JPS6319214B2

JPS6319214B2 -

Info

Publication number: JPS6319214B2
Application number: JP58070967A
Authority: JP
Inventors: Nobutaka Tani; Tsuneo Hayashi
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1983-04-21
Filing date: 1983-04-21
Publication date: 1988-04-21
Also published as: JPS59196738A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は血液中の有害成分を除去するための吸
着体に関する。さらに詳しくは血液あるいは血
漿、血清中からリポ蛋白、とくに極低密度リポ蛋
白（VLDL）および（または）低密度リポ蛋白
（LDL）を選択的に吸着除去するための吸着体に
関する。血液中に存在するリポ蛋白のうちVLDL、
LDLはコレステロールを多く含み、動脈硬化の
原因となることが知られている。とりわけ家族性
高脂血症などの高脂血症、高コレステロール症に
おいては正常値の数倍のVLDLおよび（または）
LDL値を示し、冠動脈の硬化などをひきおこす。
これらの疾患の治療には食事療法、薬物療法が行
なわれているが効果に限度があり、副作用も懸念
されている。とくに家族性高脂血症に対しては
VLDL、LDLを多く含んだ患者の血漿を分離し
たのち、正常血漿またはアルブミンなどを成分と
する補液と交換してVLDL値、LDL値を低下さ
せる、いわゆる血漿交換療法が現在のところほぼ
唯一の効果的な治療法である。しかしながら、血
漿交換療法は周知のごとく、(1)高価な新鮮血漿あ
るいは血漿製剤を用いる必要がある、(2)肝炎ウイ
ルスなどの感染の惧れがある、(3)有害成分のみで
なく有用成分も同時に除去してしまう、すなわち
リポ蛋白のばあい有用である高密度リポ蛋白
（HDL）も同時に除去してしまうなどの欠点を有
する。叙上の欠点を解消する目的で膜による有害成分
の選択的除去が試みられているが、選択性の点で
満足できるものはいまだえられていない。また同
じ目的で抗原、抗体などを固定した、いわゆる免
疫吸着体を用いる試みがなされており、該方法は
選択性の点ではほぼ満足できるものの、用いる抗
原、抗体の入手が困難かつ高価であるという欠点
を有する。さらには、除去対象物質に特異的な親和性（ア
フイニテイー）を有する物質（以下、リガンドと
いう）を担体に固定した、いわゆるアフイニテイ
ークロマトグラフイーの原理による吸着体も試み
られている。該方法に用いられるリガンドは抗
原、抗体などに比べれば入手しやすい物質が多い
が、生体に由来する物質が多いため体外循環治療
に用いるには滅菌操作などに対する安定性、価
格、安全性などの点で満足しうるものはほとんど
ない。本発明者らは叙上のごとき欠点を克服すべくさ
らに鋭意研究を重ねた結果、特定の粘度と硫黄含
量を有するデキストラン硫酸および（または）そ
の塩を水不溶性多孔体に共有結合を介して固定す
ることによつて、高効率でかつ安全に、しかも選
択性よくリポ蛋白を吸着除去しうる体外循環治療
用吸着体がえられることを見出し、本発明を完成
するに至つた。すなわち、本発明は極限粘度（1M食塩水溶液
中、25℃で測定、以下同様）が0.12dl／ｇ以下で
かつ硫黄含量が15重量％以上、好ましくは15〜22
重量％のデキストラン硫酸および（または）その
塩が水不溶性多孔体に共有結合を介して固定され
てなる体外循環治療用リポ蛋白吸着体およびその
製造法に関する。デキストラン硫酸および（または）その塩とは
ロイコノストツク・メセンテロイデス
（Leuconostoc mesenteroides）などにより生産
される多糖であるデキストランの硫酸エステルお
よび（または）その塩である。デキストラン硫酸および（または）その塩がカ
