 水性媒体中デンプンをβ−アミラーゼにより加
水分解される、マルトースの製造方法において、
レトログラデーシヨン（retrogradation）を阻害
しかつ微生物感染を避けるため約65〜70℃のプロ
セス温度を用いることが好都合である。 従つて、上述のバシラス サーキユランス
（Bacillus circulans）β−アミラーゼは、その急
速な失活の故に約65〜70℃での商業的用途に対し
ては十分適合したものではない。 米国特許3804715においては、熱抵抗性β−ア
ミラーゼが開示されており、これは英国特許
1130398において記載されている如く小麦のもみ
がらから抽出される。しかるに、β−アミラーゼ
は、商業的プロセスにおいて細菌源由来の酵素と
比較して興味が少ない。と言うのは、後者は植物
源のβ−アミラーゼのコストと比較して相当に低
コストで大規模で製造できるからである。 かくして、デンプンの加水分解を経済的方法で
可能ならしめるために長期間65〜70℃で用いるこ
とのできる十分に熱安定性である、微生物のマル
トース産生アミラーゼの有効は製法が要求され
る。 本発明の目的は、PCMBの如きスルフイデイ
リル試剤によつて失活されるものとは異なり新規
な微生物マルトース産生アミラーゼを提供するこ
とにあり、このアミラーゼは公知の微生物のβ−
アミラーゼよりもより高い温度安定性を有する。 本発明はかかる性質を有する、新規な抽出細胞
マルトース産生酵素（C599アミラーゼ）が、バ
シラス ステアロサーモフイラス コンプレツク
ス（Bacillus stearothermophilus complex）に
帰属する、新規な単離された微生物から産生され
るという知見に基づいている。 本発明のより良き理解のため、以下の説明並び
に添付図面に注意されるべきである： 第１図は温度に対するマルトース産生酵素の相
対活性をプロツトしたグラフであり、 第２図はPHに対し相対活性をプロツトしたグラ
フであり、さらに 第３図は本発明の新規プラスミドpDN452に対
する制限エンドヌクレアーゼ制限地図である。 発明の要約 本発明の第一の面によれば、本発明はマルトー
ス産生アミラーゼ酵素製品を提供するものであ
り、この製品は以下の特徴を有する新規な熱安定
性マルトース産生アミラーゼを含んでなる： (a) バシラス菌株C599（受託番号NC1B11837）を
適当な栄養培地中で培養することによつて得ら
れ、 (b) バシラス（Bacillus）菌株C599から由来した
マルトース産生アミラーゼの酵素化学的および
免疫学的性質を示し、 (c) PH5.5で酢酸塩緩衝液（0.1M）中30分の反応
時間で測定したその最適活性は約60℃であり、 (d) 約60℃のMCイルバイン（Ilvaine）緩衝液中
で測定した場合、30分の反応時間でその最適PH
が4.5〜６の範囲内にあり、さらに (e) PH5.5の酢酸塩緩衝液（0.1M）中70℃で60分
後で少なくとも75％の残留活性を有する。 マルトース産生アミラーゼ製品は固体又は液体
の形態にある。固体形態物は１ｇ当たり500〜
25000U（後に定義）の活性度を一般に有する。 第二の面によれば、本発明は上記のマルトース
産生の熱安定性アミラーゼ酵素製品の製造方法を
提供するものであり、この方法はバシラス
（Bacillus）菌株C599又はそのアミラーゼ産生変
異株又は突然変異株を、炭素源および窒素源並び
に無機塩を含有する適当な栄養培地中で培養し、
引き続き所望によりマルトース産生アミラーゼ酵
素製品を回収することを含んでなる。 更に、DNA組切換え技術を用いることにより、
形質転換した新規熱安定性マルトース産生アミラ
ーゼについてコードする遺伝子を、他の微生物に
形質転換するが、該微生物は適当な培養条件のも
とで、供与体微生物（C599）によつて産生され
るよりも、実質的により多量のマルトース産生ア
ミラーゼを産生する。 第三の面によれば、本発明は適当な宿主微生物
を、マルトース産生の熱安定性アミラーゼについ
てコードする遺伝子を含有する組換え型プラスミ
ドを用いて変質転換し、次いで炭素源および窒素
源並びに無機塩を含有する適当な栄養培地中で変
質転換した微生物を培養し、更に引き続き所望に
より該マルトース産生アミラーゼ酵素製品を回収
することによりマルトース産生アミラーゼ酵素の
製造方法を提供する。 別の面によれば、本発明は熱安定性マルトース
産生アミラーゼについてコードする遺伝子を含有
する組換え型プラスミドの調製方法を提供するも
のであり、この方法はアミラーゼを産生する供与
体微生物由来の染色体DNAを、適当な制限酵素
を用いて切断してアミラーゼコード遺伝子を含有
する線状DNA−鎖を得、適当なベクターを適当
な制限酵素を用いて切断し第二の線状DNA−配
列を得、次いで線状DNA−配列を結合しアミラ
ーゼ遺伝子を含有する組換えプラスミドを得るこ
とを含んでなる。 好ましくはE.コリー（coli）プラスミドを、適
当な制限酵素を用いて切断するが、この酵素は供
与体DNAの断片の両端に結合可端は両端を有す
る線状DNAを与えるであろう。 DNA−配列の二種の線状源の結合は、当業者
に周知の技術を用い、リガーゼを使用することに
より達成される。 本発明の好ましい態様によれば、宿主微生物は
バシラス群、好ましくは、B.サブチリス
（subtilis）から選ばれる。 宿主微生物の形質転換は又、組換えプラスミド
をE.コリー（coli）細胞に形質転換し、デンプン
崩壊形質転換体を同定し次いでそのようなAmy+
形質転換体由来の組換えプラスミドを選択された
宿主微生物にサブクローニングすることを含む周
知方法によつても達成される。 宿主微生物（好ましくはアミラーゼ活性を示さ
ない）は、適当な培地で培養した場合、該組換え
プラスミドを獲得すると、新規なマルトース産生
アミラーゼを産生する。アミラーゼは増殖培地に
分泌し、かくして簡単な酵素回収工程を得る。 本発明は又、前記アミラーゼについてコードす
る遺伝子を含有する、新規な組換えプラスミド、
pDN452を提供するものであり、このプラスミド
は、バシラス（Bacillus）C599由来の染色体
DNAを製限酵素Mbolを用いて切断し、４〜
12kb（キロベース対）範囲のDNA−配列を単離
し、E.コリー（coli）プラスミドpACYC184（す
でに制限酵素BamHLで切断されている）と結合
させ、E.コリー（coli）細胞に形質転換し、アミ
ラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを担持する、
澱粉崩壊形質転換体を同定し、該プラスミドを制
限酵素Sau3Alを用いて切断し、すでに制限酵素
BamHLを用いて切断されたプラスミドpBD64と
アミラーゼ活性を表わすDNA断片とを結合させ
次いで新規な組換えプラスミドをB.サブチリス
（subtilis）に形質転換することにより調整され
る。 第３図は、本発明の新規プラスミドpDN452に
対する制限エンドーヌクレアーゼ制限地図を示
す。新規プラスミドは7.6kb雑種プラスミドであ
り、これはpBD64のヌクレオシド配列を含んで
なり更に該プラスミドのBamH1部位で、前記ア
ミラーゼについてコードするバシラス
（Bacillus）C599由来のDNA配列が挿入されてい
る。 別の面から、本発明は高純度マルトースシロツ
プの製造方法を提供するものであり、この方法に
おいてはデンプンを、水性媒体中新規マルトース
産生アミラーゼ酵素製品で処理する。 試験結果より、新規マルトース産生アミラーゼ
酵素製品は、マルトースおよびハイマルトースシ
ロツプの製造に適していることが判明した。この
ような製品は、低吸湿性、低粘度、良好な熱安定
性およびまろやかで、マルトースの甘すぎない味
覚の故に、幾つかの製果工場による製品として特
に興味がある。 マルトースシロツプを製造する工業的方法は、
デンプンを液化し、次いでマルトース産生酵素、
並びに所望によりアミロペクチンの１，６−分岐
点を分解する酵素、例えばα−１，６−アミログ
ルコシダーゼを用いて糖化することを含んでな
る。 本発明の新規酵素は、公知のβ−アミラーゼを
同様に多くの点において同様に反応するけれど
も、以下の詳細な説明からも明らかなように幾つ
かの本質的な点において異つている。従つて、新
規酵素はβ−アミラーゼよりもむしろマルトース
産生アミラーゼとして特徴づけられる。 新規酵素は、SDS−ポリアクリルアミド ゲル
電気泳動において、約70000ダルトンの分子量を
示す単一バンドとして移動する。薄層ゲルエレク
トロフオカスシングによつて決定した等電点は
8.5である。 C599アミラーゼは、アミロペクチン、グリコ
ーゲンおよびアミロース、反応生成物の実質的部
分を構成するマルトースを加水分解する。グルコ
ースは、形成したマルトース１〜10％に対応して
小量産生される。 分枝多糖類、例えばアミロペクチンおよびグリ
コーゲンからC599アミラーゼはリミツトデキス
トリンを形成し、これはグリコアミラーゼにより
加水分解できる。 スルヒドリル試剤、例えばｐ−700安息香酸水
銀並びにキレート化剤、例えばEDTAは酵素活
性に何ら影響を与えない。 C599マルトース産生アミラーゼは次の点にお
いて公知のβ−アミラーゼと異なる： １ シユレーデインガーシクロデキストリンを定
量的に加水分解する。シユレーデインガーβ−
シクロデキストリンは３：１のモル比でマルト
ースおよびグルコースに加水分解され、一方、
α−シクロデキストリンは10：１のモル比でマ
ルトースおよびグルコースに加水分解される。
マルトース産生アミラーゼでインキユベートし
たα−シクロデキストリンの 1HNMFスペク
トル分析は、第一の主要生成物としてα−マル
トースの初期形成を示す。 ２ マルトトリオースは、等モル量のマルトース
およびグルコースに定量的に分解する。マルト
ース産生アミラーゼでインキユーベートしたマ
ルトトリオースの 1HNMRスペクトル分析は、
加水分解生成物がα−マルトースおよびグルコ
ースであることを示す。 ３ 70℃の緩衝液中で安定であり、更に、 ４ C599マルトース産生アミラーゼのリミツト
デキストリンはI2−KI−試剤との着色複合体を
与えない。 従つて、本発明に係るマルトース産生アミラー
ゼは、α−１，４−グルコシド結合を攻撃する外
酵素であり、主加水分解生成物はα−マルトース
である。 公知のマルトースシロツプ中に存在するマルト
トリオースを、マルトースおよびグルコースに定
量的に分解しこれによりマルトース収率を増加す
る、本発明のマルトース産生アミラーゼの能力は
注目すべきである。と言うのは、最近、マルトー
ス80％以上を含有するハイマルトースシロツプに
興味が高まつているからである。 本発明の詳細 本発明にかかるマルトース産生アミラーゼを産
生し得る微生物は、以下の如く調製した寒天基質
上で増殖するその能力によつて選択した。 トリプトン（10ｇ）、アミロペクチン（CPC雪
片10ｇ）、バクト（Bacto）寒天（40ｇ）および
脱イオン水（1000ml）を以下の組成を有する、当
量の塩の溶液と共に無菌的に55℃で混合した： （NH4）2SO4：0.04重量％ MgSO4、7H2O：0.1 〃 CaCl2：0.04重量％ KH2PO4：0.6 〃 塩の溶液のPHを、10N硫酸で3.0に調整した。 クルスビク（Krisuvilc）（アイスランドの温泉
地）で採取した土壊サンプルを上記寒天基質上に
散布し次いで65℃で培養した。 48時間後、寒天表面をヨウ素蒸気で発色させ次
いで未発色アミロペクチンの帯域によつて囲まれ
たコロニー、C599を単離した。下方に寒天を有
するC599の単離したコロニーを、PH4.5のデンプ
ンと共に60℃および70℃で一夜インキユベートし
た。薄層クロマトグラフイン試験は、加水分解主
産物としてマルトースを示した。 単離した微生物C599をナシヨナル コレツク
シヨン オブ インダステリアル バクテリア
（National Collection of Industrial Bacteria）
（トリーリサーチ・ステシヨン、アバデイーン、
スコツトランド）に1983年３月15日に、受託番号
NC11837をもつて寄託した。 分 類 近時において見出された本発明に係る微生物
は、好気性で、杆状でかつ有芽細菌である。従つ
て、該微生物はバシラス（Bacillus）属に属す
る。 胞子形成が乏しい寒天基質上では、培養株が急
速に自己融解し次いで死滅する。従つて、バシラ
ス（Bacillus）種の分類に対し通常用いられてい
る分類学上のプログラムを行うことは不可能であ
つた。 しかし、形態並では50℃〜70℃の範囲にある増
殖に対する温度は、新規微生物がバシラス・ステ
アロサーモフイラス・コンプレツクス（Bacillus
atearothermophilus complex）に帰属すること
を示している。 形 態 胞子は卵形で、約１×1.6μであり更に末端又は
末端の近くに位置している。 胞子嚢は強く膨潤しておりラケツト又は太鼓の
ばち様である。 酵素活性の決定 １マルトース産生アミラーゼ単位(U)は、標準条
件（温度60℃、PH5.5および反応温度30分）下で
毎分1μモルのマルトースに相当する還元糖を形
成する酵素の量と定義する。 0.1M酢酸塩緩衝液又は0.05M燐酸塩緩衝液
（PH５）中の0.5％可溶性デンプン（メルク
（Merck）社によつて供給される）を、１ml当た
り0.1〜0.2Uを含有する脱イオン水に溶解した酵
素１mlでインキユベートする。0.05NNaOHを４
ml添加することにより30分後に反応を停止する。 次いで、還元糖の含量をソモギイー
（Somogyi）法により測定する（Somogyi：J.
