JPH0530994A - シクロピアゾン酸非生産性麹菌の検出用培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 シクロピアゾン酸（ＣＰＡ）はある種の麹
菌によって生産される発癌性物質である。産業上有益な
ＣＰＡ非生産性麹菌を選択することを目的とする。ＣＰ
Ａ非生産性麹菌を得る確率が高く、且つ簡便な操作でＣ
ＰＡ非生産性麹菌を検出可能な培地を製造する。 【構成】 通常使用されている以上の濃度の０．２ー
６．０ｍＭの第一イオン及び／または第二鉄イオンを含
有せしめた麹菌の栄養寒天平板培地を製造する。該培地
に麹菌を生育させるとＣＰＡ生産性麹菌は赤いコロニー
を形成するが、ＣＰＡ非生産性麹菌は白いコロニーを形
成する。この培地を使用して、白いコロニーを形成する
麹菌を選択すると、ＣＰＡ非生産性麹菌を約５０％の確
率で選択することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、シクロピアゾン酸（Ｃ
ＰＡ）非生産性麹菌の検出用培地に関するものである。

【０００２】ＣＰＡは特定の麹菌により生産される物質
で、発癌性があるとされている。従って、麹菌を使用す
る工業においては、その様な麹菌を使用しないことが望
ましいとされている。

【０００３】

【従来の技術】従来、ＣＰＡ非生産性麹菌の検出法は、
希釈胞子懸だく液の一定量を通常の寒天平板培地に塗抹
し、培養した後、出現したコロニーを無作為に釣り上げ
て、一旦斜面保存培地に生育させる。その麹菌を、適当
な液体培地で，通常条件下に、通常時間培養する。その
全ての麹菌について、培養濾液におけるＣＰＡ存在の有
無ないしはその濃度を次の方法で分析して、ＣＰＡ非生
産性麹菌を検出するものである。

【０００４】即ち、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）（松戸隆直、佐々木正興；食品分析デ−タブック
第２集、１９８９年、４月、５９ペ−ジ、尚文社）や薄
層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（Ｊ．Ａ．Ｌａｎｓｄ
ｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｉ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ａｐｐｌｉ
ｅｄ ａｎｄ ＥｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ，４５，７６６−７９６，１９８３）で定
量する。

【０００５】また、ＣＰＡは大腸菌や枯草菌等の細菌の
成育を阻害するので、大腸菌や枯草菌等の細菌の生育可
能な寒天平板培地上で、麹菌培養濾液を滲み込ませた濾
紙片周辺に生じるそれらの細菌の生育阻害ゾーンを測定
する方法も考案されている（Ｏ．Ｂｅｎｋｈｅｍｍａ
ｒ，Ｆ．Ｇａｕｄｅｍｅｒ，ａｎｄ Ｉ．Ｂｏｕｖｉｅ
ｒ−Ｆｏｕｒｃａｄｅ，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎ
ｖｉｒｏｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ，５０，１０８７−１０９３，１９８５）。

【０００６】また、ＣＰＡは、０．１Ｎ苛性ソーダまた
は１％炭酸ソーダ等各種のアルカリ性溶液に溶解し、そ
の溶液は、アルポ−ト・コッキング（Allport-Cockin
g）試薬および第二鉄イオンによって各々、紫青色およ
び橙赤色の定性反応を与えるのでその性質を利用する事
によりＣＰＡ生産性を分析する。

【０００７】しかし、全ての麹菌について上記のような
分析を施す事は大変な時間と労力を必要とし、且つ目的
とするＣＰＡ非生産性麹菌が取得できる確率が極めて低
いと云う欠点を有していた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＣＰＡ非生
産性麹菌を得る確率が高く、且つ簡便な操作でＣＰＡ非
生産性麹菌を検出する方法を提供することを目的として
いる。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
について鋭意研究した結果、通常用いられる濃度より高
濃度の、第一鉄及び／または第二鉄イオンを含有せしめ
た麹菌栄養寒天培地を殺菌し、製造した平板培地に、麹
菌を接種し、培養すると、ＣＰＡ非生産性の麹菌の場合
は、白いコロニ−を形成するが、生産性の麹菌の場合
は、赤いコロニーを形成する事を発見した。本発明は、
この知見に基いて完成されたものである。

