JPH051277B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なアントラサイクリン抗生物質に
関し、さらに詳しくは下記式 で示されるアントラサイクリン抗生物質に関す
る。 アントラサイクリン系抗生物質としては、従来
から放線菌の培養液から得られるダウノマイシン
（米国特許第3616242号明細書参照）及びアドリア
マイシン（米国特許第3590028号明細書参照）が
知られており、これらの化合物は実験腫瘍に対し
て広い抗癌スペクトルを有し、癌化学療法剤とし
て臨床的にも広く利用されている。しかし、ダウ
ノマイシン及びアドリアマイシンはかなり強力な
抗癌作用を示すが決して満足できるものではな
く、発酵法、半合成法、微生物変換法等各種の手
段により種々の類縁化合物を創製する試みが行わ
れており、既にいくつか提案されている〔例え
ば、特公昭51−34915号公報（アクラシノマイシ
ンＡ及びＢ）、T.Oki et al、The Journal of
Antibiotics、Vol.33、第1331〜1340頁、F.
Arcamone、Topics in Antibiotic Chemistry、
Vol2、第102〜279頁、ELLIS HORWOOD
LIMITED発行等参照〕。 本発明により提案される前記式（）の化合物
は、アントラサイクリノン骨核の10位にメトキシ
カルボニル基を有しかつ、４位にメトキシ基を有
する点に構造的特徴を有する従来の文献に未載の
新規な抗生物質である。以下、本明細書において
この抗生物質を「D788−５」と命名し、該名称
を用いる。 本発明によるD788−５は、各種のアントラサ
イクリン系抗生物質の微生物による生合成及び発
酵生産性の研究過程において、見い出されたもの
である。即ち、ダウノマイシン、カルミノマイシ
ン及びその類縁化合物は、９個の酢酸分子、１個
のプロピオン酸分子が脂肪酸生合成に準じた方法
で脱水縮合することによりデカケタイドを形成
し、これよりアクラビノン、ε−ロドマイシノン
を経て生合成される経路が本発明者らにより主と
して微生物変換試験法を用いて解明されている
が、その詳細はいまだ明らかでない（The
Journal of Antibiotics、Vol.33、第1158〜1166
頁）。 本発明者らはさらに、ダウノマイシン生合成が
ブロツクされた変異菌株を単離し、その生成物を
分析することによりダウノマイシン生合成を解明
すべく鋭意研究の過程で、今回新しく土壌より分
離したダウノマイシン及びバウマイシン生産性の
放線菌株を用いて、ブロツク変異株の取得を試み
た結果、ダウノマイシン生合成の１前駆体である
本発明のD788−５を生成蓄積する菌株の単離に
成功し、本発明を完成した。 本発明で提供されるD788−５物質は従来まで
に発見されているアントラサイクリン類の中間構
造を有する物質で、後述する如く、マウス白血病
の増殖を強く阻害し、その特異的構造から特徴的
な制癌作用が期待される化合物である。 D788−５物質の製造はアクテイノミセイテス
属に属するダウノマイシン及びその類縁化合物を
生産する能力を有する土壌分離菌株又は公知の菌
株を、変異原として例えば紫外線或はＮ−メチル
−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（NTG）を用いる通常の変異処理により容易に単
離されるD788−５生産菌株を、適当な栄養源か
ら成る培地に培養することにより行なうことが出
来る。これらの生産菌株のうち具体的なものとし
ては今回新しく土壌より分離したダウノマイシン
及びバウマイシン生産菌株ストレプトミセス
（Streptomyces）D788菌株をNTGで変異処理
し、得られる変異株で4L−660株を挙げることが
出来る。 該菌株は、昭和59年２月20日付で工場技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第7459号
（FERM BP−7459）として寄託されている。 以下に、4L−660株の菌学的性状を示す。 （） 本菌株は次項で詳しく説明するが、形態観察
を行う為の培地では殆んど気中菌糸を形成しな
い、唯色素生成用に使つたペプトン・イースト
エキス・鉄寒天培地に於て比較的良く気中菌糸
の形成が見られた。そこで、その培地を用いた
結果を記す。気中菌糸は直線状で、輪生枝は見
とめられない。成熟した胞子鎖は短く、20〜３
ケ位が認められた。胞子の大きさは0.6〜0.8×
0.8〜2.5ミクロン位で、胞子の表面は平滑であ
る。 （） 各種培地における生育状態 色の記載について（ ）内に示す標準はH.
