JPH04148692A - ホスホマイシンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ｃｉｓ−プロペニルホスホン酸を微生物反応
によりホスホマイシンに変換することを特徴とする抗生
物質ホスホマイシンの製造方法に関するものである。ホ
スホマイシンは、放線菌の二次代謝産物であり、化学構
造は、以下の式１に示す（−）−（ＩＲ，２Ｓ）−１，
２−エポキシプロピルホスホン酸である。ダラム陽性菌
、陰性菌に広い抗菌スペクトルを示し、緑膿菌、変形菌
、セラチア及び多剤耐性ブドウ球菌及び大腸菌による感
染症に内服或いは注射薬として使用されている。

〔従来の技術〕

ホスホマイシンの製造技術としては、生産菌であるスト
レプトマイセス・フラジェ（ＳｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ
　ｆｒａｄｉｅ　）　、ストレプトマイセス・ピリドク
ロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｌｒｉｄｏ
ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）又はストレプトマイセス・エ
ドモレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｗｅｄｍｏ
ｒｅｎｓｉｓ）の培養液よりホスホマイシンを分離、精
製する方法（特公昭４５−９８２８号公報）、又はスト
レプトマイセス・オーダイネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ　ｏｄａｉｎｅｎｓｉｓ）の培ｉ液よりホスホ
マイシンを分離、精製する方法（特開昭５１−５４９８
９号公報）　、Ｃｌ５−プロペニルホスホン酸を化学的
にエポキシ化する方法（特公昭４６−４３２０６号公報
）　、ｔｅｒｔ−ブタノールを原料として化学的に合成
する方法〔ジャーナル・オブ拳オーガニック會ケミスト
リー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）　３５．３５１０　（１９７０）］　、ペ
ニシリウム属、オイデュウム属及びフッシロマイセス属
に属するカビを用いてｃｉｓ−プロペニルホスホン酸を
エポキシ化する方法【アプライド・マ・ｒクロバイオロ
ジー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　
２２．５５　（１９７１）］、セルビブリオ属及びブレ
ビバクテリウム属に属する細菌を用いてｃｉｓ−プロペ
ニルホスホン酸をエポキシ化する方法（特開昭６４−３
７２ＥｌＢ号公報）が知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

前記従来のホスホマイシンの製造方法において、放線菌
の培養液から分離、精製する方法はその生産量が低いと
いう欠点があった。また、化学的に合成する方法では、
抗生物質として不活性な（＋）一体が副生すること、ま
た煩雑な光学分割を行う必要があった。また、カビを用
いる方法では、基質であるｃｉｓ−プロペニルホスホン
酸の濃度が高くなると変換率が低下する現象が認められ
ること、細菌を用いる方法では、生成物であるホスホマ
イシンに対する耐性が低いことという欠点があった。

そこで、高濃度のｃｉｓ−プロペニルホスホン酸及びホ
スホマイシンに対する耐性を有し、且つｃｉｓ−プロペ
ニルホスホン酸をホスホマイシンに変換する能力を有す
る微生物の開発が望まれてきた。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者はこうしたａｍにおいて、ｃｉｓ・プロペニル
ホスホン酸を基質としホスホマイシンを製造するに適し
た方法を鋭意検討し、シュウドモナス属、アルカリゲネ
ス属、コリネバクテリウム属、フラボバクテリウム属、
アエロモナス属、ノカルディア属及びスプレブトマイセ
ス属に属する微生物が、ｃｉｓ−プロペニルホスホン酸
を光学活性的にホスホマイシンに変換し、なおかつ、高
濃度のｃｉＳ−プロペニルホスホン酸及びホスホマイシ
ン存在下でもエポキシ化の能力が高いことを発見し、本
発明を完成したのである。

本発明において利用される微生物は、シュウドモナス属
、アルカリゲネス属、コリネバクテリウム属、フラボバ
クテリウム属、アエロモナス属、ノカルディア属又はス
トレプトマイセス属に属し、ｃｉｓ−プロペニルホスポ
ン酸を光学活性的に変換する能力を有するものであれば
、いずれのものでも用いられる。

