JPS6256782B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は血液中の有害成分の除去用の吸着体に
関する。さらに詳しくは、血液あるいは血漿、血
清中からリポ蛋白、特に低密度リポ蛋白
（LDL）を選択的に吸着除去するための吸着体に
関する。 血液中に存在するリポ蛋白のうちLDLはコレ
ステロールを多く含み、動脈硬化の原因となるこ
とが知られている。とりわけ家族性高脂血症等の
高コレステロール症では正常値の数倍のLDL値
を示し、冠動脈の硬化等をひきおこす。この治療
のため、血中LDLの低下を目的として食事療
法、プロブコール、コレスチラミン等の薬物療法
が行なわれているが効果に限度があり、副作用も
懸念されている。特に家族性高脂血症に対しては
患者の血漿を分離した後、正常血漿あるいはアル
ブミン等を成分とする補液と交換する、いわゆる
血漿交換療法が現在のところほぼ唯一の効果的な
治療法である。しかしながら周知のごとく血漿交
換療法は、１）高価な新鮮血漿あるいは血漿製剤
を用いる必要がある、２）肝炎ビールス等の感染
のおそれがある、３）有害成分のみでなく有用成
分も同時に除去してしまう等の欠点を有する。こ
れらの欠点を解消する目的で膜による有害成分の
除去が試みられているが、選択性の点で満足でき
るものはいまだ得られていない。 また同じ目的で抗原、抗体等を固定したいわゆ
る免疫吸着体を用いる試みがなされており、これ
は選択性の点ではほぼ満足できるものの、用いる
抗原、抗体の入手が困難かつ高価であるという致
命的な欠点を有する。 さらには有害成分に親和性を有する化合物（い
わゆるリガンド）を固定した、いわゆるアフイニ
テイークロマトグラフの原理による吸着体も試み
られている。これに用いるリガンドは比較的安価
で、選択性も比較的よく好都合であるが、担体に
アガロースに代表されるソフトゲルを用いている
ため、カラムに充填した場合に十分な流量を得る
のが困難であつた。すなわち近年発達した体外循
環回路を用いた血液、血漿かん流療法（いわゆる
プラズマフエレーシス等）にこれらの吸着体を用
いようとすれば、高流量を得るためにカラム形状
に特別の工夫を要し、またしばしば詰りを生ずる
ため予備のカラムを用意しておく必要があるなど
問題点が多く、安定して治療を行なえる状況には
到つていない。吸着体の流れ特性を向上させるた
めには機械強度の大きい担体を用いればよいのは
明白であるが、これらの担体を用いるとアガロー
ス等のソフトゲルに比べて吸着能力が低下するこ
とが知られている。 一方、硫酸化多糖等のポリアニオン化合物がリ
ポ蛋白と親和性を持ち、金属イオンの共存下で沈
殿を形成することが知られており〔例えばM.
Burnstein and H.R.Scholnick，Adv.in Lipid.
Res.，11，67（1973）〕、臨床分析等に用いられ
てる。しかしながらこの方法で患者の血中から
LDLを除去しようとすれば、処理しようとする
血漿に対し少くとも0.05％のポリアニオン化合物
および0.02M上の金属イオンを添加しなければな
らず、また生じた沈殿を遠心分離等の方法で分離
する必要が生じ、操作が煩雑で危険性が高く、事
実上適用不可能であつた。 本発明者らは鋭意研究の結果、特定のポーラス
ポリマーハードゲルを用い、これにリポ蛋白に親
和性を有するポリアニオン化合物を固定すること
により、安価で流れ特性がよく、かつソフトゲル
を担体に用いた場合に比し吸着能力が低下しない
除去能力に優れたリポ蛋吸着体を得、本発明に到
達した。 すなわち本発明は、球状蛋白質の排除限界分子
量が100万以上１優以下のポーラスポリマーハー
ドゲルに、リポ蛋白に親和性を有するポリアニオ
ン化合物を固定してなるリポ蛋白吸着体である。 以下詳細に本発明を説明する。 本発明に用いるに適した担体は、１）耐圧性で
あること、２）比較的大きな径の細孔を有するこ
とが必要であり、ポリマーハードゲルは本発明に
最も適した担体である。 ここでいうハードゲルとは、デキストラン、ア
ガロース、アクリルアミド等のソフトゲルに比べ
溶媒による膨潤が少なく、また圧力により変形し
にくいゲルのことをいう。ハードゲルとソフトゲ
ルは次の方法により区別することができる。すな
わち後記参考例に示したごとくゲルを円筒状カラ
ムに均一に充填し、水性液体を流した際の圧力損
失と流量の関係が、ハードゲルではほぼ直線とな
るのに対し、ソフトゲルでは圧力がある点を越え