D.Tresner ＆ E.J.Backus著System of
color wheels for Streptomycete taxonomy
（J.Appl.Mierobiol 11巻 335〜338頁、1963
年）を用い、補足的に日本色彩研究所出版の
「色の標準」も用いた。 （） 次の各培地における生育状態（特にこと
わらないかぎり28℃培養） （）

【表】 生理的性質 (1) 生育温度範囲：（イースト・麦芽・寒天培
地を使用、PH6.0で20℃、28℃、30℃、37℃、
42℃の各温度で実験）、20℃から37℃までは
生育がみとめられた。42℃では生育しない。 (2) ゼラチンの液化：陽性、（グルコース・ペ
プトン・ゲラチン培地を使用し20℃で培養）。 (3) スターチの加水分解：陽性（弱い）（スタ
ーチ・無機塩寒天培地）。 (4) スキム・ミルクの凝固・ペプトン化：どち
らも陰性 (5) メラニン様色素の生成：（トリプトン・イ
ースト・ブロス、ペプトン・イースト・鉄・
寒天、及びチロシン寒天培地使用）、いづれ
の培地でも陽性。 （） 各種炭素源の利用性：（フリドハム・ゴ
ドリーブ寒天培地上） １ Ｌ−アラビノース 陽性 ２ Ｄ−キシロース 陰性 ３ Ｄ−グルコース 陽性 ４ Ｄ−フラクトース 僅かに陽性（疑わしい） ５ シユクロース 〃 （ 〃 ） ６ イノシトール 陰性 ７ Ｌ−ラムノース 陰性 ８ ラフイノース 〃 ９ Ｄ−マンニツト 〃 本発明によるD788−５生産菌株の培養は、放
線菌の栄養源として通常使用されそれ自体公知の
培地組成物中で行うことができる。例えば、炭素
源としては、グルコース、グリセリン、蔗糖、殿
粉、マルトーズ、動植物油などが使用でき、窒素
源としては、例えば大豆粉、肉エキス、酵母エキ
ス、ペプトン、コーンステープリカー、綿実粕、
魚粉などの有機物並びに硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、硝酸ナトリウム、リン酸アンモニ
ウムなどの無機体窒素が使用できる。又必要に応
じて食塩、塩化カリウム、リン酸塩その他
Mg⁺⁺、Ca⁺⁺、Zn⁺⁺、Fe⁺⁺、Cu⁺⁺、Mn⁺⁺あるい
はNi⁺⁺などの２価金属塩類及びアミノ酸やビタ
ミン類を添加する他発酵中の発泡を抑制するた
め、例えばシリコーン（信越化学〓製、−
KM75；商標）などの消泡剤を適宜添加すること
もできる。 温度、PH、通気撹拌および発酵時間等の発酵条
件は、用いられる菌株が最大量の該化合物を蓄積
する様に選択する。例えば温度は20〜40℃、好ま
しくは28℃、PHは５〜９、好ましくは６〜７にお
いて、発酵時間は１〜10日間、好ましくは６日間
で発酵を行うのが有利である。 該培養物からD788−５を単離、採取するには、
発酵終了後の培養物を遠心分離によるか、ケイ藻
土の如き適当な濾過助剤の存在下で濾過すること
により、菌体と上澄または濾液に分離する。 上澄からはPH７〜９でクロロホルム、トルエ
ン、酢酸エチルなどの有機溶媒で抽出する。 菌体からは必要により、アセトン、メタノー
ル、エタノールもしくはブタノール等の有機溶媒
を用いて抽出する。それぞれ濃縮乾洞して赤色の
粗粉末を得る。これを吸着担体、例えば、合成吸
着樹脂、シリカゲルを用いたクロマトグラフイー
により処理するか、陰イオン交換樹脂、陽イオン
交換樹脂を用いる処理等を単独にあるいは適宜組
合せて使用することにより、D788−５は純粋な
形で採取できる。 次に本発明によるD788−５の有用性について
述べる。本物質はマウス白血病培養細胞L1210の
増殖及び核酸合成を抑制する作用を有する。例え
ば20％仔牛血清を含むRPM11640培地（ローズウ
エルバーグ研究所）へL1210細胞を５×10⁴ケ／
ml接種し、同様に本物質を0.002〜0.25μｇ／mlの
濃度で添加し、37℃にて炭酸ガス培養器中で培養
し対照区に対する50％増殖阻害濃度を求めた。更
