JPS6137913B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

ポリアミノ酸を担体とした酵素の固定化方法と
して、ポリアミノ酸の酸性アミノ酸単位のカルボ
キシル基を酸アジド化して酵素蛋白のアミノ基と
ペプチド結合させる方法は知られている（特公昭
51−19031）。この方法は固定化物の酵素活性が高
くかつこの高活性を長期間持続させうるすぐれた
方法であるが、グルコースオキシダーゼのような
糖蛋白酵素の場合には塩基性アミノ酸残基がウレ
アーゼやウリカーゼなどの数分の１しかないため
固定化物の単位重量当りの酵素活性が低いという
欠点があつた。そこで発明者は糖蛋白酵素の糖鎖
部分に着目し、糖蛋白酵素を過ヨウ素酸又は過ヨ
ウ素酸塩で処理することによつて糖鎖部分にアル
デヒド基を形成させこれを酸性アミノ酸単位を有
するポリアミノ酸のヒドラジド化物と反応させる
ことによつて単位重量当りの酵素活性が高くかつ
安定性のより増大した糖蛋白酵素の固定化物を得
ることに成功したものである。 糖蛋白酵素とは糖又はその誘導体を含む複合蛋
白質の酵素のことで例えばグルコースオキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、α−
ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼＡ、リパー
ゼ、ヒアルロニダーゼ等が含まれる。過ヨウ素酸
又は過ヨウ素酸塩を形成するカチオンは酵素活性
を阻害しないものであれば特に限定されない。例
えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネ
シウムなどのイオンを用いればよい。酵素を過ヨ
ウ素酸又は過ヨウ素酸塩で処理する方法はベルオ
キシダーゼについてP.K.Nakaneの方法（J.
Histochem.Cytochem.、16、９（1968））が知ら
れており、他の酵素もこれに準じて行えばよい。
個々の酵素についての具体的条件、すなわちPH、
温度、時間、濃度などは反応の進行と酵素の失活
の両面を考慮する必要があり、最適条件は酵素に
よつて異なるので予め試験を行つて定めるのがよ
い。通常は、PHは酵素の安定範囲であり、温度は
０℃〜常温程度、時間は５分〜２時間程度であ
る。反応は公知の緩衝液、たとえば重炭酸、リン
酸、ホウ酸、酢酸などの塩の水溶液中で行うこと
が好ましい。反応の停止は過ヨウ素酸自体の量を
制限することによつて行つてもよいが、通常はエ
チレングリコールなどのジオール体又はアスコル
ビン酸のような還元剤を添加することによつて行
う。 固定化物の単位重量当りの酵素活性を高める為
に固定化反応の前になるべく過ヨウ素酸処理酵素
溶液から反応試薬等を除去し、濃縮しておくのが
よい。そのために透析、限外濾過、ゲル濾過など
の公知の手段を適宜選択して行えばよい。 過ヨウ素酸又は過ヨウ素酸塩で処理した酵素は
α−位又はω−位のカルボキシル基が酸ヒドラジ
ド基に変換された酸性アミノ酸単位を含有するポ
リアミノ酸（以下ポリアミノ酸ヒドラジドとい
う。）と反応させる。酸性アミノ酸とはモノアミ
ノジカルボン酸のことで例えばグルタミン酸、ア
スパラギン酸、α−アミノアジピン酸の如きもの
である。ポリアミノ酸のα−位又はω−位のカル
ボキシル基が酸ヒドラジド基になつた酸性アミノ
酸単位のほかの構成単位としては、酸性アミノ
酸、その低級アルキルエステル、酸アミド及び金
属塩が挙げられるが、このほか必要に応じロイシ
ン、アラニン、フエニルアラニンなどの中性アミ
ノ酸、セリン、スレオニンなどのオキシアミノ酸
及びそのＯ−置換体、システイン、メチオニンな
どの含硫アミノ酸及びそのＳ−置換体、リジン、
アルギニン、ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸及
びその低級アシル体のうちの１種又は２種以上を
含むことができる。これらのアミノ酸及びその誘
導体単位は光学活性体、ラセミ体、又はこれらの
混合体のいずれであつてもよい。更に、これらの
重合体を後述のヒドラジン法で製造した場合には
２つの重合体のエステル残基間にヒドラジンが作
用して−CONHNHCO−型の架橋結合が形成され