るとゲルが変形し圧密化して流量が増加しなくな
る。本発明では、後記参考例に示したカラムを用
いた場合、少くとも0.3Kg／cm²まで上記直線関係
のあるものをハードゲルと称する。 次に要求される性質は比較的大きな径の細孔を
有することである。すなわちLDLは分子量が少
くとも100万以上といわれる巨大分子であり、こ
れを吸着除去するためにはLDLが細孔内に侵入
できることが必要である。 次にLDLが細孔内に侵入できても、細孔内に
侵入する確率がある程度大きくなければ吸着体と
しての性能は低い、すなわち移動相と固定相（細
孔内）間の分配比（固定相の濃度／移動相の濃
度）が大きいほど好ましいと考えられる。従つて
細孔径が大きい程有利と思われる。 細孔径の測定法には種々あり、水銀圧入法が最
もよく用いられているが、ポリマーハードゲルの
場合には適用できないことがある。したがつて細
孔径の目安として排除限界分子量を用いるのが適
当である。排除限界分子量とは成書（例えば波多
野博行、花井俊彦著、実験高速液体クロマトグラ
フ、化学同人）等に述べられているごとく、ゲル
浸透クロマトグラフイーにおいて細孔内に侵入で
きない（排除される）分子のうち最も小さい分子
量をもつものの分子量をいう。現象的には、排除
限界分子量以上の分子は移動相体積Vo近傍に溶
出されることから、種々の分子量の化合物を用い
て溶出体積との関係を調べれば排除限界分子量を
求めることができる。排除限界分子量は対象とす
る化合物の種類により異なることが知られてお
り、一般に球状蛋白質、デキストラン、ポリエチ
レングリコール等についてよく調べられている
が、リポ蛋白についてはほとんど調べられていな
い。従つて最も類似している球状蛋白質（ビール
スを含む）を用いて得られた値を用いるのが適当
である。 排除限界の異なる種々の担体を用いて検討した
結果、予想に反し排除限界分子量がLDLの分子
量より小さい100万程度のものでもある程度の
LDL吸着能を示し、また細孔径の大きいもの程
能力が大きいわけではなく、むしろLDL以外の
蛋白が除去されることから最適な細孔径の範囲が
存在することが明らかになつた。すなわち100万
未満の排除限界分子量を持つ担体を用いた場合は
LDLの除去量は小さく実用に耐えないが、排除
限界分子量が100万乃至数百万とLDLの分子量に
近い担体でもある程度実用に供しうる吸着体が得
られた。一方排除限界分子量とLDLの吸着量、
およびLDL以外の蛋白質の吸着（いわゆる非特
異吸着）との関係を調べると、排除限界分子量が
大きくなるにつれLDLの吸着量が増加するが、
この増加は排除限界が1000万を超えると頭打ちと
なり、一方LDL以外の蛋白、例えばIGG、IGM等
の吸着が目立つようになることがわかつた。さら
に排除限界分子量が１億以上になるとリガンドの
固定化量が減少して結果的にLDLの吸着量が減
り、非特異吸着が無視できなくなる。従つて本発
明に用いる担体の好ましい排除限界分子量は100
万以上１億以下であり、最も好ましくは300万以
上7000万以下である。 次に担体の多孔構造については表面多孔性より
も全多孔性が好ましく、空孔容積が20％以上であ
ることが好ましい。担体の形状は、粒状、繊維
状、膜状、ホローフアイバー状等任意の形状を選
ぶことができる。粒子状の担体を用いる場合、そ
の粒子径は１μ以上5000μ以下であるのが望まし
い。 さらに担体表面には固定化反応に用い得る官能
基あるいは容易に活性化し得る官能基が存在して
いると好都合である。これらの官能基の代表例と
しては、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ
ル基、チオール基、酸無水物基、サクシニルイミ
ド基、塩素基、アルデヒド基、アミド基、エポキ
シ基等があげられる。 本発明に適したポリマーハードゲルの代表例と
しては、スチレン―ジビニルベンゼン共重合体、
架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレー
ト、架橋されたビニルエーテル―無水マレイン酸
共重合体、架橋されたスチレン―無水マレイン酸
共重合体、架橋ポリアミド等の合成高分子や多孔
質セルロースゲル等の硬質多孔体、およびこれら
の表面に多糖類、合成高分子等をコーテイングし
たもの等があげられるが、これらに限定されるわ
けではない。これらのポリマーハードゲルは単独