に上記のL1210培養細胞を10％仔牛血清を含む
RPM11640培地へ５×10⁵ケ／mlとなる様に懸濁
し、37℃にて炭酸ガス培養器中で１〜２時間培養
を行つたのち、本物質を種々濃度で添加し、15分
後にさらに¹⁴C−ウリジン（0.05μCi／ml）または
¹⁴C−チミジン（0.05μCi／ml）を添加し、37℃に
て60分間培養した。反応液へ冷10％トリクロル酢
酸を添加し、反応を中止すると同時に、酸不溶物
を沈澱させ、冷５％トリクロル酢酸にてさらに２
回洗滌したのち、ギ酸に溶解し、放射活性を測定
し、無添加対照区に対する放射能の取込み率から
50％取込み阻害濃度を求めた。次表に結果を示
す。

【表】 以上の結果に示される如く、本D788−５はマ
ウス白血病細胞L1210に対し、極めて低濃度で増
殖を阻止し、同時にRNAおよびDNA合成を阻害
する作用を有しているが、代表的アントラサイク
リン抗生物質ダウノマイシンと比較して、増殖阻
止作用が弱い割には、核酸合成阻害作用が強く、
特にRNA合成をより強く阻害する特徴を有する
化合物であり、制癌剤としての用途が期待され
る。 以下に本発明を実施例によりさらに詳しく説明
する。 実施例 １ ストレプトミセスD788（Streptomyces D788）
4L−660菌株（微工研条寄第7459号）のYS（0.3％
酵母エキス、１％可溶性デンプン、1.5％寒天、
PH7.2）斜面培養より一白金耳を採り、下記する
種母培地100mlを分注殺菌した500ml容三角フラス
コに接種し、28℃、ロータリーシエカー
（220rpm）にて２日間振盪培養して種母を作成し
た。 種母培地 可溶性デンプン 0.5％ グルコース 0.5％ エスサンミート（大豆粉、味の素社製） 1.0％ 酵母エキス 0.1％ NaCl 0.1％ K₂HPO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.1％ 水道水 0.1％ PH7.4（殺菌前） 次いで、下記組成の生産培地15を入れ、殺菌
した30容ジヤーフアーメンター１基に上記の種
母培養液を、750ml（５％に相当）ずつ添加接種
した。 生産培地 台湾酵母 ５％ 可溶性デンプン 7.5％ 酵母エキス 0.3％ NaCl 0.2％ CaCO₃ 0.3％ ミネラル混液※ 0.06％ 水道水 PH8.2（加熱殺菌前） ※CuSO₄・5H₂O 2.8ｇ、FeSO₄・7H₂O 0.4ｇ MnCl₂・4H₂O 3.2ｇ、ZnSO₄・7H₂O 0.8ｇ を蒸留水500mlに溶解したもの。 通気量５／分、撹拌450回転／分で、28℃、
130時間培養すると培養液は濃赤褐色を呈し、培
養液１ml中およそ300μｇのD788−５を蓄積した。 なお、培養液中の本物質は培養液１mlに1Mク
エン酸緩衝液（PH3.5）１mlを加え、これにアセ
トン２mlを加えて撹拌、室温で１時間放置、遠心
操作により上清を分取、その10〜30μを薄層シ
リカゲルプレート（F₂₅₄、メルク社製）の下端よ
り２cm位置にスポツトし、クロロホルム／メタノ
ール／水／酢酸（120／40／３／0.4）で展開し、
D788−５のスポツトRf値；0.4を薄層用クロマト
スキヤンナー（島津製作所製CS−910型）を用い
て波長495nｍで測定し、標準曲線より算定して
定量した。 実施例 ２ 実施例１で得られた培養液およそ14にアセト
ン30を加え撹拌しながらPHを3.5に調整し、更
に１時間撹拌を続けた。これを濾過助剤（トプコ
パーライト）を用いて吸引濾過し、得られた濾液
を減圧下に10にまで濃縮した。濃縮液をPH7.5
でクロロホルム10ずつを用いて２回抽出した。
得られたクロロホルム抽出液をPH2.0で酸性水に
転溶（10×２）し、この水層を4N苛性ソーダ
ーでPH7.5となしクロロホルム５で２回抽出し
た。クロロホルム抽出層を無水硫酸ナトリウムで
脱水し、減圧下濃縮乾固してD788−５の粗粉末