る。 このようなポリアミノ酸ヒドラジドは酸性アミ
ノ酸低級アルキルエステル単位を含有する単一重
合体又は共重合体の成型物又は液状物をヒドラジ
ンと反応させたのち、必要に応じ未反応のエステ
ル基の一部又は全部をカルボキシル基に変換させ
ることによつて得ることができる（ヒドラジン
法）。ポリアミノ酸ヒドラジドを成型物として得
る方法は公知の方法で得たポリ酸性アミノ酸低級
アルキルエステルの成型物を公知の方法でヒドラ
ジド化してもよく、又、公知の方法で得られたポ
リ酸性アミノ酸ヒドラジドの溶液から公知の乾式
法又は湿式凝固法で目的の形状を有する成型物に
してもよい。ポリアミノ酸ヒドラジドは上記ヒド
ラジン法のほか、ポリアミノ酸クロリドにヒドラ
ジンを作用させるなどヒドラジド化物を製造しう
るいかなる方法にても製造することができる。酸
性アミノ酸誘導体のポリマーは有機溶剤に可溶で
あるので容易に種々の形状に成形したり、固体表
面にコーテイングすることができ、固定化酵素の
使用に望ましい任意な形状にして用いることがで
きるという特徴を有している。 過ヨウ素酸又は過ヨウ素酸塩で処理した酵素を
固定化する方法は該酵素を安定PH範囲の公知の緩
衝液、たとえば重炭酸、リン酸、ホウ酸などの塩
の水溶液とし、これにポリアミノ酸ヒドラジドを
必要により水、上記緩衝液などに懸濁後混合して
40℃以下好ましくは25℃以下で１時間〜48時間程
度接触させればよい。固定化物は必要により濾
過、遠心分離などにより反応液より分離して緩衝
液などで洗浄してから使用に供する。 次に、実施例１で得られた本発明の酵素固定化
物及び原料酵素について酵素活性とPHの関係を測
定した結果を第１図に示す。測定はグルコースオ
キシダーゼ10Uを0.1Mリン酸、0.1Mクエン酸、
２ｍMEDTA及び２ｍMNaN₃を含有する緩衝液
で所定のPHに調整した溶液5.0mlに懸濁又は溶解
し、基質として１mg/mlの安息香酸を含む20ｍＭ
グルコース0.1mlを添加して26℃でマグネチツク
スターラーで撹拌しつつ１分間酵素反応させ、溶
存酸素濃度の減少速度を溶存酸素電極で測定する
ことによつて求めた。図中、実線は本発明の酵素
固定化物を、そして点線は原料酵素を示す。 酵素の熱安定性を第２図に示す。図中、実線は
実施例１で得られた本発明の酵素固定化物、鎖線
は同じく実施例１で得られた酸アジド法の酸素固
定化物、一点鎖線は実施例２で得られたアミノ誘
導体固定化酵素、そして点線は原料酵素を示す。
測定方法は、各酵素をPH6.5の0.1Mリン酸緩衝液
で各温度で30分間放置後残存活性を測定して行つ
た。 実施例におけるグルコースオキシダーゼ活性は
小型磁気撹拌子を入れた酸素電極セル（5.0ml）
に200ｍＭグルコース、２ｍMEDTA、２ｍＭア
ジ化ナトリウムを含有する0.1Mリン酸緩衝液PH
6.5を満し、25℃で撹拌（500r.p.m）しつつ、グ
ルコースオキシダーゼ溶液又は固定化グルコース
オキシダーゼ懸濁液0.1mlを入れて最大酸素減少
速度を測定し、酵素を加えない場合について補正
して活性を算出した。1Uは１分間に１μmolの溶
存酸素を消費する活性をいう。 実施例 １ グルコースオキシダーゼ４mg（210U/mg、ベー
リンガー社製）を0.3MNaHCO₃0.4mlで溶解し、
0.06MNaIO₄0.4mlを加えて室温で30分間反応させ
た後、PH7.0の0.1Mアスコルビン酸0.4mlを加えて
反応を停止させた。この反応液をアミコン社製ダ
イアフロ−PM−10を用い窒素ガス加圧下５℃で
限外濾過して0.4mlに濃縮した。冷
0.1MNaHCO₃1.6mlを加え限外濾過で0.4mlに濃縮
する操作を３回行つて530U/mlの活性化グルコー
スオキシダーゼ液1.0mlを得た。 極限粘度〔η〕＝1.2のポリ−η−メチル−Ｄ−
グルタメート６重量部、ポリウレタンジイソシア
ナート３重量部及びエピクロルヒドリン１重量部
をジクロルエタン９容量部、トルエン１容量部か
らなる溶媒300重量部に３重量％になるように溶
解した液50ｇを80〜100メツシユの多孔質ガラス
ビーズ10ｇに加え、充分撹拌した後エバポレータ
ーで溶媒を除去し、100℃で５時間乾燥した。得
られた乾燥物を80％泡水ヒドラジン10容量部にピ
リジン１容量部を加えて溶液50mlに投入し、50℃