Biol.Chem.、193、p265（1951）。 酵素活性を測定する別の方法は、マルトトリオ
ースを当モル量のマルトースおよびグルコースに
定量的に分解できる能力に基づく。 １マルトース産生アミラーゼNOVO単位
（MANU）は、標準条件下で毎分1μモルのマル
トトリオースを分解する酵素の量として定義す
る。PHを約11にシフトさせることにより酵素反応
を停止する。得られたグルコースは、脱水素酵素
（メルク社、GlucDH）により、NADHの形成の
もとグルコノラクトンに変換される。形成した
NADHの量を、340nmでの比色定量により測定
した。 標準条件：温度37℃±0.05℃ PH5.0 インキユーベーシヨン時間30分 試 薬： １ 0.1Mクエン酸塩緩衝液（PH5.0） 5.255ｇのクエン酸（C6H8O7、H2O）を、約
200mlの脱イオン水に溶解し次いで4.0／
1.0NNaOHを用いPHを5.0に調整する。脱イオン
水を添加し250mlとし次いでPHをコントロールす
る。緩衝液を冷蔵庫内で１週間保存する（PHは使
用前に検査する必要がある）。しかし好ましくは
試験日毎に調製する。 ２ マルトトリオース基質20mg／ml 500（1000）mgのマルトトリオース（シグマ
（Sigma M8378）に、クエン酸塩緩衝液（試薬
１）を25（50ml）まで添加する。試験毎に調製す
る。 ３ GlucDH試薬 酵素混合物｛メルク（merck）No.14055フラス
コ「１」および「２」｝、を緩衝液メルクNo.14051
を用いて満たす。15分放置後、フラスコ内容物を
約200ml緩衝液（メルクNo.14051）を有する500ml
測定フラスコに移し更に別の緩衝液を添加して
500mlとする。冷蔵庫内で14日間安定である。 ４ 停止剤 0.06NNaOH グルコース標準曲線： 1.6ｇのグルコースを1000mlの脱イオン水に溶
解し次いで1.0、2.0、4.0、6.0および10.0mlを、脱
イオン水で希釈して100mlにする。得られた５種
の標準液は、各々88.8、177.6、355.2、532.9およ
び888.1μモル／のグルコース濃度を有する。 上記グルコース標準液2.0mlをGlucDH試薬3.0
mlと混合し次いで室温で30分インキユベートし、
しかる後OD340を測定することによりグルコース
標準曲線を作成する。ブランクとして、グルコー
スの代わりに脱イオン水を含むサンプルを用い
る。 酵素試薬サンプル： 最終希釈度が標準曲線によりカバーされる範囲
内にあるように試験サンプルを脱イオン水で希釈
する。 分 析： 500μのマルトトリオース基質（37℃に予熱）
を、500μ酵素（37℃に予熱）に添加し注意深
く混合後混合物を水浴（37℃）にとりつけた。30
分反応後、試験管を水浴からとり出し、1000μ
の停止剤を添加した。次いで、3.0mlのGlueDH
試薬を添加し、室温で30分放置後OD340を測定し
た。 ブランクとして、酵素含有サンプル、停止剤お
よびマルトトリオース基質を用いた。停止剤添加
直後に、マルトトリオース基質を添加した。 酵素の製造 本発明のマルトース産生アミラーゼを産生しう
るバシラス（Bacillus）株を通常、適当な発酵培
地中で好気性条件下で培養する前に固体基質上で
増殖させる。両方の培地は、酵母エキスのような
生長促進栄養素と一緒に、同化しうる炭素源及び
窒素源並びに所望により無機塩を含む。発酵を、
50〜55℃の範囲で、6.5のPHで実施するのが典型
的であり、自動装置によりほぼ一定に保持するの
が好ましい。酵母は培地中に分泌される。 生じる、発酵液から細菌細胞、崩壊物を他の固
形分と一緒に例えば遠心分離により除去すること
ができる。酵素を含む上澄液を更に例えば過ま
たは遠心分離により清澄にし、次に必要に応じ例
えば限外過によるか、または減圧下に蒸発器中
で濃縮し、得られた濃縮液を必要に応じて、例え
ば凍結乾燥または噴霧乾燥によつて乾燥すること
ができる。生ずる粗製酵素製品は、約500〜
25000E／ｇの範囲の活性を示すのが代表的であ
る。 酵素の精製 本発明のマルトース産生アミラーゼは、バツチ
の発酵培養ブロスから次の如くして精製できる： 4E／mlの酵素活性を有する培養ブロス250を
過し次いで液を遠心分離し、無菌過し次い
で凍結乾燥する。もとの活性の47％に相当する、
１ｇ当たり2400Eの活性を有する凍結乾燥粉末
193ｇを得る。 粉末を15mMの酢酸塩緩衝液（PH5.0）に溶解
し次いで電導率や約1mSになるまで15mM酢酸塩
緩衝液（PH5.0）に対し透析する。次いで、同緩
衝液ですでに平衡化した陽イオン交換体CM−セ
フアロースCl−6Bに、透析物を適用した。アミ
ラーゼをカラム内に通過せしめ、一方残存タンパ
クの60％をイオン交換体により吸着された。 このカラムからの溶出液のPHを酢酸でPH4.0に
調整し次いで引き続き溶出液を、15mM酢酸塩緩
衝液（PH4.0）で平衡化したCM−セフアロース
C1−6Bに適用した。これらの条件のもとで、ア
ミラーゼはイオン交換体により吸着される。次い
で、イオン強度を増加した、PH4.0の酢酸塩緩衝
液で酵素を溶離する。溶出液中の酵素活性は対称
ピーク中のタンパク含量に従う。ピーク部分は、
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による単
一な鋭いタンパクバンドを有す。MWは約70000
ダルトンである。イソーエレクトロフオカツシン
グにより測定したpIは8.5である。結晶化し、再
溶解し更に凍結乾燥した製品について比活性はタ
ンパク１mg当たり325MANUである。 免疫学的性質 アクセルセン（N.H.Axelsen）らによりア・
マニユアル・オブ・クオンテイタテイブ・イムノ
エレクトロフオレシス（Ａ Manual of
Quantitative Immunoelectrophoresis）（オス
ロ、1973）23章に記載された方法により、精製マ
ルトース産生アミラーゼでうさぎを免疫すること
によつて単因子に抗血清を生じさせた。 この血清に対しての粗C599アミラーゼについ
ての、前記著者による交差イミムエレクトロフオ
レシスにより、抗血清の単一特異性を確認する免
疫沈降体の単一ピークを得た。 酵素化学的性質 本発明のマルトース産生アミラーゼの活性の温
度およびPHに対する依存性を、PH及び温度を所定
の数値に調節した反応混合物を使用して、前記の
方法によつて測定した。 添付図面を参照されたい。 第１図は、温度に対しプロツトした相対活性を
示すグラフであり（基質４％可溶性デンプン、PH
5.5（0.1M酢酸塩）、反応時間30分）更に 第２図は、PHに対しプロツトした相対活性を示
す（温度60℃、基質２％可溶性デンプン、反応時
間30分、MCイリバイン（Ilivaine）緩衝液）。 添付図面から以下の内容が明らかである。すな
わち、C599マルトース産生アミラーゼは約60℃
のPH5.5で最適活性を有し更にその最適PHは4.5〜
6.0の範囲内にある。最適活性の50％以上が80℃
でも未だ見出されている。 マルトース産生酵素の熱安定性を測定するた
め、酵素製剤（1500E／ｇ）を、それぞれ50℃、
60℃および70℃の温度でPH5.5の0.1M酢酸塩緩衝
液（150mg／ml）と混合した。残留アミラーゼ活
性を上記方法で測定した。次表に結果を示す：
プンを加水分解し得る酵素（以下、マルトース産
生アミラーゼとも言う）およびその製造方法に関
する。 発明の背景 β−アミラーゼは、マルトース産生エキソ−ア
ミラーゼであり、アミロース、アミロペクチン又
はグリコーゲンの非還元性末端からα−１，４−
グルコシド結合を加水分解し、マルトースのβ形
を与える。マルトースのβ形は、水溶液でα−形
およびβ−形の混合物に自然的に異性化するであ
ろう。 β−アミラーゼは、製糖産業、製パン産業、お
よび醸造産業において用いるマルトース含有シロ
ツプを得るために用いられる。 β−アミラーゼは、種々の植物および微生物か
ら単離されてきている（W.M.FogartyおよびC.
