JPH0515433B2 - - Google Patents
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- JPH0515433B2 JPH0515433B2 JP56094927A JP9492781A JPH0515433B2 JP H0515433 B2 JPH0515433 B2 JP H0515433B2 JP 56094927 A JP56094927 A JP 56094927A JP 9492781 A JP9492781 A JP 9492781A JP H0515433 B2 JPH0515433 B2 JP H0515433B2
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- Japan
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- tryptophan
- dna
- strain
- bacteria
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- Biomedical Technology (AREA)
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- Biotechnology (AREA)
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- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
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- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、発酵法によるＬ−トリプトフアン
の製造法に関する。 発酵法によりＬ−トリプトフアンを製造しよう
とする場合、野性株は殆んど菌体外にＬ−トリプ
トフアンを生産しないので、野性株に人工的に突
然変異を生起せしめてＬ−トリプトフアン生産能
を付与する方法がとられている。 従来知られているＬ−トリプトフアン生産能を
有する人工変異株としては、ブレビバクテリウ
ム、ミクロバクテリウム又はコリネバクテリウム
属の５−メチルトリプトフアンに耐性を有する変
異株（米国特許3700539）、コリネバクテリウム属
のチロシンとフエニルアラニンを要求し、フエニ
ルアラニンアンタゴニストに耐性を有する変異株
（特公昭51−19037）、バチルス属の５−フルオロ
トリプトフアンに耐性を有する変異株（特開昭49
−85289）、ブレビバクテリウム属の５−メチルト
リプトフアン及びｍ−フルオロトリプトフアンに
耐性を有する変異株（特開昭50−42091）等が知
られている。 一方、最近上述のような人工変異による育種と
異なるところの遺伝子組換え技術をＬ−トリプト
フアン生産菌の育種に利用する試みもいくつか報
告されている。例えば、Appl.Environ.
Microbiol.38，(2)，181−190，（1979）にはエシ
エリヒア・コリのtrp E472遺伝子をもつプラス
ミドを含有するE.coliの特定の変異株が、約
1.3g／のＬ−トリプトフアンを生産したことが
記載されている。又、「日本発酵工学会 昭和55
年度大会講演要旨集170頁（1980）」にもやはりエ
シエリヒア・コリのトリプトフアンオペロンを組
み込んだプラスミドを含有するエシエリヒア・コ
リの変異株が360mg／のＬ−トリプトフアンを
生産したことが記載されている。 本発明者らは、叙上のような従来の発酵法によ
るＬ−トリプトフアンの製造法に対し、トリプト
フアンアンタゴニストに耐性を有するバチルス属
の変異株の染色体より得たトリプトフアンアンタ
ゴニスト耐性に関与する遺伝子領域が組み込まれ
ているベクターを含有しているバチルス属の細菌
が高い収率でＬ−トリプトフアンを生産すること
を知つた。 トリプトフアンアンタゴニストとは、バチルス
属の微生物の増殖を抑制するようなものである
が、その抑制はＬ−トリプトフアンが培地中に共
存すれば、全体的または部分的に解除されるよう
なものである。例えば、４−フルオロ−トリプト
フアン（以下４−FTと記す）、５−フルオロトリ
プトフアン（以下５−FTと記す）、６−フルオロ
−トリプトフアン、７−フルオロ−トリプトフア
ン、４−メチル−トリプトフアン、５−メチルト
リプトフアン、６−メチル−トリプトフアン、７
−メチル−トリプトフアン、ナフチルアラニン、
インドールアクリル酸、ナフチールアクリル酸、
β−（２−ベンゾチエニール）アラニン、スチリ
ール酢酸、インドール、トリプトザン等がある。 トリプトフアンアンタゴニスト耐性に関与する
遺伝子領域の供与菌は、バチルス属のトリプトフ
アンアンタゴニストに耐性を有する変異株ならど
のような菌株でもよいが、耐性の程度のより高い
ものが望ましい、又多くの場合、Ｌ−トリプトフ
アン生産能がより高いものを遺伝子供与菌として
用いれば、よりよい結果が得られる。 遺伝子供与菌より染色体DNAを抽出する方法
は、例えばJ.Bacteriol，89，1065（1965）に記載
されているような通常の方法で行うことができ
る。 ベクターDNAとしては、どのようなものでも
よい。例えば、スタフイココツカス属微生物由来
のpT127，pC194，pC221，pC223，pUB112
（以上Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：1680−
1682，（1977）参照），pUB110（J.Bacteriol.，
134：318−329，（1978）参照），pTP4，pTP5
（以上Microbios Letters，５：55−59，（1978）
参照），枯草菌由来のpLS15，pLS28，（以上J.