ルシウムなどの２価カチオンの存在下にリポ蛋白
と沈殿を形成することが知られており、通常該目
的には分子量が50万（極限粘度が約0.20dl／ｇ）
程度のデキストラン硫酸および（または）その塩
が使用される。しかしながら、比較例に示すよう
に叙上のごときデキストラン硫酸および（また
は）その塩を水不溶性多孔体に固定してもLDL
および（または）VLDLの吸着能力は低く、実用
に耐えない。本発明者らは種々検討を重ねた結
果、極限粘度が0.12dl／ｇ以下、より好ましくは
0.08dl／ｇ以下でかつ硫黄含量が15重量％以上の
デキストラン硫酸および（または）その塩が高い
LDLおよび（または）VLDL吸着能力と選択性
を示すことを見出した。さらに驚くべきことに、
叙上のごとき沈殿法では10〜40mMの２価カチオ
ンを必要とするのに対し、本発明の吸着体では２
価カチオンの添加を必ずしも行なわなくとも高い
吸着能力と選択性を示すことが見出された。また
デキストラン硫酸および（または）その塩の毒性
は低いが、分子量がある程度以上大きくなると毒
性が増加することが知られており、この点からも
極限粘度が0.12dl／ｇ以下、より好ましくは0.08
dl／ｇ以下の比較的低分子量のデキストラン硫酸
および（または）その塩を用いることによつて、
固定されたデキストラン硫酸および（または）そ
の塩が万が一脱離した際の危険を防止できる。さ
らには、デキストラン硫酸および（または）その
塩は大部分がα−１，６−グリコシド結合である
ので高圧蒸気滅菌などの操作を施しても変化が少
ない。デキストラン硫酸および（または）その塩の分
子量の測定法には種々あるが、粘度測定によるの
が一般的である。しかしながら、デキストラン硫
酸および（または）その塩は高分子電解質である
ため溶液のイオン強度、PH、さらにデキストラン
硫酸および（または）その塩の硫黄含量（すなわ
ち、スルホン酸基の量）などによつて同じ分子量
のものでも粘度が異なる。本発明でいう極限粘度
とは、デキストラン硫酸および（または）その塩
をナトリウム塩とし、中性の1M食塩水溶液中、
25℃で測定したものである。本発明に用いるデキストラン硫酸および（また
は）その塩は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、塩と
してはナトリウム、カリウムなどの水溶性塩が好
ましい。本発明に用いる担体の水不溶性多孔体としては
つぎの性質を備えていることが好ましい。 (1) 機械的強度が比較的高く、カラムなどに充填
して、血液、血漿などの体液を流したばあいの
圧力損失が小さく、目詰りなどをおこさない。 (2) 充分な大きさの細孔が多数存在すること、す
なわち吸着除去対象物質が細孔内に侵入できる
ことが必要であり、球状蛋白質およびウイルス
を用いて測定した排除限界分子量が100万〜１
億の範囲である（ただし排除限界分子量とは細
孔内に侵入できない（排除される）の分子のう
ち最も小さい分子量をもつものの分子量をい
う）。 (3) 表面に固定化反応に用いうる官能基または容
易に活性化しうる官能基、たとえばアミノ基、
カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール
基、酸無水物基、サクシニルイミド基、塩素
基、アルデヒド基、アミド基、エポキシ基など
が存在する。 (4) 高圧蒸気滅菌などの滅菌操作による変化が少
ない。なお、(2)の球状蛋白質およびウイルスを用いて
測定した排除限界分子量（以下、排除限界分子量
という）に関しては、排除限界分子量100万未満
の担体を用いたばあいはVLDL、LDLの除去量
は小さく実用に耐えないが、排除限界分子量が
100万〜数百万とVLDL、LDLの分子量に近い担
体でもある程度実用に供しうるものがえられる。
一方、排除限界分子量が１億を超えると、リガン
ドの固定量が減少して結果的に吸着量が減り、ま
たゲルの強度も低下するため好ましくない。かか
る理由のため本発明に用いる水不溶性多孔体は排
除限界分子量が100万〜１億の範囲であることが