T.Kelly、Progress in Industrial
Microbiology、15巻、112−115頁、1973年）。植
物（大麦、甘しよおよび大豆）およびバシラス
（Bacillus）種、B.ミコイデス（B.mycoides）、
B.メガテリウム（B.megaterium）、およびB.ポ
リミキサ（B.polymyxa）由来のβ−アミラーゼ
は、サルフイデイリル（sulphydryl）試薬、例え
ば活性部位がSH基を含むことが示されるような
PCMB（パラクロロ安息香酸水銀）によつて活性
が阻害される全酵素である。 これまでPCMBによつて阻害されないとして
説明されてきた唯一のβ−アミラーゼは、バシラ
ス サーキユランス（Bacillus circulans）であ
る（米国特許4001136）。B.サーキユランス（B.
circulans）β−アミラーゼは、上述のβ−アミ
ラーゼよりもより熱的に安定である。しかし、65
℃およびそれ以上で急速に失活する。 水性媒体中デンプンをβ−アミラーゼにより加
水分解される、マルトースの製造方法において、
レトログラデーシヨン（retrogradation）を阻害
しかつ微生物感染を避けるため約65〜70℃のプロ
セス温度を用いることが好都合である。 従つて、上述のバシラス サーキユランス
（Bacillus circulans）β−アミラーゼは、その急
速な失活の故に約65〜70℃での商業的用途に対し
ては十分適合したものではない。 米国特許3804715においては、熱抵抗性β−ア
ミラーゼが開示されており、これは英国特許
1130398において記載されている如く小麦のもみ
がらから抽出される。しかるに、β−アミラーゼ
は、商業的プロセスにおいて細菌源由来の酵素と
比較して興味が少ない。と言うのは、後者は植物
源のβ−アミラーゼのコストと比較して相当に低
コストで大規模で製造できるからである。 かくして、デンプンの加水分解を経済的方法で
可能ならしめるために長期間65〜70℃で用いるこ
とのできる十分に熱安定性である、微生物のマル
トース産生アミラーゼの有効は製法が要求され
る。 本発明の目的は、PCMBの如きスルフイデイ
リル試剤によつて失活されるものとは異なり新規
な微生物マルトース産生アミラーゼを提供するこ
とにあり、このアミラーゼは公知の微生物のβ−
アミラーゼよりもより高い温度安定性を有する。 本発明はかかる性質を有する、新規な抽出細胞
マルトース産生酵素（C599アミラーゼ）が、バ
シラス ステアロサーモフイラス コンプレツク
ス（Bacillus stearothermophilus complex）に
帰属する、新規な単離された微生物から産生され
るという知見に基づいている。 本発明のより良き理解のため、以下の説明並び
に添付図面に注意されるべきである： 第１図は温度に対するマルトース産生酵素の相
対活性をプロツトしたグラフであり、 第２図はPHに対し相対活性をプロツトしたグラ
フであり、さらに 第３図は本発明の新規プラスミドpDN452に対
する制限エンドヌクレアーゼ制限地図である。 発明の要約 本発明の第一の面によれば、本発明はマルトー
ス産生アミラーゼ酵素製品を提供するものであ
り、この製品は以下の特徴を有する新規な熱安定
性マルトース産生アミラーゼを含んでなる： (a) バシラス菌株C599（受託番号NC1B11837）を
適当な栄養培地中で培養することによつて得ら
れ、 (b) バシラス（Bacillus）菌株C599から由来した
マルトース産生アミラーゼの酵素化学的および
免疫学的性質を示し、 (c) PH5.5で酢酸塩緩衝液（0.1M）中30分の反応
時間で測定したその最適活性は約60℃であり、 (d) 約60℃のMCイルバイン（Ilvaine）緩衝液中
で測定した場合、30分の反応時間でその最適PH
が4.5〜６の範囲内にあり、さらに (e) PH5.5の酢酸塩緩衝液（0.1M）中70℃で60分
後で少なくとも75％の残留活性を有する。 マルトース産生アミラーゼ製品は固体又は液体
の形態にある。固体形態物は１ｇ当たり500〜
25000U（後に定義）の活性度を一般に有する。 第二の面によれば、本発明は上記のマルトース
産生の熱安定性アミラーゼ酵素製品の製造方法を
提供するものであり、この方法はバシラス
（Bacillus）菌株C599又はそのアミラーゼ産生変
異株又は突然変異株を、炭素源および窒素源並び
に無機塩を含有する適当な栄養培地中で培養し、
引き続き所望によりマルトース産生アミラーゼ酵
素製品を回収することを含んでなる。 更に、DNA組切換え技術を用いることにより、
形質転換した新規熱安定性マルトース産生アミラ
ーゼについてコードする遺伝子を、他の微生物に
形質転換するが、該微生物は適当な培養条件のも
とで、供与体微生物（C599）によつて産生され
るよりも、実質的により多量のマルトース産生ア
ミラーゼを産生する。 第三の面によれば、本発明は適当な宿主微生物
を、マルトース産生の熱安定性アミラーゼについ
てコードする遺伝子を含有する組換え型プラスミ
ドを用いて変質転換し、次いで炭素源および窒素
源並びに無機塩を含有する適当な栄養培地中で変
質転換した微生物を培養し、更に引き続き所望に
より該マルトース産生アミラーゼ酵素製品を回収
することによりマルトース産生アミラーゼ酵素の
製造方法を提供する。 別の面によれば、本発明は熱安定性マルトース
産生アミラーゼについてコードする遺伝子を含有
する組換え型プラスミドの調製方法を提供するも
のであり、この方法はアミラーゼを産生する供与
体微生物由来の染色体DNAを、適当な制限酵素
を用いて切断してアミラーゼコード遺伝子を含有
する線状DNA−鎖を得、適当なベクターを適当
な制限酵素を用いて切断し第二の線状DNA−配
列を得、次いで線状DNA−配列を結合しアミラ
ーゼ遺伝子を含有する組換えプラスミドを得るこ
とを含んでなる。 好ましくはE.コリー（coli）プラスミドを、適
当な制限酵素を用いて切断するが、この酵素は供
与体DNAの断片の両端に結合可端は両端を有す
る線状DNAを与えるであろう。 DNA−配列の二種の線状源の結合は、当業者
に周知の技術を用い、リガーゼを使用することに
より達成される。 本発明の好ましい態様によれば、宿主微生物は
バシラス群、好ましくは、B.サブチリス
（subtilis）から選ばれる。 宿主微生物の形質転換は又、組換えプラスミド
をE.コリー（coli）細胞に形質転換し、デンプン
崩壊形質転換体を同定し次いでそのようなAmy+
形質転換体由来の組換えプラスミドを選択された
宿主微生物にサブクローニングすることを含む周
知方法によつても達成される。 宿主微生物（好ましくはアミラーゼ活性を示さ
ない）は、適当な培地で培養した場合、該組換え
プラスミドを獲得すると、新規なマルトース産生
アミラーゼを産生する。アミラーゼは増殖培地に
分泌し、かくして簡単な酵素回収工程を得る。 本発明は又、前記アミラーゼについてコードす
る遺伝子を含有する、新規な組換えプラスミド、
pDN452を提供するものであり、このプラスミド
は、バシラス（Bacillus）C599由来の染色体
DNAを製限酵素Mbolを用いて切断し、４〜
12kb（キロベース対）範囲のDNA−配列を単離
し、E.コリー（coli）プラスミドpACYC184（す
でに制限酵素BamHLで切断されている）と結合
させ、E.コリー（coli）細胞に形質転換し、アミ
ラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを担持する、
澱粉崩壊形質転換体を同定し、該プラスミドを制
限酵素Sau3Alを用いて切断し、すでに制限酵素
BamHLを用いて切断されたプラスミドpBD64と
アミラーゼ活性を表わすDNA断片とを結合させ
次いで新規な組換えプラスミドをB.サブチリス
（subtilis）に形質転換することにより調整され
る。 第３図は、本発明の新規プラスミドpDN452に
対する制限エンドーヌクレアーゼ制限地図を示
す。新規プラスミドは7.6kb雑種プラスミドであ
り、これはpBD64のヌクレオシド配列を含んで
なり更に該プラスミドのBamH1部位で、前記ア
ミラーゼについてコードするバシラス
（Bacillus）C599由来のDNA配列が挿入されてい
る。 別の面から、本発明は高純度マルトースシロツ
プの製造方法を提供するものであり、この方法に
おいてはデンプンを、水性媒体中新規マルトース
産生アミラーゼ酵素製品で処理する。 試験結果より、新規マルトース産生アミラーゼ
酵素製品は、マルトースおよびハイマルトースシ
ロツプの製造に適していることが判明した。この
ような製品は、低吸湿性、低粘度、良好な熱安定
性およびまろやかで、マルトースの甘すぎない味
覚の故に、幾つかの製果工場による製品として特
に興味がある。 マルトースシロツプを製造する工業的方法は、
デンプンを液化し、次いでマルトース産生酵素、
並びに所望によりアミロペクチンの１，６−分岐
点を分解する酵素、例えばα−１，６−アミログ
ルコシダーゼを用いて糖化することを含んでな
る。 本発明の新規酵素は、公知のβ−アミラーゼを
同様に多くの点において同様に反応するけれど
も、以下の詳細な説明からも明らかなように幾つ
かの本質的な点において異つている。従つて、新
規酵素はβ−アミラーゼよりもむしろマルトース
産生アミラーゼとして特徴づけられる。 新規酵素は、SDS−ポリアクリルアミド ゲル
電気泳動において、約70000ダルトンの分子量を
示す単一バンドとして移動する。薄層ゲルエレク
トロフオカスシングによつて決定した等電点は
8.5である。 C599アミラーゼは、アミロペクチン、グリコ
ーゲンおよびアミロース、反応生成物の実質的部
分を構成するマルトースを加水分解する。グルコ
ースは、形成したマルトース１〜10％に対応して
小量産生される。 分枝多糖類、例えばアミロペクチンおよびグリ
コーゲンからC599アミラーゼはリミツトデキス
トリンを形成し、これはグリコアミラーゼにより
加水分解できる。 スルヒドリル試剤、例えばｐ−700安息香酸水
銀並びにキレート化剤、例えばEDTAは酵素活
性に何ら影響を与えない。 C599マルトース産生アミラーゼは次の点にお
いて公知のβ−アミラーゼと異なる： １ シユレーデインガーシクロデキストリンを定
量的に加水分解する。シユレーデインガーβ−
シクロデキストリンは３：１のモル比でマルト
ースおよびグルコースに加水分解され、一方、
α−シクロデキストリンは10：１のモル比でマ
ルトースおよびグルコースに加水分解される。
マルトース産生アミラーゼでインキユベートし
たα−シクロデキストリンの 1HNMFスペク
トル分析は、第一の主要生成物としてα−マル
トースの初期形成を示す。 ２ マルトトリオースは、等モル量のマルトース
およびグルコースに定量的に分解する。マルト
ース産生アミラーゼでインキユーベートしたマ
ルトトリオースの 1HNMRスペクトル分析は、
加水分解生成物がα−マルトースおよびグルコ
ースであることを示す。 ３ 70℃の緩衝液中で安定であり、更に、 ４ C599マルトース産生アミラーゼのリミツト
デキストリンはI2−KI−試剤との着色複合体を
与えない。 従つて、本発明に係るマルトース産生アミラー
ゼは、α−１，４−グルコシド結合を攻撃する外
酵素であり、主加水分解生成物はα−マルトース
である。 公知のマルトースシロツプ中に存在するマルト
トリオースを、マルトースおよびグルコースに定
量的に分解しこれによりマルトース収率を増加す
る、本発明のマルトース産生アミラーゼの能力は
注目すべきである。と言うのは、最近、マルトー
ス80％以上を含有するハイマルトースシロツプに
興味が高まつているからである。 本発明の詳細 本発明にかかるマルトース産生アミラーゼを産
生し得る微生物は、以下の如く調製した寒天基質
上で増殖するその能力によつて選択した。 トリプトン（10ｇ）、アミロペクチン（CPC雪
片10ｇ）、バクト（Bacto）寒天（40ｇ）および
脱イオン水（1000ml）を以下の組成を有する、当
量の塩の溶液と共に無菌的に55℃で混合した： （NH4）2SO4：0.04重量％ MgSO4、7H2O：0.1 〃 CaCl2：0.04重量％ KH2PO4：0.6 〃 塩の溶液のPHを、10N硫酸で3.0に調整した。 クルスビク（Krisuvilc）（アイスランドの温泉
地）で採取した土壊サンプルを上記寒天基質上に
散布し次いで65℃で培養した。 48時間後、寒天表面をヨウ素蒸気で発色させ次
いで未発色アミロペクチンの帯域によつて囲まれ
たコロニー、C599を単離した。下方に寒天を有
するC599の単離したコロニーを、PH4.5のデンプ
ンと共に60℃および70℃で一夜インキユベートし
た。薄層クロマトグラフイン試験は、加水分解主
産物としてマルトースを示した。 単離した微生物C599をナシヨナル コレツク
シヨン オブ インダステリアル バクテリア
（National Collection of Industrial Bacteria）
（トリーリサーチ・ステシヨン、アバデイーン、
スコツトランド）に1983年３月15日に、受託番号
NC11837をもつて寄託した。 分 類 近時において見出された本発明に係る微生物
は、好気性で、杆状でかつ有芽細菌である。従つ
て、該微生物はバシラス（Bacillus）属に属す
る。 胞子形成が乏しい寒天基質上では、培養株が急
速に自己融解し次いで死滅する。従つて、バシラ
ス（Bacillus）種の分類に対し通常用いられてい
る分類学上のプログラムを行うことは不可能であ
つた。 しかし、形態並では50℃〜70℃の範囲にある増
殖に対する温度は、新規微生物がバシラス・ステ
アロサーモフイラス・コンプレツクス（Bacillus
atearothermophilus complex）に帰属すること
を示している。 形 態 胞子は卵形で、約１×1.6μであり更に末端又は
末端の近くに位置している。 胞子嚢は強く膨潤しておりラケツト又は太鼓の
ばち様である。 酵素活性の決定 １マルトース産生アミラーゼ単位(U)は、標準条
件（温度60℃、PH5.5および反応温度30分）下で
毎分1μモルのマルトースに相当する還元糖を形
成する酵素の量と定義する。 0.1M酢酸塩緩衝液又は0.05M燐酸塩緩衝液
（PH５）中の0.5％可溶性デンプン（メルク
（Merck）社によつて供給される）を、１ml当た
り0.1〜0.2Uを含有する脱イオン水に溶解した酵
素１mlでインキユベートする。0.05NNaOHを４
ml添加することにより30分後に反応を停止する。 次いで、還元糖の含量をソモギイー
（Somogyi）法により測定する（Somogyi：J.