Bacteriol.，131：699−701，（1977）参照），
pLS13（J.Bacteriol.，129：1487−1494（1977）参
照），pPL，pPL2（以上J.Bacteriol.，124，484
（1975）参照）等がある。 染色体DNA及びベクターDNAはそれぞれ制限
エンドヌクレアーゼを用いて切断する。それぞれ
のベクターは適した制限エンドヌクレアーゼがあ
るが、それは、上記ベクターについての記載があ
る文献に開示されている。染色体DNAについて
は、制限エンドヌクレアーゼによる切断が部分的
に行われるように反応条件を調節すれば、多くの
種類の制限酵素が使用できる。 かくして得られた染色体DNA断片と、切断さ
れたベクターDNAとを連結せしめる方法は、リ
ガーゼを用いる通常の方法が使用できる。 一方、ターミナルトランスフエラーゼを用い
て、染色体DNA断片と開裂したベクターDNAと
にデオキシアデニル酸とデオキシチシジル酸、ま
たは、デオキシグアニル酸とデオキシチシジル酸
をそれぞれ付加し、混合したのち、アニーリング
して連結せしめる方法も利用しうる。 かくして得られた染色体DNA断片とベクター
の結合物の受容菌は、バチルス属の微生物ならば
どのようなものでもよいが、Ｌ−トリプトフアン
要求菌を用いれば、形質転換株を洗濯する際に好
都合である。もちろんＬ−トリプトフアン生産能
が高い菌株、あるいはよりＬ−トリプトフアン生
産能が高い菌株より誘導したＬ−トリプトフアン
要求菌を用いれば、より好ましい結果が得られ
る。 組換えDNAを上記のようなDNA受容菌に導入
するには、例えばMolec.gen.Genet.168，111−
115（1979）に記載されているような、通常の形質
転換法が使用できる。 形質転換株のうちより、Ｌ−トリプトフアン生
産能を有し、トリプトフアンアンタゴニスト耐性
に関与する遺伝子領域が組み込まれているベクタ
ーを含有する形質転換株を選択するには、例え
ば、DNA受容菌として、Ｌ−トリプトフアン要
求菌を用い、Ｌ−トリプトフアンを含まずDNA
受容菌の生育が抑制されるような量のトリプトフ
アンアンタゴニストを含む培地中又は培地上に生
育しうるような菌株を選別すればよい。又ベクタ
ーDNA上のマーカーとして用いることができる
形質を併せもつ菌株を選別できるような培地を用
いれば、より選別が容易である。 このようにして一旦選別されたトリプトフアン
アンタゴニスト耐性に関与する遺伝子領域が組み
込まれている組換えベクターは、DNA受容菌よ
り抽出後他のDNA受容菌、例えばＬ−トリプト
フアン生産能を有するDNA受容菌に導入するこ
とができる。 得られたＬ−トリプトフアン生産菌を培養する
方法は、従来のＬ−トリプトフアン生産菌の培養
方法と特に変らない。即ち、培地としては、炭素
源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じアミノ
酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常
のものである。炭素源としては、グルコース、シ
ユクロース、ラクトース等及びこれらを含有する
澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。
窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩その他が使用できる。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にＬ−トリプトフアンの生産
蓄積が停止するまで行なわれる。 かくして培養液中には著量のＬ−トリプトフア
ンが生成蓄積される。培養液よりＬ−トリプトフ
アンを採取するには、通常の方法が適用できる。 実施例 (1) バチルス・ズブチリスマーバーグ株由来の
YS−11（トリプトフアンアンタゴニスト耐性を
有しない）〔Molec.gen.Genet.vol.170，117−
122（1979）〕及び本菌由来の５−FT耐性のトリ
プトフアン生産株No.65，４−FT耐性のトリプ
トフアン生産株No.34の３株を、それぞれ３mlの
ペンナツセイブロス（Difco社製）に植えつ
け、30℃16時間振とう培養し、次に100mlの同
じ培地で37℃３時間、更に1000mlの同じ培地で
37℃，1.5時間培養して菌体を対数増殖期まで
ふやした。これらをそれぞれ集菌後、常法に従
い〔J.Bac.vol.89，1065（1965）〕、DNAを抽出、
精製し、YS−11から2.1mg，No.65から1.0mg，No.