このうち、特に好ましくは、シュウドモナス・プチダ（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）　　Ｉ　Ｋ　
−８株、アルカリゲネス・フェーカリス（Ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）　ＩＦＯＩ　３１１１
株、コリネバクテリウム・フラビゲナム（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｎａｖｉｇｅｎｕｍ）　ＡＨＵ１
３４５株、フラボバクテリウム・エステルアロマチカム
（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｓｔｅｒａｒｏｒ
ｎａｔｉｃｕｍ）ＩＦＯ３７５１ａ、アニロモナス・ハ
イドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈｉ
ｌａ）　　Ｉ　ＡＭ　１０１８株−、ノカルディア−コ
ーラリナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｃｏｒａｌｌｉｎａ）Ｉ
Ｆ０３３３Ｂ、ストレプトマイセス・グリセウス（ＳＬ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）　　Ｉ　ＡＭ
　０１２３株及びストレプトマイセス（ＳｔｒｅｐＬｏ
ｍｙｃｅｓ　ｓｐ、）　　ｆＫ−１７株である。

また、これらの微生物に紫外線を照射したり、ＮＴＧ　
（Ｎ−メチル−Ｎｏ　−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン）やＥＭＳ　（エタンメタンスルホン酸）等の変異銹
起剤て処理することにより、ホスホマイシンの生産能を
高めた変異株を使用することもできる。

上記の菌株において、シュウドモナス・プチダＩＫ−８
とストレプトマイセスＩＫ−１７は、本発明者が土壌中
より新たに分離したものである。これらの菌株の菌学的
性質及び微生物工業技術研究所への寄託番号は下記の通
りである。

形態：２〜４の極給毛を有する直桿菌 ０．７〜１．Ｏ×１．５〜２．０Ｊ１ｍ連動性：有り ダラム染色：陰性 胞子形成：無し １−遣」Ｄ１ζ姐史（１１抜■ （１）標準寒天平板培地 コロニーは円形、表面は平滑、 全縁状で蛍光有 り。

（２）標準寒天斜面培地 直線状で表面は平滑、バター質、玉虫色、生育良好。

（３）標準液体培地 かすかに粉状沈澱を有する。皮膜形成はなし。

ｌ−土星煎豆１ カタラーゼ：陽性 チトクロームオキシダーゼ：陽性 色素生成：黄色（トリプトソイ寒天培地、水溶性） ０−Ｆ試験：酸化型 酸産生ニブドウ糖　　十 キシロース　＋ マルトース ラクトース マニトール シユクロース− 澱粉 発育：　５℃　　　　　　　　＋ ４１’Ｃ マツコンキー寒天培地　十 ＳＳ寒天培地　　　　　十 硝酸塩還元 硝酸塩からガス アルギニンジヒドラーゼ　　　　＋ ゼラチン分解 Ｔｗｅｅｎ８０分解 尿素分解　　　　　　　　　　　十 クエン酸の利用　　　　　　　　十 ＴＳ　　夏　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　−／−リドマスミルク　　　　　アルカリ化 酸素要求　　　　　　　　偏性好気 以上の菌学的性質よりパージ・マニュアル（Ｂｅｒｇｅ
ｙ　ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｒ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版により検索し
たところ、重囲はシュウドモナス・プチダと認められた
ので、重囲をシュードモナス・プチダＩＫ−８とした。

そして、重囲を平成２年１０月６日付で微生物工業技術
研究所に寄託し、該寄託番号はＦＥＲＭ　　Ｐ−１１７
５１である。

第１表に各培地におけるコロニーの性状を示した。

１−１μり１軽 イースト・麦芽培地を用いて、スライド培養により菌の
形態を観察したところ、以下のようであった。

基生菌糸：放射状であり、断裂しない。

気菌糸：単純分岐している。

胞子：胞子柄は気菌糸より出て、直線状に１０個以上連
鎖している。胞子　は白色でその大きさは、０．５〜１
．ＯＸｌ、０〜２．０μｍ、円筒型をなし、表面は平滑
である。胞子のう、菌核はない。