Biol.Chem.、193、p265（1951）。 酵素活性を測定する別の方法は、マルトトリオ
ースを当モル量のマルトースおよびグルコースに
定量的に分解できる能力に基づく。 １マルトース産生アミラーゼNOVO単位
（MANU）は、標準条件下で毎分1μモルのマル
トトリオースを分解する酵素の量として定義す
る。PHを約11にシフトさせることにより酵素反応
を停止する。得られたグルコースは、脱水素酵素
（メルク社、GlucDH）により、NADHの形成の
もとグルコノラクトンに変換される。形成した
NADHの量を、340nmでの比色定量により測定
した。 標準条件：温度37℃±0.05℃ PH5.0 インキユーベーシヨン時間30分 試 薬： １ 0.1Mクエン酸塩緩衝液（PH5.0） 5.255ｇのクエン酸（C6H8O7、H2O）を、約
200mlの脱イオン水に溶解し次いで4.0／
1.0NNaOHを用いPHを5.0に調整する。脱イオン
水を添加し250mlとし次いでPHをコントロールす
る。緩衝液を冷蔵庫内で１週間保存する（PHは使
用前に検査する必要がある）。しかし好ましくは
試験日毎に調製する。 ２ マルトトリオース基質20mg／ml 500（1000）mgのマルトトリオース（シグマ
（Sigma M8378）に、クエン酸塩緩衝液（試薬
１）を25（50ml）まで添加する。試験毎に調製す
る。 ３ GlucDH試薬 酵素混合物｛メルク（merck）No.14055フラス
コ「１」および「２」｝、を緩衝液メルクNo.14051
を用いて満たす。15分放置後、フラスコ内容物を
約200ml緩衝液（メルクNo.14051）を有する500ml
測定フラスコに移し更に別の緩衝液を添加して
500mlとする。冷蔵庫内で14日間安定である。 ４ 停止剤 0.06NNaOH グルコース標準曲線： 1.6ｇのグルコースを1000mlの脱イオン水に溶
解し次いで1.0、2.0、4.0、6.0および10.0mlを、脱
イオン水で希釈して100mlにする。得られた５種
の標準液は、各々88.8、177.6、355.2、532.9およ
び888.1μモル／のグルコース濃度を有する。 上記グルコース標準液2.0mlをGlucDH試薬3.0
mlと混合し次いで室温で30分インキユベートし、
しかる後OD340を測定することによりグルコース
標準曲線を作成する。ブランクとして、グルコー
スの代わりに脱イオン水を含むサンプルを用い
る。 酵素試薬サンプル： 最終希釈度が標準曲線によりカバーされる範囲
内にあるように試験サンプルを脱イオン水で希釈
する。 分 析： 500μのマルトトリオース基質（37℃に予熱）
を、500μ酵素（37℃に予熱）に添加し注意深
く混合後混合物を水浴（37℃）にとりつけた。30
分反応後、試験管を水浴からとり出し、1000μ
の停止剤を添加した。次いで、3.0mlのGlueDH
試薬を添加し、室温で30分放置後OD340を測定し
た。 ブランクとして、酵素含有サンプル、停止剤お
よびマルトトリオース基質を用いた。停止剤添加
直後に、マルトトリオース基質を添加した。 酵素の製造 本発明のマルトース産生アミラーゼを産生しう
るバシラス（Bacillus）株を通常、適当な発酵培
地中で好気性条件下で培養する前に固体基質上で
増殖させる。両方の培地は、酵母エキスのような
生長促進栄養素と一緒に、同化しうる炭素源及び
窒素源並びに所望により無機塩を含む。発酵を、
50〜55℃の範囲で、6.5のPHで実施するのが典型
的であり、自動装置によりほぼ一定に保持するの
が好ましい。酵母は培地中に分泌される。 生じる、発酵液から細菌細胞、崩壊物を他の固
形分と一緒に例えば遠心分離により除去すること
ができる。酵素を含む上澄液を更に例えば過ま
たは遠心分離により清澄にし、次に必要に応じ例
えば限外過によるか、または減圧下に蒸発器中
で濃縮し、得られた濃縮液を必要に応じて、例え
ば凍結乾燥または噴霧乾燥によつて乾燥すること
ができる。生ずる粗製酵素製品は、約500〜
25000E／ｇの範囲の活性を示すのが代表的であ
る。 酵素の精製 本発明のマルトース産生アミラーゼは、バツチ
の発酵培養ブロスから次の如くして精製できる： 4E／mlの酵素活性を有する培養ブロス250を
過し次いで液を遠心分離し、無菌過し次い
で凍結乾燥する。もとの活性の47％に相当する、
１ｇ当たり2400Eの活性を有する凍結乾燥粉末
193ｇを得る。 粉末を15mMの酢酸塩緩衝液（PH5.0）に溶解
し次いで電導率や約1mSになるまで15mM酢酸塩
緩衝液（PH5.0）に対し透析する。次いで、同緩
衝液ですでに平衡化した陽イオン交換体CM−セ
フアロースCl−6Bに、透析物を適用した。アミ
ラーゼをカラム内に通過せしめ、一方残存タンパ
クの60％をイオン交換体により吸着された。 このカラムからの溶出液のPHを酢酸でPH4.0に
調整し次いで引き続き溶出液を、15mM酢酸塩緩
衝液（PH4.0）で平衡化したCM−セフアロース
C1−6Bに適用した。これらの条件のもとで、ア
ミラーゼはイオン交換体により吸着される。次い
で、イオン強度を増加した、PH4.0の酢酸塩緩衝
液で酵素を溶離する。溶出液中の酵素活性は対称
ピーク中のタンパク含量に従う。ピーク部分は、
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による単
一な鋭いタンパクバンドを有す。MWは約70000
ダルトンである。イソーエレクトロフオカツシン
グにより測定したpIは8.5である。結晶化し、再
溶解し更に凍結乾燥した製品について比活性はタ
ンパク１mg当たり325MANUである。 免疫学的性質 アクセルセン（N.H.Axelsen）らによりア・
マニユアル・オブ・クオンテイタテイブ・イムノ
エレクトロフオレシス（Ａ Manual of
Quantitative Immunoelectrophoresis）（オス
ロ、1973）23章に記載された方法により、精製マ
ルトース産生アミラーゼでうさぎを免疫すること
によつて単因子に抗血清を生じさせた。 この血清に対しての粗C599アミラーゼについ
ての、前記著者による交差イミムエレクトロフオ
レシスにより、抗血清の単一特異性を確認する免
疫沈降体の単一ピークを得た。 酵素化学的性質 本発明のマルトース産生アミラーゼの活性の温
度およびPHに対する依存性を、PH及び温度を所定
の数値に調節した反応混合物を使用して、前記の
方法によつて測定した。 添付図面を参照されたい。 第１図は、温度に対しプロツトした相対活性を
示すグラフであり（基質４％可溶性デンプン、PH
5.5（0.1M酢酸塩）、反応時間30分）更に 第２図は、PHに対しプロツトした相対活性を示
す（温度60℃、基質２％可溶性デンプン、反応時
間30分、MCイリバイン（Ilivaine）緩衝液）。 添付図面から以下の内容が明らかである。すな
わち、C599マルトース産生アミラーゼは約60℃
のPH5.5で最適活性を有し更にその最適PHは4.5〜
6.0の範囲内にある。最適活性の50％以上が80℃
でも未だ見出されている。 マルトース産生酵素の熱安定性を測定するた
め、酵素製剤（1500E／ｇ）を、それぞれ50℃、
60℃および70℃の温度でPH5.5の0.1M酢酸塩緩衝
液（150mg／ml）と混合した。残留アミラーゼ活
性を上記方法で測定した。次表に結果を示す：
【表】
70℃で60分後、酵素活性の75％が保持される。
公知のβ−アミラーゼは、このような良好な熱安
定性を示さない。 本発明のマルトース産生アミラーゼの活性に対
する、多種の試薬の影響を次の第２表に示す。
公知のβ−アミラーゼは、このような良好な熱安
定性を示さない。 本発明のマルトース産生アミラーゼの活性に対
する、多種の試薬の影響を次の第２表に示す。
【表】
【表】
Hg++およびCa++の如き重金属イオンは、C599
アミラーゼ活性を阻害し、一方、PCMB、
EDTA又はシユレデインガー−シクロデキスト
リンは活性に何ら影響を与えない。 バシラスC599由来のマルトース産生アミラーゼ
遺伝子のクローニング 以下に詳しく述べるように、マルトース産生ア
ミラーゼ遺伝子は次の方法によりクローン化で
き、B.サブチリス（subtilis）内で発現できる： C599由来の染色体DNAを、制限酵素MboI
（Biolabs cat.No.147）を用いて部分分解する。４
〜12kbの範囲内の断片を単離し次いで、すでに
制限酵素BamHI（Biolabs cat.No.136）で切断さ
れた、E.コリー（coli）プラスミドpACYL184
（チヤーン（Chan）等、J.Bacteriol.134：1141〜
56、1978）と結合させる（DANリガーゼ
（Biolabs Cat.No.202）を用いる）。 プラスミドpACYC184はテトラサイクリンお
よびクロラムフエニコールの双方に対し耐性を付
与し更に制限酵素BamHIに対し１個の制限部位
を有する。DNAをBamHI部位に挿入すると、テ
トラサイクリンに対する耐性を付与する能力が破
壊されるが、クロラムフエニコールに対しては破
壊されない。 結合混合物を、コンピテントE.コリー（coli）
細胞内に形質転換する。形質転換した細胞を、可
溶性デンプンおよびクロラムフエニコールを含有
する適当な選択培地上にプレートする。BamHI
部位内でクローン化した断片を担持する、クロラ
ムフエニコール抵抗性形質転換体はテトラサイク
リン感受性ありとして同定される。これらの内、
アミラーゼ活性を示す形質変換体は、寒天を含有
するデンプンをヨウ素の蒸気にさらした場合コロ
ニーの周囲に現われる青いハローによつて同定さ
れる。このような形質変換体は、新規のマルトー
ス産生アミラーゼについてコードする遺伝子を含
む、第一の組換えプラスミドを担持する。 B.サブチリス（subtilis）にサブクローニング
するため、プラスミドpBD64（スタフイロコツカ
スアウレウス（Staphylococcus aureus）プラス
ミドpUB110（Gryczan et al.，J.Bacteriol.141：
246−53、1980）の誘導体である）が用いられる。
pBD64は、B.サブチリス（subtilis）内で複製す
ることができ更にカナマイシンおよびクロラムフ
エニコールに対し耐性を付与する。 pBD64は、BamHIで分解され次いでSau3AI
（Biolabs Cat.No.169）で一部分解した先の調製の
第一の組換えプラスミドと結合させる。このサブ
クローニングは、プラスミドpUB110｛B.サブチ
リス（subtilis）に形質転換できるスタフイロコ
ツカス アウレウス（Staphylococcus aureus）
由来のプラスミドである｝を担持するアミラーゼ
−ネガチブB.サブチリス（subtilis）株を用い、
いわゆるレスキユ手法（Gryczan etal.、Mol.