34から2.9mgのDNA標品をそれぞれ得た。 (2) プラスミドpUB110のDNAはBRL社製のも
のを使用した。 (3) (1)で得た染色体DNA15μｇ及びプラスミド
pUB110のDNA5μｇに市販の制限酵素BamH
，EcoR，XbaLBglをそれぞれ与え、37
℃で120分作用させて、DNAを切断し、65℃５
分間加熱処理した。 次にこれらの切断した染色体DNA及びプラ
スミドDNAフラグメントを混合し、ATP及
び、ジチオスレイトールの存在下にT4フアー
ジ由来のDNAリガーゼによつて10℃にて24時
間、DNA鎖の連絡反応を行つた。次に65℃に
て５分間加熱した後、反応液に２倍容のエタノ
ールを加えて、DNAを沈殿せしめて採取した。
これらを50μのTENバツフアー※ にとかし、
50μの２倍強度のSMM溶液※※ に加えた。 ※ 20mM トリス塩酸塩 20mM NaCl 1mM EDTA （PH8.0） ※※ 500mM シユークロース 20mM マレイン酸 20mM MgCl2 （PH6.5） (4) Ｌ−トリプトフアン要求株であるバチル
ス・ズブチリスマーバーグ由来のMIT〔Jap.J.
Genet.vol.45，１−９（1970）〕をペンナツセイ
ブロス（Difco社製）10mlに植えつけ、37℃で
振とう培養し、対数増殖中期まで生育させた
後、集菌洗菌した。これを最終濃度２mg／mlと
なるようにリゾチームを加えたSMMP溶液※※ （1/10容）に懸濁し、37℃に保ちつつ1.5時
間、ゆつくり振とうして細胞壁をなくしたプロ
トプラストとした（顕微鏡観察で確認した）。
このものを集菌洗菌し1/10容のSMMP溶液に
懸濁してプロトプラスト液とした。 ※ ２倍強度のSMMに４倍強度のペンナツセ
イブロスを添加した溶液 ここで得たプロトプラスト液0.5mlに(3)で得た
組換えDNA溶液、それぞれ0.1mlを加えて、直ち
に1.5mlの40％ポリエチレングルコール含有SMM
液を添加し、穏やかに振とうし、２分後、５mlの
SMMPを加えて、次いで集菌、SMMで洗菌し、
最終的に１mlのSMM液に懸濁した。 次にこれらの懸濁液を、純水1000mlにグルコー
ス5g、カザミノ酸5g，K2HPO4 3.5g，KH2PO4
1.5g，MgCl24g，コハク酸ソーダ135.1g，Ｌ−
メチオニン100mg、チミン100mg、寒天8g、更に
No.65を遺伝子供与菌としたものについては200mg
の５−FT，No.34を遺伝子供与菌としたときは200
mgの４−FTを含むPH7.0のプロトプラストの再生
用平板培地に播種し、30℃にて７日間静置培養し
た。 生じたコロニーを釣り上げ、この中からＬ−ト
リプトフアン生産の高いものを更に選別し、YS
−11より形質転換株AJ11688（FERM−P6024）
を、No.65より形質転換株AJ11690（FERM−
P6026）を、No.34より形質転換株AJ11691
（FERM−P6027）を得た。尚、これらの形質転
換株はいずれも、受容菌MITのトリプトフアン
要求性が回復し、プラスミドpUB110の性質カナ
マイシン耐性をもつことから、プラスミド
pUB110にDNA供与菌のトリプトフアン合成の
遺伝子が組み込まれたことを示している。尚、制
限酵素Bglを用いて得た菌株AJ11690では、カ
ナマイシン感受性となつたが、本酵素がpUB110
のカナマイシン耐性を担う遺伝子を切断するとい
う知見〔高木康敬 遺伝子操作実験法 講談社サ
イエンテイフイク p117〕から合理的に説明で
きるものである。 (5) (4)で得られた形質転換株AJ11688，