適当である。叙上のごとき性質を備えた水不溶性多孔体の代
表例としては、スチレン−ジビニルベンゼン共重
合体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアク
リレート、架橋されたビニルエーテル−無水マレ
イン酸共重合体、架橋されたスチレン−無水マレ
イン酸共重合体、架橋ポリアミドなどなどの合成
高分子の多孔体や多孔質セルロースゲル、さらに
はシリカゲル多孔質ガラス、多孔質アルミナ、多
孔質シリカアルミナ、多孔質ヒドロキシアパタイ
ト、多孔質ケイ酸カルシウム、多孔質ジルコニ
ア、ゼオライトなどの無機多孔体があげられる
が、これらに限定されるわけではないまた水不
溶性多孔体の表面は多糖類、合成高分子などでコ
ーテイングされていてもよい。水不溶性多孔体の粒子径は一般的には小さい方
が吸着能力の点で好ましいが、粒子径があまりに
小さくなるとカラムに充填したばあいの圧力損失
が大きくなり好ましくなく、１〜5000μの範囲で
あることが好ましい。また水不溶性多孔体は単独
で用いてもよいし２種類以上混合して用いてもよ
い。叙上の代表例の中でも多孔質セルロースゲルは
前記(1)〜(4)の性質を備えているばかりでなく、デ
キストラン硫酸および（または）その塩を効率よ
く固定することができるため本発明に最も適した
水不溶性多孔体のひとつである。デキストラン硫酸および（または）その塩を水
不溶性多孔体に固定する方法には種々あるが、体
外循環治療に用いるにはリガンドが脱離しないこ
とが重要であるので、リガンドが結合の強固な共
有結合を介して水不溶性多孔体に固定されている
ことが望ましい。固定化方法の代表例としては、ハロゲン化シア
ン法、エピクロルヒドリン法、ビスエポキサイド
法、ハロゲン化トリアジン法などがあげられる
が、結合が強固でリガンドの脱離の危険性が少な
いエピクロルヒドリン法が最も本発明に適してい
る。しかしながら、該エピクロルヒドリン法は反
応性が低く、とくにデキストラン硫酸および（ま
たは）その塩を固定するばあいにはリガンドの官
能基が水酸基であるためさらに反応性が低く、通
常の方法では充分なリガンド固定量をうることは
難しい。本発明者らは種々検討の結果、エピクロルヒド
リンで活性化されたエポキシ化水不溶性多孔体と
デキストラン硫酸および（または）その塩を反応
させる工程において、デキストラン硫酸および
（または）その塩の濃度（水不溶性多孔体（乾燥
重量）を除く全反応系重量に対する濃度、以下同
様）を３重量％以上、より好ましくは10重量％以
上に保つことによつて充分な量のデキストラン硫
酸および（または）その塩が固定されることを見
出した。デキストラン硫酸および（または）その
塩の固定化量については、有意なリポ蛋白吸着量
をうるにはカラム体積１mlあたり0.2mg以上が好
ましく、また経済性を考慮すると100mg以下が望
ましい。また、多孔質セルロースゲルを用いると他の水
不溶性多孔体に比べ、同じ条件でもデキストラン
硫酸および（または）その塩の固定量が多く、好
都合である。エピクロルヒドリンにより活性化された水不溶
性多孔体とデキストラン硫酸および（または）そ
の塩との反応でえられる吸着体は、デキストラン
硫酸および（または）その塩が式：（式中、O^Aはデキストラン硫酸および（または）
その塩の水酸基に由来する酸素原子、O^Bは水不
溶性多孔体の表面水酸基に由来する酸素原子）で
示される結合を介して水不溶性多孔体に固定され
ている。なお、固定化反応終了後未反応のデキストラン
硫酸および（または）その塩は回収して精製など
の工程を経て再使用することもできる。デキストラン硫酸を固定したのち、未反応の活
性基（エピクロルヒドリンを用いたばあいはエポ
キシ基）はモノエタノールアミンなどで封止して
おくのが望ましい。本発明による吸着体を体外循環治療に用いるに
は種々の方法があるが、入口と出口に体液成分
（血球、蛋白質など）は通過するが吸着体は通過
できないフイルター、メツシユなどを装着したカ
ラムに充填し、該カラムを体外循環回路に組み込