Gen.Genet.177：459〜67、1980）により好まし
く行う。 次いで、B.サブチリス（subtilis）株を担持す
るpUB110の形質転換細胞を、可溶性デンプンお
よびクロラムフエニコールを含有する適当な選択
培地上にプレートする。第二の組換えプラスミド
を担持するAmy+形質転換体を上述の如く同定し
更にこの形質転換体由来のプラスミドを単離し次
いでpUB110を担持しないアミラーゼ−ネガチブ
バシラスサブチリス（Bacillus subtilis）に形質
転換する。次いで、これらの形質転換細胞を適当
な選択培地にプレートし更に上記第二の組換えプ
ラスミドを担持するAmy+形質変換体を同定す
る。 以下に本発明の実施例を非制限的に説明する。 例 １ バシラス株C599（受託番号NC1B11837）由来の
マルトース産生アミラーゼの製造 C599培養株を次の寒天上で１〜２日間60℃で
増殖した。 バクトデキストロース ２ｇ バクト寒天 25ｇ バクト炭素基（Difco Manual）内での微量金
属および塩 0.5ｇ 水 1000ml 接種材料 上記の増殖培地由来の凍結乾燥した培養株を、
500mlのバツフル付振とうフラスコ内中次の基質
100ml内で増殖させた： バクト トリプトン 10ｇ グルコース 10ｇ 燐酸水素カリウム ３ｇ 水 1000ml 培養は１〜２日間50〜55℃で行つた。 (a) 回分発酵 500mlの振とうフラスコに、次の組成を有する
基質1000mlを装入した： NZ−ケース（シエフイールド） 10ｇ 酵母エキス（バクト） ５ｇ リン酸水素カリウム ３ｇ マルトデキストリン 10ｇ 水 1000ml 上記接種材料は１〜５mlを、振とうフラスコに
接種した。培養は50℃で２日間行つた。 得られた発酵ブロスは１ml当たり約10〜20Uを
有していた。 振とうフラスコから550のスチール製フアー
メンターまでのスケールアツプは、培地の量を各
工程において３〜５倍増加させないことにより段
階的に行うことができる。 550のスケールでは、収率は１ml当たり約5U
であつた。 (b) 連続発酵 以下の組成を有するTMPおよびSMP基質を用
いて連続発酵を行つた。： TMP−基質：トリプトン（Bacto） 30ｇ マルトデキストリン
（MCO3L） 20ｇ 燐酸水素カリウム ３ｇ プルロニツク 0.5ｇ 水 1000ml SMP−基質：ソイトーン（デイフコ） 20ｇ マルトデキストリン 10ｇ 燐酸水素カリウム ３ｇ プルロニツク 0.5ｇ 水 1000ml 発酵は、１の実容量を有するエスシエバイラ
−（Esehweiler）フアーメンター（タイプS10）
を用いて行なつた。 発酵は上記接種材料100mlを用いて開始し、更
に基質の補充は24時間後55℃で開始した。３％硫
酸でPHを6.5に調節し、温度55℃に保つた。 通気 ：１／基質１／分 撹拌 ：1000ppm 希釈率：Ｄ＝0.05hr 上記条件のもとで、活性収率はTMPに対し１
ml当たり50〜75Uであり、SMPに対し１ml当た
り40〜50Uであつた。 例 ２ B.サブチリスC599由来のマルトース産生アミ
ラーゼ遺伝子のクローニング Ａ 微生物およびプラスミド 全てのバシラス サブチリス（Bacillus
subtilis）株は、B.サブチリス（subtilis）168
（Spizizen、Proc Natl.Acad.Sci.44：1072−78、
1958）の誘導体であつた。 DN304：aro I906saeA321amyはQB1133
（Steinmetz et al.、Mo1.Gen.Genet148：281−
85、1976）のMet+形質変換体であり更に1984年
３月７日にナシヨナル コレクシヨン オフ イ
ンダクトリアル バクテリー（Natinal
Collection of Industrial Bacteria、トリーリサ
ーチステーシヨン、アバデイーン、スコツトラン
ド）に寄託され、受託番号NC1B11957を得た。
DN314はDN304pUB110であり更にDN311は
DN304pBD64である。プラスミドpUB110および
pBD64（Gryczan et al.、J.Bacteriol.134：318−
329 1978、およびGryczan et al.、J.
Bacteriol.141：246−53、1980）はB.サブチリス
（subtilis）株BD366およびBD624からそれぞれ単
離した。pUB110およびpBD64は双方とも、カナ
マイシンに対し耐性を付与し更にpBD64又はク
ロラムフエニコールに耐性を付与した。B.サブ
チリス（subtilis）株168、QB1133、BD366およ
びBD624は、バシラス ジエネテイク ストツ
ク センター、コロンブス、オハイオ、USAか
ら得ることができる（それぞれ菌株フアイル番号
BGSC1Ar、IA289、IE6およびIE22）。全てのエ
シエリキア コリ（Escherichia coli）株は、E.
コリー（coli）K12の誘導体であつた。 E.コリー（coli）No.802met r-m+gallac
（Wood、J.Mol.Biol.16：118−33 1966）および
プラスミドpACYC184（チヤーン等、J.
Bacteriol.134：1141−56、1978）を担持するE.
coli MC1000：△（araleu）7697ara Ｄ 139△
lac ｘ 74 gal Ｋ gal Ｕ atr Ａ（Casadaban
et al.、J.Mol.Biol.30 138：179−207、1980）
は、1984年３月７日に寄託された（NC1B11958
およびNC1B11956）。 Ｂ E.コリーの形質転換 LB（10ｇのバクトトリプトン、５ｇのバクト酵
母抽出物および水１当たり10ｇNaCl、PH7.0）
中でE.コリー（coli）Ｋ−12株No.802の一夜培養
物を500mlLB中100倍に希釈し次いでOD450が0.4
になるまで37℃で増殖した。培養物を冷却し、
3000rpm（ゾーバル（Sorvall）GS3ローターで）
で15分間回転した氷上で15分放置し、200mlの冷
0.1MCaCl2で再懸濁させ、3000rpmで10分間回転
した氷上に20分間放置し、５mlの冷0.1MCaCl2に
再懸濁させ次いで氷上で20分間放置する。次いで
冷グリセロールを10％になるまで添加し次いで一
部を液体窒素中で凍結し次いで−70℃で保存し
た。凍結細胞を氷上で融解し、DNAを添加し、
混合物を氷上で45分、37℃で２分間インキユベー
トし次いで適当な選択培地上にプレートした。 Ｃ バシラス サブチリスの形質転換 コンピテント バシラス サブチリス
（Bacillus subtilis）細胞を、ヤシビン（Yasbin）
等（J.Bacteriol.121：296〜304、1975）に従つて
調製した。次いで、遠心分離（7000rpm、３分）
により細胞を得、20％グリセロールを含有する上
澄液10容量中に再沈殿させ、液体窒素中で凍結乾
燥し次いで−70℃で保存した。形質転換に対し、
凍結細胞を42℃で融解し次いで一容量の緩衝液
｛0.4％グルコース、0.04M MgCl2および0.002M
EGTAを含むSpizizenの微少培地（Spizizen、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 44：1072〜78、1958）｝
と混合した。DNAを添加し次いで37℃で20分間
振とうしながら混合物をインキユベートした。次
いで、細胞を適当な選択培地上にプレートした。 Ｄ E.コリー由来のプラスミドpACYC184の調製 プラスミドpACYC184を担持するE.コリーＫ−
12株MC1000を、250mlのLB、0.4％グルコース、
20μｇ／mlのクロラムフエニコール中で一夜増殖
した。細胞は、遠心分離により得、次いで４mlの
緩衝液１（0.025MのトリスHCl、PH＝8.0、0.01M
のEDTA、0.05Mのグルコース、２mg／mlのリゾ
チーム）中で再懸濁した。懸濁液を０℃で15分間
インキユベートし次いで８mlの緩衝液２（0.2Mの
NaOH、１％SDS）と混合した。次いで、６ml
の緩衝液３（3Mの酢酸ナトリウム、PH＝4.8）を
添加し、混合物を０℃で60分間保持し、次いで
19000rpmで20分間遠心分離した（ゾバールSS34
ローラで約45000ｇ）。上澄液を0.6容量の冷イソ
プロパノールで沈殿させ、次いで1.2mlの5TE
（0.05MトリスHCl、PH＝8.0、0.005M EDTA）
および20μの煮沸RNaseA（ベーリンガー）（２
mg／ml）中で再沈殿させた。30分後、VTi65管内
の4.0mlの緩衝液４（80ｇCsClおよび56mlの5TE）
および0.1mlのEtBr（エチジウム ブロミド）の
頂部上に加層した。混合物を45000rpmで20時間
遠心分離した。次いで、プラスミドを管から取り
出し、透析し次いでセクシヨンG.で述べた如く
抽出した。 Ｅ バシラス サブチリス（Bacillus subtilis）
DN311由来のプラスミドpBD64の調製 以下の修正を行う他は、E.コリー（coli）株
（セクシヨンＤ参照）について述べた如くプラス
ミドを調製した。増殖は、0.01Mの燐酸カリウ
ム、PH＝7.0および6μｇ／mlのクロラムウエニコ
ールを含むLB中で行つた。 採取後、細胞を37℃でリゾチームとインキユベ
ートした。緩衝液２は、１容量の緩衝液２および
３容量の緩衝液５（0.2Mのグリシン、0.2Mの
NACl、および１％のSDS）の混合物と取り換え
た。以下の工程はＤに述べた工程と同じである。 Ｆ B.サブチリス由来のプラスミドの小スチー
ル調製 LB（0.01Mの燐酸塩、PH7.0および適当な抗生物
質を含む）中、５mlのB.サブチリス（subtilis））
由来のプラスミドを、以下を除く他セクシヨンＥ
と同様に調製した： １：緩衝液の容量を1/4にした。 ２：0.5mlのフエノールおよび0.5mlのクロラムフ
エニコールを緩衝液３の後に添加する。 ３：19000rpmで遠心分離後、上澄液をエタノー
ルで沈殿させ、400μの緩衝液（0.05Mのトリ
スHCl、PH＝8.0、0.1Mの酢酸ナトリウム）中
で再沈殿させ、再たびプラスミドを沈殿させ、
400μの緩衝液中で再懸濁させ、洗浄し次い
で1μl／mlの煮沸RNaseA（ベーリンガー）を有