AJ11690，AJ11691をDNA供与菌であるYS−
11，No.65，No.34及びDNA受容菌MITと比較し
て、Ｌ−トリプトフアン生産能を調べたとこ
ろ、第１表に示す結果を得た。 培養はグルコース80g，NH4Cl 10g，KCl
2.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4・7H2Ｏ 0.4g，
FeSO4・7H2Ｏ 10mg，MuSO4・4H2Ｏ 10
mg、カザミノ酸4.0g、Ｌ−メチオニン100mg、
チミン100mg（菌株MITの場合Ｌ−トリプトフ
アン100mg添加）及びCaCO3（別殺菌）25gを水
１に含むPH7.0の培地３mlを試験管に分注し
たものに、被験菌株を植えつけ30℃にて72時間
培養し、培養終了後の遠心上清液中のＬ−トリ
プトフアンをバイオアツセイ法で定量したもの
である。 【表】
の製造法に関する。 発酵法によりＬ−トリプトフアンを製造しよう
とする場合、野性株は殆んど菌体外にＬ−トリプ
トフアンを生産しないので、野性株に人工的に突
然変異を生起せしめてＬ−トリプトフアン生産能
を付与する方法がとられている。 従来知られているＬ−トリプトフアン生産能を
有する人工変異株としては、ブレビバクテリウ
ム、ミクロバクテリウム又はコリネバクテリウム
属の５−メチルトリプトフアンに耐性を有する変
異株（米国特許3700539）、コリネバクテリウム属
のチロシンとフエニルアラニンを要求し、フエニ
ルアラニンアンタゴニストに耐性を有する変異株
（特公昭51−19037）、バチルス属の５−フルオロ
トリプトフアンに耐性を有する変異株（特開昭49
−85289）、ブレビバクテリウム属の５−メチルト
リプトフアン及びｍ−フルオロトリプトフアンに
耐性を有する変異株（特開昭50−42091）等が知
られている。 一方、最近上述のような人工変異による育種と
異なるところの遺伝子組換え技術をＬ−トリプト
フアン生産菌の育種に利用する試みもいくつか報
告されている。例えば、Appl.Environ.
Microbiol.38，(2)，181−190，（1979）にはエシ
エリヒア・コリのtrp E472遺伝子をもつプラス
ミドを含有するE.coliの特定の変異株が、約
1.3g／のＬ−トリプトフアンを生産したことが
記載されている。又、「日本発酵工学会 昭和55
年度大会講演要旨集170頁（1980）」にもやはりエ
シエリヒア・コリのトリプトフアンオペロンを組
み込んだプラスミドを含有するエシエリヒア・コ
リの変異株が360mg／のＬ−トリプトフアンを
生産したことが記載されている。 本発明者らは、叙上のような従来の発酵法によ
るＬ−トリプトフアンの製造法に対し、トリプト
フアンアンタゴニストに耐性を有するバチルス属
の変異株の染色体より得たトリプトフアンアンタ
ゴニスト耐性に関与する遺伝子領域が組み込まれ
ているベクターを含有しているバチルス属の細菌
が高い収率でＬ−トリプトフアンを生産すること
を知つた。 トリプトフアンアンタゴニストとは、バチルス
属の微生物の増殖を抑制するようなものである
が、その抑制はＬ−トリプトフアンが培地中に共
存すれば、全体的または部分的に解除されるよう
なものである。例えば、４−フルオロ−トリプト
フアン（以下４−FTと記す）、５−フルオロトリ
プトフアン（以下５−FTと記す）、６−フルオロ
−トリプトフアン、７−フルオロ−トリプトフア
ン、４−メチル−トリプトフアン、５−メチルト
リプトフアン、６−メチル−トリプトフアン、７