【００１０】すなわち、本発明は、麹菌の栄養寒天培地
に０．２ー６．０ｍＭの第一鉄及び／または第二鉄イオ
ンを含有せしめることを特徴とするシクロピアゾン酸非
生産性麹菌の検出用培地に関するものである。

【００１１】以下本発明を詳細に説明する。本発明の培
地製造に際し、窒素源、炭素源、無機塩類、寒天、第一
鉄及び／または第二鉄イオンを培地に含有させ、ｐＨを
調整する。必要に応じて、微量要素を含有せしめる。ま
た、必要に応じて、麹菌生育抑制剤である２，６−ジク
ロロ−４−アニリンを含有せしめる。培地は殺菌操作を
受けて、製造される。また殺菌後、シャーレに培地を分
注し、平板固化させ、ＣＰＡ非生産性麹菌の検出用平板
培地を製造する。

【００１２】炭素源としては、グルコース、スクロー
ス、フルクトース等の糖類、マンニトール、イノシトー
ルなどの糖アルコール類、デンプン等の高分子多糖類、
アミノ酸、カザミノ酸、ポリペプトン、ソイトーン等の
有機炭素源、等の麹菌資化可能なものであればよい。培
地に添加する濃度は０．１ー１０％で充分である。

【００１３】窒素源としては、硫安、硝安、硝酸カリ、
塩化アンモン、アンモニア等の無機窒素源、アミノ酸、
カザミノ酸、ポリペプトン、ソイトーン等の有機窒素
源、等の麹菌資化可能なものであればよい。培地に添加
する濃度は０．０１ー１％で充分である。

【００１４】無機塩類として先ず、第一及び第二りん酸
カリ、ナトリウム及びアンモニウム塩を通常使用する。
使用濃度は０．０１ー５％の範囲であればよい。その外
に、食塩、塩化カリ、硫酸ナトリウム、硫酸カリ、塩化
亜鉛、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、塩化マンガン、硫酸マンガ
ンなどを０．００００１ー１％の範囲で使用する。

【００１５】第一鉄及び第二鉄イオンは塩化塩、硫酸
塩、炭酸塩 硝酸塩などの形態で加える事ができるが、
普通は塩化物または硫酸塩として０．２ー６．０ｍＭを
加える。最適には０．２ー２．０ｍＭである。これ以下
の濃度ではコロニーの色調の識別が困難になる。この濃
度以上では麹菌の生育が極端に阻害される。

【００１６】微量要素としては、麹菌の生育に必要な、
各種アミノ酸類、各種ビタミン類、上記に記載の金属イ
オン以外の各種金属イオン類、等等を麹菌の生育に適し
た量を含有せしめる。

【００１７】カビの成育抑制剤である２、６−ジクロロ
−４−アニリンは０．１ー１０ｐｐｍの濃度，最適には
２ｐｐｍの濃度で含有せしめる。これは寒天平板培地に
おける麹菌コロニ−の過剰生育を抑え、コロニ−同士が
重なり合うのを防ぐためのものである。

【００１８】寒天は０．５から３％を含有せしめるのが
よい。

【００１９】ｐＨは培地殺菌前、アンモニアまたは苛性
ソーダ、苛性カリ等で調節し、殺菌後、ｐＨ３ー７にな
るようにする。

【００２０】培地殺菌は通常操作の蒸気殺菌を通常の条
件で行なう。例えば、１２０℃、８ー２０分位行なえば
充分である。第二鉄イオンを添加した培地の場合はメン
ブランフィルター殺菌も利用出来る。この場合は、予め
殺菌しておいた０．４５μのメンブランフィルターを使
用すればよい。