み、血液、血漿などの体液をカラムに通して行な
う方法が代表的である。つぎに実施例をあげて本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はかかる実施例のみに限定され
るわけではない。比較例１セルロフアインＡ−３（チツソ(株)製の多孔質セ
ルロースゲル、排除限界分子量50000000、粒子径
45〜105μｍ）10mlに20％NaOH4ｇ、ヘプタン12
ｇおよびノニオン系界面活性剤トウイーン
（Tween）20を１滴加え、40℃で２時間撹拌後エ
ピクロルヒドリン５ｇを加えて２時間撹拌した。
静置後上澄みを捨て、ゲルを水洗過してエポキ
シ化セルロースゲルをえた。つぎにLDL沈殿用として市販されている極限
粘度0.20dl／ｇ、平均重合度（原料デキストラン
の平均重合度、以下平均重合度という）3500、硫
黄含量17.7重量％のデキストラン硫酸ナトリウム
0.5ｇを水２mlに溶解し、これに叙上のごとくし
てえられたエポキシ化セルロースゲル２mlを加
え、PH12に調整した（デキストラン硫酸ナトリウ
ムの濃度は約10重量％）。これを40℃で16時間振
とう後ゲルを別し、2M食塩水、0.5M食塩水、
水で洗浄し、デキストラン硫酸ナトリウムが固定
化されたセルロースゲルをえた。未反応のエポキ
シ基はモノエタノールアミンを用いて封止した。
固定されたデキストラン硫酸ナトリウムの量はカ
ラム体積１mlあたり4.2mgであつた。比較例２デキストラン硫酸ナトリウムを極限粘度0.124
dl／ｇ、平均重合度140、硫黄含量5.7重量％のも
のにかえたほかは比較例１と同様にしてデキスト
ラン硫酸ナトリウムが固定されたセルロースゲル
をえた。固定されたデキストラン硫酸ナトリウム
の量はカラム体積１mlあたり2.5mgであつた。実施例１デキストラン硫酸ナトリウムとして (1) 極限粘度0.027dl／ｇ、平均重合度12、硫黄
含量17.7重量％ (2) 極限粘度0.055dl／ｇ、平均重合度40、硫黄
含量19重量％ (3) 極限粘度0.083dl／ｇ、平均重合度140、硫黄
含量19.2重量％ (4) 極限粘度0.118dl／ｇ、平均重合度270、硫黄
含量17.7重量％の４種類を用い、比較例１と同様にしてデキスト
ラン硫酸ナトリウムが固定されたセルロースゲル
をえた。固定されたデキストラン硫酸ナトリウム
の量はカラム体積１mlあたりそれぞれ2.0mg、1.5
mg、4.0mg、4.3mgであつた。実施例２架橋ポリアクリレートゲルであるトヨパール
HW65（東洋曹達(株)製、排除限界分子量5000000、
粒子径50〜100μｍ）10mlに飽和NaOH水溶液６
ml、エピクロルヒドリン15mlを加え、撹拌しなが
ら50℃で２時間反応させたのち、ゲルをアルコー
ル、水で洗浄してエポキシ化されたゲルをえた。えられたゲル２mlに極限粘度0.055dl／ｇ、平
均重合度40、硫黄含量19重量％のデキストラン硫
酸ナトリウム0.5ｇおよび水２mlを加えた（デキ
ストラン硫酸ナトリウムの濃度は約13重量％）。
ついでPH12に調整し、40℃で16時間振とうし、ゲ
ルを別し、2M食塩水、0.5M食塩水、水で洗浄
してデキストラン硫酸ナトリウムが固定されたゲ
ルをえた。未反応のエポキシ基はモノエタノール
アミンを用いて封止した。固定されたデキストラ
ン硫酸ナトリウムの量はカラム体積１mlあたり
0.4mgであつた。実施例３極限粘度0.055dl／ｇ、平均重合度40、硫黄含
量19重量％のデキストラン硫酸ナトリウムを用
い、固定化反応におけるデキストラン硫酸ナトリ
ウムの濃度を2.5重量％にかえたほかは比較例１
と同様にしてデキストラン硫酸ナトリウムが固定
されたゲルをえた。固定されたデキストラン硫酸
ナトリウムの量はカラム体積１mlあたり0.15mgで
あつた。試験例比較例１〜２、実施例１〜３でえられたデキス
トラン硫酸ナトリウムが固定されたゲルのそれぞ
れ１mlをカラムに充填し、高脂血症患者の血漿
（総コレステロール濃度300mg／dl）６mlを流し、