する100μのTE中で再懸濁させた。 Ｇ バシラスC599由来のクロラムフエニコール
DNAの調製 約50mlの培養物から凍結した細胞のペレツト
を、1.1mlの緩衝液（0.05MのトリスHCl、PH＝
7.4、0.1MのNaCl、25％の蔗糖）中で再懸濁させ
た。100μのリゾチーム（25mg／ml）および
150μのEDTA（0.5M、PH＝8.0）を添加した。
混合物を37℃で30分間インキユベートした。２ml
の0.2％SDSを、37℃で30分間のインキユベーシ
ヨン後添加した。0.95mlの混合物当り、１ｇの
CaClおよび0.05mlのEtBr（10mg／ml）を、添加し
次いで混合物を45000rpmで、15℃で20時間、
VTi65ローター（ベツクマン）中で遠心分離し
た。 長波長Ｕランプのもとで、DNAを位置決定し
次いで注射器をチユーブに入れDNAを取り出し
た。EtBrをイソプロパノールで抽出し次いで溶
液をTEE（0.01MトリスHCl、PH＝8.0、0.01Mの
EDTA）に対し２時間透析した。次いで溶液を
TEEで８mlに調節し、フエノールで２回更にク
ロロホルムで１回抽出した。DNAを0.1Mの
NaClおよび冷エタノールで沈殿させ、次いで１
mlのTE（0.01MトリスHCl、PH＝8.0、0.001Mの
EDTA）中で溶解した。染色体DNA（chr DNA）
の溶液を４℃で保存した。 Ｈ バシラス（Bacillus）C599由来のchr DNA
の部分切断および分画 C599（セクシヨンＧ参照）由来のchr DNA60μ
ｇを、900μの緩衝液（0.01MトリスHCl、PH＝
7.4、0.05MのNaCl、0.01MのMgCl2、0.006Mの
メルカプトエタノール、100μｇ／mlのゼラチン）
中、10単位のMboI（Biolabs Cat.No.147）を用い
37℃で切断した。10分後、更に40分後、450μ
のサンプルとフエノールを用いて抽出し、0.1M
のNaClおよび冷エタノールで沈殿した。各サン
プルを100μのTEE中に溶解した。12mlの蔗糖
勾配（Maniatis Ｔ等、Cell15：687−701、1978）
当たり、100μのDNAを付加し次いでSW41ロ
ーター（ベツクマン）中27000rpmで20℃で22時
間、遠心分離した。 管の底部を穿孔した後、0.5mlのフラクシヨン
を抜き取り次いで冷エタノールで沈殿させた。
DNAを50μのTEに溶解し次いで各フラクシヨ
ン中のDNAの大きさを0.5μｇ／mlのEtBrで染色
した0.7％アガロースゲル上で評価した。約４〜
12kbのDNAを含む断片を集め、フエノールで抽
出し、エタノールで沈殿させ次いでTE中に溶解
した。 Ｉ アミラーゼ遺伝子を含有する組換遺伝子の単
離 4μｇのpACY184（セクシヨンＤ参照）を、50μ
の緩衝液（0.006MトリスHCl、PH＝8.0、
0.15MのNaCl、0.006MのMgCl2、0.006Mのメル
カプトエタノール、100μｇ／mlのゼラチン）中
8UのBamHI（Biolaba Cat.No.136）を用いて：37
℃で１時間切断した。線状DNAを、子牛の小腸
アルカリ性ホスフアターゼ（シグマP4502）で処
理した（グツドマン等、Methuds in
Enzymology、68：75〜90、1979）。次いで、
0.4μｇBamHIおよびホスフアターゼ処理
pACYC184を、約100UDNAリガーゼ（Biolaba
Cat.No.202）を用い蔗糖勾配由来の約1μｇの
C599chrDNAと、100μの緩衝液（0.66Mトリス
HCl、PH＝7.5、0.01MのMgCl2、25μｇ／mlのゼ
ラチン0.001MのATP、0.0.1MのDTT）中、16℃
で４時間結合させた。結合DNAを、セクシヨン
Ｂで述べた知く、コンピテントE.コリー株No.802
に形質転換した。 二層から成る新たに注加した寒天プレート上に
細胞をプレートした：低部には、0.5％の可溶性
デンプンおよび60μｇ／mlのクロラムフエニコー
ルを有する10mlのLB寒天。頂部には、クロラム
フエニコールを含まない同じ寒天25ml。37℃で一
夜インキユベーシヨン後、約1200個のクロラムフ
エニコール耐性形質変換体を得た。これらの内
600個は、これらの形質変換体のプラスミドが
BamHI部位内のクローン化断片を担持している
ことを示す感受性テトラサイクリンであつた。こ
れらの600個のコロニー（C599の遺伝子バンクを
表わす）の内、一種の株（DN400と命名）は、
寒天を含むデンプンをヨウ素蒸気にさらすと、該
コロニーの周囲に青いハローが出現することによ
つて指示される如くアミラーゼ活性を示した。株
DN400は、アミラーゼコードづけ遺伝子を含む、
約14000の塩基対のプラスミド（pDN400と命名）
を担持することが判明した。 Ｊ バシラス サブチリスにおけるpDN400のサ
ブクローニング 約1μｇのpDN400（セクシヨン１で述べた如く
構成されかつセクシヨンＤにおいてpACY184に
ついて説明した如くE.コリー株DN400から調製
した）を、100μの緩衝液中で37℃で0.06Uの
Sau3Al（Biolabs Cat.No.169）を用いて切断した。
25μアリコートを、フエノール抽出し次いで
0.1MNaClおよび冷エタノールで沈殿させた。
DNAの1/2を、すでにBamHIで切断した（セク
シヨンＩでpACYC184について説明した如く）、
0.4μｇプラスミドpBD64（セクシヨンＥ参照）と
結合させた（セクシヨンＨ参照）。 該株由来のプラスミドを単離し（セクシヨンＦ
で説明した如く）次いでバシラス サブチリス株
（DN304と命名）に形質転換した（セクシヨンＣ
で説明した如く。 プラスミドpDN452を担持する、一種のAmy+
形質転換体株（DN463と命名）を単離した。以
下の例３で説明するように、DN463を培養した
場合、本発明の新規熱安定性アミラーゼ製品の収
率が向上することが説明した。 例 ３ バシラス サブチリスDN463由来の熱安定性
のマルトース産生アミラーゼの製造 上記クローン化微生物DN463の培養物を500ml
振とうフラスコ中の次の基質100ml上に接種し
た： 液化デンプン 12.5％ｗ／ｖ（水道水） 大豆ミル 7.5％ Na2HPO4 １ ％ 接種前に、5μｇ／mlのクロラムフエニコール
を上記基質に添加した。 30℃で３〜４日間インキユベーシヨンを行つ
た。 培養ブロスを、6000ｇで20分間遠心分離した。
約2000U／mlを有する、遠心分離濃厚物を次の実
施例で直接用いた。 例 ４ 糖化用基質を、イオン水に7DEのスプレー乾燥
したマルトデキストリンを再溶解し次いで約30％
D.S.に仕上げることによつて調製した。糖化実験
は、標準5000mlの実験室用バツチ反応器内で行つ
た。この基質の一部を60℃に加熱し次いでPHを
5.5に調整し次いで50アミラーゼ単位／ｇD.S.を
添加した。60℃で72時間後、シロツプ中のグルコ
ース、マルトースおよびマルトトリオースの含量
は次の如くであつた。 グルトース ：５％ マルトース ：67％ マルトトリオース：０％ 同条件のもと、25β−アミラーゼ単位／ｇD.S.
のバイオザイム（Biozym）MII（大豆β−アミラ
ーゼ、20.000β−アミラーゼ／ｇ）を用いて糖化
すると、グルコース0.3％、マルトース61％およ
びマルトトリオース７％を含有するシロツプを得
る。
アミラーゼ活性を阻害し、一方、PCMB、
EDTA又はシユレデインガー−シクロデキスト
リンは活性に何ら影響を与えない。 バシラスC599由来のマルトース産生アミラーゼ
遺伝子のクローニング 以下に詳しく述べるように、マルトース産生ア
ミラーゼ遺伝子は次の方法によりクローン化で
き、B.サブチリス（subtilis）内で発現できる： C599由来の染色体DNAを、制限酵素MboI
（Biolabs cat.No.147）を用いて部分分解する。４
〜12kbの範囲内の断片を単離し次いで、すでに
制限酵素BamHI（Biolabs cat.No.136）で切断さ
れた、E.コリー（coli）プラスミドpACYL184
（チヤーン（Chan）等、J.Bacteriol.134：1141〜
56、1978）と結合させる（DANリガーゼ
（Biolabs Cat.No.202）を用いる）。 プラスミドpACYC184はテトラサイクリンお
よびクロラムフエニコールの双方に対し耐性を付
与し更に制限酵素BamHIに対し１個の制限部位
を有する。DNAをBamHI部位に挿入すると、テ
トラサイクリンに対する耐性を付与する能力が破
壊されるが、クロラムフエニコールに対しては破
壊されない。 結合混合物を、コンピテントE.コリー（coli）
細胞内に形質転換する。形質転換した細胞を、可
溶性デンプンおよびクロラムフエニコールを含有
する適当な選択培地上にプレートする。BamHI
部位内でクローン化した断片を担持する、クロラ
ムフエニコール抵抗性形質転換体はテトラサイク
リン感受性ありとして同定される。これらの内、
アミラーゼ活性を示す形質変換体は、寒天を含有
するデンプンをヨウ素の蒸気にさらした場合コロ
ニーの周囲に現われる青いハローによつて同定さ
れる。このような形質変換体は、新規のマルトー
ス産生アミラーゼについてコードする遺伝子を含
む、第一の組換えプラスミドを担持する。 B.サブチリス（subtilis）にサブクローニング
するため、プラスミドpBD64（スタフイロコツカ
スアウレウス（Staphylococcus aureus）プラス
ミドpUB110（Gryczan et al.，J.Bacteriol.141：
246−53、1980）の誘導体である）が用いられる。
pBD64は、B.サブチリス（subtilis）内で複製す
ることができ更にカナマイシンおよびクロラムフ
エニコールに対し耐性を付与する。 pBD64は、BamHIで分解され次いでSau3AI
（Biolabs Cat.No.169）で一部分解した先の調製の
第一の組換えプラスミドと結合させる。このサブ
クローニングは、プラスミドpUB110｛B.サブチ
リス（subtilis）に形質転換できるスタフイロコ
ツカス アウレウス（Staphylococcus aureus）
由来のプラスミドである｝を担持するアミラーゼ
−ネガチブB.サブチリス（subtilis）株を用い、
いわゆるレスキユ手法（Gryczan etal.、Mol.