【００２１】殺菌後、適当な直径のシャーレに適当な量
の培地を分注するが、直径９ｃｍのシャーレであれば、
培地量は５ー２０ｍｌで充分である。

【００２２】このようにして、ＣＰＡ非生産性麹菌の検
出用培地が製造される。

【００２３】次に、ＣＰＡ非生産性麹菌の検出用培地を
用いて、ＣＰＡ非生産性麹菌を検出する方法を以下に記
す。上記の方法を用いて、ＣＰＡ非生産性麹菌の検出用
培地を作成し、適当な大きさのシャーレに分注し寒天を
固化させ、ＣＰＡ非生産性麹菌の検出用平板培地とす
る。胞子懸だく液を適当に希釈して、平板培地に塗抹す
る。この時、平板培地に麹菌コロニーを一平板当り、１
ないし５０個位形成させるように希釈するのがよい。培
養は２０ないし４０℃で、３ないし１０日位行なう。そ
うすると麹菌コロニーが形成され、シャーレ裏側から見
ると、ＣＰＡ生産性の麹菌のコロニーは赤いが、非生産
菌麹菌の場合は白いのでＣＰＡ生産性と非生産性麹菌を
明瞭に区別出来る。

【００２４】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によれば、通常の麹菌の平板培養法と同様に、培地に
麹菌を接種培養するだけの極めて簡単な方法により、Ｃ
ＰＡ非生産性麹菌を肉眼的観察により、下記の応用例に
示される如く、従来法に比べて、５０倍も効率よく検出
することができる、培地、試験管、シャーレなどがす
くなくて済む、簡単な操作で１回に多検体の試験を行
なう事ができる、等の種々の利点を有する。

【００２５】以下実施例、応用例を示して本発明を詳細
に説明する。

【００２６】

【実施例】 実施例１ 表１に記載する組成のＣＰＡ非生産性麹菌の検出用培地
を次の如くに製造した。表１に記載の量の培地成分を蒸
留水７００ｍｌに溶かした後、１４％アンモニアでｐＨ
５．６に調整すると同時にアンモニアを窒素源とした。
更に蒸留水を加え培地量を１０００ｍｌにした。寒天２
０ｇを加え、よく攪拌後、この培地を１２０℃，１０分
蒸気殺菌した。殺菌後、寒天が固化しない内に、直径９
ｃｍシャーレに１０ｍｌ宛て分注し、寒天が固化するま
で室温に放置した。こうのようにして、ＣＰＡ非生産性
麹菌の検出用培地を製造した。

【００２７】表１．ＣＰＡ非生産性麹菌の検出用培地組
成（リッター当り） マンニトール ３０ｇ グルコース １０ｇ コハク酸 １０ｇ カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ） ３ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄ １ｇ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．３ｇ ＦｅＳ０₄・７Ｈ₂Ｏ ０．２ｇ（第一鉄イオ
ンとして０．７２ｍＭ） ２、６−ジクロロ−４−アニリン ２ｐｐｍ 寒天 ２０ｇ １４％アンモニアで、殺菌前、ｐＨ５．６に調整する。

【００２８】実施例２ 表２に記載する組成のＣＰＡ非生産性麹菌の検出用培地
を次の如くに製造した。表２に記載の量の培地成分を蒸
留水８００ｍｌに溶解した後、１０％アンモニアでｐＨ
５．６に調整すると同時にアンモニアを窒素源とした。
更に蒸留水を加え培地量を１０００ｍｌにした。寒天２
０ｇを加え、よく攪拌後、この培地を１２０℃，１０分
蒸気殺菌した。殺菌後、寒天が固化しない内に、直径９
ｃｍシャーレに１５ｍｌ宛て分注し、寒天が固化するま
で室温に放置した。こうのようにして、ＣＰＡ非生産性
麹菌の検出用培地を製造した。

【００２９】表１．ＣＰＡ非生産性麹菌の検出用培地組
成（リッター当り） マンニトール ３０ｇ グルコース １０ｇ コハク酸 １０ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄ １ｇ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．３ｇ ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ ０．１ｇ（第二鉄イオ
ンとして０．３７ｍＭ） ２、６−ジクロロ−４−アニリン ２ｐｐｍ 寒天 １５ｇ １０％アンモニアで、殺菌前、ｐＨ５．６に調整する。

【００３０】

【応用例】 胞子懸だく液の調製 マルトエキス ８％、寒天 １．５％（ｐＨ ５．８−
６．０）の斜面培地にＣＰＡ生産性のアスペルギルス・
オリゼ−ＩＦＯ４２７８株を３０℃、７日間培養し、胞
子を形成させた。

【００３１】その胞子を約１０⁵−１０⁷／ｍｌになるよ
うに０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸だくし、
Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（ＮＴＧ）を１ｍｇ／ｍｌになるように添加した。さら
に、３０℃、１０−６０分、軽く振盪し変異処理を行な
った。等量の６％Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₃溶液を加え、反応を停止
させた。