2.5ｇを得た。 実施例 ３ 実施例２で得たD788−５粗粉末2.5ｇを少量の
クロロホルムに溶解し、予めクロロホルムで充填
したシリカゲル（ワコーゲルＣ−200：和光純薬
〓）カラム（ベツド容量300ml）に吸着させクロ
マトグラフイーを行つた。本物質はクロロホルム
−メタノール（10：１）混液で溶出されるので、
前述のTLCで監視し、選択されたフラクシヨン
を集め、減圧下に少量となるまで濃縮した。これ
に５倍容量のｎ−ヘキサンを添加すると純粋な
D788−５が1.65ｇ得られた。 このようして得られたD788−５は以下の様な
物理化学的性質を示した。 ●融点 162〜163℃（分解） ●TLC（Rf値） 0.46〔TLCプレートF24（前出）、
クロロホルム：メタノール：水：酢酸＝120：
40：３：0.4〕 この時他のサンプルは以下のRf値を示す。

【表】 ●HPLC（保持時間） 9.9分（カラム：YMC−
パツクＡ−312、移動相：40％アセトニトリル
in0.01MD−10−カンフアースルフオン酸（PH
4.1）流量1.0ml／min） この時ダウノマイシンの保持時間は7.1分であ
る。 ●UV、可視吸収 メタノール中のλmaxは以下の通り。（カツ
コ内はE¹%₁cm） 234nｍ（742）、252nｍ（416）、289nｍ
（156.5）、479nｍ（228）、494nｍ（221）、532n
ｍ（113.5）。 ●IR（KBr法）νcm^-1（主なもの） 3450、2920、1730、1610、1580、1400、
1280、1235、1200、1120、1055、1000、980、
820、800 ●PMR（90MHz、CDCl₃）δppm 1.1（3H、ｔ、Ｊ＝7.5 Ｈ−14）、1.3（3H、
ｄ、Ｊ＝6.5 Ｈ−6′）、1.3〜1.9（4H、ｍ、Ｈ−
13、Ｈ−2′）、2.3（2H、bs、Ｈ−８）、3.47
（1H、bs、Ｈ−4′）、3.72（3H、ｓ、COOCH₃）、
4.08（3H、ｓ、４−OCH₃）、4.1（1H、ｑ、Ｊ＝
6.5 Ｈ−5′）、4.28（1H、ｓ、Ｈ−10）、5.28
（1H、bs、Ｈ−７）、5.5（1H、bs、Ｈ−1′）、
7.37（1H、ｄ、ｊ＝８ Ｈ−３）、7.75（1H、
ｔ、Ｊ＝８ Ｈ−２）8.0（1H、ｄ、Ｊ＝８
Ｈ−１） phenolic OH none 実施例 ４ 実施例３で得たD788−５ 235mgを0.1N塩酸50
mlに溶解し85℃、30分間加水分解した。反応後を
クロロホルム50mlを用いて抽出し、抽出液を２度
水洗した。更に飽和食塩水で洗浄した後クロロホ
ルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下少
量となるまで濃縮した。これに５倍量のｎ−ヘキ
サンを添加すると赤色結晶性粉末174mgが得られ
た。 得られたアグリコンは以下に示すPMRスペク
トラムより、４−Ｏ−メチル−ε−ロドマイシノ
ンと同定された。 ●TLC（Rf値） 0.33（TLCプレートF₂₅₄（前出）、
ベンゼン：アセトン：ギ酸＝100：30：１） この時他のアグリコンは以下のRf値を示し
た。 ε−ロドマイシノン 0.51 ダウマイシノン 0.28 ●PMR（90MHz、CDCl₃）δppm 1.15（3H、ｔ、Ｊ＝7.5H−14） 1.35〜1.95（2H、ｍ、Ｈ−13） 2.25（2H、ｍ、Ｈ−８） 3.7（3H、ｓ、COOCH₃） 4.03（3H、ｓ、４−OCH₃） 4.23（1H、ｓ、Ｈ−10） 5.32（1H、ｍ、Ｈ−７） 7.31（1H、ｄ Ｊ＝８ Ｈ−３） 7.70（1H、ｔ Ｊ＝８ Ｈ−２） 7.92（1H、ｄ Ｊ＝８ Ｈ−１） 13.18、13.88（phenolic OH）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 で示される新規アントラサイクリン抗生物質。