で用いてもよいし２種類以上混合して用いてもよ
い。 本発明に用いるに適したリポ蛋白に親和性を有
するポリアニオン化合物の代表例としては、ヘパ
リン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、
コンドロイチンポリ硫酸、ヘパラン酸、ケラタン
硫酸、ヘパリチン硫酸、キシラン硫酸、カロニン
硫酸、セルロース硫酸、キチン硫酸、キトサン硫
酸、ペクチン硫酸、イヌリン硫酸、アルギン酸硫
酸、グリコーゲン硫酸、ポリラクトース硫酸、カ
ラゲニン硫酸、デンプン硫酸、ポリグルコース硫
酸、ラミナリン硫酸、ガラクタン硫酸、レバン硫
酸、メペサルフエート等の硫酸化多糖、リンタン
グステン酸、ポリ硫酸化アネトール、ポリビニル
アルコール硫酸、ポリリン酸等があげられる。最
も好ましい例としては、ヘパリン、デキストラン
硫酸、コンドロイチンポリ硫酸があげられる。 リポ蛋白に親和性を有する化合物（リガンド）
を担体に固定する方法としては既知の種々の方法
を用いることができる。すなわち物理的吸着法、
イオン結合法、共有結合法等である。本発明によ
る吸着体を治療に用いるには、滅菌時あるいは治
療中にリガンドが脱離しないことが重要であるの
で結合の強固な共有結合法が望ましく、イオン結
合法を用いるにしてもリガンドを共有結合的に架
橋しておくことが望ましい。また必要によりスペ
ーサーを担体とリガンドの間に導入してもよい。 リガンドの固定化量については、リガンドの性
状、活性により異なるが、有意のリポ蛋白吸着量
を得るにはカラム体積１mlあたり0.02mg以上が好
ましく、また経済性を考慮すると100mg以下が望
ましい。さらに好ましくはカラム体積１mlあたり
0.5mg以上20mg以下である。 本発明による吸着体を治療に用いるには種々の
方法がある。最も簡便な方法としては患者の血液
を体外に導出して血液バツグ等に貯め、これに本
発明の吸着体（粒子）を混合してLDLを除去し
た後、フイルターを通して吸着体（粒子）を除去
し血液を患者に戻す方法がある。この方法は複雑
な装置を必要としないが、１回の処理量が少なく
治療に時間を要し、操作が煩雑になるという欠点
を有する。次の方法は吸着体をカラムに充填し、
体外循環回路に組み込みオンラインで吸着除去を
行なうものである。処理方法には全血を直接かん
流する方法と、血液から血漿を分離した後、血漿
をカラムに通す方法がある。本発明による吸着体
は、いずれの方法にも用いることができるが、前
述のごとくオンライン処理に最も適している。 本発明による吸着体を用いてLDLを除去する
際、処理しようとする血液、あるいは血漿に多価
金属イオンを添加することにより除去効率、選択
性を向上させることが可能である。この目的に用
いる多価金属イオンとしては、カルシウム、マグ
ネシウム、バリウム、ストロンチウム等のアルカ
リ土類金属イオン、アルミニウム等の属元素イ
オン、マンガン等の属元素イオン、コバルト等
の属元素イオン等があげられる。 以下実施例により本発明をさらに詳しく説明す
る。 参考例 両端に孔径15μｍのフイルターを装着したガラ
ス製円筒カラム（内径９mm、カラム長150mm）に
アガロースゲル（Biorad社製Biogel A5m、粒径
50〜100メツシユ）、ポリマーハードゲル（東洋曹
達工業(株)製トヨパールHW65、粒径50〜100μ
ｍ、およびチツソ(株)製セルロフアインGC−700、
粒径45〜105μｍ）をそれぞれ均一に充填し、ペ
リスタテイツクポンプにより水を流し、流量と圧
力損失の関係を求めた。結果を図１に示す。それ
によるとポリマーハードゲルが圧力の増加にほぼ
比例して流量が増加するのに対し、アガロースゲ
ルは圧密化をひきおこし圧力を増加させても流量
が増加しないことを示している。 実施例 １ 架橋アクリレートゲル（全多孔性のハードゲ
ル）であるトヨパールHW55（球状蛋白質の排除
限界分子量（以下蛋白質の排除限界と略称する）
700000、粒径、50〜100μｍ）、HW60（蛋白質の
排除限界1000000、粒径50〜100μｍ）、HW65
（蛋白質の排除限界5000000、粒径50〜100μｍ）、
HW75（蛋白質の排除限界50000000、粒径50〜
100μｍ）各10mlに飽和NaOH水溶液６ml、エピ
クロルヒドリン15mlを加え撹拌しながら50℃で２
時間反応しエポキシ化ゲルを得た。このゲルに濃
アンモニア水20mlを加え50℃で２時間撹拌しアミ