【００３２】３，０００ ｘ ｇで１０分、遠心分離を
行ない、上澄液を除いた。適量の上記りん酸緩衝液を加
えて攪拌した後、再び遠心分離を行なった。このような
りん酸緩衝液による洗浄を２回行ない、ＮＴＧ変異処理
胞子懸だく液とした。この胞子懸だく液をＣＰＡ非生産
性麹菌を検出するための被検試料液とした。

【００３３】培養 実施例２の如くにして、作製したＣＰＡ非生産性麹菌の
検出用平板培地上に上記の被検試料液を０．１ｍｌずつ
滴下し、Ｌ字棒で塗抹し、３０℃，１０日間培養した。

【００３４】平板培地におけるＣＰＡ非生産性麹菌の
検出 出現するコロニ−を寒天平板の裏面より観察すると、大
部分のコロニ−は、赤くなったが、約１％のコロニ−は
白かった。白いコロニー４７３個分離した。

【００３５】液体培養によるＣＰＡ非生産性の確認 表２に記載の培地からＦｅＣｌ₃・７Ｈ₂Ｏ、２、６−ジ
クロロ−４−アニリン、寒天を除いた液体培地を作成し
た。３００ｍｌ容のエーレンマイヤーフラスコに８０ｍ
ｌずつ分注し、１２０℃、１０分間蒸気殺菌した。上記
の分離菌の胞子或いは菌糸片を接種し、２８−３０℃，
３０日間培養した。それらの培養濾液について、下記の
松戸らのＨＰＬＣ分析法により、ＣＰＡを定量した。

【００３６】結果 白いコロニーを形成する４７３個の内、ＨＰＬＣでＣＰ
Ａを検出出来ないＣＰＡ非生産菌は２５１株であった。
親株アスペルギルス・オリゼ−ＩＦＯ４２７８株はＣＰ
Ａを１．９μｇ／ｇ生産していた。ところが、ＣＰＡ非
生産性麹菌の検出用培地を使用しないで（ＣＰＡ非生産
麹菌の検出用培地より塩化第二鉄を添加しない培地、即
ち従来の培地を使用して）無作為に寒天平板培地より１
０００個のコロニーを釣菌し、上記と同様に液体培養
し、培養液をＨＰＬＣで分析した結果、ＣＰＡを検出出
来ないＣＰＡ非生産菌は１１個であった。

【００３７】この結果から分るように、本発明の使用に
より約５０％の確率でＣＰＡ非生産性麹菌を検出できる
のに、従来の培地使用では約１％の確率でしか検出出来
なかった。この事により、本発明はＣＰＡ非生産性麹菌
の検出に、如何に簡便、且つ有効に使用されるか理解出
来る。

【００３８】ＨＰＬＣ法によるＣＰＡ分析：先ず、培養
濾液を濾過したもの1．０ｍｌを正確にとり、そこへ内
部標準物質として０．１５％インドメタシン（indometh
acin）のエタノ−ル溶液を２０μｌ加え、０．４５μｍ
のフィルタ−で濾過し、その２μｌを次の条件のＨＰＬ
Ｃへ導入した（松戸隆直、佐々木正興； 食品分析デ−
タブック第２集、１９８９年、４月、５９ペ−ジ、尚文
社）。

【００３９】カラム：ＴＳＫゲルＯＤＳ−８０ＴＭ、
４．６Ｉ．Ｄ． ｘ ２５０ｍｍ 移動相：１．０ｍＭ ＺｎＳＯ₄，５０ｍＭ Ｈ₃ＰＯ₄
−ＣＨ₃ＣＮ（４５：５５） 流速： １．０ｍｌ／分 検出： ＵＶ２８４ｎｍ

【００４０】ほとんど夾雑ピ−クの重らないシャ−プな
ＣＰＡのピ−クが得られ、内部標準物質のインドメタシ
ンとの面積比から正確なＣＰＡの定量値を計算する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 麹菌の栄養寒天培地に０．２ー６．０ｍ
   Ｍの第一鉄イオン及び／または第二鉄イオンを含有せし
   めることを特徴とするシクロピアゾン酸非生産性麹菌の
   検出用培地。