Ｉ−」ト１１双 ＬＬ−ジアミノピメリン酸 ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸 グリシン アラニン 五−」Ｊし旧１１亘 アミラーゼ カタラーゼ 色素産生 ゼラチン液化 ミルクのペプトン化 糖の資化性 Ｌ−アラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース Ｄ−フラクトース シュクロース し−ラムノース ラフィノース イノシトール Ｄ−マニトール 澱粉　　　　　　　　　　　　十 デキストリン　　　　　　　　＋ マルトース　　　　　　　　　＋ ラクトース　　　　　　　　　＋ イヌリン Ｄ−ガラクトース　　　　　　＋ Ｄ−マンノース　　　　　　　＋ ソルビトール グリセロール　　　　　　　＋ 以上の菌学的性質より、パージ・マニュアル第８版によ
り検索した所、本菌株はストレプトマイセス属細菌と同
定された。その種については、ストレプトマイセス・ア
ルボビナセウス（ＳＬｒｅｐｔｏｒｎｙｃｅｓ　ａｌｂ
ｏｖｉｎａｃｅｕｓ）　　に近いもののＤ−マニトール
を資化しないことから、明確な確定には至らなかった。

そこで、本菌株をストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、）　　Ｉ　Ｋ　−１７株
とした。そして、重囲を平成２年１０月６日付で微生物
工業技術研究所に寄託し、該寄託番号はＦＥＲＭ　　Ｐ
−１１７５０である。

ホスホマイシンは、上記菌株の一種をｃｉｓ−／ロペニ
ルホスホン酸を含有した培地で培養することによって得
られる。Ｃｌ５−プロペニルホスホン酸の添加方法等と
しては、例えば、■培地中に予め添加しておく方法、■
まず通常の微生物培養の培地で前記微生物を培養し、適
当な時期に添加する方法、又は■培養した菌体を集め菌
体処理物とし、これを適当な水系溶媒でｃｉｓ−プロペ
ニルホスホン酸と接触せしめる方法のいずれを取ること
もできる。

この菌体処理物としては、生菌体以外にも乾燥菌体、ア
セトン処理菌体、固定化菌体等の処理物が使用できる。

培地の度素源としては、グルコース、シュクロース等の
糖類をはじめ、グリセロール等のアルコール類、クエン
酸等の有機酸類、又は廃糖蜜、コーンステイブリカー等
の天然物由来のもののうちから、使用菌種の資化しうる
ちのを選択して用いることができる。

窒素源としては、硫安、塩化アンモニウム等のアンモニ
ウム塩、尿素等のアミド類、アミノ酸類、又は肉エキス
、ペプトン等の蛋白質やその加水分解物等が使用できる
。また、通常の微生物培養に用いられる栄養塩類、即ち
、リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、鉄、亜
鉛、コバルト、マンガン等の金属塩、更に酵母エキス、
ビタミン、ヌクレオチド等の生育因子が必要に応じて添
加される。

培養は、一般の通気攪拌培養を行う。培養温度は、菌が
生育する温度であればいずれてもよいが２５〜３０℃が
好ましい。また、培地のｐＨは６〜８の間が望ましい。

添加するｃｉｓ−プロペニルホスホン酸の濃度は、菌が
育成する範囲内であればいずれの濃度でも使用できるが
、通常は０゜３〜２．０％である。

反応液からのホスホマイシンの採取には、公知の遠心分
離法、抽出法、濃縮法、クロマトグラフィー法等が使用
できる。

ホスホマイシンの定量方法は、特に限定されないが、通
常、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍ１ｒ
ａｂｉｌｉｓ）　　Ｉ　Ｆ　ＯＩ　３３００及びセラチ
ア−７／レセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓ
ｃｅｎｓ）　Ｉ　Ａ　Ｍ　Ｉ　Ｏ８５を用いるバイオア
ッセイ法に従って行われる。