吸着されたLDLの量を総コレステロールを指標
として測定した（用いた血漿中のコレステロール
はほとんどがLDLに由来するため）。結果を第１表に示す。

【表】実施例４実施例１でえられた吸着体のうち、極限粘度
0.027dl／ｇ、平均重合度12、硫黄含量17.7重量
％のデキストラン硫酸ナトリウムを固定したもの
を生理食塩水中に分散させた状態で120℃20分間
高圧蒸気滅菌を施し、実施例３と同様にして
LDLの吸着量を測定したところ、該滅菌操作に
よる吸着量の減少はわずかであつた。実施例５実施例１でえられた吸着体のうち、極限粘度
0.027dl／ｇ、平均重合度12、硫黄含量17.7重量
％のデキストラン硫酸ナトリウムを固定したもの
１mlをカラムに充填し、これに正常ヒト血漿
（LDLコレステロールとHDLコレステロールの比
が約１：１）６mlを通したところ、LDLは大幅
に減少したが、HDLはほとんど吸着されなかつ
た。実施例６実施例５で用いた吸着体１mlをカラムに充填
し、これにVLDL、LDL、HDLを含む正常ウサ
ギの血漿６mlを通し、カラム通過前後での血漿中
のリポ蛋白をポリアクリルアミドゲルを用いたデ
イスク電気泳動法で調べた。第１図はその結果を
示すチヤートである。第１図中、曲線ＡおよびＢ
はそれぞれカラム通過前、通過後の電気泳動の結
果であり、縦軸は570nｍにおける吸光度、↑は
それぞれVLDL、LDL、HDLのバンドが出現し
た位置を示す。第１図に示すごとく、VLDL、LDLは吸着さ
れたが、HDLはほとんど吸着されなかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図はポリアクリルアミドゲルを用いたデイ
スク電気泳動の結果を示すチヤートである。

Claims

【特許請求の範囲】１極限粘度が0.12dl／ｇ以下でかつ硫黄含量が
15重量％以上であるデキストラン硫酸および（ま
たは）その塩が水不溶性多孔体に共有結合を介し
て固定されてなる体外循環治療用リポ蛋白吸着
体。２水不溶性多孔体の排除限界分子量が100万〜
１億の範囲である特許請求の範囲第１項記載の吸
着体。３水不溶性多孔体が多孔質セルロースゲルであ
る特許請求の範囲第１項または第２項記載の吸着
体。４デキストラン硫酸および（または）その塩が
式：（式中、O^Aはデキストラン硫酸および（または）
その塩の水酸基に由来する酸素原子、O^Bは水不
溶性多孔体の表面水酸基に由来する酸素原子であ
る）で示される結合を介して水不溶性多孔体に固
定されてなる特許請求の範囲第１項、第２項また
は第３項記載の吸着体。５デキストラン硫酸および（または）その塩の
固定量がカラム体積１mlあたり0.2mg以上である
特許請求の範囲第１項、第２項、第３項または第
４項記載の吸着体。６エポキシ化された水不溶性多孔体とデキスト
ラン硫酸および（または）その塩とを反応させる
にあたり、デキストラン硫酸および（または）そ
の塩濃度を水不溶性多孔体（乾燥重量）を除く全
反応系重量の３重量％以上としたことを特徴とす
る極限粘度が0.12dl／ｇ以下でかつ硫黄含量が15
重量％以上のデキストラン硫酸および（または）
その塩が水不溶性多孔体に共有結合を介して固定
されてなる体外循環治療用リポ蛋白吸着体の製造
法。７水不溶性多孔体の排除限界分子量が100万〜
１億の範囲である特許請求の範囲第６項記載の製
造法。８水不溶性多孔体が多孔質セルロースゲルであ
る特許請求の範囲第６項または第７項記載の製造
法。９デキストラン硫酸および（または）その塩が
式：（式中、O^Aはデキストラン硫酸および（または）
その塩の水酸基に由来する酸素原子、O^Bは水不
溶性多孔体の表面水酸基に由来する酸素原子であ
る）で示される結合を介して水不溶性多孔体に固
定されてなる特許請求の範囲第６項、第７項また
は第８項記載の製造法。１０デキストラン硫酸および（または）その塩
の固定量がカラム体積１mlあたり0.2mg以上であ
る特許請求の範囲第６項、第７項、第８項または
第９項記載の製造法。