−メチル−トリプトフアン、ナフチルアラニン、
インドールアクリル酸、ナフチールアクリル酸、
β−（２−ベンゾチエニール）アラニン、スチリ
ール酢酸、インドール、トリプトザン等がある。 トリプトフアンアンタゴニスト耐性に関与する
遺伝子領域の供与菌は、バチルス属のトリプトフ
アンアンタゴニストに耐性を有する変異株ならど
のような菌株でもよいが、耐性の程度のより高い
ものが望ましい、又多くの場合、Ｌ−トリプトフ
アン生産能がより高いものを遺伝子供与菌として
用いれば、よりよい結果が得られる。 遺伝子供与菌より染色体DNAを抽出する方法
は、例えばJ.Bacteriol，89，1065（1965）に記載
されているような通常の方法で行うことができ
る。 ベクターDNAとしては、どのようなものでも
よい。例えば、スタフイココツカス属微生物由来
のpT127，pC194，pC221，pC223，pUB112
（以上Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：1680−
1682，（1977）参照），pUB110（J.Bacteriol.，
134：318−329，（1978）参照），pTP4，pTP5
（以上Microbios Letters，５：55−59，（1978）
参照），枯草菌由来のpLS15，pLS28，（以上J.
Bacteriol.，131：699−701，（1977）参照），
pLS13（J.Bacteriol.，129：1487−1494（1977）参
照），pPL，pPL2（以上J.Bacteriol.，124，484
（1975）参照）等がある。 染色体DNA及びベクターDNAはそれぞれ制限
エンドヌクレアーゼを用いて切断する。それぞれ
のベクターは適した制限エンドヌクレアーゼがあ
るが、それは、上記ベクターについての記載があ
る文献に開示されている。染色体DNAについて
は、制限エンドヌクレアーゼによる切断が部分的
に行われるように反応条件を調節すれば、多くの
種類の制限酵素が使用できる。 かくして得られた染色体DNA断片と、切断さ
れたベクターDNAとを連結せしめる方法は、リ
ガーゼを用いる通常の方法が使用できる。 一方、ターミナルトランスフエラーゼを用い
て、染色体DNA断片と開裂したベクターDNAと
にデオキシアデニル酸とデオキシチシジル酸、ま
たは、デオキシグアニル酸とデオキシチシジル酸
をそれぞれ付加し、混合したのち、アニーリング
して連結せしめる方法も利用しうる。 かくして得られた染色体DNA断片とベクター
の結合物の受容菌は、バチルス属の微生物ならば
どのようなものでもよいが、Ｌ−トリプトフアン
要求菌を用いれば、形質転換株を洗濯する際に好
都合である。もちろんＬ−トリプトフアン生産能
が高い菌株、あるいはよりＬ−トリプトフアン生
産能が高い菌株より誘導したＬ−トリプトフアン
要求菌を用いれば、より好ましい結果が得られ
る。 組換えDNAを上記のようなDNA受容菌に導入
するには、例えばMolec.gen.Genet.168，111−
115（1979）に記載されているような、通常の形質
転換法が使用できる。 形質転換株のうちより、Ｌ−トリプトフアン生
産能を有し、トリプトフアンアンタゴニスト耐性
に関与する遺伝子領域が組み込まれているベクタ
ーを含有する形質転換株を選択するには、例え
ば、DNA受容菌として、Ｌ−トリプトフアン要
求菌を用い、Ｌ−トリプトフアンを含まずDNA
受容菌の生育が抑制されるような量のトリプトフ
アンアンタゴニストを含む培地中又は培地上に生