Gen.Genet.177：459〜67、1980）により好まし
く行う。 次いで、B.サブチリス（subtilis）株を担持す
るpUB110の形質転換細胞を、可溶性デンプンお
よびクロラムフエニコールを含有する適当な選択
培地上にプレートする。第二の組換えプラスミド
を担持するAmy+形質転換体を上述の如く同定し
更にこの形質転換体由来のプラスミドを単離し次
いでpUB110を担持しないアミラーゼ−ネガチブ
バシラスサブチリス（Bacillus subtilis）に形質
転換する。次いで、これらの形質転換細胞を適当
な選択培地にプレートし更に上記第二の組換えプ
ラスミドを担持するAmy+形質変換体を同定す
る。 以下に本発明の実施例を非制限的に説明する。 例 １ バシラス株C599（受託番号NC1B11837）由来の
マルトース産生アミラーゼの製造 C599培養株を次の寒天上で１〜２日間60℃で
増殖した。 バクトデキストロース ２ｇ バクト寒天 25ｇ バクト炭素基（Difco Manual）内での微量金
属および塩 0.5ｇ 水 1000ml 接種材料 上記の増殖培地由来の凍結乾燥した培養株を、
500mlのバツフル付振とうフラスコ内中次の基質
100ml内で増殖させた： バクト トリプトン 10ｇ グルコース 10ｇ 燐酸水素カリウム ３ｇ 水 1000ml 培養は１〜２日間50〜55℃で行つた。 (a) 回分発酵 500mlの振とうフラスコに、次の組成を有する
基質1000mlを装入した： NZ−ケース（シエフイールド） 10ｇ 酵母エキス（バクト） ５ｇ リン酸水素カリウム ３ｇ マルトデキストリン 10ｇ 水 1000ml 上記接種材料は１〜５mlを、振とうフラスコに
接種した。培養は50℃で２日間行つた。 得られた発酵ブロスは１ml当たり約10〜20Uを
有していた。 振とうフラスコから550のスチール製フアー
メンターまでのスケールアツプは、培地の量を各
工程において３〜５倍増加させないことにより段
階的に行うことができる。 550のスケールでは、収率は１ml当たり約5U
であつた。 (b) 連続発酵 以下の組成を有するTMPおよびSMP基質を用
いて連続発酵を行つた。： TMP−基質：トリプトン（Bacto） 30ｇ マルトデキストリン
（MCO3L） 20ｇ 燐酸水素カリウム ３ｇ プルロニツク 0.5ｇ 水 1000ml SMP−基質：ソイトーン（デイフコ） 20ｇ マルトデキストリン 10ｇ 燐酸水素カリウム ３ｇ プルロニツク 0.5ｇ 水 1000ml 発酵は、１の実容量を有するエスシエバイラ
−（Esehweiler）フアーメンター（タイプS10）
を用いて行なつた。 発酵は上記接種材料100mlを用いて開始し、更
に基質の補充は24時間後55℃で開始した。３％硫
酸でPHを6.5に調節し、温度55℃に保つた。 通気 ：１／基質１／分 撹拌 ：1000ppm 希釈率：Ｄ＝0.05hr 上記条件のもとで、活性収率はTMPに対し１
ml当たり50〜75Uであり、SMPに対し１ml当た
り40〜50Uであつた。 例 ２ B.サブチリスC599由来のマルトース産生アミ
ラーゼ遺伝子のクローニング Ａ 微生物およびプラスミド 全てのバシラス サブチリス（Bacillus
subtilis）株は、B.サブチリス（subtilis）168
（Spizizen、Proc Natl.Acad.Sci.44：1072−78、
1958）の誘導体であつた。 DN304：aro I906saeA321amyはQB1133
（Steinmetz et al.、Mo1.Gen.Genet148：281−
85、1976）のMet+形質変換体であり更に1984年
３月７日にナシヨナル コレクシヨン オフ イ
ンダクトリアル バクテリー（Natinal
Collection of Industrial Bacteria、トリーリサ
ーチステーシヨン、アバデイーン、スコツトラン
ド）に寄託され、受託番号NC1B11957を得た。
DN314はDN304pUB110であり更にDN311は
DN304pBD64である。プラスミドpUB110および
pBD64（Gryczan et al.、J.Bacteriol.134：318−
329 1978、およびGryczan et al.、J.
Bacteriol.141：246−53、1980）はB.サブチリス
（subtilis）株BD366およびBD624からそれぞれ単
離した。pUB110およびpBD64は双方とも、カナ
マイシンに対し耐性を付与し更にpBD64又はク
ロラムフエニコールに耐性を付与した。B.サブ
チリス（subtilis）株168、QB1133、BD366およ
びBD624は、バシラス ジエネテイク ストツ
ク センター、コロンブス、オハイオ、USAか
ら得ることができる（それぞれ菌株フアイル番号
BGSC1Ar、IA289、IE6およびIE22）。全てのエ
シエリキア コリ（Escherichia coli）株は、E.
コリー（coli）K12の誘導体であつた。 E.コリー（coli）No.802met r-m+gallac
（Wood、J.Mol.Biol.16：118−33 1966）および
プラスミドpACYC184（チヤーン等、J.
Bacteriol.134：1141−56、1978）を担持するE.
coli MC1000：△（araleu）7697ara Ｄ 139△
lac ｘ 74 gal Ｋ gal Ｕ atr Ａ（Casadaban
et al.、J.Mol.Biol.30 138：179−207、1980）
は、1984年３月７日に寄託された（NC1B11958
およびNC1B11956）。 Ｂ E.コリーの形質転換 LB（10ｇのバクトトリプトン、５ｇのバクト酵
母抽出物および水１当たり10ｇNaCl、PH7.0）
中でE.コリー（coli）Ｋ−12株No.802の一夜培養
物を500mlLB中100倍に希釈し次いでOD450が0.4
になるまで37℃で増殖した。培養物を冷却し、
3000rpm（ゾーバル（Sorvall）GS3ローターで）
で15分間回転した氷上で15分放置し、200mlの冷
0.1MCaCl2で再懸濁させ、3000rpmで10分間回転
した氷上に20分間放置し、５mlの冷0.1MCaCl2に
再懸濁させ次いで氷上で20分間放置する。次いで
冷グリセロールを10％になるまで添加し次いで一
部を液体窒素中で凍結し次いで−70℃で保存し
た。凍結細胞を氷上で融解し、DNAを添加し、
混合物を氷上で45分、37℃で２分間インキユベー
トし次いで適当な選択培地上にプレートした。 Ｃ バシラス サブチリスの形質転換 コンピテント バシラス サブチリス
（Bacillus subtilis）細胞を、ヤシビン（Yasbin）
等（J.Bacteriol.121：296〜304、1975）に従つて
調製した。次いで、遠心分離（7000rpm、３分）
により細胞を得、20％グリセロールを含有する上
澄液10容量中に再沈殿させ、液体窒素中で凍結乾
燥し次いで−70℃で保存した。形質転換に対し、
凍結細胞を42℃で融解し次いで一容量の緩衝液
｛0.4％グルコース、0.04M MgCl2および0.002M
EGTAを含むSpizizenの微少培地（Spizizen、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 44：1072〜78、1958）｝
と混合した。DNAを添加し次いで37℃で20分間
振とうしながら混合物をインキユベートした。次
いで、細胞を適当な選択培地上にプレートした。 Ｄ E.コリー由来のプラスミドpACYC184の調製 プラスミドpACYC184を担持するE.コリーＫ−
12株MC1000を、250mlのLB、0.4％グルコース、
20μｇ／mlのクロラムフエニコール中で一夜増殖
した。細胞は、遠心分離により得、次いで４mlの
緩衝液１（0.025MのトリスHCl、PH＝8.0、0.01M
のEDTA、0.05Mのグルコース、２mg／mlのリゾ
チーム）中で再懸濁した。懸濁液を０℃で15分間
インキユベートし次いで８mlの緩衝液２（0.2Mの
NaOH、１％SDS）と混合した。次いで、６ml
の緩衝液３（3Mの酢酸ナトリウム、PH＝4.8）を
添加し、混合物を０℃で60分間保持し、次いで
19000rpmで20分間遠心分離した（ゾバールSS34
ローラで約45000ｇ）。上澄液を0.6容量の冷イソ
プロパノールで沈殿させ、次いで1.2mlの5TE
（0.05MトリスHCl、PH＝8.0、0.005M EDTA）
および20μの煮沸RNaseA（ベーリンガー）（２
mg／ml）中で再沈殿させた。30分後、VTi65管内
の4.0mlの緩衝液４（80ｇCsClおよび56mlの5TE）
および0.1mlのEtBr（エチジウム ブロミド）の
頂部上に加層した。混合物を45000rpmで20時間
遠心分離した。次いで、プラスミドを管から取り
出し、透析し次いでセクシヨンG.で述べた如く
抽出した。 Ｅ バシラス サブチリス（Bacillus subtilis）
DN311由来のプラスミドpBD64の調製 以下の修正を行う他は、E.コリー（coli）株
（セクシヨンＤ参照）について述べた如くプラス
ミドを調製した。増殖は、0.01Mの燐酸カリウ
ム、PH＝7.0および6μｇ／mlのクロラムウエニコ
ールを含むLB中で行つた。 採取後、細胞を37℃でリゾチームとインキユベ
ートした。緩衝液２は、１容量の緩衝液２および
３容量の緩衝液５（0.2Mのグリシン、0.2Mの
NACl、および１％のSDS）の混合物と取り換え
た。以下の工程はＤに述べた工程と同じである。 Ｆ B.サブチリス由来のプラスミドの小スチー
ル調製 LB（0.01Mの燐酸塩、PH7.0および適当な抗生物
質を含む）中、５mlのB.サブチリス（subtilis））
由来のプラスミドを、以下を除く他セクシヨンＥ
と同様に調製した： １：緩衝液の容量を1/4にした。 ２：0.5mlのフエノールおよび0.5mlのクロラムフ
エニコールを緩衝液３の後に添加する。 ３：19000rpmで遠心分離後、上澄液をエタノー
ルで沈殿させ、400μの緩衝液（0.05Mのトリ
スHCl、PH＝8.0、0.1Mの酢酸ナトリウム）中
で再沈殿させ、再たびプラスミドを沈殿させ、
400μの緩衝液中で再懸濁させ、洗浄し次い
で1μl／mlの煮沸RNaseA（ベーリンガー）を有
する100μのTE中で再懸濁させた。 Ｇ バシラスC599由来のクロラムフエニコール
DNAの調製 約50mlの培養物から凍結した細胞のペレツト
を、1.1mlの緩衝液（0.05MのトリスHCl、PH＝
7.4、0.1MのNaCl、25％の蔗糖）中で再懸濁させ
た。100μのリゾチーム（25mg／ml）および
150μのEDTA（0.5M、PH＝8.0）を添加した。
混合物を37℃で30分間インキユベートした。２ml
の0.2％SDSを、37℃で30分間のインキユベーシ
ヨン後添加した。0.95mlの混合物当り、１ｇの
CaClおよび0.05mlのEtBr（10mg／ml）を、添加し
次いで混合物を45000rpmで、15℃で20時間、
VTi65ローター（ベツクマン）中で遠心分離し
た。 長波長Ｕランプのもとで、DNAを位置決定し
次いで注射器をチユーブに入れDNAを取り出し
た。EtBrをイソプロパノールで抽出し次いで溶