で３時間反応させたのち十分に水洗してガラスビ
ーズコーテイングPMGヒドラジド体を得た。 該ヒドラジド体0.5ｇに冷0.1MNaHCO₃1.5mlを
加えて撹拌した後静置して上清を除去した後、上
述の活性化グルコースオキシダーゼ液1.0mlを直
ちに加え、５℃で２日間ゆるやかに振盪して反応
させた。次いで室温にて１日間放置してから反応
上清液を除去し、0.5MNaCl、２ｍMEDTA含有
の0.1Mリン酸緩衝液PH7.0で５回洗浄してグルコ
ースオキシダーゼ固定化物（酵素活性428U）を
得た。洗液中の酵素活性は33Uであつた。この固
定化物について第１図のPH７における測定条件で
２月間に延200回の反復測定を行つたところ200回
目の活性は第１回目の94％であつた。 次に、上記で得られたガラスビーズコーテイン
グPMGヒドラジド体0.5ｇを氷冷した0.1N塩酸５
ml中に15秒間放置し、３重量％の亜硝酸ナトリウ
ム水溶液0.75mlを加えて20分間ゆつくり撹拌して
反応させた後ガラスビーズを濾別し、氷冷水次い
でPH8.5の0.05Mリン酸緩衝液で洗浄してアジド
化物を得た。このアジド化物を同じグルコースオ
キシダーゼ４mgを0.3MNaHCO₃4mlに溶解した液
に投入し、上記と同様に反応及び洗浄を行つたと
ころ酵素活性140Uのグルコースオキシダーゼ固
定化物が得られた。洗液中の酵素活性は688Uで
あつた。 実施例 ２ 実施例１と同じグルコースオキシダーゼを実施
例１と同様に処理して活性化グルコースオキシダ
ーゼ液を得た。 実施例１で得られたガラスビーズコーテイング
PMGヒドラジド体1.0ｇに上記活性化グルコース
オキシダーゼ1260Uを実施例１と同様に作用さ
せ、1100Uのグルコースオキシダーゼ固定化物を
得た。 実施例１と同じ多孔質ガラスビーズ10ｇを10％
γ−アミノプロパントリエトキシシランのトルエ
ン溶液80mlに加え、５時間リフラツクスした後エ
タノールで洗浄し、γ−アミノプロパントリエト
キシシランを結合させたガラスビーズを得た。こ
のガラスビーズ1.4ｇに上記活性化グルコースオ
キシダーゼ1760Uを実施例１と同様に作用させ、
900Uのグルコースオキシダーゼ固定化物を得
た。 この２つの固定化物について、下表の条件で処
理後、残存活性を測定した結果を下表に示す。

【表】 実施例 ３ 250U/mgのペルオキシダーゼ（ベーリンガー社
製）1.2mgを0.3MNaHCO₃0.25mlに溶解し、
0.06MNaIO₄0.2mlを加えて実施例１と同様に反応
させ、以下実施例１と同様に処理して510U/mlの
活性化ペルオキシダーゼ液0.5mlを得た。 この活性化ペルオキシダーゼ液0.5mlに
0.1MNaHCO₃1ml及び実施例１で得られたガラス
ビーズコーテイングPMGヒドラジド体0.1ｇを加
え、４℃で２日間ゆるやかに振盪して反応させ
た。PH7.0の0.1Mリン酸緩衝液２mlで洗浄後同じ
緩衝液１mlを加え、NaBH₄0.2mgを加えて４℃で
５時間反応させたのちPH7.0の0.1Mリン酸緩衝液
で５回洗浄して2200U/ｇのペルオキシダーゼ固
定化物104mgを得た。酵素活性は0.01％H₂O₂を基
質としてフエノール・アンチピリンによる発色を
測定して定めた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で得られたグルコースオキシダ
ーゼ固定化物及び固定化に用いた原料酵素につい
てPHと酵素活性の関係を示した図であり、第２図
は酵素の熱安定性を測定した結果を示すものであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 糖蛋白酵素を過ヨウ素酸又は過ヨウ素酸塩で
   処理して該酵素にアルデヒド基を生成させてか
   ら、α−位又はω−位のカルボキシル基が酸ヒド
   ラジド基に変換された酸性アミノ酸単位を含有す
   るポリアミノ酸と反応させることを特徴とする糖
   蛋白酵素の固定化方法。 ２ α−位又はω−位のカルボキシル基が酸ヒド
   ラジド基に変換された酸性アミノ酸単位を含有す
   るポリアミノ酸がポリ−γ−メチルグルタメート
   をヒドラジンと反応させることにより得られたも
   のである特許請求の範囲第１項記載の方法。