育しうるような菌株を選別すればよい。又ベクタ
ーDNA上のマーカーとして用いることができる
形質を併せもつ菌株を選別できるような培地を用
いれば、より選別が容易である。 このようにして一旦選別されたトリプトフアン
アンタゴニスト耐性に関与する遺伝子領域が組み
込まれている組換えベクターは、DNA受容菌よ
り抽出後他のDNA受容菌、例えばＬ−トリプト
フアン生産能を有するDNA受容菌に導入するこ
とができる。 得られたＬ−トリプトフアン生産菌を培養する
方法は、従来のＬ−トリプトフアン生産菌の培養
方法と特に変らない。即ち、培地としては、炭素
源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じアミノ
酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常
のものである。炭素源としては、グルコース、シ
ユクロース、ラクトース等及びこれらを含有する
澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。
窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩その他が使用できる。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にＬ−トリプトフアンの生産
蓄積が停止するまで行なわれる。 かくして培養液中には著量のＬ−トリプトフア
ンが生成蓄積される。培養液よりＬ−トリプトフ
アンを採取するには、通常の方法が適用できる。 実施例 (1) バチルス・ズブチリスマーバーグ株由来の
YS−11（トリプトフアンアンタゴニスト耐性を
有しない）〔Molec.gen.Genet.vol.170，117−
122（1979）〕及び本菌由来の５−FT耐性のトリ
プトフアン生産株No.65，４−FT耐性のトリプ
トフアン生産株No.34の３株を、それぞれ３mlの
ペンナツセイブロス（Difco社製）に植えつ
け、30℃16時間振とう培養し、次に100mlの同
じ培地で37℃３時間、更に1000mlの同じ培地で
37℃，1.5時間培養して菌体を対数増殖期まで
ふやした。これらをそれぞれ集菌後、常法に従
い〔J.Bac.vol.89，1065（1965）〕、DNAを抽出、
精製し、YS−11から2.1mg，No.65から1.0mg，No.
34から2.9mgのDNA標品をそれぞれ得た。 (2) プラスミドpUB110のDNAはBRL社製のも
のを使用した。 (3) (1)で得た染色体DNA15μｇ及びプラスミド
pUB110のDNA5μｇに市販の制限酵素BamH
，EcoR，XbaLBglをそれぞれ与え、37
℃で120分作用させて、DNAを切断し、65℃５
分間加熱処理した。 次にこれらの切断した染色体DNA及びプラ
スミドDNAフラグメントを混合し、ATP及
び、ジチオスレイトールの存在下にT4フアー
ジ由来のDNAリガーゼによつて10℃にて24時
間、DNA鎖の連絡反応を行つた。次に65℃に
て５分間加熱した後、反応液に２倍容のエタノ
ールを加えて、DNAを沈殿せしめて採取した。
これらを50μのTENバツフアー※ にとかし、
50μの２倍強度のSMM溶液※※ に加えた。 ※ 20mM トリス塩酸塩 20mM NaCl 1mM EDTA （PH8.0） ※※ 500mM シユークロース 20mM マレイン酸 20mM MgCl2 （PH6.5） (4) Ｌ−トリプトフアン要求株であるバチル
ス・ズブチリスマーバーグ由来のMIT〔Jap.J.