液をTEE（0.01MトリスHCl、PH＝8.0、0.01Mの
EDTA）に対し２時間透析した。次いで溶液を
TEEで８mlに調節し、フエノールで２回更にク
ロロホルムで１回抽出した。DNAを0.1Mの
NaClおよび冷エタノールで沈殿させ、次いで１
mlのTE（0.01MトリスHCl、PH＝8.0、0.001Mの
EDTA）中で溶解した。染色体DNA（chr DNA）
の溶液を４℃で保存した。 Ｈ バシラス（Bacillus）C599由来のchr DNA
の部分切断および分画 C599（セクシヨンＧ参照）由来のchr DNA60μ
ｇを、900μの緩衝液（0.01MトリスHCl、PH＝
7.4、0.05MのNaCl、0.01MのMgCl2、0.006Mの
メルカプトエタノール、100μｇ／mlのゼラチン）
中、10単位のMboI（Biolabs Cat.No.147）を用い
37℃で切断した。10分後、更に40分後、450μ
のサンプルとフエノールを用いて抽出し、0.1M
のNaClおよび冷エタノールで沈殿した。各サン
プルを100μのTEE中に溶解した。12mlの蔗糖
勾配（Maniatis Ｔ等、Cell15：687−701、1978）
当たり、100μのDNAを付加し次いでSW41ロ
ーター（ベツクマン）中27000rpmで20℃で22時
間、遠心分離した。 管の底部を穿孔した後、0.5mlのフラクシヨン
を抜き取り次いで冷エタノールで沈殿させた。
DNAを50μのTEに溶解し次いで各フラクシヨ
ン中のDNAの大きさを0.5μｇ／mlのEtBrで染色
した0.7％アガロースゲル上で評価した。約４〜
12kbのDNAを含む断片を集め、フエノールで抽
出し、エタノールで沈殿させ次いでTE中に溶解
した。 Ｉ アミラーゼ遺伝子を含有する組換遺伝子の単
離 4μｇのpACY184（セクシヨンＤ参照）を、50μ
の緩衝液（0.006MトリスHCl、PH＝8.0、
0.15MのNaCl、0.006MのMgCl2、0.006Mのメル
カプトエタノール、100μｇ／mlのゼラチン）中
8UのBamHI（Biolaba Cat.No.136）を用いて：37
℃で１時間切断した。線状DNAを、子牛の小腸
アルカリ性ホスフアターゼ（シグマP4502）で処
理した（グツドマン等、Methuds in
Enzymology、68：75〜90、1979）。次いで、
0.4μｇBamHIおよびホスフアターゼ処理
pACYC184を、約100UDNAリガーゼ（Biolaba
Cat.No.202）を用い蔗糖勾配由来の約1μｇの
C599chrDNAと、100μの緩衝液（0.66Mトリス
HCl、PH＝7.5、0.01MのMgCl2、25μｇ／mlのゼ
ラチン0.001MのATP、0.0.1MのDTT）中、16℃
で４時間結合させた。結合DNAを、セクシヨン
Ｂで述べた知く、コンピテントE.コリー株No.802
に形質転換した。 二層から成る新たに注加した寒天プレート上に
細胞をプレートした：低部には、0.5％の可溶性
デンプンおよび60μｇ／mlのクロラムフエニコー
ルを有する10mlのLB寒天。頂部には、クロラム
フエニコールを含まない同じ寒天25ml。37℃で一
夜インキユベーシヨン後、約1200個のクロラムフ
エニコール耐性形質変換体を得た。これらの内
600個は、これらの形質変換体のプラスミドが
BamHI部位内のクローン化断片を担持している
ことを示す感受性テトラサイクリンであつた。こ
れらの600個のコロニー（C599の遺伝子バンクを
表わす）の内、一種の株（DN400と命名）は、
寒天を含むデンプンをヨウ素蒸気にさらすと、該
コロニーの周囲に青いハローが出現することによ
つて指示される如くアミラーゼ活性を示した。株
DN400は、アミラーゼコードづけ遺伝子を含む、
約14000の塩基対のプラスミド（pDN400と命名）
を担持することが判明した。 Ｊ バシラス サブチリスにおけるpDN400のサ
ブクローニング 約1μｇのpDN400（セクシヨン１で述べた如く
構成されかつセクシヨンＤにおいてpACY184に
ついて説明した如くE.コリー株DN400から調製
した）を、100μの緩衝液中で37℃で0.06Uの
Sau3Al（Biolabs Cat.No.169）を用いて切断した。
25μアリコートを、フエノール抽出し次いで
0.1MNaClおよび冷エタノールで沈殿させた。
DNAの1/2を、すでにBamHIで切断した（セク
シヨンＩでpACYC184について説明した如く）、
0.4μｇプラスミドpBD64（セクシヨンＥ参照）と
結合させた（セクシヨンＨ参照）。 該株由来のプラスミドを単離し（セクシヨンＦ
で説明した如く）次いでバシラス サブチリス株
（DN304と命名）に形質転換した（セクシヨンＣ
で説明した如く。 プラスミドpDN452を担持する、一種のAmy+
形質転換体株（DN463と命名）を単離した。以
下の例３で説明するように、DN463を培養した
場合、本発明の新規熱安定性アミラーゼ製品の収
率が向上することが説明した。 例 ３ バシラス サブチリスDN463由来の熱安定性
のマルトース産生アミラーゼの製造 上記クローン化微生物DN463の培養物を500ml
振とうフラスコ中の次の基質100ml上に接種し
た： 液化デンプン 12.5％ｗ／ｖ（水道水） 大豆ミル 7.5％ Na2HPO4 １ ％ 接種前に、5μｇ／mlのクロラムフエニコール
を上記基質に添加した。 30℃で３〜４日間インキユベーシヨンを行つ
た。 培養ブロスを、6000ｇで20分間遠心分離した。
約2000U／mlを有する、遠心分離濃厚物を次の実
施例で直接用いた。 例 ４ 糖化用基質を、イオン水に7DEのスプレー乾燥
したマルトデキストリンを再溶解し次いで約30％
D.S.に仕上げることによつて調製した。糖化実験
は、標準5000mlの実験室用バツチ反応器内で行つ
た。この基質の一部を60℃に加熱し次いでPHを
5.5に調整し次いで50アミラーゼ単位／ｇD.S.を
添加した。60℃で72時間後、シロツプ中のグルコ
ース、マルトースおよびマルトトリオースの含量
は次の如くであつた。 グルトース ：５％ マルトース ：67％ マルトトリオース：０％ 同条件のもと、25β−アミラーゼ単位／ｇD.S.
のバイオザイム（Biozym）MII（大豆β−アミラ
ーゼ、20.000β−アミラーゼ／ｇ）を用いて糖化
すると、グルコース0.3％、マルトース61％およ
びマルトトリオース７％を含有するシロツプを得
る。
第１図は温度に対するマルトース産出酵素の相
対活性をプロツトしたグラフであり、第２図はPH
に対して相対活性をプロツトしたグラフであり、
さらに第３図は本発明の新規プラスミドpDN452
に対する制限エンドヌクレアーゼ制限地図であ
る。
対活性をプロツトしたグラフであり、第２図はPH
に対して相対活性をプロツトしたグラフであり、
さらに第３図は本発明の新規プラスミドpDN452
に対する制限エンドヌクレアーゼ制限地図であ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ マルトースを産生しつつデンプンを加水分解
し得るアミラーゼ酵素であつて、PH5.5で約60℃
の最適温度を有し、60℃でPH4.5〜６の最適PHを
有し、70℃で60分後少なくとも75％の残留活性を
有し、約70000ダルトンの分子量を有し、更にマ
ルトトリオースを定量的に等モル量のマルトース
とグルコースに分解することを特徴とする、前記
アミラーゼ酵素。 ２ 固体の形態で１ｇ当たり500〜25000Uの範囲
内のアミラーゼ活性を示す、特許請求の範囲第１
項記載のアミラーゼ酵素。 ３ マルトースを産生しつつデンプンを加水分解
し得るアミラーゼ酵素であつて、PH5.5で約60℃
の最適温度を有し、60℃でPH4.5〜６の最適PHを
有し、70℃で60分後少なくとも75％の残留活性を
有し、約70000ダルトンの分子量を有し、更にマ
ルトトリオースを定量的に等モル量のマルトース
とグルコースに分解する該アミラーゼ酵素の製造
方法であつて、 バシラス（Bacillus）菌株C599（受託番号
NC1B11837）又はこの変異株又は突然変異株を、
炭素源および窒素源並びに無機塩を含有する最適
な栄養培地中で培養することを含んでなる、前記
方法。 ４ 前記アミラーゼ酵素が培養ブロスから回収さ
れる、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ マルトースを産生しつつデンプンを加水分解
し得るアミラーゼ酵素であつて、PH5.5で約60℃
の最適温度を有し、60℃でPH4.5〜６の最適PHを
有し、70℃で60分後少なくとも75％の残留活性を
有し、約70000ダルトンの分子量を有し、更にマ
ルトトリオースを定量的に等モル量のマルトース
とグルコースに分解する該アミラーゼ酵素の製造
方法であつて、 バシラス菌株C599（受託番号NC1B11837）によ
つて産生されたアミラーゼについてコードする遺
伝子を含有する形質転換宿主微生物を、炭素源お
よび窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄養培
地中で培養することを含んでなる、該アミラーゼ
酵素の製造方法。 ６ 前記アミラーゼ酵素を培養ブロスから回収す
る、特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７ 前記宿主微生物がバシラス（Bacillus）群に
属する、特許請求の範囲第５項記載の方法。 ８ 前記宿主微生物がバシラス サブチリス
（Bacillus subtilis）である、特許請求の範囲第
７項記載の方法。 ９ 前記宿主生物がバシラス サブチリス
（Bacillus subtilis）菌株168又はその突然変異株
又は変異株である、特許請求の範囲第７項記載の
方法。 １０ 供与体微生物がバシラス（Bacillus）サブ
チリスC599（受託番号NC1B11837）である、特許
請求の範囲第５項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| DK1359/83A DK135983D0 (da) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | Maltogen amylaseenzymprodukt og fremgangsmade til dets fremstilling og anvendelse |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS602185A JPS602185A (ja) | 1985-01-08 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| EP (1) | EP0120693B1 (ja) |
| JP (1) | JPS602185A (ja) |
| AT (1) | ATE43634T1 (ja) |
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| DE (1) | DE3478469D1 (ja) |
| DK (1) | DK135983D0 (ja) |
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