〔実施例〕

以下実施例により本発明を具体的番こ説明する。

災ｌ五上 本実施例は、第２表に示す各菌株番こお：ｆるホスホマ
イシンの生産量を検討したものである。

０．３％のＣ１５−プロペニルホスホン酸、５％のグリ
セロール、０．５％の肉エキス、１％のペプトン、２％
のトリプトン、０．１５％のＮａＣｅ０．０５％のＣｏ
Ｃｌ２　・７ＨｔＯ及び０．０２％のＮ　ａ　Ｖ　Ｏｓ
を含む培地（１）Ｈ７，５）１０ｄを入れた大型試験管
に、本発明で使用する菌株を接種し、３０℃、７日間、
振賑培養した。培養液中に蓄積したホスホマイシンの量
は、ノ＜イオアッセイで測定した。

（以下、余白） 第 表 具体的にいえば、プロテウス・シラビリヌＩＦ０１３３
００菌又はセラチア・マルセセンスＩＡＭ１０６５菌を
スラントより、酵母エキス−ペプトン培地（各０．５％
を含む）に接種し、３０℃で一夜培養する。得られた培
養液ＩＪを、滅菌した後５０〜５５℃に保温した０、３
％肉エキス、０．５％ペプトン及び０．２％酵母エキス
を含む寒天培地１００Ｗｌに加え、滅菌したシャーレに
分注し固化させる。ペーパーディスク（直径８ｍｍ）に
被検液５０μｒをしみこませ、寒天上に置き３０℃で１
６時間培養する。得られた阻止内の大きさを測定し、前
もって作成した標準ホスホマイシン（シグマ社製）によ
る検量線より定量する。

各菌株のホスホマイシン生産量を第２表に示す。この結
果によれば、ホスホマイシンは０．０５〜０．５５ｍｇ
／ｍ１培地も生産され、特に、シュードモナス・プチダ
ＩＫ−８、アルカリゲネスーフェーカリスＩＦＯ１３１
１１、ストレプトマイセス・グリセウス］ＡＭＯ１２３
、ストレプトマイセス・エスピーＩＫ−１７は、０．４
０〜０５５ｍｇ／ｍＩ！培地と多くのホスホマイシンが
生産された。

ス１−例」− 本実施例は、第３表に示す３種の菌株の生育状況トｃｉ
ｓ−プロペニルホスホン酸及びホスホマイシンの１度と
の関係を検討したものである。

０．５％の酵母エキスと０．５％のペプトンを含む培地
にｃｉｓ−プロペニルホスホン酸又はホスホマイシンを
添加した寒天培地に本発明で使用する各菌株を接種し、
３０℃で７日間培養し、その生育を測定する。

その結果を第３表に示す。この結果によれば、これらの
菌株は、高濃度のｃｉｓ−プロペニルホスホン酸（２％
濃度）又はホスホマイシン（１，５％濃度）存在下でも
、十分に良好な生育を示し、そのため十分な耐性を有す
ることが判明した。

（以下、余白） ス１１引１ 本実施例は、本実施例において生産された化合物が光学
純度に優れたホスホマイシンであることを確認したもの
である。

０．３％のｃｉｓ−プロペニルホスホン酸、５％のグリ
セロール、１％のクエン酸ナトリウム、０゜５％の肉エ
キス、１％のペプトン、２％のトリプトン、０．１５％
のＮａＣ１，０，０５％のＣＯＣｌ２　−７Ｈ１０及び
０．０２％のＮ　ａ　Ｖ　Ｏｓの組成の滅菌培地１００
Ｊ　（ｐＨ７，５）を含む５００−の容振薇フラスコに
シュウドモナス・プチダＩＫ−８株を接種し、３０℃で
７日間振羨培養した。培養液１０００−より、遠心分離
（ｌＯｌｏｏＯｒｐｍ、１５分）にて、菌体を除去した
。