Genet.vol.45，１−９（1970）〕をペンナツセイ
ブロス（Difco社製）10mlに植えつけ、37℃で
振とう培養し、対数増殖中期まで生育させた
後、集菌洗菌した。これを最終濃度２mg／mlと
なるようにリゾチームを加えたSMMP溶液※※ （1/10容）に懸濁し、37℃に保ちつつ1.5時
間、ゆつくり振とうして細胞壁をなくしたプロ
トプラストとした（顕微鏡観察で確認した）。
このものを集菌洗菌し1/10容のSMMP溶液に
懸濁してプロトプラスト液とした。 ※ ２倍強度のSMMに４倍強度のペンナツセ
イブロスを添加した溶液 ここで得たプロトプラスト液0.5mlに(3)で得た
組換えDNA溶液、それぞれ0.1mlを加えて、直ち
に1.5mlの40％ポリエチレングルコール含有SMM
液を添加し、穏やかに振とうし、２分後、５mlの
SMMPを加えて、次いで集菌、SMMで洗菌し、
最終的に１mlのSMM液に懸濁した。 次にこれらの懸濁液を、純水1000mlにグルコー
ス5g、カザミノ酸5g，K2HPO4 3.5g，KH2PO4
1.5g，MgCl24g，コハク酸ソーダ135.1g，Ｌ−
メチオニン100mg、チミン100mg、寒天8g、更に
No.65を遺伝子供与菌としたものについては200mg
の５−FT，No.34を遺伝子供与菌としたときは200
mgの４−FTを含むPH7.0のプロトプラストの再生
用平板培地に播種し、30℃にて７日間静置培養し
た。 生じたコロニーを釣り上げ、この中からＬ−ト
リプトフアン生産の高いものを更に選別し、YS
−11より形質転換株AJ11688（FERM−P6024）
を、No.65より形質転換株AJ11690（FERM−
P6026）を、No.34より形質転換株AJ11691
（FERM−P6027）を得た。尚、これらの形質転
換株はいずれも、受容菌MITのトリプトフアン
要求性が回復し、プラスミドpUB110の性質カナ
マイシン耐性をもつことから、プラスミド
pUB110にDNA供与菌のトリプトフアン合成の
遺伝子が組み込まれたことを示している。尚、制
限酵素Bglを用いて得た菌株AJ11690では、カ
ナマイシン感受性となつたが、本酵素がpUB110
のカナマイシン耐性を担う遺伝子を切断するとい
う知見〔高木康敬 遺伝子操作実験法 講談社サ
イエンテイフイク p117〕から合理的に説明で
きるものである。 (5) (4)で得られた形質転換株AJ11688，
AJ11690，AJ11691をDNA供与菌であるYS−
11，No.65，No.34及びDNA受容菌MITと比較し
て、Ｌ−トリプトフアン生産能を調べたとこ
ろ、第１表に示す結果を得た。 培養はグルコース80g，NH4Cl 10g，KCl
2.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4・7H2Ｏ 0.4g，
FeSO4・7H2Ｏ 10mg，MuSO4・4H2Ｏ 10
mg、カザミノ酸4.0g、Ｌ−メチオニン100mg、
チミン100mg（菌株MITの場合Ｌ−トリプトフ
アン100mg添加）及びCaCO3（別殺菌）25gを水
１に含むPH7.0の培地３mlを試験管に分注し
たものに、被験菌株を植えつけ30℃にて72時間
培養し、培養終了後の遠心上清液中のＬ−トリ
プトフアンをバイオアツセイ法で定量したもの
である。 【表】
Claims (1)
- １ トリプトフアンアンタゴニストに耐性を有す
るバチルス属の変異株の染色体より得たトリプト
フアンアンタゴニスト耐性に関与する遺伝子領域
が組み込まれているベクターを含有し、Ｌ−トリ
プトフアン生産能を有するバチルス属細菌を培養
し、培地中に生成蓄積されたＬ−トリプトフアン
を採取することを特徴とする、発酵法によるＬ−
トリプトフアンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56094927A JPS57208994A (en) | 1981-06-19 | 1981-06-19 | Preparation of l-tryptophan by fermentation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56094927A JPS57208994A (en) | 1981-06-19 | 1981-06-19 | Preparation of l-tryptophan by fermentation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57208994A JPS57208994A (en) | 1982-12-22 |
| JPH0515433B2 true JPH0515433B2 (ja) | 1993-03-01 |
Family
ID=14123597
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56094927A Granted JPS57208994A (en) | 1981-06-19 | 1981-06-19 | Preparation of l-tryptophan by fermentation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57208994A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5889194A (ja) * | 1981-11-24 | 1983-05-27 | Ajinomoto Co Inc | 微生物によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
| JPS5894391A (ja) * | 1981-11-27 | 1983-06-04 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS531358A (en) * | 1976-06-28 | 1978-01-09 | Sanyo Electric Co Ltd | Total heat exchange element |
-
1981
- 1981-06-19 JP JP56094927A patent/JPS57208994A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57208994A (en) | 1982-12-22 |
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