ノ基を導入した。 次にヘパリン200mgを10mlの水に溶解しPH4.5に
調整した後、これに３mlの上記アミノ基含有ゲル
を加えた。これに１―エチル―３―（ジメチルア
ミノプロピル）―カルボジイミド200mgをPHを4.5
に保ちながら添加し４℃で24時間振とうした。反
応終了後、２モル食塩溶液、0.5モル食塩溶液、
水で洗浄しヘパリン固定化ゲルを得た。固定化さ
れたヘパリンの量はそれぞれ2.2mg／ml、1.8mg／
ml、1.4mg／ml、0.8mg／mlであつた。 実施例 ２ 硬質セルロース多孔体（全多孔性のハードゲ
ル）、セルロフアインGC700（チツソ(株)製、蛋白
質の排除限界400000、粒径45〜105μｍ）、セルロ
フアインＡ―２（チツソ(株)製（試作品）、蛋白質
の排除限界700000、粒径45〜105μｍ）、セルロフ
アインＡ―３（チツソ(株)製（試作品）、蛋白質の
排除限界約50000000、粒径45〜105μｍ）をそれ
ぞれ吸引過し、各10gをとり、これに20％
NaOHを4g、ヘプタン12gを加え、さらにノニオ
ン系界面活性剤TWEEN20を１滴加え撹拌してゲ
ルを分散させた。40℃で２時間撹拌後、これにエ
ピクロルヒドリン5gを加え40℃で２時間撹拌し
た。静置後、上澄みを捨て、ゲルを水洗過して
エポキシ化ゲルを得た。これに15mlの濃アンモニ
ア水を加え40℃で1.5時間撹拌し、内容物を吸引
過、水洗してアミノ基の導入されたセルロース
ゲルを得た。 次にヘパリン200mgを10mlの水に溶解し、これ
に上記アミノ基含有ゲル３mlを加えてPH4.5に調
整した。これに１―エチル―３―（ジメチルアミ
ノプロピル）―カルボジイミド200mgをPH4.5に保
ちながら添加し、４℃で24時間振とうした。反応
終了後、２モル食塩溶液、0.5モル食塩溶液、水
で洗浄しヘパリン固定化ゲルを得た。固定化され
たヘパリン量はそれぞれ2.5mg／ml、2.2mg／ml、
1.8mg／mlであつた。 実施例 ３ ヘパリンをコンドロイチンポリ硫酸にかえた他
は実施例１と同じ方法でコンドロイチンポリ硫酸
固定化トヨパールゲルHW65を得た。固定化量は
1.2mg／mlであつた。 実施例 ４ セルロフアインＡ―３ ４mlに0.5モルNaIO₄
を加えて10mlとし１時間室温で撹拌後、過水洗
してアルデヒド基を導入した。次にこのゲルをPH
８のリン酸緩衝液10ml中に懸濁し、ジエチルアミ
ン50mgを加えて室温で20時間撹拌し別した。こ
れを１％NaBH₄溶液10ml中に懸濁し15分間還元
後、集、洗浄してアミノ基を導入した。 次にデキストラン硫酸300mgを0.25モルNaIO₄
溶液10mlに溶解し室温で４時間撹拌後、エチレン
グリコール200mgを加えて１時間撹拌する。この
溶液をPH８に調整した後、上記アミノ基含有ゲル
を懸濁し24時間撹拌した。反応終了後、ゲルを
集、水洗し、これを１％NaBH₄溶液10mlに懸濁
し15分間還元し、過水洗してデキストラン硫酸
固定化セルロースゲルを得た。固定化量は0.5
mg／mlであつた。 実施例 ５ 実施例１〜４で合成した吸着体各１mlを試験管
にとり、これに人血漿３ml（CaCl₂0.02M含有）
を加えて撹拌し、20℃で15分間静置後、上澄みの
コレステロール濃度およびLDL（β―リポ蛋
白）量を測定した。結果を表１に示す。

【表】

【表】 【図面の簡単な説明】

図１は、参考例において各種ゲルを用いて流速
と圧力損失の関係を調べたグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 球状蛋白質の排除限界分子量が100万以上１
   億以下のポーラスポリマーハードゲルに、リポ蛋
   白に親和性を有するポリアニオン化合物を固定し
   てなるリポ蛋白吸着体。 ２ ポーラスポリマーハードゲルが合成高分子か
   らなる特許請求の範囲第１項記載の吸着体。 ３ ポーラスポリマーハードゲルが多孔質セルロ
   ースゲルである特許請求の範囲第１項記載の吸着
   体。 ４ ポリアニオン化合物が硫酸化多糖である特許
   請求の範囲第１項記載の吸着体。 ５ 硫酸化多糖がヘパリン、デキストラン硫酸、
   コンドロイチンポリ硫酸から選ばれる少くとも１
   種である特許請求の範囲第４項記載の吸着体。 ６ ポリアニオン化合物の固定化量がカラム体積
   １mlあたり0.02mg以上100mg以下である特許請求
   の範囲第１項記載の吸着体。