得られた上澄に２０ｇの顆粒状活性炭を加え、濾過する
ことにより着色物質を取り除いた。濾液を陰イオン交換
樹脂アンバーライトＣＧ５０（ローム・アンド・ハース
社製）を充填したカラム（６ｘ５０ｃｍ）に通し、ホス
ホマイシンを吸着させ、このカラムを水洗後、１％の塩
化ナトリウム溶液１．０００−を用いてホスホマイシン
を溶出させた。活性画分を集め減圧濃縮後メタノールを
加え、２５％のメタノール溶液とした。

次に、２５％のメタノール溶液を用いて充填した活性ア
ルミナ（ＩＣＮアルミナＡ１スーパ−１ＩＣＮバイオメ
デイカル社製）カラム（３×３０ｃｍ）に上記溶液を通
し、ホスホマイシンを吸着させ、水及び０．５Ｍのアン
モニア水にてホスホマイシンを溶出した。活性画分を集
め減圧濃縮後２０％のメタノールに溶解し、２０％のメ
タノールを用いて充填したセファデックスＬＨ２０（フ
ァルマシア社製）カラム（３Ｘ３０ｃｍ）に吸着し、２
０％のメタノール溶ｆｉ２０　（１／にて溶出した。活
性画分を減圧濃縮・乾燥しホスホマイシンナトリウム塩
１５０ｍｇが得られた。

本化合物のＨ−ＮＭＲ（Ｄ、０）は、δ１．　４７　（
３Ｈ，ｄ、Ｊ＝５．９）、２．８５　（ＩＨ。

Ｊ＝１９．３．５．２Ｈｚ）、３．２〜３．４（ＩＨ，
ｍ）と標準化合物と完全に一致した。また、施光度〔α
）　１３５Ｒ１１１”°’＝−９，０となり、標準化合
物の−８，４（ｃ＝１．水）と同等若しくはそれ以上の
値を示し、同化合物は１００％に近い光学純度を有する
ホスホマイシンと同定された。

夫産且↓ 本実施例も実施例３と同様な確認をしたものである。

使用菌株をストレプトマイセス・エスピーＩＫ−１７株
に代えて、実施例３と同様に行い、ホスホマイシンナト
リウム塩を１１０ｍｇ得た。この化合物も、実施例３の
化合物と同様に優れた光学純度をもつホスホマイシンで
あった。

〔発明の効果〕

本製造方法によれば、前記に示すように、ｃｉｓ−プロ
ペニルホスホン酸を光学活性的に効率よくホスホマイシ
ンに変換し製造でき、更にｃｉｓ−プロペニルホスホン
酸及びホスホマイシンの高濃度存在下であっても、効率
よくホスホマイシンを製造できる。

特許出願人　　　有限会社　ビセイケン代　理　人　　
　弁理士　　小島清路 手続補正書（自発） 平成２年１１月９日 ２゜ ３゜ ４゜ 発明の名称 ホスホマイシンの製造方法 補正をする者 事件との関係　特許出願人 名古屋市西区枇杷島四丁目９番２４号 有限会社　ビセイケン 代表者　犬飼　忠彦

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）シュウドモナス属、アルカリゲネス属、コリネバ
   クテリウム属、フラボバクテリウム属、アエロモナス属
   、ノカルディア属又はストレプトマイセス属に属し、ｃ
   ｉｓ−プロペニルホスホン酸を不斉エポキシ化する能力
   を有する微生物の培養液、菌体及びその処理物のうちの
   少なくとも１つとｃｉｓ−プロペニルリン酸とを適当な
   媒体中で接触、反応せしめることにより、該媒体中にホ
   スホマイシンを蓄積し、該ホスホマイシンを採取するこ
   とを特徴とするホスホマイシンの製造方法。